BLOQUE 4

Control bacteriano

antibiótico más adecuado para el tratamiento de
la infección y permite instaurar las medidas de
aislamiento adecuadas para evitar la transmisión
del microorganismo a otros pacientes.
El estudio de los mecanismos de resistencia se
puede realizar mediante la detección del gen que
codifica dicho mecanismo (detección genotípica;
v. capítulo 16) o mediante la demostración del efec­
to que ese gen ocasiona (detección fenotípica). La
detección genotípica conlleva el empleo de técnicas
de biología molecular que, en muchas ocasiones,
no están al alcance de los laboratorios clínicos. Por
ello, la detección fenotípica resulta muy útil en la
práctica clínica y es ampliamente empleada.
El objetivo de los siguientes experimentos es
mostrar cómo detectar algunos de los mecanis-
mos de resistencia más prevalentes mediante
pruebas fenotípicas.

ESTUDIO EXPERIMENTAL 1. DETECCIÓN DE CEPAS PRODUCTORAS

DE b-LACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO EN ENTEROBACTERIAS
El principal mecanismo de resistencia a los b-lactámicos en las enterobacterias es la producción de
b-lactamasas, que son enzimas capaces de hidrolizar el anillo b-lactámico inactivando estos antibió-
ticos. Destacan las b-lactamasas de espectro extendido (BLEE), ya que hidrolizan y confieren resis-
tencia a penicilinas, cefalosporinas de tercera y cuarta generación y monobactámicos. Las BLEE se
caracterizan por ser sensibles a la acción de los inhibidores clásicos de las b-lactamasas, como el
ácido clavulánico o el tazobactam.
Los genes que codifican estas enzimas se encuentran localizados en elementos móviles, lo que facilita
su diseminación. El aislamiento de bacterias productoras de BLEE está en auge desde su primera des-
cripción en Alemania en 1983 en una cepa de Klebsiella ozaenae. En la actualidad se han identificado
más de 300 BLEE diferentes, la mayoría pertenecientes a las familias TEM, SHV y CTX-M. Debido
al aumento de los aislamientos productores de BLEE durante los últimos años, su detección en el
98
laboratorio se convierte en una tarea necesaria para facilitar su control epidemiológico.
Fenotipos que se deben detectar:
● Capacidad para hidrolizar cefalosporinas de tercera y cuarta generación y monobactámicos.

● Capacidad del ácido clavulánico para inhibir la actividad enzimática de las b-lactamasas.

TÉCNICAS
Antibiogramas para demostrar el efecto sinérgico producido entre las cefalosporinas de tercera gene-
ración o los monobactámicos y el ácido clavulánico.

MATERIAL NECESARIO
● Tubos con solución salina (SS) estéril.
● Agar Mueller-Hinton (MH).
● Discos de antibióticos: ceftazidima (30 mg), cefotaxima (30 mg), ceftriaxona (30 mg), aztreonam

(30 mg), amoxicilina-ácido clavulánico (20/10 mg).

● Estándar de turbidez equivalente a un estándar 0,5 de la escala de McFarland (108 UFC/mL).

● Hisopos estériles.

● Pinzas metálicas.

● Vórtex.

PROTOCOLO EXPERIMENTAL (TABLA 11-1)

La técnica empleada es el método de difusión con discos. La preparación del inóculo, las placas y los
discos se explica en el anexo de técnicas básicas.
Dado que la interpretación de la existencia de un efecto sinérgico no siempre es totalmente objetiva,
se recomienda el empleo de una cepa control negativo de Escherichia coli ATCC 25922 no productor
de BLEE, y de una cepa control positivo de Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 productor de BLEE.

Día 1
● Preparación del inóculo. A partir de una placa de cultivo de 18-24 h, tomar una colonia

con un asa y ajustar el inóculo a una turbidez equivalente al estándar 0,5 de la escala

de MacFarland en SS. Homogeneizar en vórtex durante 15-20 s.
 CAPÍTULO 11
Resistencia antibiótica

TABLA 11-1  Cronograma del experimento*

Día 1 Día 2

Preparación del inóculo Lectura de resultados

Preparación de medios
Dispensación de discos
Incubación (24 h)

*Los tres experimentos tienen una cronología similar.

