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ACTUALIZACIÓN Revista de la Facultad de Medicina

Universidad Nacional de Colombia


1999 - Vol. 47 N°2 Págs. (89 - 97)

Las pruebas serológicas en el diagnóstico de la enfermedad infecciosa

Miguel A. Guzmán U_rreg~,MD_.Profesor Asociado. Departamento de Microbiología. Maye Bernal Rivera Be. Profesora Asistente.
Departamento de Microbiologia, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Colombia.

Las pruebas serológicas basadas en la PRUEBAS DIRECTAS PRUEBAS DE PRECIPITACIÓN


reacción antígeno anticuerpo constitu-
yen una valiosa herramienta en el diag- Las pruebas de precipitación, cuya di-
Son aquellas que basadas en el princi-
námica fue estudiada por Heildelberger
nóstico y manejo de la enfermedad in- pio de la reacción antígeno anticuerpo
hacia 1.930 (5), constituyen una de las
fecciosa. Su introducción como ayudas investigan la presencia del antígeno. En
diagnósticas se inició a finales del siglo pruebas secundarias más versátiles. La
el caso de la enfermedad infecciosa equi-
pasado y tuvo uno de sus momentos es- característica fundamental de ésta, es que
vale a decir que investigan la presencia
el antígeno está siempre en dilución en
telares hacia 1905 cuando August Von del agente etiológico o, uno de sus com-
una solución tampón la cual generalmen-
Wassermann O), adaptó la fijación de ponentes.
complemento desarrollada por Jules te es solución salina. Heildelberger (5)
Bordet (2,3) al diagnóstico de la sífilis encontró que el fundamento visible de
PRUEBAS INDIRECTAS
(4), convirtiéndola en un procedimiento la reacción antígeno-anticuerpo ocurre
clásico que hasta hace pocos años cons- en las reacciones de precipitación sola-
Son aquellas que basadas en la reacción
tituía el pilar fundamental de laborato- mente cuando los dos componentes es-
antígeno anticuerpo, investigan no ya, el
rio para el diagnóstico de esta enferme- agente en sí, sino la huella que dejó éste tán en proporciones óptimas y que este
dad, fue la famosa reacción de fenómeno puede evidenciarse claramen-
al pasar por su huésped en términos de
Wassermann. De entonces a nuestros te en la llamada curva de precipitación;
una respuesta inmune puesta en eviden-
días las pruebas serológicas han reco- cia por el hallazgo de anticuerpos espe- cuando se coloca una serie de capilares
rrido un largo camino buscando la pre- con concentraciones descendentes de
cíficos contra el agente o alguno de sus
cisión del diagnóstico de la enfermedad componentes y que, indirectamente per- anticuerpos dirigidos contra una concen-
infecciosa. Cientos de investigaciones mite suponer que el agente en cuestión tración constante del antígeno homólo-
han contribuido al desarrollo y perfec- estuvo presente en el huésped en algún go en dilución, se produce, luego de un
cionamiento de estos procedimientos momento. período de incubación, el fenómeno vi-
procurando siempre conseguir que ten- sible y se puede determinar la presencia
gan una gran sensibilidad y una gran es- Las pruebas serológicas de acuerdo con de tres zonas claramente diferenciables:
pecificidad, cualidades muy difíciles de el procedimiento que utilicen para evi- en los tubos iniciales en donde la con-
alcanzar. En los últimos años, se preten- denciar la reacción antígeno anticuerpo centración de anticuerpos predomina
de además, que los procedimientos sean se dividen también en dos grandes gru- sobre la concentración de antígeno no
simples de realizar y que el resultado se pos: primarias y secundarias. se observa ningún fenómeno visible, a
produzca rápidamente; la medicina con- medida que la dilución de los anticuerpos
temporánea parece estar llegando a esta PRUEBAS SECUNDARIAS progresa se llega a una zona en que la
deseada meta. concentración de anticuerpo y antígeno
Son aquellas en las cuales la reacción es óptima produciéndose una precipita-
CLASES DE PRUEBAS ción franca, cuando la concentración de
SEROLÓGICAS antígeno-anticuerpo da lugar a una ma-
nifestación visible lo cual- permite una anticuerpos continúa disminuyendo pre-
Desde el punto de vista de aquello que lectura visual macroscópica. Su realiza- domina, entonces, la concentración de
investigan, se dividen en dos grandes ción usualmente es simple. Este tipo de antígeno y en esta zona tampoco hay nin-
categorías, pruebas directas y pruebas pruebas incluyen la precipitación y la gún fenómeno visible. La primera zona
indirectas. aglutinación. recibe el nombre de prozona, la segunda

