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Tecnicas de Laboratorio PDF
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TÉCNICAS DE
LABORATORIO
TECNICAS DE LABORATORIO
SOLUCIONES: Concentración
• Indicar todos los valores con sus correspondientes unidades; la relación de valores
que tienen las mismas unidades se deben indicar sin unidades ya que las mismas se
cancelan.
• Sumar o restar sólo aquellos valores que tienen las mismas unidades.
• No se deben hacer comparaciones de valores con diferentes dimensiones.
• Se debe asignar a una determinada variable las mismas unidades a través de todos
los cálculos.
• Multiplicar o dividir unidades cuando se dividen o multiplican valores; luego incluir
el producto o cociente de las unidades con el resultado calculado.
• Multiplicar o dividir unidades en cada paso de un cálculo; no esperar hasta el final
del cálculo para deducir cuales serán las unidades finales.
• La pendiente de una curva tendrá las dimensiones de y dividida por aquéllas de x.
• Multiplicar valores tabulados o graficados por 10 o el múltiplo más adecuado para
evitar trabajar con números muy grandes o muy pequeños.
• Las dimensiones del lado izquierdo de una ecuación deben ser iguales a aquéllas del
lado derecho.
• El análisis de las unidades después de cada paso de un cálculo permite detectar
errores cometidos durante el cálculo.
Unidades de concentración
En SI, el uso de mol l-1 y las unidades relacionadas se acepta para la expresión de
concentraciones sobre la base de cantidades de sustancia por unidad de volumen. Un
mol se define como la cantidad de sustancia que contiene las entidades elementales
equivalentes a los átomos presentes en 0.012 kg de carbono-12. Se ha demostrado
experimentalmente que 0.012 kg de carbono-12 contienen 6.02217 x 1023 átomos. Este
número es el número de Avogadro y se utiliza para definir el mol de cualquier unidad
elemental tal como átomo, molécula, ión, protón o electrón. Un mol puede ser también
definido como el equivalente del peso molecular (más correctamente a la masa
molecular en g) de una sustancia. Por lo tanto, el peso de una sustancia (su masa) y
moles pueden ser interconvertidos como se muestra en las siguientes ecuaciones:
Concentración molar, mol l-1, el número de moles por litro (M) puede
expresarse como una función de las cantidades relativas de acuerdo a las siguientes
relaciones:
V1 . C 1 = V 2 . C2
ESPECTROFOTOMETRIA
T (transmitancia) = I / I0 = 10-ε.c.b
También se designa A como " densidad óptica", esta magnitud varía de cero para
I = Io (absorción nula) hasta para I = 0 (absorción total).
La constante k es el coeficiente de extinción (o absortividad).Es una
característica intrínseca de cada sustancia y depende de la longitud de onda, sus
unidades dependen de las utilizadas para c y b:
Rayos X 0.01-15 nm
UV lejano 15-200 nm
UV cercano 200-400 nm
Visible 400-800 nm
Infrarrojo 800-2500 nm
TECNICAS DE LABORATORIO
ESPECTROFOTOMETRO
Instrucciones de manejo:
Muy importante:
Equipamiento requerido:
centrífugas de 15000 g y deben cubrir un rango de 100 ml a pocos litros. Son muy útiles
además, las centrífugas para tubos de 1.5 ml (Eppendorf)
Buffers:
* Los factores que se deben tener en cuenta para la elección de un buffer son los
siguientes:
+ El pH deseado.
+ Si el buffer es aniónico o catiónico. Por ejemplo, para una cromatografía de
intercambio aniónico se debe usar un buffer catiónico (por ejemplo, Tris y no fosfato)
+ Variación del pH con la fuerza iónica y la temperatura.
+ La reactividad química. Por ejemplo las aminas primarias como el Tris pueden
interferir con el análisis de proteínas o pueden inhibir algunas enzimas.
+ Absorción a 280 nm.
Costo. Especialmente si se utiliza en grandes escalas.
+ Solubilidad.
Métodos de extracción:
* El tejido se lava con una solución salina para eliminar trazas de material
extracelular.
* El extracto obtenido luego de la lisis se denomina homogenato.
Habitualmente se centrífuga de 10 min a 15000 g a 1 hora a 100000 g. El sobrenadante
se denomina extracto crudo y el pellet contiene la fracción de membrana.
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* Las células vegetales tienen una pared compuesta por carbohidratos complejos
insolubles, ligninas o ceras que rodean la membrana plasmática.