● Inoculación de placas de MH en césped (en tres direcciones) sin dejar ninguna zona libre. Dejar
secar durante 3-5 min antes de depositar los discos.
● Dispensación de los discos con pinzas estériles. Es necesario asegurarse de que los discos

contacten perfectamente con la superficie del agar, por lo que se recomienda presionar
ligeramente sobre la superficie del agar. Para la detección de cepas productoras de BLEE,
deben colocarse tres discos de cefalosporinas (cefotaxima, ceftacidima y ceftriaxona)
y uno de aztreonam alrededor de un disco de amoxicilina-ácido clavulánico, siguiendo
el esquema de la figura 11-4. Es especialmente importante mantener la distancia entre los discos
(20 mm) para poder apreciar el efecto de sinergia que confirmará la producción de BLEE.
● Incubación a 35 °C en atmósfera aerobia durante 18-24 h.

Día 2
Lectura de los resultados.
La sinergia entre los discos de las cefalosporinas y el de amoxicilina/ácido clavulánico confirma la
presencia de una cepa productora de BLEE (v. fig. 11-4). 99

ESTUDIO EXPERIMENTAL 2. DETECCIÓN DE METALO-b-LACTAMASAS

EN PSEUDOMONAS AERUGINOSA
Otro tipo de b-lactamasas son las denominadas carbapenemasas, que son enzimas capaces de
degradar a los b-lactámicos de amplio espectro denominados carbapenémicos.
© Elsevier. Fotocopiar sin autorización es un delito.

FIGURA 11-4  Test de sinergia de doble disco para la detección de enterobacterias productoras de b-lactamasas
de espectro extendido (BLEE). Se muestra el resultado positivo de una cepa de Escherichia coli productora de BLEE.
AMC, amoxicilina-ácido clavulánico; ATM, aztreonam; CAZ, ceftacidima; CPD, cefpodoxima; CRO, ceftriaxona.
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Control bacteriano

Las carbapenemasas del tipo metalo-b-lactamasas (MBL) están aumentando en los últimos años.
Se caracterizan por poseer un dominio de unión al cinc, que debe estar ocupado por dos iones de
este metal para que la enzima mantenga su actividad hidrolítica. Por lo tanto, todas las MBL tienen
en común que son sensibles a la inhibición por agentes quelantes de cationes divalentes, como el
ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), pero no por los inhibidores clásicos de las b-lactamasas,
como el ácido clavulánico. Las cepas productoras de MBL suelen presentar resistencia a la práctica
totalidad de los b-lactámicos, incluidos carbapenémicos, con la excepción de aztreonam. Por lo tanto,
el hecho de observarse una gran sensibilidad a aztreonam y una sensibilidad reducida o resistencia a
ceftazidima y cefepima, además de resistencia a imipenem y meropenem, nos debe hacer sospechar
de la presencia de una cepa productora de MBL.
Fenotipos que se deben detectar:
● Una cepa productora de MBL es resistente a los carbapenémicos.

● Las MBL requieren unir a su centro activo dos iones de cinc.

TÉCNICAS
Si quelamos con EDTA los iones presentes en el medio, la enzima no podrá ser activa y se incremen-
tará la sensibilidad a imipenem.
● Microdilución en caldo y tiras de E-test®: consiste en calcular el cociente entre los valores de la

CMI a imipenem en presencia y ausencia de un quelante.

● Difusión en disco (test de los discos combinados y test de sinergia con doble disco): consiste

en medir los halos de inhibición generados al enfrentar la cepa en estudio con un disco cargado
con un carbapenémico y otro disco cargado con el mismo carbapenémico y un compuesto
inhibidor de las MBL (EDTA). Un aumento de 6 mm del diámetro del halo de inhibición generado
en el disco con quelante, respecto al que no contiene quelante, permite inferir la presencia
100 de MBL en el aislamiento. Por su parte, el test de la sinergia de doble disco se fundamenta
en la potenciación del halo de inhibición generado alrededor del disco antibiótico cuando
este se enfrenta con un disco cargado con un inhibidor de la acción enzimática de las MBL.

MATERIAL NECESARIO
● Tubos con solución salina (SS) estéril.
● Medio de cultivo (dos placas de agar MH).
● Discos de antibióticos: tres discos de imipenem (10 mg), un disco de ceftazidima (30 mg)

y un disco blanco (sin antibiótico).

● EDTA: 0,1 M.

● Hisopos estériles.

● Pinzas metálicas.

● Pipetas automáticas y puntas de pipeta.

● Incubadora a 37 °C.

● Nefelómetro o escala MacFarland.

● Vórtex.

PROTOCOLO EXPERIMENTAL (V. TABLA 11-1)

La técnica empleada es el método de difusión con discos. La preparación del inóculo, las placas y los
discos se explica en el anexo de técnicas básicas.