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en donde el fenómeno es visible se de- mas apareciera en forma de un precipi- se dispone en una cámara electrofo-
nomina zona de proporciones óptimas y tado lineal en el espacio entre el orificio rética, en la parte central se hacen orifi-
la tercera zona se llama postzona. La di- que contiene el antígeno y el orificio que cios en línea para colocar los controles
námica de las reacciones de precipita- contiene el antisuero, esta reacción co- de concentración conocida de la proteí-
ción es siempre la misma. En el pasado nocida como doble inmunodifusión de na en estudio y en los otros los sueros
la reacción de precipitación fue adapta- Óuchterlony ganó gran aceptación como humanos en los cuales se desea cuanti-
da como recurso diagnóstico utilizando herramienta de análisis inmunoquímico ficar la proteína, se somete a separación
sistemas de tubo capilar para observar y se adaptó para diagnóstico de algunas electroforética en forma que la proteína
el fenómeno, ejemplo de esa aplicación entidades clínicas, siendo particular-men- por su carga eléctrica relativa migra ha-
fue la determinación de la proteína C te útil en el diagnóstico serológico de algu- cia el ánodo o, hacia el cátodo y en esta
reactiva. La reacción de VDRL y sus mo- nas entidades micóticas sistémicas como migración ira reaccionando con su anti-
dificaciones son típicas reacciones de Histoplasmosis, Coccidioidomicosis y cuerpo homólogo dando una precipita-
precipitación (4). Paracoccidioido-micosis entre otras (7); ción en forma de cohete, al término del
otra de las grandes aplicaciones de la tiempo de corrido se mide la distancia
Una modificación al sistema de precipi- reacción de precipitación en agarosa lo entre el vértice del cohete y el centro del
tación en tubo consistió en colocar en- constituyó la elegante reacción desarro- orificio correspondiente, esta distancia
tre el suero que contenía los anticuerpos llada por Mancini, Carbonara y es directamente proporcional a la con-
y la dilución del antígeno una capa de Heremans (8) para cuantificación de pro- centración de la proteína en estudio.
agarosa fundida que al solidificarse for- teínas plasmáticas conocida como Aunque esta técnica es sumamente exac-
ma un tapón que separa los dos reactivos inmunodifusión radial, estos autores de- ta, es muy dispendiosa y requiere una
los cuales difunden a través de la agarosa mostraron que diluyendo un anticuerpo cámara de electroforesis; por tales razo-
en forma tal que al encontrarse en pro- homólogo en agarosa y colocándose en nes no tuvo mucha aceptación como re-
porciones óptimas forman un anillo de un orificio hecho en la agarosa una mez- curso diagnóstico.
precipitación claramente visible en la cla de antígenos en donde esté presente
agarosa, sin embargo, técnicamente este aquella proteína para la cual esta presente La combinación de electroforesis e
tipo de reacción era difícil y Oudin la el anticuerpo homólogo, la difusión se inmunodifusión en agarosa permitió a
modificó en el sentido de fundir la hace en forma radial dando un franco Williams y Grabar desarrollar el sistema
agarosa mezclándole una determinada anillo de precipitación alrededor del ori- denominado inmunoelectroforesis como
cantidad de antisuero y colocándolo en ficio, con la circunstancia, de que el diá- una herramienta muy útil para el estudio
un tubo de ensayo para dejarla solidifi- metro de este anillo es directamente pro- de mezclas antigénicas tal como ocurre
car y luego colocar el antígeno en dilu- porcional a la concentración de la pro- en el suero humano. El sistema desarro-
ción en la parte superior; esta modifica- teína en estudio; el procedimiento ganó llado por Williams y Grabar (lO) consis-
ción permitió conocer que cuando el rápida aceptación y es en la actualidad te en realizar un fraccionamiento
antígeno es una mezcla de compuestos ampliamente utilizado en todo el mun- electroforético de suero humano en una
antigénicos al difundirse unidireccio- do para la cuantificación de proteínas capa de agarosa colocada en un
nalmente en la agarosa estos se difun- plasmáticas tales como albúmina, IgG, portaobjeto microscópico, colocando el
den a mayor o menor velocidad según IgA, IgM, C3, C5, ceruloplasmina, suero humano en un pequeño orificio
su peso molecular y reaccionan con su inhibidor de Cl esterasa y haptoglobinas, hecho en la capa de agarosa y que puede
anticuerpo homólogo formándose tantos entre otras. contener entre 5-10 microlitros de suero
anillos de precipitación cuantas fraccio- humano, la placa se coloca en cámara
nes antigénicas existan lo cual puso de Un sistema de cuantificación similar pero electroforética de manera que un extre-
manifiesto que la reacción de precipita- combinando un procedimiento electrofo- mo esté en contacto con el ánodo y el
ción era una valiosa herramienta de aná- rético fue el desarrollado por Laurell (9) otro extremo con el cátodo y se aplica
lisis inmunológico. conocido como técnica del "Rocket" por una corriente continua de 150 voltios por
Un gran desarrollo de esta idea lo cons- la forma que la precipitación asume en 20 minutos, las proteínas plasmáticas se
tituyó el sistema propuesto por el agar, simulando un cohete espacial. separan electroforéticamente según su
Óuchterlony (6), de utilizar la agarosa La técnica de Laurell utiliza una fina capa carga eléctrica relativa de modo que
fundida en caja de Petri, colocar los de agarosa fundida mezclada con un aquella proteína electronegativa marcha
reactivos anticuerpo y antígeno en orifi- antisuero que contiene anticuerpos con- al ánodo y aquellas menos electronega-
cios equidistantes en forma tal que di- tra una determinada fracción del suero tivas marchan al cátodo; terminando el
fundieran en la agarosa en una doble di- humano, esta capa de agarosa fundida tiempo de separación electroforética se
fusión y la zona de proporciones ópti- se coloca en una lámina de vidrio y esta hace una pequeña zanja frente al orifi-

