Ta de fusión de oligonucleótidos (tm)

¿Qué es la PCR?
% T

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR:

polymerase chain reaction) es una técnica de
amplificación de secuencias de DNA in vitro

T % G + C

tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)

tm = 81.5 + 16.6 (log 10 [K+]) + 0.41 (%[G + C]) – (675/n)

3’ …. TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC .... 5’
5’ …. AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG .... 3’
3’ …. TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC .... 5’
5’ AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG .... 3’
3’ …. TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC 5’
5’ …. AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG .... 3’

3’ …. TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC .... 5’ 3’ …. TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC .... 5’

5’ AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG .... 3’ 5’ AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG .... 3’
3’ …. TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC 5’ 3’ …. TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC 5’
5’ …. AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG .... 3’ 5’ …. AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG .... 3’

3’ …. TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC .... 5’
5’ AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG .... 3’
3’ …. TCCAGCTTAAGCTA…………TCGCTTAAGCTATC 5’
5’ …. AGGTCGAATTCGAT…………AGCGAATTCGATAG .... 3’

PCR

1er de
Desnaturalización
Extensión
Unión ciclo
oligos

Extensión
2ndode
Unión ciclo
oligos
Desnaturalización

1
 La PCR según Mullis

Eritrocitos sanos Eritrocitos falciformes

 Desnaturalización (100oC)

 Unión cebadores

 Polimerización (37oC)

Diagnóstico de un tipo de anemia falciforme

Individuos
Sanos

Glu Sano Enfermo

5’ …CGACTCCTGAG .... 3’ 5’ …CGACTCCTGTG .... 3’
3’ …GCTGAGGACTC .... 5’ 3’ …GCTGAGGACAC .... 5’
Individuos DdeI DdeI
con anemia
110 p.b. 110 p.b.
Val

DNA polimerasa termoestable Comparación entre Klenow yTaq polimerasa

Saiki et al. Science. (1988) 239: 487
Thermus aquaticus: Taq polimerasa

2
 Termoestabilidad de la Taq N-terminal:13 Pro Actividad correctora de pruebas (KlenTaq)
Fragmento completo:
Actividad exonucleasa: unión de NMP a
• 17 nuevos aminoácidos
Klenow Taq
- hidrófobos
- aromáticos Hebra 2: Asp355 Phe309
Glu357 Desaparecido
• 4 Lys 4 Arg
Thr358 Desaparecido
Hélice C: Asp424 Leu356
Leu345
Interfase (hélices G,Q,R): Val307
• Asn524 Trp428
• Asp819 Phe724
• Arg858 Leu763
• Arg909 Tyr811

NÚCLEO HIDROFÓBICO MAYOR EN TAQ

Pasos en la PCR Elementos de la PCR

KLENOW Taq POLIMERASA • DNA Molde

• Cebadores (oligonucleótidos)
• Desnaturalización
• Desnaturalización • DNA polimerasa termoestable
100oC
95oC • Desoxinucleótidos trifosfatos
• Unión cebadores y
polimerización • Unión cebadores • Tampón de reacción

37oC (45-55 oC) Tm • pH

• Cationes divalentes
• Polimerización
• Cationes monovalentes
72oC

Rendimiento extracción DNA en tejidos humanos

Fuente de DNA Cantidad de partida Rendimiento

Sangre 30 µl 0.5 - 1 µg

Suspensiones
Optimización de la PCR
5 10 5 células 2 - 5 µg
celulares

Células bucales Lavado bucal 0.1 - 1 µg

Semen 30 µl 5 - 10 µg

Raíz de pelo 1 raíz 10 - 200 ng

Bloque de tejido 50 mg 0.1 - 10 µg

3
 Ta de fusión de oligonucleótidos (tm)
Diseño de cebadores
% T

• LONGITUD: 18-25 nucleótidos complementarios

• COMPOSICIÓN: G+C entre 40% y 60%

• DIMERIZACIÓN: No deben unirse entre si



• CONCENTRACIÓN: 0.1-0.5 µM de cada cebador T % G + C


tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)

tm = 81.5 + 16.6 (log 10 [K+]) + 0.41 (%[G + C]) – (675/n)

Grado de homología y tm Nuevas DNA polimerasas termoestables

• 100 % homología

5´ TCCAGCTTAAGCTACCAAA 3´ tm = 52oC

3’ AGGTCGAATTCGATGGTTT--------- 5’

• 75 % homología

5´ TCCAGCTTAAGCTACCAAA 3´ tm = 36oC

3’ ACGTCTAATACGATGGCTT--------- 5’

Eficiencia de la amplificación en la PCR Otros componentes de la reacción

Log Nf

14
12
10
Log de Nf

8
6
4
2
0

0 10 20 30 40 50 60
Número de ciclos
Número de ciclos (n)

Nf = No (1+Y) n Ejemplo
Nf = número final de moléculas Nf = 10 12
No = número inicial de moléculas No = 3 x 10 5 (1µg DNA)
Y= eficiencia Y = 0,7
n= n o de ciclos n = 28.8

4
 Razón Recomendaciones

↑ Especifidad Eliminar P no deseados • Cambiar cebadores

• ↑ T hibridación

Optimización de la técnica • Cambiar [Mg 2+]

• Cambiar polimerasa

↑ Fidelidad Reducir el error • ↓ No ciclos

• ↑ [molde]

• Cambiar polimerasa

Razón Recomendaciones

↑ Rendimiento ↑ Moléculas • ↑ No ciclos Aplicaciones

• ↑ [molde]
• ↓ T hibridación • Clonaje de genes
• Cambiar polimerasa • Diagnóstico
• Evolución molecular
• ↑ t extensión 
• Cuantificación de mRNAs

↓ errores • ↑ t extensión • Secuenciación
↑ Fidelidad • Localización de AN in situ
• Cambiar polimerasa
• Forense
• Cambiar [Mg 2+]
• ↓ t desnaturalización
• Otras

• ↑ [molde] 

Alineamiento de pectin esterasas

Ventajas de la PCR en clonación

• A partir de RNA total y en un solo paso (RT- FP1

PCR) pueden obtenerse cDNAs específicos
FP2
• No es necesario el empleo de librerías para
obtener fragmentos genómicos definidos
RP2 RP1

5
 PCR anidado (Nested PCR) Deteccion de mutaciones: SSCP
N-Ras Normal (A) N-Ras Mutado (B)

FP1 FP2 RP2 RP1 P32

P32
...CAA... ...CT
TA...
...GTT... ...GA
AT...
P32 P32
FP1+RP1 Desnaturalización
1a PCR
FP2 RP1 ...CAA... ...GTT... ...CT
TA... ...GA
AT...

(A) (A/B) (B)

CAA
2a PCR FP2+RP2 CTA
GAT
GTT

DNA shuffling: β-lactamasa

Evolución molecular. DNA shuffling
[Cefotoxima] (µg/mL)
PCR sin oligos Posición 0.02
TEM-1 320
ST-1 640
ST-2 10
ST-4
Posición TEM-1
(MIC 0.02) ST-1
(MIC 320) ST-2
(MIC 640) ST-4
(MIC 10)
1 3
14 A V A A
42 A A G A
92 G G S G
104 E K K K
182 M T T T
238 G S S S
DNAsa I PCR con oligos 241 R R H R
2 4
• TEM-1: β-lactamasa
• ST-1: descendiente de TEM-1 tras 3 ciclos de
mutagénesis/recombinación/selección
• ST-2: descendiente de ST-1 por retrocruzamientos
Mutaciones útiles Mutaciones nuevas
• ST-4: construcción diseñada resultante