Día 1*
● Preparación del inóculo. A partir de una placa de cultivo de 18-24 h, tomar una colonia

con un asa y ajustar el inóculo a una turbidez equivalente al estándar 0,5 de la escala

de MacFarland en SS. Homogeneizar en vórtex durante 15-20 s.

*Empléense como controles positivos cepas de laboratorio conocidas productoras de MBL de tipos VIM-2 e IMP-13,
y como control negativo la cepa salvaje PAO1.
 CAPÍTULO 11
Resistencia antibiótica

● Inoculación de las placas MH en césped (en tres direcciones), sin dejar ninguna zona libre. Dejar
secar 3-5 min antes de depositar los discos.
● Dispensación de los discos. Para llevar a cabo el test de los discos combinados, y siguiendo

las indicaciones de la figura 11-5A, depositar dos discos de imipenem en una de las placas

de MH. Para llevar a cabo el test de sinergia con doble disco, y siguiendo las instrucciones
de la figura 11-5B, depositar en el centro de la otra placa de MH el disco de filtro blanco.
A un lado, y a una distancia de borde a borde de los discos de 10 mm, colocar el disco
de imipenem y, al otro lado y a la misma distancia, el disco de ceftazidima.
● Inoculación del quelante. Siguiendo las indicaciones de la figura 11-5, inocular 10 mL de la solución

de EDTA 0,1 M sobre uno de los dos discos de imipenem, colocándolo sobre la primera placa,
y 10 mL de esta misma solución sobre el disco de filtro blanco. Mantener las placas a temperatura
ambiente y no moverlas durante 5 min, para permitir que los discos absorban la solución.
● Incubación a 35 °C en atmósfera aerobia durante 18-24 h.

Día 2
Lectura de los resultados.

ANÁLISIS Y RESULTADOS ESPERADOS

● Test de los discos combinados: considerar como resultado positivo para la producción de MBL
un aumento del diámetro del halo de inhibición del disco suplementado con EDTA de al menos
6 mm más que el disco que únicamente contiene imipenem (v. fig. 11-5A).
● Test de sinergia de doble disco: considerar como resultado positivo para la producción

de MBL la potenciación del halo de inhibición generado entre los discos de antibiótico (imipenem
y/o ceftazidima) y el quelante (v. fig. 11-5B).
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© Elsevier. Fotocopiar sin autorización es un delito.

FIGURA 11-5  Pruebas fenotípicas para la detección de cepas de Pseudomonas aeruginosa productoras
de metalo-b-lactamasas. En la imagen inferior, se muestra un resultado positivo. A. Disposición de los discos para
realizar el test de los discos combinados. B. Disposición de los discos para realizar el test de sinergia de doble disco.
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Control bacteriano

ESTUDIO EXPERIMENTAL 3. DETECCIÓN DE CEPAS DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS

RESISTENTES A METICILINA
S. aureus es uno de los principales causantes de infecciones, tanto nosocomiales como comunitarias.
Es el agente etiológico de múltiples patologías, entre las que destacan las infecciones de la piel y
los tejidos blandos, la bacteriemia, la endocarditis, las infecciones del sistema nervioso central y las
infecciones del aparato genitourinario. Las penicilinas antiestafilocócicas, como meticilina, nafcilina,
cloxacilina u oxacilina, son los antibióticos de primera elección para su tratamiento. Sin embargo,
están apareciendo numerosos casos producidos por S. aureus resistentes a la meticilina (MRSA o
SARM, según el acrónimo en inglés o en castellano, respectivamente) y S. aureus resistentes a la
oxacilina. Ambos antibióticos pertenecen a la misma familia y presentan resistencia cruzada, por lo
que la detección de resistencia a uno de ellos implica resistencia al otro. Desde su primera aparición
en el Reino Unido en 1961, los SARM se han distribuido por todo el mundo y su prevalencia ha in-
crementado significativamente, oscilando entre el 25-50% en los diferentes países europeos.
Su detección rápida es imprescindible para aplicar el tratamiento adecuado. Pero, ¿a qué se debe su
resistencia? Y, por lo tanto, ¿cómo se pueden detectar?
Las penicilinas antiestafilocócicas son antibióticos b-lactámicos estables a la acción de las b-lactama-
sas, que actúan fijándose y bloqueando a las proteínas fijadoras de la penicilina (conocidas como PBP
por su afinidad con los b-lactámicos). Estas proteínas se encuentran en la membrana citoplásmica y son
responsables de la síntesis del peptidoglucano. Las cepas de S. aureus contienen normalmente cuatro
PBP. La resistencia a este grupo antibiótico se debe a la síntesis de una PBP de baja afinidad por estos
antibióticos, denominada PBP2a o PBP2’. Debido a esta baja afinidad, los antibióticos b-lactámicos
son incapaces de unirse a esta proteína y, por lo tanto, de realizar su acción. La bacteria se convierte
102 en resistente. Esta alteración puede adquirirse gracias a la adquisición de ADN exógeno, en concreto la
adquisición del gen mecA, que codifica dicha proteína con baja afinidad por estos b-lactámicos.
Para la detección de cepas resistentes a la meticilina en los laboratorios clínicos, se emplea la deter-
minación de la sensibilidad a los antibióticos oxacilina y cefoxitina. ¿Por qué?
Razones:
● Las cepas de S. aureus resistentes a oxacilina (SARM) presentan resistencia cruzada con todos

