UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

DECANATO

PROYECTO DE TESIS

TITULO:

Bacterias endófitas diazotróficas en oriza sativa L. ´´arroz ´´, Lambayeque, 2014.

AUTORES:

Est. Esther Magaly De la Cruz Lucero

Est. Anna Derly Mestanza Espinal

PATROCINADORA:

Dra. Blga. Carmen Rosa Carreño Farfán

APROBADO POR:

PRESIDENTE DEL JURADO MIEMBRO SECRETARIO

MIEMBRO VOCAL JEFE CENTRO DE INVESTIGACIÓN

JEFE DEPARTAMENTO DECANO

 UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

DECANATO

PROYECTO DE TESIS

I. GENERALIDADES:

1. Título del proyecto

Bacterias endófitas diazotróficas en oriza sativa L. ´´arroz ´´, Lambayeque, 2014.

2. Personal investigador

2.1.Autores
Est. Esther Magaly De la Cruz Lucero
Est. Anna Derly Mestanza Espinal

2.2.Patrocinadora
Dra. Blga. Carmen Rosa Carreño Farfán

3. Carrera Profesional/ Especialidad

Biología/ Microbiología y Parasitología

4. Tipo de investigación
4.1 De acuerdo al fin que persigue: Aplicada
4.2 De acuerdo a la técnica de contrastación : Experimental

5. Régimen de la investigación:
Libre

6. Localidad e institución donde se desarrollará el proyecto

Lambayeque, Laboratorio de Microbiología y Parasitología de la Facultad de Ciencias

Biológicas en la Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo, Estación Experimental Agraria
Vista Florida

7. Duración del proyecto

 7 meses.

8. Fechas probables de inicio y término

8.1 Inicio: Noviembre de 2013

8.2 Término: Mayo de 2014

9. Cronograma de actividades

2013 2014

Actividades Nov Dic Ene Feb Mar Abr May

FASE DE PLANEAMIENTO
Revisión bibliográfica X X X X X X X
Elaboración del proyecto X X
Presentación del proyecto X
Aprobación del proyecto
Implementación del proyecto X

FASE DE EJECUCIÓN
Recolección de muestras X X X
Procesamiento de muestras X X X

Registro de datos X X X X

Análisis de datos X X X

FASE DE COMUNICACIÓN
Análisis e interpretación X X X
Elaboración del informe X X X
Presentación del informe X
10. Recursos disponibles

10.1 Personal

El presente proyecto contará con el apoyo del personal técnico del laboratorio de
Microbiología y Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad
Nacional Pedro Ruiz Gallo y Estación Experimental Agraria Vista Florida.

10.2 Equipos e instrumentos


Autoclave vertical, rango T° 0-250°C, FANEN

Balanza analítica, rango 0.01-150g, EXCELL

Cámara digital 12.1 Mega Pixeles, SONY Cyber-shot.

Centrífuga GT-119-200, GREETMED

Cocina eléctrica, una hornilla, CHARITO

Computadora Intel ® CORE ™ i5-2400 CPU@3.10GHZ 3.10GHZ

Dispositivo de almacenamiento de información (USB) de 8Gb KINGSTON

Espectrofotómetro digital, 335-1000nm, GREETMED

Horno con temperatura máxima de 200°C, THELCO

Microscopio eléctrico binocular, modelo L200, CARL ZEISS

pH metro portátil, rango de pH 0.0 a 14.0, BIOCHEMICALS
INTRUMENTS S.R.L
10.3 Materiales y reactivos
 Material de vidrio: Placas de Petri, láminas portaobjetos, láminas
cubreobjetos, tubos de vidrio (13x100mm y 15x150mm), pipetas de 1 y
10mL, matraces de 250mL, vasos de precipitación, viales.
 Material de metal: Gradillas, ansas bacteriológicas, pinzas, bisturís, tijeras
 Material de plástico: Jeringas de 1 y 5mL, tubos para centrífuga
 Medios de cultivo: Medio Ashby Sacarosa, agar tripticasa soya, caldo
extracto de suelo 10 %; medio de cultivo LG, medio de cultivo LGD, medio
de cultivo BEIJERINCKIA, medio de cultivo BATATA, medio LGI, medio
JNFb, medio LGI-P, medio libre de nitrógeno con azul de bromotimol (Nfb)
semisólido, medio libre de nitrógeno con azul de bromotimol (Nfb) sólido.
 Reactivos y colorantes: Reactivos para tinción de Gram, solución salina
esterilizada (0,85%, NaCl, p/v).
10.4 Local

Laboratorio de Microbiología y Parasitología, sección Biotecnología Microbiana

de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo en
Lambayeque.

11. Presupuesto

Nº de Cantidad Producto Marca Presentación Precio

 partida S/.
2.3.15 Materiales y útiles 183,50
2.3.15.12 Papelería en general, útiles y 111,50
materiales de oficina
04 Lápices Mongol Unidad 8,00
04 Lapiceros Pilot Unidad 12,00
03 Marcadores Vikingo Unidad 7,50
02 Correctores Artesco Unidad 8,00
03 Cintas de embalaje Pelikan Unidad 3,00
1/2 Papel Kraft Ciento 14,00
02 Papel bond A4 Xerox Millar 40,00
02 Cuadernos Norma Unidad 6,00
04 Rollos de pabilo Unidad 10,00
02 Juegos de etiqueta Docena 3,00
2.3.15.21 Material agropecuario 47,00
01 Palana Unidad 24,00
07 Bolsas de Ciento 15,00
polietileno
02 Regadera Unidad 6,00
04 Sacos Unidad 2,00
2.3.15.31 Material de limpieza 25,00
Escobillas, detergente, lejía 25,00
2.3.17.11 Enseres 20,00
Tinas, baldes 20,00
2.3.18 Suministros médicos 3653,00
2.3.18.21 Material de laboratorio 3653,00
01 Agar agar Merck kg 750,00
01 Agar nutritivo Merck kg 500,00
01 Agar tripticasa soya Merck kg 500,00
01 Medio Nfb Merck kg 500,00
01 Caldo tripticasa Merck kg 250,00
01 Peptona Merck kg 250,00
02 Solución salina Litro 20,00
100 Placas de Petri Pyrex Unidad 450,00
20 Frascos de vidrio Unidad 40,00
60 Tubos de dilución Pyrex Unidad 150,00
400 Tubos de bioquímica Pyrex Unidad 160,00
04 Pipetas de 1 y 10 mL Pyrex Unidad 35,00
04 Asas bacteriológicas Unidad 8,00
04 Láminas portaobjetos Caja 16,00
04 Láminas cubreobjetos Caja 12,00
01 Algodón 500 g 12,00
2.3.21 Viajes 1000,00
2.3.21.21 Pasajes y gastos de 800,00
transporte
2.3.21.22 Viáticos y asignaciones 200,00
2.3.22 Servicios básicos, 600,00
comunicaciones,
publicidad y difusión
2.3.22.23 Internet 100,00
2.3.22.44 Servicio de impresiones, 500,00
encuadernación y
empastado
Equipamiento y bienes 640,00
duraderos
01 Cámara digital Sony Unidad 600,00
01 Dispositivo de Kingston Unidad 40,00
almacenamiento (USB)