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cio donde se colocó la muestra en forma anticuerpos que son relativamente poco microorganismos género y especie. uti-
tal que la zanja tenga la longitud casi del electronegativos migren hacia el cátodo lizan sueros monoespecíficos produci-
porta objeto, esta zanja se llena con un y reaccionen dando una línea de precipi- dos comercialmente. Las pruebas de
antisuero antihumano, obtenido usual- tación, la prueba se realiza en un tiempo hemoclasificación son típicas pruebas de
mente en cabra o en conejo y se deja de lOa 20 minutos, puede hacerse en aglutinación directa.
incubar por 18 horas para que ocurra la sangre, orina o suero. Esta técnica es al-
doble difusión, por cada proteína pre- tamente específica pero poco sensible, Las técnicas indirectas de aglutinación
sente en el suero se producirá un arco de suerte que si la prueba es positiva tie- fueron introducidas como herramientas
de precipitación muy definido, permi- ne un valor diagnóstico incuestionable, diagnósticas para investigar la presencia
tiendo un análisis de la mezcla pero si es negativa no excluye el diag- de anticuerpos dirigidos contra un de-
antigénica; la aplicación al diagnóstico nóstico, debiéndose utilizar otro proce- terminado agente, el hallazgo de tales
clínico de esta técnica es muy limitada dimiento; las técnicas de precipitación anticuerpos, visualizado por una reac-
reduciéndose al estudio del mieloma pueden ser leídas muy rápido y con un ción de aglutinación, frente a una sus-
múltiple, y a unas pocas situaciones alto grado de precisión por procedimien- pensión pura del microorganismo sospe-
neurológicas en que el estudio tos de turbidimetria utilizando un choso de ser el agente causal del cuadro
inmunoelectroforético del LCR puede nefelómetro, existen casas comerciales clínico en estudio, confirma indirecta-
arrojar alguna luz. que producen reactivos de óptima cali- mente que ese microorganismo estuvo
dad para la cuantificación de proteínas presente en el huésped y estimuló una
Una adaptación de la inmunoelec-troforesis plasmáticas, apolipoproteínas, polisacá- respuesta inmune en términos de
es la llamada contra inmunoelectroforesis ridos, etc.; pero el costo de tales reactivos anticuerpos circulantes; las técnicas in-
(ClE) o electroforesis de contracorriente; y la necesidad de un Nefelómetro son directas de aglutinación han sido amplia-
inicialmente introducida por Cullford limitan tes frente a los otros procedimien- mente utilizadas como recurso diagnós-
para estudios médico legales, pronta- tos descritos. tico en entidades como las fiebres
mente se vio que podría conveniente- entéricas: fiebre tifoidea y fiebre
mente aplicarse a estudio de situaciones PRUEBAS DE AGLUTINACIÓN paratifoidea, tifus y brucelosis ; grupo
clínicas, particularmente a la investiga- de reacciones de aglutinación que se
ción de infecciones de sistema nervioso La reacción de aglutinación fue desarro- conocen como prueba de los "Antígenos
central causadas por microorganismos llada hacia finales del siglo pasado por Febriles" (12-13) ; este tipo de reaccio-
capsulados cuyo polisacárido capsular Durham en esta reacción el antígeno nes, adecuadamente estandarizadas, con
hidro soluble pueda investigarse en el siempre esta en suspensión (11), pues se controles apropiados son de utilidad clí-
LCR, constituyendo su presencia allí, trata de partículas; para que la reacción nica, permiten hacer una cuantificación
prueba irrefutable de la etiología del pro- de aglutinación ocurra se requiere los si- con base en la aglutinación presente en
ceso infeccioso; procesos tales como guientes componentes: un suero diluido progresivamente, el in-
meningitis por Klebsiella pneumoniae, verso de la dilución que presente franca
Haemophilus influenzae Serotipo b, 1- Antígeno en suspensión aglutinación se llama "Titulo de agluti-
Streptococcus pneumoniae, Neisseria 2- Sistema buffer nación"; para cada antígeno investigado
meningitidis serotipos A y C, 3- Dilución de anticuerpos hay un título de referencia por encima
Cryptococcus neoformans pueden ser del cual un resultado empieza a tener sig-
convenientemente diagnosticados. Bá- La reacción puede utilizarse como prue- nificación clínica; como todas las prue-
sicamente el procedimiento consiste en ba directa o indirecta El mecanismo de bas de laboratorio estas aglutinaciones
colocar una capa de agarosa fundida en esta reacción es simple: si en un sistema tienen su utilidad y sus limitaciones las
un porta objeto, hacer dos orificios que buffer, usualmente solución salina buffer, cuales deben ser conocidas por quien las
puedan contener 5-10 microlitros sepa- se coloca una apropiada dilución de un usan como recurso diagnóstico.
rados por una distancia no mayor de suero que contenga anticuerpos especí-
5mm,colocar el porta objeto contactando ficos contra determinados grupos MODALIDADES DE
un extremo al ánodo y un extremo al antigénicos del antígeno en suspensión, AGLUTINACIÓN
cátodo, colocar el LCR que se supone las moléculas de anticuerpos reaccionan
contiene el polisacárido en el orificio con los grupos antigénicos de las partí- Las técnicas de aglutinación son muy
cercano al cátodo así que al migrar el culas del antígeno y actúan como puente versátiles y se han podido modificar para
polisacárido, que es electronegativo, 10 produciendo grumos fácilmente visibles. permitir la investigación de anticuerpos
traerá dirigiéndose hacia el ánodo, el Las técnicas directas de aglutinación son contra grupos antigénicos que pueden
suero antipolisacárido se coloca en el ampliamente utilizadas en Bacteriología ser solubles y por tanto no darían una
orificio cerca al ánodo para que los para la identificación serológica de los manifestación visible de aglutinación ;

