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UNIVERSIDAD INCA GARCILASO DE LA VEGA

FACUL
TAD DE CIENCIAS FARMACEUTICAS Y BIOQUIMICA

GUIA DE PRÁCTICAS DE ANÁLISIS BIOQUÍMICO Y


CLÍNICOII
INTRODUCCION

Una de las características del laboratorio de análisis clínicos es la de utilizar muestras clínicas con el objeto
de obtener datos que sirvan de apoyo para el diagnóstico de enfermedades y como revisión rutinaria de
la salud del paciente.

Gracias a las pruebas que se realizan en el laboratorio de análisis clínicos podremos detectar
enfermedades frecuentes, tales como la anemia, la diabetes,infecciones varias, y otras menos fecuentes
y más graves como leucemias o enfermedades cancerígenas.

Esto plantea la necesidad de que el estudiante este preparado para poder utilizar la tecnología más
actualizada en el análisis de estas muestras asi como estar preparado para desarrollar las técnicas
necesarias con este fin.

El curso de Análisis Bioquímico y Clínico II esta diseñado para brindar al estudiante las herramientas
necesarias para en el futuro poder desempeñarse en el campo de los análisis clínicos y uno de los medios
para el logro de nuestros propósitos lo constituye la GUÍA DE PRÁCTICAS DE ANÁLISIS BIOQUÍMICO Y
CLÍNICO II, el cual ha sido concebido como un material educativo que va a servir para afianzar
conocimientos, desarrollar habilidades y destrezas, asi como orientar la autoeducación permanente. Por
ello se ubica como un material delectura independiente, es accesible, sirve de información y recreación,
desempeña un papel motivador, se orienta a facilitar la lectura comprensiva, a ampliar conocimientos en
otras fuentes, crear hábitos y actitudes, asi como a desarrollar destrezas para el procesamiento de
información, adquisición y generación de conocimientos.

Los alumnos deben leer detenidamente cada práctica, antes de su realización, para una mejor
comprensión en el desarrollo de esta, ademas debe realizar esquemas de lo observado el cual sera
revisado por el profesor responsable de práctica en los informes que los estudiantes entregarán luego
de cada práctica.
REGLAS BÁSICAS DE HIGIENE Y SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

Las medidas de seguridad en Laboratorios son un conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger
la salud de los que alli se desempeñan frente a los riesgos propios derivados de la actividad, para evitar
accidentes y contaminaciones tanto dentro de su ambito de trabajo, como hacia el exterior.
Las reglas basicas aquí indicadas son un conjunto de practicas de sentido comun realizadas en forma
rutinaria.
1. Se debera conocer la ubicación de los elementos de seguridad en el lugar de trabajo, tales como:
extinguidores, salidas de emergencia, botiquin de priemros auxilios.
2. No se permitira comer, beber, fumar o maquillarse.
3. No se deberan guardar alimentos en el laboratorio, ni en los refrigeradores.
4. Se debera utilizar vestimenta apropiada para realizar trabajos de laboratorio (guardapolvo
preferentemente de algodón y de mangas largas, zapatos cerrados, evitando el uso de accesorios
colgantes) y cabello recogido con gorro.
5. Es imprescindible mantener el orden y la limpieza. Cada persona es responsable directa de la zona
que le ha sido asignada y de todos los lugares comunes.
6. Las manos deben lavarse cuidadosamente despues de cualquier manipulacion de laboratorio y al
termino de cada practica.
7. Se deberan utilizar guantes apropiados para evitar el contacto con sustancias quimicas o material
biologico. Toda persona cuyos guantes se encuentren contaminados no debera tocar objetos, ni
superficies, tales como: telefono, lapiceros, manijas de cajones o puertas, cuadernos, etc.
8. No se permitira pipetear con la boca.
9. No se permitira corre en los laboratorios.
10.Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras o impactos. Se utilizaran
anteojos de seguridad cuando se manipulen productos quimicos que emitan vapores o puedean
provocar proyecciones, se evitara el uso de lentes de contacto.
11.No se deben bloquear las rutas de escape o pasillos con equipos, maquinas u otros elementos que
entorpezcan la coreecta circulacion.
12.Las superficies de trabajo se descontaminan luego de finalizar el trabajo o al fin del dia y luego de cada
derrame o salpicadura de material viable con desinfectantes efectivos contra los agentes en cuestion.
13.Se requerira el uso de mascarillas descartables cuando exista riesgo de produccion de aerosoles
(mezcla de particulas en medio liquido) o polvos, durante operaciones de pesada de sustancias toxicas
o biopatogenas, apertura de recipientes con cultivos despues de agitacion, etc.
14.Las practicas que produzan gases, vapores, humos o particulas, aquellas que pueden ser riesgosas por
inhalacion deben llevarse a cabo bajo campana.
15.Se debera verificar la ausencia de vapores inflamables antes de encender fuego. No se operara con
materiales inflamables o solventes sobre llamas directas o cerca de las mismas.
16.El amterial de vidrio roto no se depositara con los residuos comunes. Sera conveniente ubicarlo en
cajas resistentes, envuelto en papel y dentro de bolsas plasticas.
17.Sera necesario que todo recipiente que tubiera conteniendo amterial inflamable, y deba ser
descartado sea vaciado totalmente, escurrido, enjuagado con un solvente apropiado y luego con agua
varias veces.
18.Esta prohibido descartar liquidos o material biologico por los desagues de las piletas. En cada caso se
deberan seguir los procedimientos establecidos para la gestion de residuos.
19.Todos los cultivos y otros desechos bioogicos se descontaminan antes de ser desechados mediante
un metodo de descontaminacion aprobado, como por ejemplo, mediante autoclave.
20.Los laboratorios contaran con un botiquin de primeros auxilios con los elementos indispensables para
atender casos de emergencia.
PRÁCTICA N° 1

LAVADO Y PREPARACIÓN DE SUSPENSIONES DE GLÓBULOS ROJOS

Introducción:

Para las pruebas inmunohematológicas es necesario trabajar con glóbulos rojos lavados y suspendidos al
5%.

Los glóbulos rojos deben lavarse para reducir la concentración de leucocitos y aumentar la remoción de
plaquetas y restos celulares, los cuales podrían provocar resultados falsos positivos si se confunden con
aglutinados. Este lavado se realiza con solución salina (pH: 6.5 - 7.5).

Materiales:

Tubos de vidrio (75mm x 12 mm).


Muestra de sangre (con anticoagulante).
Solución salina.
Centrifuga.
Pipeta Pasteur
Parafilm
Jeringas de 10 ml.

Método:

Centrifugar la muestra para separar el plasma de los Glóbulos rojos.


Con una pipeta Pasteur, colocar 0,2 – 0,5 ml de Glóbulos rojos en un tubo.
Completar con Solución Salina hasta 1 cm del borde del tubo de vidrio.
Centrifugar durante 2 minutos a 3400 rpm. Para sedimentar las células.
Extraer la Solución salina.
Agitar el tubo para resuspender los Glóbulos Rojos. Esta secuencia constituye el primer lavado.
Repetir los pasos 3 – 6 por lo menos dos veces. En el último lavado, la solución salina debe ser clara, sin
signos de hemólisis.
Para preparar una suspensión al 5% agregar 5 volúmenes de Glóbulos Rojos lavados con 95 volúmenes
de Solución salina.

Preparar Glóbulos rojos lavados al 10%, 20% y 40%.


PRÁCTICA N° 2

GRUPO SANGUÍNEO: PRUEBA GLOBULAR Y SÉRICA

Introducción:

El sistema de grupo sanguíneo ABO sigue siendo el más significativo en medicina transfusional. Es el único
en el cual el suero de la mayoría de las personas no expuestas a eritrocitos humanos posee anticuerpos
recíprocos constantes y previsibles. A causa de estos anticuerpos la transfusión de sangre ABO
incompatible podría provocar hemolisis intravascular grave, así como también las otras manifestaciones
de las reacciones hemolíticas transfusionales agudas.

Materiales:

Tubos de vidrio (75mm x 12 mm).


Glóbulos Rojos lavados al 5% (A,B y O).
Kit de Grupo Sanguíneo.
Solución salina.
Centrifuga.

PRUEBA GLOBULAR O DIRECTA:

Enfrentamos un reactivo que nos indica la presencia del Antígeno del Glóbulo Rojo, en caso de Rh (el
Antígeno D)

Procedimiento:

A 3 tubos de 75 x 12 mm; rotularlo con Anti A, Anti B y Anti D.