Imprevistos 300,00
TOTAL 6396,50

12. Financiación

El presente proyecto será financiado por los responsables, con ayuda del laboratorio de
Microbiología y Parasitología de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad Nacional
Pedro Ruiz Gallo en Lambayeque.

II. PLAN DE INVESTIGACION

1. REALIDAD PROBLEMÁTICA

El cultivo de Oryza sativa L. ¨arroz¨ constituye un alimento básico en América Latina y el

Caribe. El cereal proporciona el 20% del suministro de energía alimenticia del mundo, en
tanto que a Triticum aestivum L. ¨trigo¨ le corresponde el 19% y a Zea mays L. ¨maíz¨ el
5% (FAO, 2004). En el Perú, como en otros países, el rendimiento está muy relacionado
con la aplicación de insumos químicos que constituyen el 44,6% de los costos de
producción, destacando con el 21,7% los fertilizantes químicos.(MINAG, 2012)

Los fertilizantes químicos reponen los nutrientes removidos del suelo, a través de la
cosecha de los cultivos, posibilitan el uso de variedades de alto rendimiento y contribuyen
significativamente a la productividad agrícola. El uso de estos insumos ha sido crítico para
el mejoramiento de suelos nutricionalmente pobres, contribuyendo con 30 – 50% al
incremento de los rendimientos (Pelletier et al., 2011).
La necesidad por fertilizantes químicos se incrementa día a día, proyectándose para el
2020 un requerimiento de 208 millones de toneladas, de los que 115,3 millones
corresponderán a la urea. Desafortunadamente, la producción de fertilizantes
nitrogenados es dependiente de la energía obtenida de combustibles de origen fósil.
Actualmente la reducción de la oferta de petróleo por el agotamiento de los yacimientos y
los mayores costos para la extracción, ha traído consigo el incremento de los precios de
los fertilizantes químicos (Aguado, 2012).

Además de la disminución de la rentabilidad, la aplicación excesiva de fertilizantes

químicos tiene efectos detrimentales en el ambiente. La eficiencia de recuperación o
porcentaje del nutriente aplicado que es absorbido por la planta, es en promedio 50% para
el nitrógeno (SAGARPA, 2010). Los fertilizantes nitrogenados se pierden por
volatilización, desnitrificación, lixiviación y erosión (Pedraza et al., 2010; Salhia, 2010).
Las emisiones liberadas hacia la atmósfera en las formas de amoníaco, óxidos nítrico y
nitroso causan la lluvia ácida y destruyen la capa de ozono. A su vez, los nitratos
lixiviados originan eutrofización de aguas superficiales y contaminan los mantos
freáticos, generando enfermedades en los seres vivos (Aguado et al., 2012).

La fijación biológica de nitrógeno es una alternativa para proveer de este elemento a

las plantas. Las bacterias diazotróficas o fijadoras de nitrógeno reducen el nitrógeno
molecular hasta amoníaco. Estas bacterias pueden ser rizosféricas y endófitas y forman
parte de las denominadas rizobacterias promotoras del crecimiento de las plantas (Plant
Growth Promoting Rhizobacteria, PGPR). Las PGPR benefician a los cultivos agrícolas a
través de mecanismos directos como la fijación de nitrógeno, síntesis de reguladores del
crecimiento, solubilización de minerales, producción de sideróforos y estimulación del
sistema de absorción de iones como los nitratos. También presentan mecanismos
indirectos o de biocontrol, mencionándose, la competencia por un nicho ecológico o por
nutrientes, la interacción directa con el patógeno (parasitismo y lisis enzimática),
antibiosis, producción de sideróforos e inducción de resistencia sistémica en las plantas
(Hernández et al., 2006; Martínez et al., 2010; Nihorimbere et al., 2011; Bhattacharyya
& Jha, 2012).

En Lambayeque no se han realizado investigaciones para aislar y caracterizar las

bacterias diazotróficas en los cultivos de arroz, requisito indispensable para trabajos
posteriores en invernadero y campo, con la perspectiva de obtener un inoculante
comercial.

1.1 Identificación del problema

Impacto negativo de los fertilizantes en el cultivo de arroz y desconocimiento de la
actividad benéfica de los microorganismos endófitos de los cultivos agrícolas.
1.2 Delimitación del problema

Bacterias endófitas diazotróficas y productoras de acido indol acético en oriza sativa

L. arroz. Lambayeque 2014.

2. PROBLEMA CIENTIFICO
 ¿Cuales son las Bacterias endófitas diazotróficas en Oriza sativa L. ´´arroz´´.
Lambayeque 2014.

3. HIPÓTESIS

Implícita

4. JUSTIFICACION E IMPORTANCIA

En el contexto de desarrollo sostenible, la biofertilización resurge como una práctica

factible y necesaria en los sistemas de producción agrícola del Perú. El encarecimiento de
los fertilizantes sintéticos y la preocupación de la sociedad por, consumir alimentos libres
de químicos, producidos con el menor impacto ambiental, justifica la investigación de
bacterias diazotróficas, estableciendo las ventajas y alcances, pero también las
limitaciones del empleo de microorganismos en la agricultura.