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'.
sin embargo, muchas de estas sustancias Pruebas tales Como investigación de FUACIÓN DE COMPLEMENTO
son componentes de los microorga- antígenos de hepatitis B, proteína C
nismos que pueden adherirse por mani- reactiva, polisacáridos bacterianos y Esta técnica fue desarrollanda por Bordet
pulación química sobre partículas iner- micóticos en LCR, pruebas de embara- (2) a principios de siglo y tiene como
tes, el reactivo así obtenido se suspende zo, investigación de Streptococcus fundamento la utilización de una canti-
en un sistema buffer el cual se puede pyogenes, tipificación de grupos del gé- dad precisa de complemento sérico,
hacer reaccionar con un suero que con- nero Streptococcus utilizan este tipo de usualmente obtenido del curí, el cual se
tenga anticuerpos contra los grupos ad- reacciones. Son herramientas sencillas, utiliza de manera total en presencia de
heridos a la partícula inerte sirviendo de rápidas, y en su mayoría de una alta es- la reacción de un antígeno con su anti-
puente entre las partículas y presentan- pecificidad. cuerpo homólogo. Bordet decidió intro-
do el fenómeno visible de la aglutinación. ducir en la reacción una segunda fase
Dos tipos de partículas han sido amplia- COAGLUTINACIÓN
utilizando un sistema indicador que per-
mente utilizadas, los glóbulos rojos hu- mitiera determinar que el complemento
La coaglutinación es una modalidad de
manos o de algunas especies animales y había sido utilizado en la primera fase
la aglutinación pasiva reserva en la cual
partículas de látex de un diámetro muy de la reacción indicando que evidente-
la partícula indicadora utilizada es una
regular 0.85 micras, a estas partículas se les mente en la primera fase un anticuerpo
cepa de Staphylococcus aureus, particu-
puede adherir proteínas, polisacáridos, áci- había reaccionado con el antígeno, la
larmente la cepa Cowan (14). Esta cepa
dos nucleicos y hormonas, produciendo segunda fase o sistema indicador que
tiene dentro de los componentes de su
variados tipos de antígeno con fines diag- Bordet utilizó fue una suspensión de gló-
pared bacteriana una proteína denomi-
nóstico, como la partícula cumple un bulos rojos de carnero sensibilizados con
nada proteína A, la cual tiene la propie-
papel de portador pasivo de los grupos un anticuerpo anti - glóbulo rojo de car-
dad biológica de unirse químicamente a
antigénicos el tipo de aglutinación, se nero los cuales con el complemento pro-
la fracción Fe de la molécula de IgG hu-
llama aglutinación pasiva, si la partícula ducen la hemólisis del glóbulo rojo dan-
mana y de conejo de forma que el
usada es un glóbulo rojo la reacción re- do un fenómeno claramente visible, en
Staphylococcus queda convertido en una
cibe el nombre de hemoaglutinación pa- esta forma, si en la primera fase de la
partícula recubierta de moléculas espe-
siva, si la partícula es látex la reacción reacción el complemento presente se uti-
cíficas de anticuerpos contra aquellos
recibe el nombre de aglutinación de lá- liza, en la segunda fase no hay comple-
antígenos bacterianos, parasitarios o
tex. Por la facilidad de su realización y mento y el fenómeno hemolítico no ocu-
micóticos que se desean investigar. El
la interpretación éstas pruebas juegan un rre; a su tumo, si en la primera fase el
reactivo así obtenido es un reactivo de
destacado papel como recurso diagnos- complemento no se utiliza porque no hay
gran especificidad, muy estable y muy
tico, no solo de enfermedades infeccio- reacción antígeno anticuerpo el comple-
económico, que puede ser utilizado co-
sas, sino en otras condiciones; ejemplo mento queda libre y se utiliza en la se-
mercialmente para diagnóstico.
de estas técnicas son la investigación de gunda fase dando un fenómeno visible
factor reumatoideo, la cuantificación de PRUEBAS PRIMARIAS de hemólisis. Esta reacción por su ex-
anticuerpos antitiroglobulina, antimicro- quisita sensibilidad y especificidad fue
somales, entre otros. Las pruebas de Son aquellas en las cuales la reacción
rápidamente incorporada como recurso
aglutinación han sido modificadas para antígeno anticuerpo no da lugar a nin-
diagnóstico por August Von
la investigación directa de antígenos guna manifestación visible, requirién-
Wassermann (1), para el diagnóstico de
bacterianos, micóticos, parasitarios y aún dose, para evidenciar que la reacción ha
la sífilis. De entonces a nuestros días la
virales, cuyo hallazgo en un paciente tie- ocurrido, procedimientos técnicos com-
técnica ha sido perfectamente valorada
ne el mismo valor del aislamiento del plejos y en ocasiones equipos
y estandarizada como prueba cuantitati-
agente etiológico, en este caso, la partí- sofisticados y costosos. Las pruebas pri-
va en el diagnóstico de la infección viral,
cula inerte glóbulo rojo o partícula de marias pueden ser directas o indirectas
parasitaria, bacteriana y micótica. Es una
látex se recubre con un anticuerpo y de gran sensibilidad y especificidad,
técnica dispendiosa, requiere una perfec-
monoespecífico que se adhiere por su que las acercan al ideal de una prueba
ta evaluación de los reactivos utilizados
fracción Fe sobre la superficie de la par- diagnóstica. Dentro de esta categoría te-
y este hecho hace que quede confinada
tícula dejando libres los grupos de com- nemos:
a los laboratorios de referencia para es-
binación específica del anticuerpo en tudios muy específicos. A nivel de en-
1- Fijación de complemento
forma tal, que el antígeno investigado fermedades infecciosas es muy útil en el
2- Inmunofluorescencia
sirve de puente y el fenómeno visible es 3- Radioinmunoensayo diagnóstico serológico de la enfermedad
una aglutinación, este tipo de aglutina- 4- Pruebas Inmunoenzimáticas de Chagas (Reacción de Guerrero Ma-
ción recibe el nombre de aglutinación 5- Inmunoelectrotransferencia chado), en el diagnóstico de micosis
pasiva reversa. 6- Inmunocromatografía sistémicas, como la histoplasmosis,