A cada uno de los tubos le dispensamos 1 gota de Glóbulos rojos lavados al 5%.
Agregamos 2 gotas del antisuero respectivo y homogenizamos.
Centrifugar a 3400 rpm x 15seg.
Leemos y anotamos los resultados.

PRUEBA SÉRICA O INVERSA:

Presencia o ausencia de Anticuerpos Anti A, Anti B y Anti D. Si hay anticuerpos en el paciente se va a


demostrar con la aglutinación. Nos confirma la Prueba globular.

Procedimiento:

A 3 tubos de 75 x 12 mm; rotularlo con G.R A, G.R B y G.R O.


A cada uno de los tubos le dispensamos 2 gotas del suero problema.
Agregamos a cada tubo 1 gota de Glóbulos rojos lavados al 5% de G.R A, G.R B y G.R O.
Homogenizamos y Centrifugamos a 3400 rpm x 15seg.
Leemos y anotamos los resultados.
Interpretación:

4+: Sobrenadante transparente y botón compacto

3+: Sobrenadante transparente, botón compacto y pequeños disgregados.

2+: Sobrenadante ligeramente turbio y varios acúmulos de aglutinación.

1+: sobrenadante turbio y grumos

Hemólisis: Sobrenadante color vino tinto, nos dice que no ha habido Rx. Ag – Ac.

Cuestionario:

Diagramar el cuadro de compatibilidad sanguínea.

Explique la relación entre el grupo sanguíneo duffy y la resistencia natural al plasmodium vivax.
PRÁCTICA N° 3

TEST DE COOMBS (DIRECTO - INDIRECTO)

Introducción:

La prueba de Coombs (también conocida como prueba de antiglobulina) es un examen de sangre que
se usa en inmunología y hematología. Este análisis puede detectar la presencia
de anticuerpos en suero que reaccionan con antígenos en la superficie de los glóbulos rojos.

Hay dos tipos distintos de la prueba de Coombs: el directo y el indirecto. La prueba de Coombs
directa detecta anticuerpos ya unidos a la superficie de los glóbulos rojos, y la prueba de Coombs
indirecta detecta anticuerpos libres que pueden reaccionar in vitro con glóbulos rojos que tienen
antígenos específicos.

Materiales:

Tubos de vidrio 12 x 75 mm.


Muestra de sangre anticoagulada del paciente – TCD.
Muestra de sangre anticoagulada del Laboratorio – TCI.
Suero (Muestra del paciente) - TCI
Reactivo (suero de antiglobulina humana poliespecífico).
Albúmina bovina al 22%
Solución salina.
Centrifuga.
Incubadora

TEST DE COOMBS DIRECTO:

Detección de Glóbulos rojos sensibilizados “in vivo”.

Procedimiento:

Preparar Glóbulos rojos lavados al 5% de la muestra de sangre anticoagulada del paciente.


Dispensar 01 gota de la suspensión preparada a un tubo de vidrio.
Agregar 2 gotas del reactivo (suero de antiglobulina humana poliespecifico) al tubo de vidrio.
Centrifugar a 3400 rpm x 15seg.
Leer e interpretar.

TEST DE COOMBS INDIRECTO:


Detección de anticuerpos (Ig G) en suero que pueden reaccionar “in vitro” con Glóbulos rojos
sensibilizados

Procedimiento:

1. Prepara Glóbulos rojos lavados al 5% de la muestra de sangre anticoagulada del laboratorio.


2. Dispensar una gota de la suspensión preparada a un tubo de vidrio.
3. Agregar 02 gotas del suero del paciente al tubo de vidrio.
4. Centrifugar a 3400 rpm x 15 s, leer y anotar.
5. Incubar a temperatura ambiente por 15 minutos.

Centrifugar a 3400 rpm x 15 s, leer y anotar.


Añadir 02 gotas de Albumina bovina 22%
Centrifugar a 3400 rpm x 15 s, leer y anotar.
Incubar a 37°C por 15 minutos.
Centrifugar a 3400 rpm x 15 s, leer y anotar.
Lavar 04 veces con SSF y decantar.
Añadir 02 gotas del reactivo (Suero de Antiglobulina humana poliespecifico)
Centrifugar a 3400 rpm x 15 s, leer e interpretar.

Título: Es una técnica semicuantitativa, busca cuantificar los anticuerpos.

Score: Puntuación de acuerdo al título.

Grado de aglutinación Score

4+ 10
3+ 8
2+ 6
1+ 4
½+ 3
½+ 1
0 0

Cuestionario:

Cuáles son los factores que afectan la prueba de Antiglobulina humana.

En qué circunstancias me daría un FALSO POSITIVO y un FALSO NEGATIVO.


PRÁCTICA N° 4

PRUEBA DE AGLUTINACION EN PLACA (ANTÍGENOS FEBRILES – BRUCELLA)

Introducción:

Son un conjunto de pruebas que sirven como su nombre lo indica para diagnosticar enfermedades que
cursan con fiebre, como Fiebre tifoidea (Salmonella), Brucelosis (fiebre ondulante, fiebre de Malta) y
Rickettsiosis (Fiebre Q, fiebre manchada de las montañas rocallosas).

Materiales:

Placas de vidrio.
Palillos desechables.
Kit de antígenos febriles (“O”, “H” “Paratífico A”, “Paratífico B” y BRUCELLA)
Pipeta automatizada de rango variable.
Suero problema.

PRUEBA CUALITATIVA:

Equilibrar los reactivos a temperatura ambiente.


Resuspender el antígeno con suavidad.
Rotular en la placa de vidrio: “O”, “H”, “A”, “B” y “BRU”.
Mediante el uso de la pipeta, depositar 40 µl de suero problema en los rótulos “O”, “H”, “A”, “B” y “BRU”.
Depositar 1 gota del antígeno sobre cada gota del suero. (Colocar el frasco gotero en posición vertical,
así se liberara 30 µl de suspensión por gota).
Efectuar la mezcla con ayuda de un palillo desechable. Emplear palillos distintos para cada mezcla.
Mover la placa de vidrio de 2 - 3 minutos a 150 rpm.
Observe la aglutinación usando cualquier buena luz indirecta contra oscuridad de fondo.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS:

Reacción negativa: Suspensión uniforme sin cambio visible alguno.

Reacción Positiva: Aglutinación débil o intensa, fácilmente visible macroscópicamente.

Positividad:

4+: 100% de los organismos son aglutinados.

3+: 75 % de los organismos son aglutinados.

2+: 50% de los organismos son aglutinados.

1+: 25 % de los organismos son aglutinados.


PRUEBA SEMICUANTITATIVA:

Si la prueba cualitativa sale positiva, pipetear: 20, 10 y 5 µl del suero problema y repetir los pasos 3 al 7.

Muestra: suero Dilución


40 µl 1/40
20 µl 1/80
10 µl 1/160
5 µl 1/320

CUESTIONARIO:

Explique por qué no puedo utilizar sueros hemolizados para la prueba de investigación de anticuerpos
para brucella.

Explique por qué se podría dar un fenómeno de zona en la investigación de anticuerpos contra brucella.
PRÁCTICA N° 5

PRUEBA DE EMBARAZO (METODO INMUNOCROMATOGRAFIA)

Introducción:

Se basa en la migración de una muestra (suero, plasma, orina, entre otros)a través de una membrana
de nitrocelulosa la cual contiene anticuerpos específicos contra el antígeno o analito que se desea
detectar.

Materiales:

Suero problema
Tira reactiva
Papel toalla

PRUEBA CUALITATIVA:

Sumergir la tira en el recipiente que contiene el suero problema, en forma vertical con las flechas
señalando hacia la orina, durante 15 segundos.

Cuida que el suero moje la tira, solo hasta la zona que indican las flechas.

Retirar la tira de prueba del recipiente y coloca en una superficie horizontal no absorbente.

Espera hasta que aparezcan uno o dos líneas coloreadas. Lee el resultado a los 3 minutos. No interpretes
los resultados luego de 10 minutos.

CUESTIONARIO:

1. La determinación de la HCG no solamente adquiere importancia para la detección de embarazo,


también existen varias situaciones vinculadas a diferentes patologías y tratamientos. ¿En qué
casos se dan? Explique.

2. ¿En qué

consiste la dieta de la hormona del embarazo?.


PRÁCTICA N° 6

PRUEBAS SEROLÓGICAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE SÍFILIS (RPR)

Materiales:

Kit de reactivo de RPR.

Pipeta automática 50 µl.