Microfibrillas de celulosa cubren la membrana y le dan cierta protección contra
la ruptura, aunque el tamaño las hace algo más vulnerables. En las vacuolas hay
compuestos fenólicos que se liberan durante la extracción y que pueden inactivar
proteínas. Por lo tanto es esencial una extracción muy rápida de la proteína en interés.
* Las bacterias tienen una pared celular constituída por un péptido glicano que le
otorga fuerza y rigidez. Se utiliza frecuentemente lizosima en un medio isotónico para
romper el péptidoglicano.
Fraccionamiento subcelular:
* Método de Biuret y µBiuret: bajo condiciones alcalinas el ión cobre (II) se une
al nitrógeno del enlace peptídico de proteínas y péptidos desarrollando una coloración
violeta con un máximo de absorción a 540-560 nm. No da interferencia con aas libres y
tiene poca dependencia de la composición de aas. Ya que el reactivo de cobre reacciona
con el enlace peptídico y no con las cadenas laterales de los aas la mayor desventaja del
método es su baja sensibilidad (1-10 mg/ml de proteínas). Algunos buffers (Tris, por
ejemplo) pueden interferir con la reacción.
Procedimientos experimentales:
Vo Vo-Vt Vt
ELECTROFORESIS
PAGE: cualquier ión o grupo cargado si es sometido a un campo eléctrico migra a una
velocidad determinada. Ya que las proteínas tienen una carga neta a cualquier pH
diferente a su punto isoeléctrico, ellas también migrarán y su velocidad de migración
dependerá de la densidad de carga (relación carga/masa). A mayor relación carga / masa
mayor velocidad de migración. El medio más frecuentemente utilizado las para
electroforesis es poliacrilamida. La poliacrilamida resulta de la polimerización de
monómeros de acrilamida en cadenas largas y entrecruzamiento de estas cadenas por
compuestos bifuncionales como la bis-acrilamida. Esta reacción crea una matriz porosa
con un tamaño de poro controlado. La forma de controlar el tamaño del poro es
modificando la concentración de acrilamida y bis-acrilamida. Así, durante la
electroforesis en geles de poliacrilamida, las proteínas están sometidas a un efecto de
filtrado molecular, por el cual las proteínas más grandes migran más lentamente en
relación a las proteínas menores. Por lo tanto la separación de proteínas nativas en
buffers no disociantes depende tanto de la carga como de la masa de proteína.
Aunque la electroforesis, en condiciones nativas o desnaturalizantes, es útil en un
número de situaciones, especialmente cuando se desea detectar una proteína particular a
través de su actividad biológica, en la mayoría de los estudios se utilizan condiciones
que disocian a las proteínas en sus subunidades. El agente de disociación mas
frecuentemente utilizado es SDS (sodium dodecyl sulfate). La electroforesis en PAGE-
SDS permite un rápido análisis de la composición de una mezcla de proteínas y es
extremadamente útil para monitorear la pureza de la muestra durante su purificación.
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C: Actividad total PP
Actividad total Homog
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ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS
Amino ácidos - Notas claves
Amino ácidos Todas las proteínas están formadas por el mismo juego estándar de 20
aas. Un aa típico tiene un grupo amino primario, un grupo carboxilo, un átomo de
hidrógeno y una cadena lateral (grupo R) unidos a un átomo de carbono α central (Cα).
La prolina es la excepción a esta regla por poseer un grupo amino secundario.
Enantiómeros Los 20 aas, excepto la glicina, tienen cuatro grupos diferentes ordenados
tetraédricamente alrededor del átomo de Cα y por lo tanto pueden existir en
configuración D o L. Estos dos enantiómeros son imágenes especulares que sólo pueden
distinguirse sobre la base de su diferente rotación de la luz polarizada en el plano. Sólo
los isómeros L se encuentran en las proteínas.
Datos útiles:
* El β-mercaptoetanol reduce las cistinas rompiendo los puentes disulfuro y el SDS
otorga carga homogénea a las proteínas determinando que corran exclusivamente por su
tamaño.
* PM promedio de un aminoácido = 120; de la glucosa libre = 180; de la glucosa
formando parte de la cadena = 162.
* tripsina corta dejando libre el carboxilo de Arg y de Lys.
* Quimotripsina corta dejando libre el carboxilo de Phe, Tyr y Trp.