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coccidioidomicosisy paracoccidioi- otros. Las técnicas de inmunofluo- tancia radiactiva que mostró mayor fa-
domicosis, entidades en las cuales per- rescencia también se utilizan en su mo- cilidad para marcar los anticuerpos fue
mite hacer un diagnóstico, controlar el dalidad indirecta, es decir, para investi- un isótopo de Iodo, inicialmente, Iodo
tratamiento y establecer un pronóstico. gar la presencia de anticuerpos contra de- 131 y posteriormente Iodo 125. La téc-
terminado antígeno, esta técnica, de gran nica fue introducida básicamente como
INMUNOFLUORESCENCIA versatilidad y aplicación al diagnóstico una técnica directa para la cuantificación
presupone contar con un anticuerpo mar- particularmente de hormonas ya que su
El desarrollo de la técnica de cado con fluoresceína, anticuerpo diri- especificidad y sensibilidad permitía
inmunofluorescencia se debe a Albert gido contra la inmunoglobulina huma- cuantificar éstos compuestos en concen-
Coons de la Universidad de Harvard (15). na, este anticuerpo marcado recibe el traciones tan bajas del orden de los
La posibilidad de marcar un anticuerpo con nombre de conjudago y puede unirse a picogramos: la endocrinología ganó con
una sustancia química para poder seguir la inmunoglobulina humana indepen- este desarrollo una poderosa arma de
el curso de este anticuerpo y así poder dientemente de la especificidad de esta. diagnóstico. posteriormente se desarro-
también poner de manifiesto un antígeno Las técnicas de inmunofluorescencia in- llaron técnicas de radioinmunoensayo
fue un deseo largamente acariciado por directa requieren que para su ejecución para investigación de marcadores
los investigadores; varios intentos se hi- se cuente con el sustrato, cuyos tumorales tales como alfafetoproteína,
cieron con distintos compuestos y colo- anticuerpos específicos se desean inves- antígeno carcinoembriónico, antígeno
rantes ; en 1940 Coons utilizó un com- tigar en un suero problema; esta técnica prostático específico. La aplicación del
puesto fluorescente, la fluoresceína, tiene una gran aplicación en diagnósti- Radioinmunoensayo en el diagnóstico de
compuesto que podía conjugarse quími- co, las técnicas más usadas son la investi- la enfermedad infecciosa fue realmente
camente con los grupos NH2 de las mo- gación de anticuerpos antinucleares, muy pobre, limitándose a la investiga-
léculas de anticuerpo sin afectar la espe- anticuerpos anti-Toxoplasma, anticuerpos ción de anticuerpos contra el virus de la
cificidad del anticuerpo; este compues- anti- Treponema pallidum, anticuerpos Hepatitis y VIH entre otros.
to podía ser excitado por la luz anti- VIH; estas técnicas correctamente
ultravioleta presentando el fenómeno de estandarizadas constituyen valiosas herra- La necesidad de utilizar isótopos radio-
la fluorescencia, es decir que al ser exci- mientas de diagnóstico. Infortunadamente activos constituyó siempre una gran
tado por la luz ultravioleta, estas radia- los reactivos son costosos y se requiere un limitante toda vez que se trataba de
ciones de onda muy corta activan los microscopio de fluorescencia que es un reactivos muy costosos con una vida
electrones del compuesto fluorescente, equipo muy costoso por la combinación media muy corta y además la lectura re-
emitiendo una radiación de onda más de filtros necesarios y por la fuente de quería necesariamente un contador de
larga dentro del espectro visible, en esta luz que es una lámpara de vapores de radiaciones gamma. El advenimiento de
forma un anticuerpo marcado al fijarse mercurio (17). A pesar de estas limitacio- las técnicas Inmunoenzimáticas fue gra-
específicamente al antígeno, por ejem- nes las pruebas de inmunofluorescencia tie- dualmente limitando su radio de acción,
plo una bacteria, se verá fluorescente. nen un lugar importante como prueba quedando en la actualidad reducido al
Desde su inicio se vislumbró la gran po- diagnóstica. campo de la investigación y apenas sí,
sibilidad de este procedimiento como algunas pruebas de diagnóstico.
herramienta en investigación y en diag- RADIOINMUNOENSAYO (RIA)
nóstico, posteriormente, se encontró que PRUEBAS
un isómero de la fluoresceína, el Un avance muy grande en las pruebas INMUNOENZIMÁ TICAS
Isotiocianato (16), era superior como primarias lo constituyó el desarrollo del
marcador fluorescente, desde entonces Radioinmunoensayo hecho hacia 1958 Las pruebas inmunoenzimáticas fueron
este fluorocromo se viene utilizando para por Yalow y Berson (19), desarrollo por desarrolladas hacia 1975 por Engvall y
marcar los anticuerpos. el cual se le otorgó el premio Nobel de Perlmann (19), quienes decidieron mar-
Medicina; básicamente este procedi- car los anticuerpos con una enzima, de
Las técnicas de inmunofluorescencia miento basado en la exquisita especifi- forma tal, que al usar el sustrato especí-
pueden aplicarse como técnicas directas cidad de la reacción antígeno-anticuer- fico de la enzima se pudiera determinar
para investigar la presencia de antígenos po introdujo para rastrear la reacción una la presencia del anticuerpo; varios tipos
virales, parasitarios, bacterianos o sustancia radioactiva que pudiera con- de enzimas fueron utilizados siendo las
micóticos en muestras clínicas; tiene una venientemente combinarse químicamen- más usadas, ureas a, fosfatasa alcalina y
amplia aplicación clínica en diagnósti- te con la molécula de anticuerpo en for- peroxidasa. La prueba inicialmente co-
co de Rabia, infección por Cytomega- ma tal que este pudiera ser fácilmente nocida por la sigla ELISA por Enzyme
lovirus, Herpes simplex 1 y 2, Epstein rastreado por la radiación emitida por el Linked Inmunosorbent Assay y ahora
Bar y virus Sincicial Respiratorio, entre marcador radioactivo utilizado. La sus- simplemente como EIA (Enzyme