Solución salina.

Palillos desechables.

PRUEBA DE RPR:

Método Cualitativo:

Dispensar 50 ul de muestra problema en un círculo de la tarjeta de prueba.


Difundir la muestra sobre toda el área del círculo de prueba, utilizando el palillo desechable.
Repita los pasos 1 y 2 para cada muestra usando una pipeta nueva.
Agitar el conjunto de botella de dispensación, invertir y golpear suavemente la aguja para extraer las
burbujas de aire.
Posicionar la aguja perpendicular a la tarjeta de prueba y permitir caer una gota de antígeno sobre
cada muestra.
Rotar la tarjeta de prueba a 100 r.p.m por 8 minutos.
Luego leer inmediatamente los resultados macroscópicamente en buena luz.

INTERPRETACION DE RESULTADOS:

REACTIVO: Grandes agregados en el centro o la periferia de la zona de prueba.

NO REACTIVO: No hay agregados. Apariencia de color gris liso.

Método Cuantitativo:

1. Utilizando una pipeta automática, dispensar 50 µl de solución salina en círculos 1 a 5 de la


tarjeta de prueba. No se diseminan.
2. Utilizando la pipeta, dispensar 50 µl de la muestra problema en la solución salina que se
encuentra en el primer círculo. (Ver Fig. 1)
3. Utilizando la misma punta de la pipeta, mezclar la solución salina y la muestra dibujando la
mezcla arriba y abajo 5 o 6 veces, luego transferir 50 µl de la mezcla al 2do circulo.
4. Realizar diluciones en serie de la misma manera hasta el último círculo. Deseche 50 µl de la
mezcla del último círculo. (Ver Fig. 2)
5. Utilizando los palillos desechables, extender las muestras diluidas sobre toda el área de cada
círculo de la prueba a partir de la dilución más alta.
6. Proceder como en la prueba cualitativa desde el paso 4 en adelante.
INTERPRETACION DE RESULTADOS:

La última dilución que tiene agregados macroscópicos indica el título de la muestra. Si la última dilución
tiene resultados positivos, la serie de diluciones debe ser extendida.
PRÁCTICA N° 7

PRUEBAS REUMATICAS: FACTOR REUMATOIDE - ASO

Materiales:

Kit de reactivo de Factor reumatoide


Kit de reactivo de ASO
Pipeta automática 10 - 100 µl.
Solución salina.
Palillos desechables.

FACTOR REUMATOIDE:

Método Cualitativo:

Utilizando una pipeta desechable, dispensar una gota de suero en un círculo de la tarjeta de prueba.
Utilizando el extremo plano de la pipeta desechable, difundir la muestra sobre toda el área del círculo
de prueba.
Repita los pasos 1 y 2 para los controles (Positivo y Negativo) usando una pipeta nueva.
Resuspender el reactivo FR LATEX con suavidad y permitir caer una gota sobre cada muestra.
Rotar la tarjeta de prueba de 80 - 100 r.p.m por 2 minutos.
Luego leer inmediatamente los resultados macroscópicamente en buena luz.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

POSITIVO: Aglutinación observable en la mezcla. Indica una concentración de FR igual o mayor a 8


UI/ml. Se debe ejecutar el método cuantitativo.

NEGATIVO: Suspensión lechosa uniforme sin aglutinación.

Método Cuantitativo:

Utilizando la Solución salina, diluir la muestra 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 o según sea necesario.
Proceder como en la prueba cualitativa desde el paso 2 en adelante.

INTERPRETACION DE RESULTADOS:

La última dilución que presenta aglutinación indica el título de la muestra. Un estimado de la


concentración de la muestra se puede expresar mediante el uso de la siguiente formula:

UI/ml DE SUERO PROBLEMA = 8 UI/ml x título del suero.


PRÁCTICA N° 8

ANTIESTREPTOLISINA O (ASO):

Método Cualitativo:

Utilizando una pipeta desechable, dispensar una gota de suero en un círculo de la tarjeta de prueba.
Utilizando el extremo plano de la pipeta desechable, difundir la muestra sobre toda el área del círculo
de prueba.
Repita los pasos 1 y 2 para los controles (Positivo y Negativo) usando una pipeta nueva.
Resuspender el reactivo ASO con suavidad y permitir caer una gota sobre cada muestra.
Rotar la tarjeta de prueba de 80 - 100 r.p.m por 2 minutos.
Luego leer inmediatamente los resultados macroscópicamente en buena luz.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

POSITIVO: Aglutinación observable en la mezcla. Indica una concentración de ASO igual o mayor a 200
UI/ml. Se debe ejecutar el método cuantitativo.

NEGATIVO: Suspensión lechosa uniforme sin aglutinación.

Método Cuantitativo:

Utilizando Solución Salina, diluir la muestra 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 o según sea necesario.
Proceder como en la prueba cualitativa desde el paso 2 en adelante.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

Título: Inversa de la máxima dilución a la que se produce aglutinación visible macroscópicamente.

El nivel aproximado de Antiestreptolisina O en la muestra, puede ser calculada por la formula siguiente:

ASO (UI/ml) = Titulo x Sensibilidad de la reacción (200 UI/ml)

Ejemplo: la muestra presenta un título de 1:2. El nivel de ASO es de 2 x 200 = 400 UI/ml.
PRÁCTICA N° 9

COPROLOGIA FUNCIONAL – REACCIÓN INFLAMATORIA.

Las materias fecales están constituidas en unas tres cuartas partes por agua. Las sustancias sólidas del
cuarto restante comprenden:

30% de bacterias muertas.


10 - 20% de grasa.
2 - 3% de proteínas.
10 - 20% de sustancias inorgánicas.
30% de restos no digeribles, componentes sólidos del jugo digestivo como pigmentos biliares y detritus
celulares.

El estudio de laboratorio de muestras fecales de origen humano, permite obtener datos que nos sirve
para determinar:

1.- La situación del funcionalismo digestivo.

2.- Infecciones intestinales causadas por virus, bacterias y hongos. 3.- Infecciones causadas por
parásitos intestinales.

Este estudio tiene su máxima indicación en las diarreas crónicas, y comprende la observación
macroscópica y microscópica de las heces, así como su análisis /químico, bacteriológico y
parasitológico.

ESTUDIO DEL FUNCIONALISMO DIGESTIVO

Con este estudio procuramos saber la digestión de los principios inmediatos. La digestión es el conjunto
de fenómenos mecánicos y bioquímicos que transforman los constituyentes orgánicos más o menos
complejos de los alimentos en sustancias simples directamente asimilables.

Los alimentos son triturados en la boca sufriendo una división física. Luego comienza una disgregación
química mediante fermentos digestivos y elementos bacterianos, siendo absorbidas, las sustancias
transformadas, por la mucosa intestinal y por último los residuos no aprovechables de la digestión son
expulsados fuera del organismo.

ALIMENTACIÓN PREVIA AL ANÁLISIS


Se debe seguir con el régimen habitual de comidas, pero hay que añadir aquellos elementos que nos
pueden suministrar una base para el diagnóstico, como son:

Carne: Se investiga el tejido conjuntivo y fibras musculares. Debe comerse lo más cruda posible.
Patatas: Se investiga la digestión de almidón.
Grasa: Se tomará en forma de leche, mantequilla o carne.
Este plan se sigue durante 3 días y luego se recoge la muestra de heces.

TOMA DE MUESTRA

Se recogerán las heces en un frasco limpio con cierre hermético, no es necesaria la esterilidad. El análisis
se hará en las 12 horas siguientes a la deposición, guardando la muestra en el frigorífico a 4-10º C.

Si el análisis se pospone más de 24 horas se añadirá un volumen igual al de las heces de una solución
acuosa al 5% de formol comercial.

CARACTERES ORGANOLÉPTICOS

OLOR:

Según la ingesta: o Inodoro: Meconio.

Aumentado: Comidas ricas en carne y pescado.

Débil: Dieta vegetariana y láctea.

Ligeramente agrio: Niños de pecho.

Fecaloide normal.

Pútrido (olor a amoniaco)

Debido a la flora proteolítica aumentada. Provoca diarreas de putrefacción (heces alcalinas y gases).

Agrio penetrante o rancio Debido a la flora sacarolítica aumentada. Provoca diarreas de fermentación
(heces ácidas y gases).

Nauseabundo Debido a la descomposición de tejidos, ocasionada por carcinoma, úlceras...

COLOR:

Marrón: Es el color habitual.