* Bromuro de cianógeno rompe enlaces peptídicos con carbonilo aportado por met.
* Cistina = Cys (S-S)Cys
TECNICAS DE LABORATORIO
Notas claves
Termodinámica
Energía de activación y estado de transición
Cinética enzimática
Velocidad de la reacción enzimática. La actividad enzimática se expresa comúnmente como
la velocidad inicial (V0) de la reacción catalizada. Las unidades de V0 son umol min-1, que
puede ser también representada por la unidad (U) o el katal (kat) (1 umol min-1 = 1U = 16.67
nanokat). El término actividad (actividad total) se refiere a las unidades totales de enzima en
la muestra, mientras que la actividad específica es el número de unidades por miligramo de
proteína (U mg –1).
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Vmax [S]
V0 =
Km + [S]
OH H C OH
H C H C OH
Los azúcares con el grupo carbonilo libre son los capaces de formar el enodiol intermediario
en medio alcalino, y por ende son reductores ya que es ese intermediario la forma reactiva de
los azúcares en una reacción de óxido-reducción.
Uno de los métodos más utilizado para la determinación de azúcar reductor es el de Somogy-
Nelson.En este método se produce la reducción del ion Cu2+ a Cu2O por acción de los
azúcares en medio alcalino y caliente. Luego por acción del Cu2O sobre el reactivo de Nelson
(arsenomolíbdico) se forma un complejo coloreado, en el que el Mo se ha reducido. Este
complejo se determina espectrofotométricamente a 540 nm.
SECUENCIACIÓN DE OLIGOSACÁRIDOS
a) Composición
El primer paso en la secuenciación es determinar la composición de monosacáridos. Para
hidrolizar la cadena de oligosacáridos se utilizan principalmente dos métodos:
1) Se puede utilizar una solución acuosa ácida para liberar los monosacáridos (ClH 2-4 N
durante 3-6 horas a 100 ° C).Luego de la hidrólisis ácida, los monosacáridos liberados se
transforman en derivados (acetatos) y se los analiza por cromatografía gaseosa con
espectrometría de masas.
2) Un método alternativo al método anterior es utilizar cloruro de metilo anhidro, que es
menos destructivo.
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b) Uniones glicosídicas
H2 COH
H2 COH
+
H3 COH H
O O
OH OH
OH OH
OH OCH 3
OH OH
α-D-glucopiranosa Metil-α-D-glucopiranósico
(CH3)SO4
NaOH
H COCH
(a) Metil a 2,3,4,6, tetra-O-metil- 2 3 H2COMe
D-glucopiranósido (a) H CL
O (b) O
(b) 2,3,4,6, tetra-O-metil-D- OMe OMe
glucopiranosa diluido
MeO
OMe MeO OH
OMe
OMe
1 mol fomaldehído
H2 COH
H2 COH
H2 COH H2 COH
O O
OH O O
OH OH OH
OH C
OH O H
O O
OH OH OH
OH
H2COH +7 HIO4
H2COH N
O H2 COH
O
O CH O C O O
O N +1 HC
O C O C C O H
H H H C O
O C C O H
O O O
H
3H C OH
+ 7 HIO3
Si las uniones fueran diferentes hay que analizar los sitios de acción del periodato y los
productos obtenidos
METABOLISMO ENERGÉTICO:
Figura 1
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Figura 2
Figura 3
TECNICAS DE LABORATORIO
LÍPIDOS
Estructura y función de los ácidos grasos
Notas claves
Estructura y propiedades
Nomenclatura
Funciones
Prostaglandinas
Introducción
Los lípidos son compuestos primarios en las células, donde funcionan como elementos
estructurales de las membranas y de tejidos especializados como el nervioso, reserva
energética, activadores específicos de enzima, transportadores de restos carbohidratos
en la síntesis de glicoproteínas y como reguladores de funciones orgánicas (vitaminas
liposolubles o el grupo de hormonas esteroides).
Con el nombre de lípidos se agrupan compuestos biológicos químicamente
heterogéneos caracterizados por la presencia, en su estructura, de compuestos
parafínicos como son principalmente los ácidos grasos o cadenas similares, que por su
carácter hidrofóbico les confieren la característica solubilidad en solventes neutros
/orgánicos) y la insolubilidad en agua. También integran la estructura de distintos
lípidos compuestos tan variables como el glicerol, aminoalcoholes (etanolamina),
aminoácidos (serina), ácido fosfórico, monosacáriodos y oligosacáridos, que introducen
en los lípidos grupos polares hidrofílicos que les imparten propiedades químicas y
físicas características. Con estructuras tan diferentes la solubilidad de los lípidos es muy
variada ofreciendo las bases para su fraccionamiento.
