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CAMPYLOBACTERACEAE HISTORIA

Bacteriología

Curso de Bacteriología Curso de Bacteriología

Los primeros aislamientos de especies del género Campylobacter fueron


realizados en el área de la microbiología veterinaria, en 1909 y 1913.
THEODOR ESCHERICH 1886

Bacilos Gram negativos curvos en


DESCRIBE deposiciones de 16/17 niños
fallecidos por diarrea

Bacilos semejantes en gatos


OBSERVA jóvenes con diarrea Vibrio felinus

Sir McFadyean John (1853-1941) Sir Stockman Stewart (1869-1926)


Royal Veterinary College London Royal Veterinary College London
Veterinary pathology

 1918 Mac Fadyean y Stockmann y posteriormente Smith establecieron la


participación de una bacteria microaerófila en el aborto del ganado bovino y
ovino, de morfología similar al género Vibrio, por lo que se lo llamó Vibrio fetus.

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En 1931, Jones y Little aislaron a partir de bovinos con En 1957 E. King
disturbios intestinales “un vibrión” microaerófilo, al que  Estudia las características de
denominaron Vibrio jejuni. Vibrios aislados de diferentes
En 1944 Doyle describió “un vibrión” aislado del intestino de fuentes.
cerdos con diarrea y lo denominó Vibrio coli.  Estableció que no todos
correspondían a Vibrio fetus .
 Determinó dos grupos con
características serológicas y
bioquímicas diferentes
 Algunos eran capaces de crecer a
25 y 37°C
 Otros lo hacían a 42°C, a estos
† Elizabeth King 1966
los consideró como “Vibrios
 “related Vibrio” relacionados” y se comprobó que
eran agentes causantes de diarrea
aguda.

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En 1972 Dekeyser y Butzler aislaron


los microorganismos de las heces de
pacientes con enteritis aguda usando La primera asociación entre “vibriones” microaerófilos
una técnica de filtración que permitía y diarrea en el hombre fue sugerida por Levy en 1946,
el pasaje de pequeños bastones
curvos a través de una membrana,
el que realizó un estudio en un brote de gastroenteritis
pero retenía microorganismos fecales sobre 357 pacientes en un penal en Illinois,
más grandes. observando en exámenes directos la presencia de
vibrios en el 20% de las muestras.
Butzler y Skirrow, Bolton y Robertson,
Blaser y col, desarrollaron medios
selectivos que permitieron aislar estos En 1963, Sébald y Veron proponen la creación del género
Prof. J.-P. Butzler
microorganismos con relativa facilidad Campylobacter.
St. Pierre Hospital - VUB y establecer su participación en
diferentes cuadros infecciosos en el
hombre.

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Taxonomía
PFEIFFER 1987

 REINO Procaryotae
 DIVISION Gracillicutes
 CLASE Proteobacteria Describe:
 FAMILIA Campylobacteraceae - hallazgos clínicos post-mortem en
 GENEROS Campylobacter intestino grueso compatibles con
Arcobacter enteritis por Campylobacter
Sulfospirillum - bacterias espiraladas, de 2 a 3 vueltas
 ESPECIE Bacteroides ureolyticus regulares, móviles, no cultivables

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Los primeros aislamientos de especies del género Campylobacter fueron


realizados en el área de la microbiología veterinaria, en 1909 y 1913.
CAMPYLOBACTER : taxonomía y nomenclatura

1909 -1919 fetos bovinos y ovinos Vibrio fetus


V. jejuni
1931 bovinos con diarrrea Vibrio jejuni
V. coli Related V. fetus
1944 cerdos con diarrea Vibrio coli Vibrios
1957 gastroenteritis? related vibrios V. hepaticus
1958 vibriosis hepática Vibrio hepaticus
1963 DNA Gén. Campylobacter
1971 –1972 diarrea en humanos C. fetus subsp. jejuni C. fetus subsp.
1977 medio selectivo C. fetus intestinalis
1992 taxonomía Fam. Campylobacteraceae subsp. jejuni

C. jejuni C. fetus subsp.


C. coli fetus

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Vandamme y col. 1992

TAXONOMÍA DE BACILOS GRAM NEGATIVOS CURVOS


Género % G-C Metabolismo

Campylobacter 29-35 No Fermentativo


Helicobacter, Campylobacter, Arcobacter y
Wolinella
Vibrio 44-50 Fermentativo
pertenecen a un grupo distinto de bacterias
Superfamilia V del rARN