Verde:
Puede ser debido a la ingesta (verduras, medicamentos...) o a la presencia de biliverdina (rapidez del
tránsito intestinal, diarreas infantiles).
Rojo:
Debido a la ingesta (remolacha) o a la existencia de hemorragias próximas al ano.
Negro:
Debido a la ingesta (sangre, morcilla, espinacas), a los medicamentos (carbón, hierro, bismuto) o a
hemorragias internas (heces pastosas, melenas).
Blanco:
Debido a la ingesta (leche, bario, caolín...) o a la ausencia de bilis fundamentalmente.
Amarillo:
Debido a la ingesta (régimen lácteo) o a diarreas de fermentación hidrocarbonada.
CONSISTENCIA:

Puede ser dura, normal, pastosa, líquida...


FORMA: Varía con la consistencia
Cilíndrica: Es la normal.
Laminada o en cinta: Debido a papilomas.
Bolitas secas y duras: Estreñimiento.

Bolitas en masas: Se presenta en la Salmonelosis.


Bola maleable del tamaño de un puño: Se presenta en la atonía del recto (personas ancianas).

VISCOSIDAD:

Se determina tocando las diferentes partes de las heces con un agitador de vidrio.
Viscosas (pastosas): Se adhieren al agitador.
Poco viscosas: No se adhieren al agitador.
Grasas: Tienen gran maleabilidad moldeándose en ellas el agitador, como tierra amasada.

EXAMEN MACROSCÓPICO

Para este examen se tritura ligeramente en un mortero con agua una cantidad de heces del tamaño de
una nuez. Luego se pasa a una placa de Petri y colocamos esta sobre una cartulina blanca y negra. Los
fragmentos de carne aparecen de color gris o marrón.

El tejido conectivo tiene forma de membranas o paquetes filamentosos. Se puede confundir con moco.
Para diferenciarlo se añadirá ácido acético al 30% y si desaparece es tejido conectivo.

El moco se puede presentar de varias formas: amorfo, transparente, opaco (con restos celulares) y
membranoso (en forma de paquetes o moldes de la mucosa).

La presencia de moco es importante, salvo en los recién nacidos, y siempre deberá resaltarse en el
informe.

ANÁLISIS MICROSCÓPICO

Nos aporta datos más fidedignos acerca de los trastornos de la digestión. Para ello habrá que instaurar
la alimentación explicada anteriormente, si no se hace así la significación del estudio es muy limitada.

Para este estudio se hace una suspensión de heces en agua destilada o suero fisiológico.

Se coge una cantidad de heces, del tamaño de una castaña, y se coloca en un mortero, copa, vaso de
precipitado o tubo de ensayo.

Se añade agua o suero fisiológico y mezclar con una varilla hasta formar una papilla homogénea y fina,
ni muy fluida ni muy espesa.

Se coloca una gota de esta suspensión en un portaobjetos y se pone un cubreobjetos encima, cuidando
que se extienda formando una capa delgada, homogénea, sin burbujas de aire. No se debe aplastar el
cubre.
Se observará con el objetivo de x10 aumentos, obteniendo una visión de conjunto, y luego se enfoca
con el de x40 aumentos.

Cuando se trata de heces líquidas, se debe hacer una mezcla homogénea y se /coloca una gota
directamente al portaobjeto.

Podremos observar:

CÉLULAS: Normalmente epiteliales de las últimas porciones del intestino. No son patológicas.

LEUCOCITOS: Se observarán deformados. Si se encuentran en poca cantidad no es patológico. Se


observan mejor mezclando la gota de la suspensión fecal con otra de azul de metileno de Loefler.

HEMATÍES: Es muy raro observarlos ya que se digieren. Si aparecen será a causa de evacuación muy
rápida o hemorragias en tramos intestinales bajos.

CRISTALES: Presentan el mismo aspecto que en el sedimento urinario.

Hay unos, característicos del parasitismo intestinal, llamados cristales de Charcot-Leyden, presentando
una forma típica de agujas de brújula.

FIBRAS MUSCULARES: Se pueden observar de diferentes formas dependiendo del grado de digestión:

Mal digeridas:

Fragmentos rectangulares estriados, débilmente amarillos. Las estrías son transversales y


longitudinales. Los bordes del rectángulo son rectos.

Parcialmente digeridas:

Trozos más pequeños con los bordes redondeados y las estrías longitudinales.

Bien digeridas:

Trozos muy pequeños con los bordes redondeados y sin estrías.

La presencia de fibras musculares mal digeridas se llama CREATORREA. Se puede deber a una
insuficiencia gástrica o pancreática.

TEJIDO CONJUNTIVO. Se observa como fibras o filamentos que se reúnen en fascículos y se


entremezclan entre si. Son incoloros y no poseen estriación. Se podría confundir con el moco, pero se
distinguen porque se transparentan al añadirle ácido acético al 30 %.

ALMIDÓN. Para su investigación se añade a la gota de emulsión fecal una gota de lugol. Los gránulos de
almidón tomarán un u otro dependiendo del grado de digestión. También podrán estar dentro de
células o aislados:

No digeridos: Azul oscuro, casi negro.

Parcialmente digeridos: Rojo o rosa.

Digeridos: Amarillos o color arenilla.


El tejido muscular, al añadir almidón a la preparación toma un color rojo-caoba. La presencia de
almidón no digerido en las heces se llama AMILORREA.

LÍPIDOS.

Para observarlas mejor usaremos el reactivo Sudam III. Una gota de este colorante se mezclará con una
gota de la suspensión fecal. Los lípidos o grasas se encuentran en las heces en forma de:

Ácidos grasos: Tienen aspecto cristalino, en forma de escamas o agujas finas rectas o curvadas.
Difícilmente se tiñen.

Grasa neutra: Aparece como gotitas de color rojo o naranja

Si la temperatura es fría (< 20º C) las gotas se transforman en masas o placas algo amarillentas o rojas.

Jabones: Difíciles de reconocer al microscopio. No se tiñen. Se presentan como masas amorfas o


cristales en forma de agujas cortas.

En la observación lo mas importante son las grasa neutras. Se informa positivamente a partir de 15-20
gotas/campo (objetivo x40). El aumento patológico de grasas en heces se llama ESTEATORREA. Si en el
microscopio se observa mas de 60 gotas /campo es seguro esteatorrea

Algunas veces, para observar las grasas se calienta el portaobjetos suavemente a la llama. De esta
forma todas las grasas (ácidos grasos, neutros y jabones) se transforman en gotitas de color rojo-
anaranjado (con Sudan III). En el estudio de las grasas en heces puede inducirnos a error, los
supositorios, los enemas oleosos y los portaobjetos y cubreobjetos mal desengrasados.

ESTUDIO FÍSICO-QUÍMICO

pH

Varía entre 6,8 y 7,2 dependiendo del régimen alimenticio. Los valores normales se van a modificar
según el proceso digestivo. La medición se hace impregnando un papel indicador con una varilla de
vidrio que contenga heces. La lectura se efectúa por el reverso del papel.

SANGRE

También se llama este análisis investigación de hemorragias ocultas. Se puede observar sangre en
heces, de color rojo, proveniente de fisuras anales o hemorroides. Esto no se considera importante.

Cuando proviene de hemorragias gástricas, duodenales, cáncer de colon, etc., la sangre se digiere,
tomando las heces un color oscuro, casi negro. Esta sangre si es importante.

Para este análisis es importantísimo que el paciente durante los 2-3 días anteriores a la toma de
muestras se someta a un régimen riguroso (“blanco”), sin carne, pescados, embutidos, lentejas,
espinacas, plátanos etc., es decir alimentos ricos en peroxidasas. Tampoco deberá tomar
medicamentos que contengan hierro o hemoglobina, o que puedan provocar pérdidas sanguíneas
como salicilatos o esteroides. La alimentación permitida consiste en: Huevos, patatas, cebolla, arroz,
garbanzos, pan y leche.
La mayoría de las pruebas para detectar hemorragias ocultas en heces se basan en la determinación de
peroxidasas como indicativo del contenido de hemoglobina. Las más importantes son:

REACCIÓN DE LA BENCIDINA:

Sobre un papel de filtro manchado de heces, se ponen unas gotas de bencidina y agua oxigenada de 10
volúmenes. Si el resultado es (+), como resultado de la presencia de peroxidasa, se formará un halo de
color verde-azulado en torno a la mancha.