La investigación de bacterias promotoras del crecimiento como las diazotróficas

requiere en primer lugar el aislamiento y caracterización en el laboratorio, para luego
determinar el efecto en invernadero y campo y posteriormente investigar el incremento
masivo para la comercialización. El propósito es la obtención de un paquete tecnológico
que pueda ser aplicado en la región, dándole un valor agregado a los recursos propios,
incrementando la rentabilidad y disminuyendo al máximo los insumos contaminantes.

Investigaciones básicas como el presente estudio, así como aplicadas de científicos,

técnicos y personas ligadas a la actividad agrícola, podrán sustentar la conveniencia de
utilizar biofertilizantes como un medio para incrementar la productividad, mejorar la
rentabilidad de la agricultura, reducir el impacto de los agroquímicos en el ambiente y
disminuir los contaminantes en los alimentos consumidos diariamente.

En Lambayeque el arroz es un cultivo muy importante, habiéndose aprobado

30207,26 ha para la campaña 2013 – 2014 (MINAGRI, 2014). Los cultivos de arroz
serán favorecidos con la obtención de un inoculante constituido por bacterias
diazotróficas debidamente caracterizadas. Este biofertilizante incrementará el desarrollo
vegetativo y rendimiento como parte de la agricultura respetuosa con el ambiente.

5. OBJETIVOS

5.1 Aislar bacterias endófitas fijadoras de nitrógeno en los cultivos de arroz de la

Estación Experimental Agraria Vista Florida en Lambayeque.
5.2 Identificar el gen nifH en las bacterias fijadoras de nitrógeno.
5.3 Cuantificar el nitrógeno fijado por las bacterias endófitas.
5.4 Identificar fenotípicamente las bacterias fijadoras de nitrógeno.
5.5 Detectar y cuantificar el ácido indol acético producido por las bacterias endófitas
fijadoras de nitrógeno.
6. ANTECEDENTES

Las bacterias fijadoras de nitrógeno son las que reciben mayor atención en el
cultivo de arroz debido a la importancia del nutriente para el cultivo. Por tanto, se
estudió la composición de la comunidad de bacterias endófitas heterótrofos cultivables
de hojas y tallos de plantas de arroz en los dos meses previos a la cosecha. Los tejidos
previamente desinfectados se maceraron, se diluyeron y se realizaron recuentos en
placa por siembra en superficie en agar nutriente y agar R2A. El número de bacterias
endófitas detectadas en tallo fue diez veces superior el de hoja. El análisis fenotípico
de las bacterias aisladas se mostró que los perfiles de restricción del gen 16 s y rRNA
eran diferentes. A su vez, el análisis de doce colonias aisladas de hojas y 16 de tallo
permitió discriminar seis y siete perfiles de restricción diferentes, respectivamente. Se
concluyó que la comunidad de bacterias endófitas cultivables es muy compleja y se
distribuye heterogéneamente ante la hoja y tallo. (Fernández et. Al., 2003)

Microrganismos de los géneros Azospirillum, Herbaspirillum, Gluconacetobacter

y Burkholderia presentan potencial para la fijación biológica del nitrógeno, FBN y
producción de reguladores del crecimiento en diferentes cultivos agrícolas. En este
contexto, se cuantificaron y aislaron bacterias diazotróficas de nueve cultivares de
arroz irrigado del Estado del Río Grande del Sur. Utilizando los medios NFb
(Azospirillum brasilense/lipoferum), JNFb (Herbaspirillum), JMV (Burkholderia),
LGI (Azospirillum amazonense) y LGI-P (Gluconacetobacter), fueron obtenidos 58
aislados. De éstos, diez aislados obtenidos en el medio NFb (I-02, I-08, I-14, I-20, I-
26, I-31, I-36, I-42, I-48 e I-54) y A. brasilense y A. lipoferum fueron evaluados in
vitro. En la FBN, A. brasilense y A. lipoferum presentaron mayores valores (41,08 y
46,82µg N ml-1, respectivamente). Respecto a la producción de ácido indolacético, el
aislado I-31 fue el mayor productor (13,47µg ml-1). Se concluyó que bacterias
diazotróficas endofíticas aisladas de cultivares de la región tienen potencial como
inoculantes, para la aplicación de fertilizantes nitrogenados (Vicentini, 2006).

La necesidad apremiante de estrategias sostenibles para la agricultura requiere del

desarrollo de preparados microbianos que mejoren la nutrición de las plantas. Se
realizó una investigación para aislar bacterias fijadoras de nitrógeno y disolventes de
fosfatos de la rizósfera y semillas de Lactuca sativa L. “lechuga”. Con el suelo
rizosférico se realizaron diluciones y se sembraron alícuotas en medio extracto de
levadura – manitol – agar rojo congo (EL – MARC), obteniéndose nueve cultivos de
rizobios que fueron investigados en la prueba de nodulación en Phaseolus
vulgaris, tolerancia de NaCl, crecimiento en G´PA y producción de acidez o
alcalinidad en el medio extracto de levadura – manitol – agar azul de bromotimol. Se
obtuvieron tres grupos de rizobios: Rhizobium, Bradyrizobium y un tercer grupo no
definido. De los potenciales rizobios, cinco disolvieron hidroxiapatita. Por su parte, en
los macerados de las semillas se observaron bacterias endófitas caracterizadas por su
comportamiento microaerofílico y producción de ácido detectado por el viraje del
indicador en el medio NFb (Peña y Reyes, 2007).
 Las bacterias del genero Herbaspirillum spp. Endófitas fijan nitrógeno, produce
fitohormonas y promueven el crecimiento vegetal, por lo que se realizó una
investigación para caracterizar y seleccionar estas bacterias en el cultivo de arroz. Se
colectaron 20 plantas en estado vegetativo y al inicio de floración. Las hojas y tallo se
desinfectaron, se maceraron y posteriormente se realizaron diluciones seriados. A
continuación, se inocularon frascos en medios de cultivo jNfb semisólido. Se
incubaron a 35° c por 4- 7 días y se investigó la formación de una película bajo la
superficie. Después de los subcultivos en este mismo medio se aislaron las bacterias
en medio solido jNfb con extracto de levadura y en medio Batata. Se obtuvieron 113
aislados, de los que 11 se identificaron preliminarmente como Herbaspirillum spp. y
la cepa 4.2 incremento significativamente la biomasa aérea de planta de arroz en
invernadero. La secuencia del gen 16s ARNr confirmo esta bacteria como
Herbaspirillum spp. concluyéndose que tiene potencial como biofertilizante.
(Punschke y Mayans, 2011)