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Irnmune Assay), mostró la posibilidad de han tenido también un gran impacto en zima, es el llamado conjugado, este an-
ser utilizada como técnica directa para el diagnóstico de entidades tales como ticuerpo es específico contra AgsHB, por
investigar la presencia de antígenos par- toxoplasmosis, enfermedad de Chagas, tanto se unirá a las partículas capturadas
ticulares o como prueba indirecta para leishmaniasis, amebiasis, giardiasis, en la primera reacción, luego de un pe-
investigar anticuerpos específicos. Muy neurocisticercosis, toxocara canis. ríodo de incubación apropiado se lavan
precozmente se vio que ésta era una téc- los pozos para remover todo aquello que
nica ideal por la posibilidad de utilizar Como prueba de tan amplia aplicación no haya reaccionado; en el pozo no per-
reactivos de gran estabilidad y vida útil clínica y tan universalmente empleadas manecerá más que el primer anticuerpo,
larga, además de estandarizar los siste- cientos de casas comerciales se han lan- el AgsHB capturado y el conjugado ad-
mas en microprocedimientos de fácil lec- zado a la producción de los reactivos en herido al AgsHB ; para poder saber que
tura visual o fotocolorimétrica, con equi- estuches que contienen todo lo necesa- ello es así, es la enzima que está mar-
pos sencillos. En la historia del desarro- rio para realizar las pruebas con un es- cando el conjugado quien revelará ese
llo de las pruebas serológicas ninguna tricto control de calidad interno asegu- hecho, para ello, será necesario colocar
ha producido tan gran impacto como rando un grado de confiabilidad alto. el substrato correspondiente, si supone-
estas pruebas inmunoenzimáticas, ellas Las técnicas inmunoenzimáticas han mos que la enzima marcadora es
introdujeron una revolución en los re- sido adaptadas en múltiples procedi- peroxidasa el substrato es agua oxige-
cursos diagnósticos tanto de la enferme- mientos tales como técnicas de captura, nada, la cual al ser interactuada por la
dad infecciosa como de las enfermeda- técnicas competitivas y técnicas indirec- pero xi das a producirá una reacción so-
des autoinmunes, endocrinas y en la in- tas; cada casa comercial tiene sus proto- bre un compuesto que se adiciona a la
vestigación de marcadores tumorales. colos que deben seguirse en forma rigu- reacción dando un color cuya intensidad
Fueron rápidamente estandarizadas rosa. se mide en un fotocolorimetro para ob-
como procedimientos directos cualita- tener una lectura de la densidad óptica.
tivos y cuantitativos y como procedi- En el campo de las enfermedades infec- Las lecturas de los controles positivos y
mientos indirectos cualitativos y cuanti- ciosas los procedimientos más comunes negativos y los sueros problemas permi-
tativos. son la técnica de captura para la investi- tirán establecer un índice de lectura para
gación de antígeno y la técnica indirec- establecer la positividad o negatividad
En el campo de las enfermedades infeccio- ta para investigación de anticuerpos. de la reacción.
sas uno de los grandes impactos ha sido el
diagnóstico de la enfermedad viral; hasta Técnicas de Captura: Son utilizadas Técnicas indirectas: Estas investigan
su aparición, eran bien limitados los recur- para la investigación de un agente la presencia de anticuerpos IgG, IgM o
sos que el clínico tenía para comprobar el etiológico por ejemplo, si se desea saber Ig A para un determinado antígeno sea
diagnóstico, a partir del desarrollo de las si un paciente tiene circulante el AgsHB este un virus, parásito, bacteria u hon-
técnicas inrnunoenzimáticas el panorama (antígeno de superficie del virus de la go; para ello, los sistemas traen las pla-
cambió radicalmente permitiendo la in- Hepatitis B) el sistema trae entonces, una cas de poliestireno sensibilizadas con los
vestigación directa de agentes placa de poliestireno con una serie de antígenos respectivos. Por ejemplo, si
etiológicos tales como, rotavirus, pozos, cada pozo es en realidad un pe- deseamos investigar anticuerpos contra
adenovirus, virus sincicial respiratorio, queño tubo de ensayo, en cada pozo se el virus de la inrnunodeficiencia huma-
componentes antigénicos de virus de ha colocado un anticuerpo monoclonal na (VIH), para establecer un diagnósti-
hepatitis B. Las técnicas indirectas abrie- específico contra el AgsHB, este anti- co de infección por VIH, el sistema co-
ron toda una serie de posibilidades para cuerpo se adhiere muy intensamente por mercial trae la placa de poliestireno en
diagnóstico de infecciones tales como su fracción Fe al poliestireno dejando cada uno de cuyos pozos tiene adheri-
sarampión, rubeola, varicelazoster infec- libre los grupos de combinación del an- dos los componentes antigénicos del
ción por Epstein Bar, cutomegalovirus, ticuerpo, el suero del paciente que VIH; en los pozos respectivos se colo-
herpes 1 y 2 Y VIHl y 2; el hecho de presuntivamente contiene el AgsHB se can los controles y los sueros en estudio
poder investigar la respuesta inmune en coloca, adecuadamente diluido en el y después de la incubación apropiada,
términos de IgG e IgM convirtió esta pozo, y se incuba por un tiempo deter- se lavan intensamente. Si el suero en
técnica en una poderosa herramienta minado, para permitir que el anticuerpo estudio contiene anticuerpos anti -VIH
para definir la situación de infección "capture" el AgsHB, si realmente está estos se fijan específica e intensamente
aguda o infección pasada, definición de la presente; luego de lavar intensamente sobre el antígeno, luego se coloca el con-
mayor trascendencia en situaciones como todo los componentes sérico s son remo- jugado que es un anticuerpo antigama-
rubeola y embarazo y toxoplasmosis y em- vidos, se coloca entonces un segundo globulina humana obtenido usualmente
barazo. En el campo de la enfermedad pa- anticuerpo producido en otra especie en cabra y además marcado con una
rasitaria las pruebas inmunoenzimáticas animal el cual viene marcado con la en- enzima, este anticuerpo se une