REACCIÓN DE WEBER O DEL GUAYACO:

La prueba es igual que la anterior pero en lugar de poner bencidina se pone guayaco

Estas pruebas son muy inespecíficas y dan habitualmente falsos positivos. La reacción de la bencidina es
más sensible que la del guayaco.

Actualmente existe una técnica que no se basa en la peroxidasa:

PRUEBA DEL CROMO RADIOACTIVO:

Tiene más sensibilidad y especificidad que las anteriores. Se basa en la capacidad del Cr radioactivo
(Cr51) para ser fijado por los hematíes y por el hecho de no ser reabsorbido en el tracto
gastrointestinal. Así pues, es excretado por las heces en las que puede ser medido por
espectrofotometría de rayos ã.

PIGMENTOS BILIARES

Investigaremos en las heces la presencia de bilirrubina y estercobilinógeno mediante 2 métodos:

PRUEBA DEL SUBLIMADO:

Más sensible para Estercobilina. Se hace poniendo en un tubo de ensayo:

Dilución de heces.................................... 5 ml.

Sublimado (ClHg).................................... 5 ml.

Se agita y se incuba a 37º C durante 1-2 horas y se observan los resultados:

ROJO.............................. ESTERCOBILINA o ESTERCOBILINÓGENO

VERDE............................ BILIRRUBINA.

BLANCO......................... Ausencia de Pigmentos.

PRUEBA DE GRIGAUT:

Más sensible para bilirrubina. Se hace poniendo en un tubo de ensayo:

ClH concentrado...................................... 5 ml.


Cl3Fe (10%)............................................. 2 gotas.

Dilución de heces.................................... 5 ml.

Se agita y se calienta ligeramente observando los resultados:

VERDE..................................... BILIRRUBINA.

ROJO........................................ ESTERCOBILINÓGENO.

Las 2 pruebas se hacen simultáneamente, debido a su diferente sensibilidad, y los resultados se


interpretan así:

SUBLIMADO GRIGAUT

ESTERCOBILINOGENO + + Heces normales


BILIRRUBINA + + Tránsitointestinal acelerado
ESTERCOBILINÓGENO + - Tránsitointestinal medianamente
acelerado
BILIRRUBINA - - Obstrucción biliar

ENZIMAS PROTEOLÍTICAS:

Se intenta comprobar la presencia de Tripsina, Quimiotripsina, etc. Las heces normales (hasta una
dilución 1/100) licuan la gelatina.

La prueba se realiza aplicando una gota de diferentes diluciones (1/5, 1/10, 1/50, 1/100) de la heces a
estudiar de heces sobre una película de gelatina. Se considera un resultado positivo si la gelatina queda
disuelta en ½ hora.

Positivo hasta una dilución 1/100........................... Digestión normal.

Positivo hasta una dilución 1/50............................. Digestión media.

Positivo hasta una dilución 1/10..............................Digestión deficiente.

CUERPOS REDUCTORES O AZÚCARES REDUCTORES EN HECES

Las heces deben de ser recientes, no debe dejarse pasar más de una hora desde que son emitidas hasta
que se realiza el examen.

Hay que diluir una parte de heces en dos partes de agua destilada, mezclar bien y centrifugar a un
número bajo de revoluciones (1.500 rpm.). Se toman 15 gotas del sobrenadante, se colocan en un tubo
de vidrio y se le añaden dos gotas de ClH 1 N. Luego calentamos para desdoblar la sacarosa.

Una vez que ha enfriado el líquido anterior, se añade una tableta de CLINITESTÒ (Ames) para azúcares
reductores y se deja disolver. A continuación comparamos con la escala de colores que lleva el reactivo.

El resultado se da en g./litro. El resultado será negativo si es inferior a 2,5 g./l. Entre 2,5 y 5 es dudoso y
será positivo si es mayor de 5 g./l.
PRÁCTICA N° 10

UROCULTIVO

Las infecciones del tracto urinario (UTI) son unas de las infecciones más comunes en humanos. En
general un limitado número de especies bacterianas son responsables de la mayoría de estas
infecciones. La presencia de microrganismos en orina se denomina bacteriuria , sean o no ,
causantes de infección. UTI puede ocurrir a toda edad desde neonatos hasta ancianos, en
personas sanas o comprometidas y debilitadas. Es responsable por el aumento de los costos en
programas de salud, como en morbilidad, mortalidad y pérdida de productividad.

MATERIALES

Muestras de orina

Asa calibrada de platino o descartable de 0,001 mL ó 0,01 mL. Guantes de látex.

Contenedor de material contaminado. Pinza estéril.

Propipeta o pipetor automático.

Placas con agar sangre de carnero (AS) o CLED Placas con agar Mc Conkey (McC)

Tubos con TSI Tubos con LIA

Tubos con Citrato de Simons Tubos con medio SIM

PROCEDIMIENTO

Mantener las muestras en refrigeración (4 °C) hasta su procesamiento por cultivo.

Las placas con AS y McC que se utilizarán en el urocultivo deben estar a temperatura ambiente.
Rotular las placas.
Si el asa calibrada no es descartable, esterilizar el asa de siembra flaméandola en el mechero
Bunsen hasta que se ponga rojo vivo. Dejar enfriar el asa.

Tomar el frasco con la muestra de orina, abrir la tapa y flamear la boca del frasco en el mechero
Bunsen.

Tomar la muestra de orina con el asa de siembra estéril introduciéndola y sacándola del frasco en
forma vertical Tapar el frasco con la muestra.

Inocular en el centro de la placa con AS a partir del cual se extiende la muestra, hacia delante y
hacia atrás. Luego, sin quemar el asa, el inóculo se disemina uniformemente con trazos
perpendiculares a la siembra inicial en toda la placa

Proceder de la misma forma para el agar Mc Conkey. Esterilizar el asa de siembra en el mechero.

Concluida la siembra, cerrar la placa y colocarla con la parte que tiene el medio de cultivo hacia
arriba. Incubar la placa de AS y Mc Conkey a 35 – 37° C en condiciones aeróbicas por 24 horas.

Tomar una azada de la muestra sin centrifugar, realizar un extendido y colorearlo por GRAM. Hacer
un sedimento de orina y observarlo. Realizar su reporte.

Lectura

Realizar la evaluación a las 24 horas, si no hay crecimiento bacteriano dejar incubar hasta las 48
horas.

La evaluación consiste en realizar el recuento de colonias, cuyo resultado se multiplica por el


factor de dilución para obtener las UFC por mL.

RESULTADOS

Anote e interprete sus resultados

FUENTES DE INFORMACION
1.-CUMITECH 2A: LABORATORY DIAGNOSIS OF URINARY TRACT INFECTIONS. ASM PRESS., MARCH
1987.-

PRÁCTICA N° 11

CULTIVO DE SECRECION DE HERIDA

Un paso importante en el tratamiento de la enfermedad infecciosa es conocer el microorganismo


que está ocasionando la infección, para ello se realiza el cultivo respectivo, esta prueba se realiza
principalmente en muestras de esputo, Hisopados faríngeos, nasales, oculares, de herida, de oído,
vaginales, uretrales, pústulas y otros. La pruebase realiza en tres fases: La primera
fase (Macroscópica) consiste en reportar las características físicas de la muestra. En la segunda
fase (Microscópica) la muestra es analizada para poder observar células u otros
elementos que pueden estar presentes. La tercera fase (Bacteriológica) puede
identificar al microoganismo .

MATERIALES

Muestras de secreción de herida purulenta. Contenedor de material contaminado.

Placas de Agar sangre de carnero Placas Agar Mc Conkey

Placas de Agar Manitol sal Placas de Agar chocolate Agar Triple Sugar Iron Agar Lisina Iron LIA
Reactivo de oxidasa Medio SIM

Agar Citrato de Simmons Tubos con agar Urea Tubos con caldo plasma

PROCEDIMIENTO

Realizar los cultivos en una cabina de bioseguridad o cerca del mechero Bunsen.
Utilizar placas con medios de cultivo cuando éstas hayan alcanzado la temperatura ambiente.

Con una porción de la muestra hacer un extendido y colorearlo por GRAM. Inoculación de la
muestra:

Muestra de aspirado purulento: Con una pipeta Pasteur inocular una gota de la muestra en un
extremo de la superficie de la placa de agar de sangre de carnero, agar Mc Conkey, agar manitol
sal y agar chocolate.

Hisopado de secreción: Frotar rotando el hisopo sobre la superficie de los medios de cultivo
tratando que toda su superficie haga contacto con el agar, empezando con el agar chocolate, agar
sangre de carnero, Mc Conkey u otros medios.