Con el objetivo se caracterizar las bacterias endófitas y rizosféricas de seighum

bicolor ´´sorgo.” Se tendrán muestras de raíces y suelos rizosféricos a las 7, 30 y 60
días del ciclo de cultivo. Para el aislamiento, las raíces se desinfectaron
superficialmente y luego se maceraron. A su vez, con el suelo rizosférico se realizaron
diluciones seriados. Las siembras se realizó en medio Nfb y agar nutritivo,
obteniéndose 7 aislados de rizósfera y 3 endófitas de raíz, mayoritariamente a los 7 y
30 días. Todas las bacterias presentaron una morfología variada, siendo el 80% Gram
negativas. Así mismo el 100% sintetizó ácido indol acético y el 50% solubilizó
fosfato como potenciales para estimular el crecimiento vegetal. (Diaz et. al;,2012)

Los inoculantes biológicos pueden ser utilizados como parte de una estrategia que
disminuya el impacto ambiental causado por los agroquímicos, por lo que se aislaron
bacterias endófitas diazotróficas de plantas de arroz cultivadas en diferentes suelos.
Las raíces y parte aérea se desinfectaron con hipoclorito de sodio 2% y se enjuagaron
con agua destilada. A continuación, las muestras se maceraron, se realizaron
diluciones decimales hasta 10-4 y se sembraron en medio base carente de nitrógeno. En
la prueba de reducción de acetileno 80 aislados demostraron positividad; no obstante,
solo en el 25% se amplificó el gen nif H. La diversidad de los aislados se analizó por
análisis de restricción del ADN ribosomal amplificado ARDRA y la identificación por
secuenciación del gen 16S rRNA, confirmándose Azospirillum lipoferum,
Herbaspirillum seropedicae, Enterobacter cloacae y Poenibacillus graminis que
podrían usarse en un futuro como inoculantes para la producción del crecimiento de
plantas de arroz (Mollo et al., 2012).

Las bacterias endófitas viven en el interior de las plantas, sin causar daño y su
presencia es relacionado con el aumento de la productividad de los cultivos agrícolas.
En este contexto, se estudió la composición de comunidades de bacterias endófitas
cultivables asociados a cuatro variedades de arroz. Se tomaron muestras de plantas en
 etapa de inflorescencia y las bacterias se aislaron en raíz, tallo, hojas y fascículos
previamente desinfectados macerados en nitrógeno fijado. Se obtuvieron 89 aislados
de bacterias endófitas, cuya abundancia estuvo relacionada con el tejido y la variedad
de arroz. La mayor densidad comprendió a la variedad F733( 1.77X 1010 UFC g-1 de
tejido) y el tejido de raíz ( 3.2 x 1010 UFC g-1 de tejido). La información obtenida de
las comunidades bacterianas permitirá investigar su funcionalidad en el cultivo de
arroz. (Pérez et. al., 2013)

Con el objetivo de mejorar la competividad del arroz, se propone la utilización de

biofertilizantes, por lo que se realizó una investigación para caracterizar las bacterias
endófitas productoras de sideróforos. Con este propósito se tomaron muestras de
raíces y hojas de plantas de arroz en macollaje, inundación, embarrugada y llenado de
grano, asi como granos luego de la cosecha, determinando que el número de
heterótrofos totales fue significativamente mayor (P<0,05) en suelo respecto a raíces,
hojas y granos. A su vez, los productores de sideróforos, predominaron en las raíces.
Con el análisis de restricción del gen 16s rDNA (ARDRA) ase obtuvieron 64 perfiles
diferentes. Los mayoritarios se identificaron como Pantoea, Burkholderia,
Pseudomonas, Enterobacter, Chromobacter y Sphingomona. Después se investigaron
27 sepas, determinando que el 100 % sintetizo ácido indol acético, pero solo
tres(Pseudomonas sp. Burkholderia cepacia , , Enterobacter sp.) demostraron
actividad de la enzima nitrogenasa en la prueba de reducción del acetileno. ( Loaces, )

7. MATERIALES Y METODOS
7.1 Materiales

7.1.1 Material biológico

Muestras de raíz, y tallo, hoja de Oryza sativa L. “arroz” obtenidas de
campos agrícolas de la Estación Experimental Agraria Vista Florida, Lambayeque.

7.2 Métodos

7.2.1 Población y muestra de estudio

La población estará constituida por las raíces, tallos, hojas de arroz en la Estación
Experimental Agraria Vista Florida, donde se encuentran las bacterias endófitas fijadoras
de nitrógeno y se trabajaran con 54 muestras, colectadas durante enero a marzo de 2014.
El número de muestras fue calculado según la formula mencionada por Alvitres (2000),
tomando en cuenta una prevalencia de 90% (Anexo 1) determinada por los autores en una
investigación piloto.

7.2.2 Variables en estudio

Las variables cualitativas serán las bacterias fijadoras de nitrógeno aisladas de las
raíces, tallos, hojas de arroz.
 7.2.3 Tipo de estudio y diseño de la contratación de hipótesis

El trabajo de investigación será descriptiva y transeccional (Hernández et al., 2003)

y para contrastar la hipótesis se utilizará el diseño de una sola casilla (Alvitres, 2000),
según el cual se aislarán e identificarán bacterias endófitas diazotróficas de arroz y se
investigará la producción de nitrógeno fijado y ácido indolacético producido.