La TLC usa generalmente sílica gel como adsorbente, esta fase fija se suspende en agua
y deposita sobre placas de vidrio ( o metálicas o plásticas) que luego de secarse queda
adherida como una capa delgada de 0,1 a 2 mm de espesor. El disolvente o fase móvil
es en general una mezcla de solventes elegido de acuerdo a los lípidos que se vaya a
separar.
Se deja correr el cromatograma y los compuestos presentes en el extracto estarán a
distintas distancias desde el origen. Esto dependerá de su estructura química, de la
naturaleza del adsorbente y la composición del solvente.
Dado que los compuestos separados son incoloros, el cromatograma se revela con algún
reactivo especial de manera de detectar las manchas.
Se deben sembrar en el mismo cromatograma compuestos standard para comparar la
posición (Rf) de estos compuestos con las distancias de las manchas correspondientes a
los compuestos del extracto.
Rf : Relación de frente: Movimiento relativo de un compuesto con respecto al frente
alcanzado por el solvente. Es una propiedad característica y reproducible.
d) Revelado: uno de los reactivos más utilizado para revelar los lípidos es el vapor de
iodo, debido a su propiedad de unirse a los dobles enlaces de los ácidos grasos
insaturados. (Aparecen manchas marrones sobre un fondo amarillo). FIG. 1
e) Densitograma: Una vez realizado el análisis cualitativo del cromatograma se realiza
su cuantificación mediante un densitograma.
Luego de identificar los compuestos se puede raspar la zona de la mancha del
cromatograma y eluirla para su posterior cuantificación.
Fig.1 Fig.2
TIPOS DE CENTRIFUGACIÓN
Centrífugas preparativas
a) De uso general máxima: 6.000rpm (6.000 g). Los rotores pueden ser de ángulo
fijo o de ángulo móvil. Difieren solamente en su capacidad de carga (tubos de 10,
50 y 100 ml).
b) De alta velocidad: velocidad máxima 25.000rpm (89.000 g). La cámara del rotor
está refrigerada para eliminar el calor producido por la fricción entre el aire y el
rotor.
MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN
Método de Maxam y Gilbert (Método Químico): Este método usa reactivos químicos
que reaccionan con bases especificas para romper el ADN preferencialmente en
determinados nucleótidos. Primeramente las cadenas de ADN se marcan
radiactivamente en el extremo 5´, y se separan (solamente una se va a secuenciar).
Luego, la cadena a secuenciar se trata con cuatro reactivos químicos diferentes que
tienen la capacidad de cortar la cadena en uno o dos nucleótidos específicos. El
tratamiento no es exhaustivo, de manera que reacciona un solo residuo de la/s base/s
susceptibles. Por consiguiente, en cada mezcla de reacción, se generan un conjunto de
fragmentos radiactivos. Finalmente, estos fragmentos son separados por tamaño
utilizando una electroforesis en gel de poliacrilamida. El revelado del gel por
autorradiografía, permite visualizar las bandas radiactivas correspondientes a los
distintos fragmentos, y a través de ellos se va armando la secuencia.
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La Tecnología del ADN recombinante constituye una mezcla de técnicas, entre las que
podemos citar:
1) Corte específico del ADN mediante nucleasas de restricción 2) Amplificación y
clonado del ADN que posibilita integrar un fragmento específico de ADN en un
elemento genético de replicación rápida (plásmido) para que pueda ser reproducido en
bacterias o levaduras 3)Secuenciación del ADN 4) Hibridización de los ácidos
nucleicos, que permite identificar secuencias específicas de ADN o ARN con gran
exactitud, debido a la capacidad de los ácidos nucleicos de unirse a secuencias
complementarias.
1)Nucleasas de Restricción
Muchas bacterias producen estas enzimas, que son capaces de cortar al ADN en sitios
determinados, ya que reconocen secuencias específicas de cuatro o seis nucleótidos.
Una nucleasa de restricción determinada cortará cualquier doble hélice de ADN en una
serie de fragmentos conocidos como fragmentos de restricción.