Esterilizar el asa de siembra en el mechero de Bunsen hasta que se ponga rojo vivo. Dejar enfriar
el asa.

Utilizando el asa de siembra y tomando como referencia central el inóculo de la muestra, realizar
la siembra por dispersión agotamiento en cuatro cuadrantes de la placa con el propósito de
obtener colonias aisladas.

Esterilizar el asa de siembra en el mechero.

Concluida la siembra, cerrar la placa y colocarla con la parte que tiene el medio de cultivo hacia
arriba.

Incubar las placas a 35 – 37 °C por 24 – 48 horas en condiciones aeróbicas. Lectura

A las 24 horas observar el crecimiento de colonias. Si no se observa crecimiento, seguir incubando


hasta las 48 horas.

Realizar la identificación según lo aprendido en las prácticas anteriores.

RESULTADOS

Anote e interprete sus resultados

FUENTES DE INFORMACION
-ESSENTIAL PROCEDURES FOR CLINICAL MICROBIOLOGY H.D.Isenberg. American Society for
Microbiology, 1998.-

-CUMITECH 23: INFECTION OF THE SKIN AND SUBCUTANEOUS TISSUE. ASM PRESS., JUNE 1988.-

-CUMITECH 13A: LABORATORY DIAGNOSIS OF OCULAR INFECTIONS. ASM PRESS., SEPTEMBER


1994.-

-CLINICAL LABORATORY TECHNICAL PROCEDURE MANUALS 3RD EDITION NCCLS DOCUMENT GP2-
A3 1996.-

PRÁCTICA N° 12

CULTIVO DE SECRECION VAGINAL Y URETRAL

Las infecciones vaginales son aquellas en las cuales el agente etiológico coloniza la mucosa vaginal
produciendo secreción asintomática. Los tres agentes etiológicos más importantes son la flora
vaginal mixta aeróbica y anaeróbica , levaduras y Trichomonas vaginalis .menos común es el
Streptococcus agalactiae y Staphylococcus aureus

.MATERIALES

Hisópos estériles
medio de transporte Amies. Tubos con suero fisiológico estéril
agar chocolate
agar sangre
agar Mac Conkey
agar Sabouraud
agar manitol sal
Reactivos de la tinción de Gram.
Agar Triple Sugar Iron
Agar Lisina Iron LIA
Reactivo de oxidasa
Medio SIM
Agar Citrato de Simmons
Tubos con agar Urea
Tubos con caldo plasma

PROCEDIMIENTO:

DIA 1:

El alumno traerá muestras de secreción vaginal y secreción uretral obtenidas de pacientes.

Realizar una coloración de Gram de las láminas obtenidas.

Suspender la muestra en suero fisiológico sobre una lámina portaobjetos, colocar la laminilla
cubreobjetos y observar al microscopio con el lente de 400X buscando la presencia de
Trichomonas vaginalis y levaduras.

Sembrar la muestra en las placas de agar sangre, agar chocolate, agar Mac Conkey y Sabouraud
según las indicaciones del profesor.

Incubar las placas de agar chocolate en presencia de CO2 a 37 oC

Las demás placas incubarlas a 37 oC en condiciones aerobias

DIA 2:

Las placas de cultivo se deben leer a las 48-72 horas de incubación. La presencia de colonias
sospechosas con las pruebas de identificación presuntiva y posteriormente definitivas indican la
presencia de patógenos en las muestras en las muestras.

Realice las pruebas necesarias para identificar a los patógenos.

RESULTADOS:

Anote e interprete sus resultados.

FUENTE DE INFORMACION

Murray, PR et al., Manual of Clinical Microbiology, 9th Ed., ASM Press, Washington, DC, 2007 .
Baron, EJ et al., Cumitech 17A: Laboratory diagnosis of female genital tract infections, Amer.
Soc. for Microbiol., Washington DC, 1993.

CDC/MMWR. Prevention of Perinatal Group B Streptococcal Disease: Revised Guidelines from


CDC. August 16, 2002

PRÁCTICA N° 13

ESPERMATOGRAMA

MUESTRA: Semen

RECOLECCION DE LA MUESTRA

Lo ideal es recoger la muestra después de 48 horas y no más de 7 días de abstinencia sexual. En el


formulario que acompaña a cada análisis de semen se debe anotar el nombre del paciente, el
período de abstinencia, así como la fecha y la hora de la recolección.

Lo ideal es que la muestra se recoja en la intimidad de una dependencia próxima al laboratorio. De


lo contrario, se debe enviar al laboratorio antes de transcurrida una hora de recolección y si la
motilidad de los espermatozoides es anormalmente baja (menos del 25 % con progresión lineal
rápida), examínese una segunda muestra lo antes posible después de la recolección.

La muestra debe obtenerse mediante masturbación y eyacularse dentro de un recipiente de vidrio


o plástico de boca ancha que esté limpio; si se usa plástico, verifíquese la ausencia de efectos
tóxicos sobre los espermatozoides. Si se va a hacer un análisis bacteriano, el paciente debe orinar
y luego lavarse y enjuagarse las manos y el pene antes de recoger la muestra en un recipiente
estéril.

Por lo general, no se deben usar condones para recoger semen porque pueden comprometerse la
viabilidad de los espermatozoides.

El coitus interruptus no es aceptable para hacer la recolección del semen, porque puede perderse
la primera porción del eyaculado, que suele contener la mayor concentración de espermatozoides.
Además habrá contaminación celular y bacteriana de la muestra y el pH ácido del líquido vaginal
ejercerá una influencia adversa sobre la motilidad de los espermatozoides.

Las muestras deben protegerse de las temperaturas extremas (no menos de 20 oC ni más de 40
oC) durante el traslado al laboratorio.

El recipiente debe rotularse con el nombre del sujeto, la fecha y la hora de la recolección y la
eyaculación y la duración de la abstinencia.

EXAMEN MACROSCOPICO LICUEFACCION.-

Una muestra de semen normal se licúa dentro de los 60 minutos de la eyaculación, a temperatura
ambiente. En algunos casos la licuefacción no es completa a los 60 minutos y esto debe ser
informado. La presencia de hilos de moco, señal de licuefacción incompleta, puede interferir con
el recuento celular. El semen normal puede contener gránulos gelatinosos que no se licúan y cuya
significación no es conocida.

La muestra debe ser mezclada cuidadosamente en el recipiente original. Un mezclado incompleto


es la principal causa de error en el recuento de espermatozoides. Un mezclado continuo mediante
la rotación del recipiente durante el tiempo de licuefacción contribuye a disminuir este error.

ASPECTO

La muestra de semen debe ser examinada inmediatamente luego de su licuefacción o dentro de


los 60 minutos de eyaculada, por simple inspección a temperatura ambiente. Una muestra normal
tiene una apariencia homogénea gris – opalescente.

Puede aparecer menos opaca cuando la concentración de espermatozoides es muy baja y marrón
cuando contiene glóbulos rojos.
VOLUMEN

El volumen del eyaculado debe ser medido en un cilindro graduado de base cónica o por
aspiración de la muestra completa en una pipeta, utilizando un aparato de aspiración mecánica. Si
la muestra será utilizada para un espermocultivo, se debe utilizar material estéril para su manejo.
Las jeringas plásticas y agujas de inyección no deben ser utilizadas para este propósito pues
alteran la calidad del semen, especialmente la motilidad.

CONSISTENCIA

La consistencia de la muestra (viscosidad) puede ser estimada aspirando la muestra en una pipeta
de 5 ml. Y permitiendo la libre caída de gotas, en las que se observa la longitud del filamento
formado. En una muestra normal se observan gotas pequeñas y bien definidas mientras que en
una muestra de consistencia aumentada se formará un filamento mayor de 2 cm. Como método
alternativo, la consistencia se puede evaluar introduciendo una varilla de vidrio en la muestra y
observando la longitud del filamento que se forma al retirarla. Este no debe exceder los 2 cm.

Una consistencia anormal, por ejemplo debida a un alto contenido de moco, puede interferir con
la determinación de varias características del semen, como ser la motilidad y la concentración.

PH

Se distribuye una gota de semen sobre papel de pH (rango de 6.1 a 10). Al cabo de 30 segundos el
color de la zona impregnada debe ser uniforme y se compara con la cartilla de calibración para
determinar el pH de la muestra.

Todo tipo de papel de pH utilizado para este análisis debe ser controlado con estándares de pH
conocido antes de ser usado.