7.2.4. Lugar de muestreo

Para aislar bacterias endófitas diazotróficas se tomarán muestras raíces, tallos, hojas de
arroz, establecidos en campos agrícolas de la Estación Experimental Agraria Vista Florida,
distrito Picsi, provincia Chiclayo, Región Lambayeque (Figura 1), geográficamente ubicado a
6° 44’ de Latitud Sur, 79° 45’ de Longitud Oeste, altura de 30 msnm, precipitación 40 mm y
temperatura 18 - 32°C (MINAGRI, 2014).

Figura 1. Ubicación del lugar de muestreo correspondiente a la Estación Experimental Vista

Florida, Lambayeque 2014 (http://www.inia.gob.pe/).
7.2.5 Obtención de muestras de raíz
En campos cultivados con arroz en distintas etapas del ciclo vegetativo se
seleccionarán aleatoriamente dos “golpes”, cada uno con un promedio de seis a siete
plantas y se depositarán en bolsas de polietileno, debidamente identificadas.
Inmediatamente después, serán transportadas en una caja térmica para su
procesamiento, manteniendo una temperatura de 10± 1°C.

7.2.6 Aislamiento de bacterias fijadoras de nitrógeno

Las bacterias fijadoras de nitrógeno se aislarán de las raíces, tallos y hojas de
arroz. Las muestras de cada “golpe” serán depositadas en bandejas de polietileno.

a. Raíces
Se tomarán las raíces de las plantas de arroz y se lavarán generosamente con
agua potable hasta eliminar el suelo remanente. A continuación, se cortarán secciones
de raíces de aproximadamente 2 cm de longitud (desde el extremo final hacia arriba),
se depositarán en un vaso de precipitación y desinfectarán superficialmente con
hipoclorito de sodio (NaClO) al 2 % durante 5 minutos y luego se enjuagarán dos
veces consecutivas con agua destilada esterilizada. Después, se depositarán las raíces
en una mayólica desinfectada con alcohol y se cortarán en fragmentos de un tamaño
aproximado de 2 cm de longitud y se enjuagarán con agua destilada esterilizada.

Las raíces previamente desinfectadas se depositarán 0,5 – 1cm por debajo de la

superficie del medio semisólido libre de nitrógeno con azul de bromotimol como
indicador, a razón de un fragmento por tubo y se incubarán a 30± 2°C hasta por 7 días.
A continuación, se seleccionarán los tubos donde se observe una película blanquecina
bajo la superficie y el viraje del indicador y se realizará un subcultivo en el mismo
medio.

Después de la incubación se tomará una alícuota de la película bacteriana, con la

que se obtendrá una suspensión en solución salina esterilizada (0,85% NaCl, p/v) y se
sembrara por agotamiento y estría en medio NFb solido complementado con extracto
de levadura. Las colonias representativas serán sembradas nuevamente en medio
semisólido NFb y posteriormente se realizará el aislamiento en los medios de cultivo
solidos utilizados para suelo rizosférico.

b. Tallo
c. Hojas

7.2.7 Identificación del gen nifH.

Con las bacterias fijadoras de nitrógeno se identificará el gen nifH. Según
Mollo et al., (2012). Se extraerá el DNA, se amplificará por PCR y se realizará el
secuenciamiento respectivo. Para la extracción del DNA por lisis alcalina, en una
colonia obtenida de 24 horas, se le agregará 100 ul de NaOH 0,05M, se incubará
durante 15 minutos a 90°C, se centrifugará por 2 minutos a 15000 rpm, se descartará
el pellet y se utilizará el sobrenadante para la amplificación. Para aquellas cepas en las
que no se pude amplificar a partir del sobrenadante, se realizará la extracción de DNA
utilizando el kit Wizard Genomic DNA Purification. Se centrifugará 1mL de cultivo
fresco por 15 minutos a 15000rpm y se extraerá DNA; el producto se resuspenderá en
50uL de agua miliQ.

Para la amplificación del gen nifH mediante PCR se prepara una mezcla
conteniendo: buffer para la Taq polimerasa 1x, MgCl2 2,5 Mm; BSA 0,2 mg/ml,
dNTPs 0,2 mM cada uno, primers PolF (5´TGCGAYCCSAARGCBGACTC- 3´) y
PolR (5´-ATSGCCATCATYTCRCCGGA- 3´) (Poly et al., 2001) 0,1 uM cada uno,
Taq DNA polimerasa 0,05 u.uL-1 y agua miliQ para completar 25 uL-1. Se amplificará
1 uL-1 de sobrenadante de lisis alcalina o de solución de ADN.

Para realizar la PCR se utilizará el siguiente programa de temperaturas:

desnaturalización inicial a 94°C durante 5 minutos, seguido de 30 ciclos que
comprenden desnaturalización (94°C durante 1 minuto), hibridación (57°C durante 1
minuto) y extensión (72°C durante 1 minuto); una etapa de extensión final de 72°C
durante 10 minutos y una etapa final de 4°C durante 15 minutos.

7.2.8 Cuantificación de nitrógeno fijado in vitro

Para la cuantificación del nitrógeno fijado in vitro por las bacterias nativas, se
utilizará el método colorimétrico del fenolhipoclorito descrito por Lara et al. (2007) y
Cadena & Martínez (2011). Cada bacteria cultivada en agar nutritivo por 24 horas,
será inoculada en tubos de 15 x 150mL conteniendo 3mL de caldo extracto de suelo
10 % (Anexo 3) y se incubarán a 30°C, por 72 horas, en agitación constante (150rpm).
A continuación, se agregarán 9 mL de KCl 2M, se agitarán a 150rpm durante 1 hora y
se dejarán en reposo por 1 hora adicional, para después tomar 10 mL del sobrenadante
y centrifugarlos (2000 rpm) durante 3 minutos. Luego, los sobrenadantes se verterán
en tubos de dilución y se añadirán 0,4 mL de solución alcohólica de fenol al 10%; 0,4
mL de nitroprusiato de sodio al 0,5% y 1mL de solución oxidante. Los tubos se
agitarán para mezclar y se dejarán en reposo durante 1 hora adicional. La positividad a
la fijación de nitrógeno estará dada por una coloración azul y se leerá la absorbancia
en espectrofotómetro de luz visible a 632,9nm. Las concentraciones se calcularán en
una recta patrón obtenida con diluciones sucesivas de una solución de 100ppm de
cloruro de amonio.