los b-lactámicos, incluidas penicilinas, cefalosporinas, carbapenémicos y monobactámicos.

● La cefoxitina es un marcador alternativo de la presencia de mecA, ya que es un inductor más

potente del sistema regulatorio de mecA en comparación con las penicilinas y, por ello, mejora
la expresión de dicho gen facilitando la detección de la resistencia.
Para facilitar la expresión y posterior detección de este mecanismo de resistencia, se recomienda
realizar el antibiograma convencional, pero empleando una placa de MH suplementada con un 4% de
NaCl. Esta recomendación se basa en que, en ocasiones, la expresión fenotípica de la resistencia no
tiene lugar bajo las condiciones estándar de cultivo utilizadas para realizar el antibiograma.

MATERIAL NECESARIO
● Tubos con solución salina (SS) estéril.
● Medio de cultivo: agar MH con un 4% de NaCl.
● Discos de antibióticos: oxacilina (1 mg) y cefoxitina (30 mg).

● Hisopos estériles.

● Pinzas metálicas.

● Vórtex.

● Estufa 37 °C.

● Nefelómetro o escala MacFarland.

● Protocolo experimental (v. tabla 11-1)

La técnica empleada es el método de difusión con discos. La preparación del inóculo, las placas y los
discos se explica en el anexo de técnicas básicas (v. anexo 2; técnica 12).
Se recomienda el empleo de cepas control: S. aureus ATCC 29213 oxacilinaS y S. aureus ATCC 4330
oxacilinaR.
 CAPÍTULO 11
Resistencia antibiótica

Día 1
● Preparación del inóculo. A partir de una placa de cultivo de 18-24 h, tomar una colonia

con un asa y ajustar el inóculo a una turbidez equivalente al estándar 0,5 de la escala

de MacFarland en SS. Homogeneizar en vórtex durante 15-20 s.
● Inoculación de las placas. Mueller-Hinton en césped (en tres direcciones), sin dejar ninguna zona

libre. Dejar secar durante 3-5 min antes de depositar los discos.

● Dispensación de los discos de cefoxitina y oxacilina con pinzas estériles. Es necesario

asegurarse de que los discos contacten perfectamente con la superficie del agar,
por lo que se recomienda presionar ligeramente sobre ella (fig. 11-6).
● Incubación a 35 °C en atmósfera aerobia durante 18-24 h.

Día 2
Lectura de los resultados.
Aquellas cepas de S. aureus resistentes a oxacilina (diámetro del halo de inhibición ≤10 mm) y a
cefoxitina (diámetro del halo de inhibición ≤21 mm) se consideran resistentes a meticilina (SARM)
(v. fig. 11-6).

103

FIGURA 11-6  Estudio de la susceptibilidad a cefoxitina y oxacilina para la detección de cepas de Staphylococcus
aureus resistentes a meticilina (SARM). El medio empleado está suplementado con un 4% de NaCl. Se muestra un
ejemplo de cepa resistente a meticilina. A. No sensible a cefoxitina. B. No sensible a oxacilina. Un diámetro de halo menor
o igual a 21 mm se considera resistente. FOX, cefoxitina; OXA, oxacilina.
© Elsevier. Fotocopiar sin autorización es un delito.

Etimologías
Antibiótico: del gr. antí-, «frente a», «contra», y
bio-, «vida».
-cida: del lat, -cīda, «que mata».
Penicilina: del lat. pēnicill(um), «forma estre-
cha y alargada», «pincel», y -īn(a), «sustancia»;
referente al antibiótico producido por el hongo
Penicillium.
-statico: del gr, sta-t(o)-, «en equilibrio», «dete-
nido».