Muchas nucleasas de restricción producen cortes escalonados, que dejan fragmentos
cortos de una sola hebra en ambos extremos. Estos extremos se denominan "extremos
cohesivos", ya que son complementarios con cualquier otro extremo producido por la
misma enzima.
Cuando los dos extremos se han unido gracias al apareamiento de bases
complementarias, pueden sellarse por la acción de una enzima conocida como ligasa,
que forma enlaces fosfodiester covalentes entre los extremos opuestos de cada hebra de
ADN.
3) Secuenciación
Es de suma utilidad conocer la secuencia exacta de un determinado fragmento de ADN,
ya que partir de este dato se pueden fabricar oligonucleótidos para amplificaciones por
PCR o saber cuales enzimas de restricción pueden ser útiles para clonar ese ADN. El
método más usado en la actualidad es una variante del método enzimático ideado por
Sanger. Gracias a la automatización de este proceso, y combinando varias técnicas de
Biología Molecular se ha llegado a determinar la secuencia completa del genoma de
varias especies, (entre ellas la humana). Todas las secuencias de genes conocidos
forman parte de bancos de datos de libre acceso en Internet. Esto permite identificar
secuencias desconocidas por comparación con estos bancos, como así también obtener
datos acerca de secuencias de interés.
4) Hibridización
Las hebras complementarias del ADN, producto de su desnaturalización pueden formar
de nuevo una doble hélice si se mantienen a 65ºC durante un período prolongado;
proceso denominado hibridización del ADN. Se producen reacciones de hibridización
similares entre dos cadenas cualquiera de ácido nucleico de una sola hebra (ADN/ADN;
ARN/ARN, ADN/ARN) siempre que tengan una secuencia de nucleotidos
complemenaria.
Puesto que la velocidad de formación de la doble hélice está limitada por la velocidad a
la que chocan dos cadenas complementarias de ácido nucleico, es posible medir la
concentración de las moléculas de ADN que presentan una secuencia particular de
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RADIACTIVIDAD
por lo tanto
N t
dN = - λ dt ln N = - λ t
No N to N0
ln No = λ t 2,3 log No = λ t
N N
Periodo de semidesintegración.
Es el tiempo necesario para que el número inicial de átomos disminuya a la mitad.
Unidades de radiactividad.
La unidad estándar de decaimiento radiactivo es el Curie (Ci). Se lo define como la
cantidad de cualquier nucleido radiactivo en el cual el número de desintegraciones por
segundo es 3,7x1010
Para la mayor parte de las aplicaciones biológicas se necesita normalmente cantidades
mucho menores de un Ci y se emplea el miliCurie (mCi) y el microCurie ( Ci) que
equivalen a 10-3 y 10-6 Ci respectivamente.
La unidad estándar de tiempo es el minuto, por lo tanto: 1 Ci=2,2x106 dpm.
Normalmente la actividad se indica por cuentas detectadas por minuto (cpm) y no como
desintegraciones por minuto (dpm), dado que es difícil determinar el número absoluto
de dpm. Esto se debe a que la eficiencia de la mayoría de los contadores es menor del
100%, es decir, solo detectan una fracción del total.
Para experimentos cuantitativos muy precisos el valor de cpm se convierte en dpm
dividiendo por la eficiencia del contador.
Actividad específica.
Los isótopos radiactivos y los compuestos marcados radiactivamente con isótopos, son
por lo general isotópicamente puros. La abundancia relativa de un isótopo se describe
por su actividad específica, que es una manera de designar la fracción de moléculas
totales presentes que es radiactiva. Este valor se expresa generalmente como actividad
(mCi o Ci) por milimol o micromol (mmlo o mol) o como Ci/gr, dpm/mol,
cpm/ mol, etc.
Dilución isotópica.
Los trazadores radiactivos pueden usarse para determinar la cantidad de una sustancia
simple en una muestra, agregando a la misma una cantidad conocida del mismo
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Donde:
a2: actividad específica en el diluyente + radiactivo agregado
x1: masa radiactiva agregada
x2: masa del diluyente (compuesto no marcado)
z: actividad (cpm) del radiactivo agregado
La actividad específica del radiactivo agregado (a1) será:
Luego, se reaisla una pequeña cantidad del compuesto y se mide la radiactividad del
mismo. De la actividad específica del mismo y conociendo el número total de cuentas
originariamente agregado, se puede calcular la cantidad del compuesto no marcado
presente desde un principio en la mezcla.