7.2.9 Identificación fenotípica de bacterias endófitas fijadoras de nitrógeno

Para la identificación del género de las bacterias diazotróficas, según Brenner
et al., (2001), Schoebitz, (2006) y Garrido, (2007), se realizarán las pruebas de
catalasa, motilidad, reducción de nitratos, utilización de sacarosa, glucosa, maltosa,
rannosa, glicerol y sorbitol, hidrolisis de la gelatina y descarboxilación de la lisina.

7.2.10 Cuantificación de ácido indolacético (AIA) producido in vitro

 Para la cuantificación de ácido indolacético producido in vitro según la reacción
colorimétrica de Salkowski descrita por Mantilla (2007) y García & Muñoz (2010)
cada bacteria nativa cultivada en agar nutritivo por 24 horas será inoculada en 5mL
de caldo tripticasa soya suplementado con triptófano (Anexo 4). Después de la
incubación a 30°C, por 72 horas en agitación constante (150rpm), los cultivos serán
centrifugados a 2000rpm durante 5 minutos. A continuación, 0,4mL de cada uno de
los sobrenadantes se depositarán en tubos, se agregarán 1,6mL de reactivo de
Salkowski modificado (Anexo 4) en una relación 1:4, se mezclarán y se dejarán en
reposo durante 30 minutos en oscuridad. La positividad a la producción de ácido
indolacético estará dada por una coloración grosella y se leerá la absorbancia en
espectrofotómetro de luz visible a 530nm. Las concentraciones se calcularán en una
recta patrón que se obtendrá con diluciones sucesivas de una solución 100ppm de
ácido indolacético.

7.2.11 Análisis de los datos

Los datos obtenidos serán ordenados en tablas y figuras que permitan
caracterizar las bacterias endófitas fijadoras de nitrógeno de arroz en Lambayeque. En
el presente trabajo se utilizaran los programas Microsoft Office Word y Excel versión
2010.

8 REFERENCIAS BIBIOGRAFICAS

Garrido, R. (2007). Aislamiento e identificación de bacterias diazotróficas rizosféricas y

endófitas asociadas a suelos y pastos del valle y sabana del cesar en dos épocas
climáticas. Tesis de Maestría. Universidad Militar Nueva Granada Bogotá, D. C.

Ministerio de Agricultura, MINAG. (2012). Estadística Agraria Mensual. Sistema

Integrado de Estadística Agraria, SIEA, Perú: Dirección de Información Agraria.

Mollo, G., Ferrando, L., Fernández, S. (2012). Aislamiento de bacterias endófitas

fijadoras de nitrógeno en plantas de arroz cultivadas en diferentes suelos.

SARGARPA, 2010.Uso de fertilizantes. Disponible en: http://www.sagarpa.gob.mx/

Vicentini, K. (2006). Fijación de nitrógeno por bacterias diazotroficas en cultivos de

arroz irrigado. Tesis Doctoral. Universidad Federal de Santa María, Santa María, RS,
Brasil.
 9. FECHA DE PRESENTACIÓN

Enero de 2014

…………………………………………………
Dra. Carmen Rosa Carreño Farfán

……………………………… ..…….…………………………
Esther Magaly De La Cruz Lucero Anna Derly Mestanza Espinal
Responsable Responsable
 ANEXO 1

Cálculo del número de muestras para el aislamiento de bacterias fijadoras de nitrógeno

Se tomó una prevalencia del 90% y se realizó el cálculo según la fórmula expuesta por
Alvitres (2000).

n= Z2 p.q
T2

n= (1,96)2 (0,90. 0,10)

(0,8)2

n = 54,02 muestras

Dónde:

n = Tamaño de la muestra

Z= 1,96 (α= 0.05) valor estándar

p = prevalencia o presencia de bacterias tolerantes al arsénico (0,90).

q = 1-p, ausencia (0,10).

T= error estimado (0,08).

 ANEXO 2

Medios de cultivo para el aislamiento, identificación y mantenimiento de bacterias

fijadoras de nitrógeno

Medio Ashby

Componentes g/L
Sacarosa (Manitol o Benzoato ) 5,0
K2HPO4 1,0
FeSO4.7H2O 0,005
MgSO4.7H2O 0,2
NaCl 0,2
CaCl2.7H2O 0,2
Agar 15

pH 7,0(+/- 0,2). Adicionar el indicador azul de bromotimol al 0,5% en medio líquido.

Medio de cultivo LG (Azotobacter spp. y Azomonas spp.)

El medio LG fue elaborado por Lipman (1904) y su composición por es la siguiente:

Componentes g/L
K2HPO4 0,05
MgSO4.7H2O 0,20
CaCl2 0,02
Cl3Fe(0,1% en solución ) 0,01
Na2MoO4.2H2O 0,20
KH2PO4 0,15
CaCO3 1,00
Sacarosa 20,0
Azul de bromotimol (0,5% en etanol) 5,00mL
Agua destilada en cantidad suficiente 1000mL

Ajustar el pH a 7,0 con NaOH y adicionar 15g de agar.

Medio de cultivo LGD (Derxia spp.)

El medio LGD o medio LG (Lipman, 1094) fue modificado por Campêlo &
Döbereiner (1970) y su composición es la siguiente:

Componentes g/L
K2HPO4 0,05
MgSO4.7H2O 0,20
CaCl2 0,01
Cl3Fe(0,1% en solución ) 0,01
Na2MoO4.2H2O 0,002
KH2PO4 0,15
NaHCO3 1,00
Glucosa 20,0
Azul de bromotimol (0,5% en etanol) 5,00mL
Agua destilada en cantidad suficiente 1000mL

Ajustar el pH a 7,0 con NaOH y adicionar 15g de agar.