El pH de la muestra debe ser medido dentro de los 60 minutos de la eyaculación y debe caer en el
rango de 7.2 a 8.0. cuando el pH es menor de 7.0 en una muestra con azoospermia se debe
sospechar disgenesia del conducto deferente, las vesículas seminales o el epidídimo.

EXAMEN MICROSCOPICO

Durante el examen microscópico inicial de la muestra se realiza una estimación de la


concentración y motilidad de los espermatozoides, de la presencia de aglutinación y de otras
células.
Se deposita 10 ul. De semen en un portaobjetos y se cubre con un cubreobjetos de 22 x 22 mm. Es
importante que la cantidad de semen depositado y el tamaño del cubreobjetos utilizado sean
siempre los mismos para que todos los exámenes se realicen en una preparación del mismo
espesor (aproximadamente 20 um.). Esta profundidad permite la expresión completa del
movimiento rotatorio de los espermatozoides normales.

Este preparado se examina con una magnificación de 400 x. El peso del cubreobjetos distribuye la
muestra para una visión óptima y se debe permitir la estabilización de la misma durante un
minuto. Dado que la motilidad y la velocidad de los espermatozoides son muy dependientes de la
temperatura, estas determinaciones deben hacerse a una temperatura tan próxima a los 37 oC
como sea posible. El resto del examen debe ser realizado a temperatura ambiente, procurando
estandarizar entre los 20 y 24 oC.

Cuando el número de espermatozoides varía considerablemente entre campos visuales significa


que la muestra no es homogénea y que el semen debe ser mezclado cuidadosamente.

MOTILIDAD

El campo microscópico es recorrido sistemáticamente y la motilidad de cada espermatozoide


observado se clasifica en:

G3 motilidad progresiva rápida G2 motilidad progresiva lenta G1 motilidad no progresiva

G0 inmóviles

Usualmente hace falta contar 4 a 6 campos para acumular 100 espermatozoides y obtener un
porcentaje de cada categoría. Se repite la cuenta con otros 100 espermatozoides y se obtiene un
promedio para cada categoría, que luego será informado.

Es recomendable repetir este recuento de la motilidad en una segunda gota de semen preparada
de la misma manera. Los resultados de ambos recuentos, si no difieren en más del 10 %, se
promedian. Para verificar si se cumple este criterio, se suman los porcentajes de categorías G3,
G2, G1 (motilidad total) y se establece que la suma de los valores de las dos muestras no difiera en
más de 1/20 entre cada recuento. En aquellas muestras en que la motilidad total sea menor al 50
%, se compara el porcentaje de espermatozoides clase

G. entre ambos recuentos. Cuando la diferencia en el recuento es superior al 10 % se debe


preparar y contar una tercera gota y estos resultados se promedian con los dos anteriores.

ELEMENTOS CELULARES DIFERENTES DE LOS ESPERMATOZOIDES


El eyaculado siempre contiene células diferentes de los espermatozoides. Encontramos células
epiteliales del tracto uretral, células de la espermatogénesis y leucocitos. Estas células han
recibido el nombre genérico de “células redondas”. Su concentración debe ser determinada en las
preparaciones frescas utilizando la cámara de Newbauer.

Como regla general, un eyaculado normal debe contener menos de 5 x 106 células redondas/ml y
el número de leucocitos no debe exceder 1 x 10 6/ml.

Las células redondas no identificadas como leucocitos incluyen las espermáticas, espermatocitos y
espermatogonias. Debido a que solo se incluyen los espermatozoides en el recuento, la
concentración de las otras células germinales y los leucocitos pueden ser calculados de manera
relativa a aquellos.

Si (N) es la cantidad de un tipo celular dado contado en los mismos campos que 100
espermatozoides y si (S) es el recuento de espermatozoides en millones por ml, se puede calcular
la concentración de la célula dada en millones por ml (C) con la siguiente fórmula, puesto que la
relación entre el número de células y el número de espermatozoides se considera igual en el
extendido y en el semen:

C= N x S 100

por ejemplo, si la cantidad de células germinales inmaduras es 10 por 100 espermatozoides


contados y si el recuento del semen es 120 x 106/ml, la concentración de células germinales
inmaduras es:

10 x 120 x 106 = por mililitros = 12 millones/ml

100

AGLUTINACION

La aglutinación de los espermatozoides significa que los espermatozoides móviles se adhieren


entre ellos cabeza con cabeza, pieza intermedia, cola con cola o de otras maneras, como pieza
intermedia con cola. A la adherencia de espermatozoides inmóviles o móviles con filamentos de
moco, con células que no son espermatozoides o con detritos no se le considera aglutinación y no
se la debe anotar como tal.

La presencia de aglutinación sugiere la existencia de una causa inmunológica de la infertilidad,


pero no es evidencia suficiente para probarla. La aglutinación se determina en

10 campos microscópicos elegidos al azar. El número promedio de espermatozoides aglutinados


entre sí se estima con un error menor al 5 %. El porcentaje de espermatozoides aglutinados puede
ser un dato de importancia. Sin embargo, aún la presencia de unos pocos espermatozoides
aglutinados debe ser informado. El tipo de la aglutinación: cabeza-cabeza; cola-cola o mixto
también debe ser informado.

VIABILIDAD DE LOS ESPERMATOZOIDES


La viabilidad espermática refleja la proporción de los espermatozoides totales que están “vivos”
de acuerdo al criterio de exclusión de algún colorante vital o mediante la expresión de su
capacidad osmorreguladora cuando se los expone a condiciones hipoosmóticas.

Reactivo: Eosina Y; hágase una solución al 0,5% (p/v) en solución fisiológica.

Mezclese una gota (10 a 15 ul) de semen fresco con una gota de solución de eosina al 0,5% en un
portaobjetos y cúbrase con el cubreobjetos.

Al cabo de dos minutos obsérvese el preparado a 400 X con luz intensa o contraste de fase.

Se cuentan cien espermatozoides, diferenciando a los espermatozoides no teñidos (vivos) de los


teñidos (muertos). Estas técnicas de tinción supravital permiten diferenciar a los espermatozoides
inmóviles pero vivos de los que están muertos.

RECUENTO DE ESPERMATOZOIDES

La concentración de espermatozoides puede determinarse con el método de la cámara de


Newbauer. En este procedimiento se prepara una dilución de 1:20 con cada muestra homogénea
mezclando bien 50 ul de semen licuado con 95 ul de diluyente. Este último consiste en 50 gr. de
NaHCO3, 10 ml de formalina al 35% (v/v) y agua destilada en cantidad suficiente para obtener un
volumen final de 1000 ml.

Si el examen preliminar del semen indica que la concentración de espermatozoides es demasiada


grande o demasiada baja, se debe ajustar el grado de dilución de la muestra como corresponda.

Así, para las muestras que contienen menos de 20 x 106 espermatozoides/ml, se puede emplear
una dilución 1:10 mientras que para las que contienen más de 100 x 106 espermatozoides/ml
corresponde una dilución 1:50.

La muestra diluida se debe mezclar muy bien y luego se pasa una gota a una cámara de Newbauer.
Déjese reposar por uno a cinco minutos, con preferencia en una cámara húmeda para reducir a un
mínimo el secado. En este tiempo las células sedimentan y luego se cuentan con el microcopio
óptico o de contraste de fase con una magnificación de 100 X o 400 X. Solo se cuentan los
espermatozoides con cola. Los espermatozoides sin cabeza y las cabezas sin cola no se cuenta.

El procedimiento para contar es el siguiente: el cuadrado central de la cámara de Newbauer


contiene 25 cuadrados grandes, cada uno de los cuales contiene 16 cuadrados más pequeños;
para las muestras que contienen menos de 10 espermatozoides por cuadrado se debe contar los
25 cuadrados; para las que contienen 10 a 40 espermatozoides por cuadrado pueden estudiarse
10 cuadrados, y para las que contienen más de 40 espermatozoides por cuadrado es suficiente
analizar cinco cuadrados. Si un espermatozoide está en la línea que divide a dos cuadrados
adyacentes, sólo se lo debe contar si está en el lado superior o izquierdo del cuadrado que se
estudia.

Se cuentan ambas cámaras del hemocitómetro y se calcula un promedio de ambos recuentos,


siempre que la diferencia entre ellos no exceda el 10%. En el caso de que los recuentos difieran en
más de un 10%, ambos se descartan y se prepara una nueva dilución.