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Vandamme y col. 1992


Vandamme y col. 1992
Superfamilia VI del rARN
Cambios de Nomenclatura

Campylobacter

Bacteroides ureolyticus
Campylobacteraceae
Campylobacter cinaedi  Helicobacter cinaedi
Arcobacter
C. fenneliae  H. feneliae
C. nitrofrigilis  Arcobacter nitrofrigilis
Flexispira
C. cryaerophila  A. cryaerophilus
Wolinella
rRNA superfamilias I a V Wolinella recta  Campylobacter rectus
Helicobacter
W. curva  C. curvus
Organismos “Campylobacter-like” de vida libre

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Vandamme y col. 1992 ESPECIES DEL GÉNERO ARCOBACTER

CARACTERÍSTICAS
• bacilos gram negativos curvos

FAMILIA • cultivos viejos: formas cocoides y


CAMPYLOBACTERACEAE • A. nitrofrigilis* filamentos largos

• A. cryaerophilus • monotricos: bipolar o monopolar


GÉNERO GÉNERO GÉNERO BACTEROIDES UREOLYTICUS
• oxidasa positivos
CAMPYLOBACTER ARCOBACTER SULFUROSPIRILLUM • A. butzleri
• crecen entre 15 y 37ºC (24ºC)
19 especies y 4 especies 4 especies • A. skirrowii • aerobiosis y anaerobiosis
subespecies
• G + C 27 a 31 mol%
• menaquinona - 6

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ESPECIES DEL GÉNERO ESPECIE


SULFUROSPIRILLUM BACTEROIDES UREOLYTICUS

• bacilo gram negativo curvo


• S. deleyianum* CARACTERÍSTICAS
• inmóvil
• bacilos gram negativos curvos
• crece a 36ºC
• S. archaconense • oxidasa positivos
• microaerófilo + hidrógeno
• crecen entre 8 y 36ºC
• metabolismo proteolítico
• de difícil cultivo ¿fastidiosos?
• S. arsenophilum • asociados a infecciones de:
• G + C 32 a 42 mol%
• de vida libre - tejidos blandos,uretritis,
- enfermedad periodontal
• S. barnesii • asociados a presencia de metales
• > número de cepas para clasificación definitiva
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Especies de Campylobacter
ESPECIES DE CAMPYLOBACTER
con patogenicidad conocida

• C. jejuni ssp. jejuni Campylobacter lari


• C. coli • ssp. lari (cepas clásicas NARTC)
• ssp. ureasum (variedades atípicas -urea neg, AN S)
• C. fetus subsp. fetus
• ssp. subantaricum (animales subantárticos)
• C. upsaliensis
• C. lari
11th International Workshop on Campylobacter, Helicobacter and related organisms,
Freiburg, 2001

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Especies de Campylobacter emergentes o Especies de Campylobacter no patógenos


con patogenicidad no bien establecida para el hombre
• C. jejuni ssp. doylei
•C. hyointestinalis (hyointestinalis, lawsonii)
• C. sputorum (sputorum, fecalis, ureolyticus) • C. fetus subsp. venerealis
• C. concisus
• C. showae
• C. mucosalis
• C. gracilis • C. helveticus
• C. rectus
• C. curvus
• C. lenienae

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CEPA CONTROL POSITIVO: Campylobacter jejuni ssp jejuni


CEPA CONTROL POSITIVO: C. jejuni
CEPA CONTROL NEGATIVO: Escherichia coli
CEPA CONTROL NEGATIVO (DÉBIL): C. upsaliensis ATCC 43954

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IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA
IDENTIFICACIÓN DEFINITIVA (determina especie)
CARACTERÍSTICAS DE CRECIMIENTO
• 42ºC – 48 h de incubación TEMPERATURAS DE CRECIMIENTO
• Microaerofilia • crecimiento a 26 – 37 y 42ºC

MORFOLOGÍA DE LA COLONIA
(Colonia invasora) SUSCEPTIBILIDAD A CEFALOTINA Y
MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA ÁCIDO NALIDÍXICO
• Gram (bacilo Gram – curvo)
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
• Contraste de fase (bacilo curvo, móvil)
• hidrólisis del hipurato
• hidrólisis del indoxil acetato
CATALASA (+) • producción de H2S
• reducción de NO3 y otras
OXIDASA (+)