Medio de Cultivo BATATA (Purificación de Azzopirillum spp y Herbaspirillum

spp)

Componentes g/L
Batata 200,0
Ácido málico 2,5
Azúcar 2,5
Solución de micronutrientes 2mL
Solución vitaminas 1mL

Pesar 200g de batat inglesa, pelar y hervor durante 30 minutos. Enseguida filtrar con
algodón. Mezclar las cantidades de ácido málico y azúcar en 50mL de agua destilada y
ajustando el ph entre 6.5 y 7.0. Posteriormente mezclar las soluciones y completar el
volumen a 1000mL con agua destilada.

Medio de cultivo LGI (Azospirillum amazonense)

El medio de cultivo LGI, desarrollado a partir del medio LG (Lipman, 1904). La I
hace referencia al investigador J. Ivo Baldani, este medio promueve el aislamiento de
Azospirillum amazonense.

Componentes g/L
K2HPO4 0,2
MgSO4.2H2O 0,2
CaCl2.2H2O 0,02
Na2MoO4.2H2O 0,002
KH2PO4 0,6
Azul de bromotimol (0,5% en etanol) 5mL
FeEDTA (Solución 1.64%) 4mL
Solución de vitaminas 1mL
Agua destilada en cantidad suficiente 1000mL
Ajustar el pH entre 6.0 y 6.2. Para el medio semisólido se debe adicionar 1.75g de
agar/l y para medio solido 15g de agar/l.

Medio de Cultivo JNFb (Herbaspirillum spp)

El medio JNFb fue desarrollado por la investigadora Johanna Döbereiner a partir del
medio NFb. La J hace referencia a la investigadora.

Componentes g/L
Acido málico 5.0
K2HPO4 0,6
MgSO4.7H2O 0,2
NaCl 0.1
CaCl2.2H2O 0,02
Solución de micronutrientes 2mL
KH2PO4 1,8
Azul de bromotimol (0,5% en etanol) 2mL
FeEDTA (Solución 1.64%) 4mL
Solución de vitaminas 1mL
KOH 4,5
Agua destilada en cantidad suficiente 1000mL
Ajustar el pH a 5.8. Para medio semisólido agregar 1.8g de agar/l y para medio solido
18g de agar/l.
Medio de cultivo LGI-P (Gluconacetobacter diazotrophicus)

Este medio fue desarrollado a partor del medio de cultivo LGI (Baldani, 1984); en
donde la P hace referencia a Pernambuco, lugar de aislamiento de la primera cepa de
Acetobacter diazotrophicus.

Componentes g/L
Azúcar cristal 100
K2HPO4 0,2
MgSO4.7H2O 0,2
CaCl2.2H2O 0,02
KH2PO4 0,6
Na2MoO4.2H2O 0,002
Azul de bromotimol (0,5% en etanol) 5mL
FeEDTA (Solución 1.64%) 1mL
FeCl3. 6H2O 0,01
Agua destilada en cantidad suficiente 1000mL

Ajustar el pH a 5.5. Para medios semisolidos se debe agregar 1.8g de agar/l y para
medio solido 17g de agar/l.

Medio mineral sin nitrógeno

Componentes g/L
K2HPO4 0,655
MgSO4.7H2O 0,2
NaCl 0,02
CaCl2.2H2O 0,01
Cl3Fe(0,1% en solución ) 3,4mL
Na2MoO4.2H2O 0,108
K2HPO4 0,15
Manitol 10,0
Sacarosa 10,0
Agar 15,0
Purpura de bromocresol 0,04
Agua destilada en cantidad suficiente 1000mL
pH 7,0 (+/- 0,2).
Agar nutritivo (AN)

Componentes g/L
Peptona 5,0
Extracto de carne 3,0
Agar agar 15,0
Agua destilada en cantidad suficiente 1000mL

Caldo extracto de suelo al 10%

Componentes g/L
K2HPO4 0,4
MgCl2 0,1
MgSO4.7H2O 0,05
FeCl3 0,01
CaCl2 0,1
Triptona 1,0
Extracto de levadura 1,0
Extracto de suelo al 10% 250mL
Agua destilada en cantidad suficiente 750mL

Ajustar a pH 7,4. Para obtener extracto de suelo al 10%, depositar en un matraz 250
g de suelo agrícola y 500mL de agua destilada. Hervir 2 horas, completar a 500mL
con agua destilada y filtrar el sobrenadante. Tomar 25mL de filtrado y completar
500mL con agua destilada.
 ANEXO 3

Cuantificación de nitrógeno fijado in vitro mediante el método indirecto de valoración

del ión amonio empleando la técnica colorimétrica de Berthelot (fenol – hipoclorito)

a. Medios de cultivo (en García  Muñoz, 2010)

a.1 Medio libre de nitrógeno con azul de bromotimol, Nfb

Componentes g/L
Ácido málico 5,0
KOH 4,0
K2HPO4 0,5
FeSO4.7H2O Trazas
MnSO4.7H2O 0,01
MgSO4.7H2O 0,01
NaCl 0,02
CaCl2 0,01
Na2MoO4 0,002
Azul de Bromotimol (0,5 % m/v en etanol) 2,0mL
Biotinol 0,5mL
Agua destilada en cantidad suficiente 1000mL

Ajustar el pH a 6,8-7,0 con NaOH. Para obtener medio semisólido añadir 2 g de agar agar.
Para medio sólido añadir 20 mg de extracto de levadura y 15 g de agar.

a.2 Caldo extracto de suelo al 10 %

Componentes g/L
K2HPO4 0,4
MgCl2 0,1
MgSO4.7H2O 0,05
FeCl3 0,01
CaCl2 0,1
Triptona 1,0
Extracto de levadura 1,0
Extracto de suelo al 10 % 250mL
Agua destilada 750mL
Ajustar a
pH 7,3. Para obtener extracto de suelo al 10 %, depositar en un matraz 250 g de suelo
agrícola y 500 mL de agua destilada. Hervir 2 horas, completar a 500 mL con agua
destilada y filtrar el sobrenadante. Tomar 25mL del filtrado y completar a 500 mL con
agua destilada.
Reactivos