Para determinar la concentración de espermatozoides, en millones/ml del semen original, se


divide el promedio del recuento por el factor de conversión que aparece en el recuadro. Por
ejemplo, si la muestra fue diluida 1 + 19 y se contaron 162 y 170 espermatozoides en 10
cuadrados de cada cámara, la concentración de espermatozoides en la muestra original es de 83 x
106/ml (166 dividido entre 2).

Factores de corrección

Número de cuadrados grandes contados

Dilución
25 10 5
(semen + diluyente)

1+9 10 4 2

1 + 19 5 2 1

1 + 49 2 0.8 0.4

De Mortimer, 1985.

ANALISIS DE LAS CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS DE LOS ESPERMATOZOIDES

Los espermatozoides humanos pueden ser clasificados utilizando un microscopio convencional de


campo claro, una coloración por el método de Papanicolaou o Giemsa..

Se deben tomar en cuenta las siguientes categorías de defectos:

Defectos de tamaño/forma de la cabeza: puede ser grande, pequeña, acintada, piriforme, amorfa,
vacuolada (> 20% del área ocupada por vacuolas no teñidas), doble y toda combinación entre
estos.
Defectos del cuello y pieza media: incluye la ausencia de cola (cabezas aisladas), cola mal insertada
o doblada (la cola en un ángulo de 90º con respecto al eje longitudinal de la cabeza), pieza media
distendida, irregular o doblada, pieza media anormalmente fina (falta la batería de mitocondrias),
y toda combinación entre éstos.

Defectos de la cola: puede ser: corta, múltiple, en horquilla, rota (ángulo > 90 grados), de espesor
irregular, arrollada, con gota citoplasmática terminal, y toda combinación entre éstos.

Las gotas citoplasmáticas mayores de 1/3 de la superficie de la cabeza normal. Las gotas
citoplasmáticas se encuentran, habitualmente, en el cuello y pieza intermedia pero algunas células
inmaduras pueden tenerla en algún lugar de la cola.

Se deben contar al menos 100 espermatozoides, preferiblemente 200, con un objetivo de


inmersión de 100 X en campo claro y una preparación teñida.

Sólo se cuentan las células reconocibles como espermatozoides. Las células inmaduras no se
cuentan como espermatozoides. Las cabezas aisladas se cuentan como formas anormales, pero no
se cuentan las colas libres. Si se nota una alta incidencia (>20% de los espermatozoides) de formas
en “cabeza de alfiler” esto debe ser informado separadamente. Estas formas no se cuentan como
defectos de la cabeza ya que rara vez contienen cromatina o estructuras propias de la cabeza.

Se pone una gota de semen en el medio de un portaobjetos limpio y se apoya otro portaobjetos
limpio sobre el primero. La gota se extiende entre ambas superficies que luego se separan
suavemente, deslizando uno sobre otro, para obtener dos extendidos.

El contorno de todas las partes del espermatozoide debe ser claramente visible. Con la tinción de
Papanicolaou la cabeza aparece teñida de azul claro en la región acrosomal y azul oscuro en la
zona posacrosomal. La pieza media puede teñirse de rojo, pero esto es considerado anormal sólo
cuando está groseramente distendida o es irregular. La cola también se teñirá de azul. Las gotas
citoplasmáticas, usualmente ubicadas detrás de la cabeza en la pieza media, se tiñen de verde.

VALORES NORMALES DE LAS VARIABLES DEL SEMEN

Volumen 2 ml o más

PH 7,2 – 7,8

Concentración de espermatozoides 20 x 106 espermatozoides/ml o más Total de


espermatozoides 40 x 106 espermatozoides o más.

Motilidad 50% o más con progresión anterógrada

(categorías G3 y G2), o 25% o más con progresión lineal rápida a los 60 min. De la recolección.

Morfología 30% o más con morfología normal.


Viabilidad 75% vivos o más (no se colorean)

Leucocitos Menos de 1 x 106/ml.

Acido cítrico total 52 umol o más por eyaculado.

Fructosa total 13 umol o más por eyaculado.


PRÁCTICA N° 14

DIAGNOSTICO DE VIH

Introducción:

El VIH el 1/2 una prueba rápida del paso es un immunoensayo rápido para la detección cualitativa
de tipo 1 y/o de type-2 del virus de inmunodeficiencia humana (VIH) en suero o plasma.

Principio:

El VIH el 1/2 una prueba rápida del paso es un immunoensayo cromatográfico del flujo lateral
basado en el principio de la técnica doble del antígeno-emparedado. La membrana está cubierta
con los antígenos recombinantes del VIH en la línea región de la prueba del dispositivo. Cuando un
espécimen es aplicado en un extremo de la membrana, reacciona con la conjugación cubierta
antígeno del oro del VIH en la prueba. La mezcla entonces emigra cromatográfico por la acción
capilar y reacciona con los antígenos recombinantes del VIH en la membrana en la línea región de
la prueba.

Si el suero o el plasma contiene los anticuerpos a HIV-1 o a HIV-2, una línea coloreada aparecerá
en la línea región de la prueba, demostrando un resultado positivo. La ausencia de la línea
coloreada de la prueba indica que el suero o el plasma no contiene los anticuerpos anti-VIH,
demostrando un resultado negativo. Una línea coloreada aparecerá siempre en la línea de control
región servir como control procesal.

Esto indica si han agregado al volumen apropiado de espécimen y esa membrana ha ocurrido el
wicking.

Característica de producto:

Una prueba lateral del rapid del flujo


Detección inmediata de infección del VIH el 1/2
Utiliza GP120, 41, y 36 recombinantes como antígenos
Detecta los anticuerpos a todos los subtipos del VIH incluyendo el tipo “O” Tarda solamente 15-20
minutos para conseguir los resultados
Resultado visual, interpretación fácil

Sensibilidad: 100%

Especificidad: 99.8%
POSITIVO NEGATIVO

FUENTES DE INFORMACION:

Bantar, Lopardo. Apuntes De Laboratorio: Urocultivo. Laboratorios Britania. 2007

Carrasco, Luis coord. / Almendral del Rio, Jose Ma. coord., "Virus patogenos", Madrid Helice
Fundacion BBVA cop. 2006

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(2007).

Flint, S. J., "Principles of virology Molecular biology, pathogenesis, and control of animal viruses",
Washington, D.C. ASM Press cop. 2004

Henry-Marban. El Laboratorio En El Dx Clinico. Masson-Salvat Medicina, 2007

K. Abbas, A. H. Lichtman y S. Pillai. Inmunologia celular y molecular (Sexta edición) Editorial


Elsevier (2008).
Koneman E.W., Allen S.D., Dowell S.R.Jr., Sommers H.M. DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO, Texto y
Atlas Color. Buenos Aires, Ed. Panamericana, 6ta edición 2008.

Mac Faddin J. PRUEBAS BIOQUÍMICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS DE IMPORTANCIA


MÉDICA.

Buenos Aires, Ed. Panamericana, 3° Edición, 2003.

Medvedeff, MG; Mereles. BE; Vedoya, MC; Chade, ME. . Guia De Trabajos Practicos. Catedra De
Micologia. Universitaria, 2007

T. J. Kindt, R.A. Goldsby y B. A. Osborne. Inmunología de Kuby (Sexta edición) Editorial McGraw-Hill
(2007).

Pérez Peña, Efraín. Infertilidad, esterilidad y endocrinología de la reproducción: un enfoque


integral. Ed.: México. 2005 Edición: 2

Speroff L, Fitz M. Endocrinología ginecológica clínica e infertilidad, 7th ed. Lippincott Williams &
Wilkins; 2004.

Santaeulària I Pérez, Ariadna. MANUAL PRACTICO DE ESTIRILIDAD Y REPRODUCCION HUMANA:


LABORATORIO DE REPRODUCCION ASISTIDA (3ª ED.) McGRAW-HILL/INTERAMERICANA DE
ESPAÑA,

S.A.U. 2007

http://whfreeman.com/immunology5e/ web del texto Inmunología de R.A. Goldsby


http://www.blink.biz/immunoanimations/ animaciones del texto Inmunobiología de CA Janaway.
http://www.immunologylink.com/ buscador general de inmunología: revistas, links, textos, bases
de datos de secuencias genómicas....

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/ buscador de bibliografía de ciencias en general


http://www2.cbm.uam.es/confocal/Protocolos.htm protocolos de técnicas usadas en el
laboratorio de inmunología http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi toda la información sobre
citoquinas y biología de la comunicación celular.

http://www-micro.msb.le.ac.uk/3035/index.html Curso basico de virología on line (University of


Leicester)

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