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específicamente con la Inmunoglo- una poderosa herramienta de análisis con da por virus HTL V-1, bacterianas, como
bulina humana fija a su vez sobre el una gran potencialidad en su ampliación al fiebre tifoidea, parasitarias como
antígeno, luego de los lavados, se agre- diagnóstico en el campo de infectología. La neurocisticercosis y micóticas como la
ga el sustrato y se revela el color por la primera aplicación masiva de esta técnica paracoccidioidomicosis. Una de sus limi-
reacción de la enzima sobre el sustrato. se introdujo para demostrar anticuerpos taciones es el alto costo de los reactivos co-
La reacción se lee fotocolorimé- contra el virus de la inmunodeficiencia hu- merciales.
tricamente para determinar la densidad mana VIH, siguiendo exactamente el desa-
óptica y establecer los índices que de- rrollo de Southem, el virus era sometido ~UNOCROMATOGRAFM
terminarán la positividad o negatividad a una digestión enzimática, sus compo-
de la reacción. nentes separados electroforéticamente En los últimos años se han desarrollado
en un gel de poliacrilarnida, transferidos una serie de pruebas serológicas rápidas
Las distintas casas comerciales han de- a un papel de nitrocelulosa y cortado en que combinan el principio de la separa-
sarrollado sistemas muy variados desde pequeñas tiras, cada tira al ponerse a re- ción cromatográfica con la reacción es-
equipos de lectura manuales, semi auto- accionar con el suero de personas su- pecífica antígeno-anticuerpo, permitien-
matizados y automatizados simples, has- puestamente infectadas con el VIH cuyo do visualizar la reacción mediante la uti-
ta equipos de la más alta sofisticación. suero contiene anticuerpos específicos lización de un marcador de oro coloidal
En materia de procedimientos inmuno- contra cada una de los componentes del (23).
enzimáticos se podría decir que hay para virus, reacciona específicamente, al la- Estas reacciones se han estandarizado como
todos los gustos (20). Estas pruebas tam- varse las tiras, todos aquellos componen- pruebas directas o indirectas y en algunas
bién han sido adaptadas en sistemas rá- tes séricos que no hayan reaccionado se ocasiones como pruebas semicuantitativas.
pidos para investigación de Strepto- lavan, quedando solo los anticuerpos Las reacciones inmunocromatográficas han
coccus pyogenes, AgsIHB, Anticuerpos específicos; para saber que ellos están allí sido comercializadas en sistemas
anti- VIH y pruebas de embarazo, entre fijados se utiliza un anticuerpo antigama- miniaturizados para ser utilizadas inclu-
otras. globulina humana marcada por una enzi- sive a nivel de consultorio médico, la
ma, usualmente peroxidasa, luego de la lectura es visual macroscópica constitu-
INMUNOELECfROTRASFERENCIA reacción se coloca el substrato respecti- yendo ayudas diagnósticas simples.
vo desarrollándose una banda nítida de La prueba ha sido ensamblada en una
En 1980 Southem (21), desarrolló un color por cada fracción del virus, para la placa plástica del tamaño de un
procedimiento para estudio de DNA, cual el suero en estudio tenga anticuerpos. portaobjeto, en su interior la placa tiene
para lo cual después de someter a Usualmente los componentes visualizados hacia un extremo una pequeña almoha-
hidrólisis selectiva el DNA procedía a son Glucoproteína 160- 120- 41 Y proteí- dilla y hacia el otro extremo una peque-
someter la muestra a una electroforesis na 66 - 55 - 31 - 24 - 17. ña tira de papel de celulosa que hace
en gel de poliacrilarnida para separar la contacto directo con la almohadilla; al
fracción de acuerdo a y peso molecular; El CDC (Centro para el Control de en- mirar la placa por su cara superior se
como los geles de acrilarnida son muy fermedades de USA) considera como observa tres ventanas; la primera se abre
frágiles y difíciles de manipular consi- criterio para confirmar un diagnóstico de directamente sobre la almohadilla absor-
deró posible transferir a un papel de ni- infección por VIH la presencia de las bente y es el sitio en donde se coloca la
trocelulosa todas aquellas bandas sepa- bandas 160/120 o 41/24 Esta técnica por muestra clínica, la segunda se abre sobre
radas en el gel de poliacrilamida y ha- su alta especificidad y sensibilidad se una zona de la membrana cromatográfica
cerlo mediante una electroforesis en la convirtió en la prueba de referencia y es el sitio donde se lee el resultado positi-
cual el gel colocado cerca al cátodo y el confirmatoria de diagnóstico de infección vo o negativo de la prueba y la tercera
papel de nitrocelulosa cerca al ánodo al por VIH y recibió el nombre de se abre sobre una zona de la membrana
recibir la corriente continua permitía que "Westemblot" por similitud a la técnica de cromatográfica en donde se lee el con-
cada banda que está presente en el gel Southem, conocido como "Southemblot" trol interno de la reacción. Debido al
fuera transferida al papel, ocupando la y no porque tuviera algo que ver con los hecho que los reactivos colocados en la
misma posición, a la manera de lo que puntos cardinales (22). También hay téc- zona de lectura de la prueba y en la zona
en fotografía un negativo se transfiere a nicas "Eastemblot" y "Northemblot" En de lectura del control interno han sido
un positivo; en esta forma el papel de síntesis el Westemblot es una prueba colocados en forma linear, la reacción
nitrocelulosa podía cortarse en peque- inmuno-enzimática sobre papel y de tipo se evidencia en una y otra ventana como
ñas tiras, cada una de las cuales conte- indirecto. Técnicas similares se han de- una banda intensamente rosada.
nía exactamente el mismo patrón de dis- sarrollado para el diagnóstico indirecto
tribución de bandas del gel original. Este de otras infecciones virales, tales como Estas técnicas se han estandarizado para
procedimiento fue considerado como las paraparesia espástica tropical causa- investigación de la hormona gonado-