• Cloruro de potasio 2 M
Cloruro de potasio 149,12 g
Agua destilada 1000mL

• Solución alcohólica de fenol 10%

Fenol concentrado 10mL
Alcohol 97º 90mL

• Nitroprusiato de sodio 0,5%

Nitroprusiato de sodio 0,5 g
Agua destilada 100mL

• Solución oxidante
Citrato de sodio 20 g
Hidróxido de sodio 1g
Hipoclorito de sodio 5% lejía comercial 2mL
Agua destilada 100mL

b. Procedimiento para elaborar la curva de calibración para cuantificar el ión

amonio (en Lara et al., 2007)

c.1 Fundamento del método colorimétrico de Berthelot (fenolhipoclorito)

Se basa en la formación de un color azul intenso de indofenol, que resulta de la
reacción del ión amonio (NH4) con los compuestos fenólicos en presencia de un agente
oxidante el cual puede ser hipoclorito de sodio u o-fenol; y la presencia de un
catalizador, principalmente nitroprusiato de sodio o de potasio. El mecanismo de la
reacción depende de la luz presente, la temperatura ambiente, catalizadores y pH
alcalino. Cuando se utiliza fenol o sodio la reacción puede ser representada de la
siguiente manera:

NH3 + 2C6H60-+ 3ClO- O = C6H4= N-C6H4-O + 2H2O + OH- + 3Cl-

c.2 Preparación de diluciones a partir de una solución madre de NH 4Cl

Para obtener la curva patrón se prepara una solución madre de 100 ppm de NH 4CI,
para lo cual se pesa 0,1 g de NH4CI y se disuelve en 1 L de agua bidestilada.
Posteriormente, a partir de la solución madre se efectúan las siguientes diluciones:
 NH4Cl
Solución patrón H2 O bidestilada (Ug/mL = ppm)
N° de tubo
[mL] [mL] NH4Cl
[µg /mL= ppm]
1 0,0 10,0 0
2 0,2 9,8 2
3 0,4 9,6 4
4 0,6 9,4 6
5 0,8 9,2 8
6 1,0 9,0 10
7 1,5 8,5 15
8 2,0 8,0 20

c.3 Procedimiento para la cuantificación de amonio por colorimetría

Obtenidas las diluciones, agregar a cada tubo 0,4mL de solución alcohólica de fenol
al 10%; 0,4mL de nitroprusiato de sodio al 0,5% y 1mL de solución oxidante, luego
agitar para mezclar y dejar en reposo durante 1 hora. Observar una coloración que varía
del verde azul al azul intenso en función de la concentración de amonio. Leer la
absorbancia de cada dilución en el espectrofotómetro a 632,9nm.
Una vez obtenida la absorbancia de todas las concentraciones de amonio, corregir los
valores y mediante regresión lineal con el programa Microsoft Excel 2007, obtener la
ecuación de la recta y el coeficiente de correlación lineal (R 2) que deberá ser mayor a 0,9
para demostrar una dispersión homogénea de los valores sobre la recta.
 ANEXO 4

Cuantificación de ácido indolacético producido in vitro mediante la reacción

colorimétrica de Salkowski

a. Caldo tripticasa soya (g/L) suplementado con triptófano (en García y Muñoz,
2009)

Componentes g/L
Peptona de caseína 17,0
Peptona de harina de soya 3,0
D (+) Glucosa (o dextrosa) 2,5
Cloruro de sodio 5,0
Fosfato dipotásico 2,5
Triptófano 0,01
Agua destilada en cantidad suficiente 1L

b. Reactivo para la detección y cuantificación de ácido indolacético producido in

vitro (en Mantilla, 2007)

Componentes mL/L
Agua destilada 250,0
Ácido sulfúrico concentrado 150,0
Cloruro de fierro 0,5 M en agua destilada 7,5

La solución de cloruro de fierro 0,5M se obtiene al mezclar 1,61 g de cloruro de fierro

(FeCl3) con 20 mL de agua destilada.

c. Procedimiento para elaborar la curva de calibración para cuantificar ácido

indolacético, AIA (en Mantilla, 2007)

c.1. Fundamento de la reacción de Salkowski

Mediante la reacción de Salkowski se detectan grupos indol presentes en el
medio de cultivo y la concentración de indol es directamente proporcional a la
intensidad de color rojo producido. A su vez, el cambio de color es el resultado de
una reacción oxidativa con el ácido sulfúrico, donde por medio de una
transaminación un grupo amino es sustituido por el cloro proveniente del FeCl 3,
originando un compuesto visible de color rosado a rojo en el caso del indolacético.
Otras coloraciones indican la presencia de productos intermedios de la síntesis del
ácido indolacético, que pueden ser generados a partir del triptófano.
c.2. Preparación de diluciones a partir de una solución madre de AlA
Para obtener una curva patrón de ácido indolacético, preparar una solución madre
de 100 µg. mL-l, para lo cual se pesan 10mg de ácido indolacético y se disuelven con
unas gotas de NaOH en un matraz aforado a 100mL. A continuación, enrasar con
agua bidestilada y agitar hasta homogenizar. Posteriormente se realizan las siguientes
diluciones:

N° de tubo Solución patrón H2O bidestilada Concentración

(100 µgmL-1) [µL] A IA (m g L - 1)
[µL]*
01 0 1000 0
02 20 980 2
03 40 960 4
04 60 940 6
05 80 920 8
06 100 900 10
07 150 850 15
08 200 800 20
09 300 700 30
10 400 600 40
11 500 500 50
12 600 400 60

*1000 µL = 1mL

c.3. Procedimiento para la cuantificación de AIA por colorimetría

Obtenidas las concentraciones parciales de AIA extraer de cada tubo 0,4mL de
solución, verter en tubos de 13 x 75 mm y agregar 1,6mL de reactivo de Salkowski
(1:4). Dejar en reposo en oscuridad por 30 minutos. Observar la presencia de una
coloración rojiza en los tubos. A continuación, leer la absorbancia de cada dilución en
espectrofotómetro a 530nm.
Una vez obtenida la absorbancia en todas las concentraciones de ácido indolacético,
corregir los valores y mediante regresión lineal en el programa Microsoft Excel 2007,
obtener la ecuación de la recta y el coeficiente de correlación lineal (R 2) que deberá
ser mayor a 0,9 para demostrar una dispersión homogénea de los valores sobre la
recta.