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GUZMÁN M Y COL
tropina coriónica humana como prueba de prueba encuentran fijados un anti- ma funcionó bien. La prueba se llama
de embarazo con una sensibilidad de 20 cuerpo policlonal contra AgsHB, el cual de bloqueo porque la droga presente en
mUI/ml, para investigación de antígeno captura el AgsHB que tiene pegado al la muestra clínica bloquea la reacción
prostático específico con una sensibili- conjugado (anticuerpo monoclonal, mar- con la droga ligada al conjugado. La re-
dad de 5 ng/ml, para la investigación de cado con oro coloidal) dando una línea acción positiva no dará, entonces, nin-
AgsHB (Antígeno de superficie del Vi- aparente rosada, el conjugado que no guna banda en la zona de la prueba, sólo
rus de Hepatitis B), para la investigación reacciona continúa migrando hacia la dará una banda en la ventana de control.
de la hormona Luteinizante LH como zona del control interno, en donde en- En el caso contrario, cuando en la mues-
prueba de ovulación, como prueba para cuentra un anticuerpo, policlonal dirigi- tra no hay la droga que se investiga, el
identificación de Streptococcus pyogenes do contra el anticuerpo monoclonal mar- conjugado es atrapado por los
en nuestras clínicas o en cultivos y como cado dando una banda rosada indican- anticuerpos libres en la zona de la prue-
pruebas para drogas de abuso como co- do que el sistema funcionó bien, la reac- ba dando una banda rosada de reacción
caína, morfina, heroína, marihuana y ción en este ejemplo es positiva: tendre- las moléculas no captadas continúan
anfetamina. mos banda en la zona de la prueba y ban- migrando siendo captadas en la zona de
Hay varios tipos de pruebas inmunocro- da en la zona de control. En caso de que control dando una banda nítida de reac-
matográficas entre las cuales tenemos: la prueba sea negativa, el conjugado ción, en este caso la presencia de banda
migra sin ser capturado en la banda de en la ventana de la prueba y la presencia
1- Prueba de Captura prueba y será atrapado en la banda de de banda en la ventana de control indi-
2- Prueba de Bloqueo control, esta debe aparecer siempre, en can que la prueba es negativa.
3- Prueba indirecta caso de no aparecer indica que el siste-
ma no funcionó porque el reactivo esta Prueba indirecta: Las pruebas
Prueba de Captura: En pruebas de tipo alterado y deberá hacerse una nueva inmunocromatográficas han sido tam-
directo la disposición de los reactivos es prueba. bién adaptadas para la investigación de
la siguiente: en la almohadilla viene ab- anticuerpos específicos contra determi-
sorbido un anticuerpo monoclonal diri- Prueba de Bloqueo: Es la más utilizada nados antígenos microbianos y así po-
gido contra el antígeno que se desea in- para la investigación de drogas de abuso. der establecer un diagnóstico indirecto,
vestigar este anticuerpo además viene En esta prueba, en la almohadilla se en- pruebas para VIH, Trypanosoma cruzi,
marcando con oro coloidal (23); en la cuentra un anticuerpo monoclonal dirigi- Dengue y Brucella, han sido ya
zona de la prueba, sobre la membrana do contra la droga que se investiga y que estandarizadas y comercializadas. En
cromatográfica, ésta colocado en forma tiene ya copados los sitios de combinación este tipo de pruebas indirectas se tiene
lineal un anticuerpo policlonal contra el con dicha droga; además, está marcado con en la almohadilla un suero monoclonal
antígeno que se desea investigar y en la oro coloidal; al colocarse la muestra clíni- específico contra la IgG humana además
zona del control interno, sobre la mem- ca en la ventana para la muestra si la droga conjugado con oro coloidal; en la zona
brana cromatográfica, esta colocado en está presente pasa muy rápidamente a la de la prueba están fijos sobre la mem-
forma lineal un anticuerpo obtenido en membrana cromatográfica y llega a la zona brana cromatográfica grupos antigénicos
conejo dirigido contra el anticuerpo de la prueba en donde la membrana del microorganismo cuyos anticuerpos
monoclonal. cromatográfica tiene fijos una banda de específicos se desean investigar, en la
anticuerpos monoclonales contra la droga zona de control se encuentra una banda
Si suponemos que se desea investigar en en cuestión, copando todos los grupos es- de un anticuerpo policlonal dirigido con-
un paciente el AgsHB, se toma la sangre pecíficos de combinación, el conjugado tra el anticuerpo monoclonal conjugado.
del paciente, se obtiene el suero, con dis- que es una molécula más pesada migra Pongamos por ejemplo que deseamos in-
pensador se colocan 4 a 5 gotas del sue- más lentamente, llega a la zona de la vestigar si el suero de un paciente tiene
ro y 4 a 5 gotas de un diluente (Buffer) prueba y encuentra que todos los grupos anticuerpos contra el VIH, entonces, se
provisto dentro del estuche de reactivo; de combinación específica del anticuer- toma la muestra de sangre, se obtiene el
estos sueros y diluente, se colocan en la po allí fijado están copados por la droga suero, 4 a 5 gotas de este se colocan en
ventana de la muestra, rápidamente ellos capturada de la muestra clínica y pasa la ventana de la muestra y luego se colo-
son absorbidos y aIJí encuentran el anti- derecho continuando hacia la zona de ca una cantidad similar de buffer; en la
cuerpo monoclonal anti-AgsHB, marca- control en donde la membrana almohadilla el anticuerpo monoclonal
do con oro coloidal, si realmente hay cromatográfica tiene una banda de conjugado antigamaglobulina humana
AgsHB este se une a los grupos de com- anticuerpos policlonales antigamaglo- captura una apreciable cantidad de mo-
binación específico del anticuerpo bulina monoclonal conjugada reaccio- léculas de la IgG contenida en el suero,
monoclonal y continúan migrando hacia nando con ella dando una banda inten- este gran complejo migra a la membra-
la membrana cromatográfica en la zona samente rosada indicando que el siste- na cromatográfica y llegará a la zona

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donde se encuentra el antígeno y allí los CALIDAD DE LOS SUEROS CONCLUSIÓN


anticuerpos específicos dirigidos contra
el VIH, si los hay, y que vienen captadas Los sueros que deban ser sometidos a Las pruebas serológicas han tenido un
en el conjugado reaccionarán dando una estudios serológicos deben ser obteni- gran desarrollo en las últimas décadas,
banda de reacción intensamente colorea- dos a partir de una muestra de sangre constituyen poderosas herramientas de
da, el exceso de conjugando continúa tomada con todas las normas de asep- diagnóstico; en el campo de la
migrando hacia la zona de control en sia y antisepsia en pacientes preferi- infectología son insustituibles. Se
donde el suero policlonal anticonjugado blemente en ayunas. Unicamente los debe, sin embargo, tener en cuenta que
está fijo, reaccionando con el conjugan- sueros límpidos, transparentes y no como todo procedimiento de laborato-
do para dar una banda intensamente co- hemolizados, deben ser utilizados para rio tienen una utilidad y una limitación,
loreada indicando que la prueba funcio- la realización de las pruebas pueden dar resultados falsos positivos
nó bien y el reactivo esta bien. serológicas. Para conservar los sueros o negativos y por tanto los resultados
lo ideal es repartir las muestras en deben ser valorados dentro del con-
En consecuencia si la prueba es positiva alícuotas de 0.5 mi, identificar correc- texto de una correlación clínica.
tendremos 2 bandas, una en la ventana tamente y congelar a 20QC, dejando
de la prueba y otra en la ventana del con- una alícuota a 42C para realizar las Como la mayoría de los procedimientos
trol, si la prueba es negativa tendremos pruebas. Nunca se debe congelar y serológicos están disponibles comercial-
una banda única en la ventana de con- descongelar y volver a congelar por- mente, los protocolos de la realización
trol, si la prueba es inválida la banda en que ese procedimiento altera la de las pruebas deben ceñirse estricta-
la ventana de control no aparece. reactividad de los sueros. mente a lo indicado por el productor.

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