Nuestro aislamiento corresponde a Nuestro aislamiento corresponde a alguna de


Campylobacter sp. las especies del género Campylobacter

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CAMPYLOBACTER: TEMPERATURAS DE CRECIMIENTO ALGUNAS PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN DE CAMPYLOBACTER


C. fetus C. jejuni C. jejuni C. coli C. lari C. upsa-
ESPECIE 26°C 37°C 42°C
fetus jejuni doylei liensis
C. jejuni ssp. jejuni - + + Catalasa + + + + + d/-

C. jejuni ssp. doylei - + - Red. NO3 + + - + + +


H2S - +/- - - + -
C. coli - + +
Hipurato - + - - - -
C. lari - + + Indoxilacet. - + + + - +

C. upsaliensis - + + Crecim. 25ºC + - - - - -


Crecim. 37ºC + + + + + +
C. fetus ssp. fetus + + v
Crecim. 42ºC - + - + + V
C. fetus ssp. venerealis + + - Sens. Ác. Nal. R S S S R R
C. hyointestinalis - + v Sens. Cefalot. S R S R R V

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V = variable Curso de Bacteriología

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Patogenicidad de Campylobacter Infección Intestinal

Países desarrollados: Más frecuente en pacientes


con diarrea
• Trasmisión: oral-fecal
Diarrea c/septicemia: Hemocultivos positivos
Pacientes c/diarrea: Altos títulos de Ac. • Dosis infectante 5x102 a 106
homólogos
• Mecanismos defensivos del huésped
Tratamiento antibiótico: Eritromicina
Inoculación Experimental: Monos- perros- pollos- • Factores de virulencia
cerdos- becerros
Diarrea experimental en humanos

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Mecanismos de virulencia
Adhesinas

• ADHERENCIA • Proteínas de membrana externa


• INVASIÓN • Lipopolisacárido

• ENTEROTOXINA • Flagelo

• CITOTOXINAS

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Campylobacter: producción de
enterotoxina

Demostrada utilizando:
• Perfusión intestinal en ratas
transporte de electrolitos al intestino

• Asa ligada en intestino de rata


aumento de fluido intestinal

• Cultivos celulares (CHO)


efecto citotónico (aumento de AMPc)

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PERFUSIÓN EN ASA INTESTINAL DE RATA


ASA LIGADA DE RATA

Dr. Heriberto FernándezUniversidad Austral de Chile / Facultad de Medicina / Instituto De Microbiologia Clinica Dr. Heriberto FernándezUniversidad Austral de Chile / Facultad de Medicina / Instituto De Microbiologia Clinica
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CDT +
Célula CHO normales C. jejuni 74.2%
Célula VERO normales
C. coli 64.7%

Célula CHO elongadas por


efecto de la enterotoxina

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BIOTIPIA Y SEROTIPIA DE
BIOTIPIA DE Campylobacter

Campylobacter

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Esquemas propuestos para Esquema de Biotipia del Dr. Hermy Lior
biotipia de Campylobacter
 Hidrólisis del Hipurato y la Prueba Rápida para H2S.
M.B. Skirrow and J. Benjamin. 1980. Differenciation of enteropathogenic campylobacter. J. Clin. Path.
33:1122

 Hidrólisis del Hipurato, Hidrólisis del DNA y Crecimiento en Agar


Extracto de Levadura y Carbón. G.A. Hebert,
D.H. Hollis, R.E. Weaver, M.A. Lambert, M.J. Blaser and C.W.Moss 1982. 30 years of campylobacters:
biochemical characteristics and a biotyping proposal for Campylobacter jejuni. J. Clin. Microbiol, 15: 1065
– 1073.

 Prueba Rápida de Hidrólisis del Hipurato, Prueba Rápida de H2S


y la Prueba de Hidrólisis del DNA.
Lior, H. 1984. New extended Biotyping Scheme for Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, and
“Campylobacter laridis”. J. Clin. Microbiol. 20:636-640

Lior, H. 1984. New extended Biotyping Scheme for Campylobacter jejuni,


Campylobacter coli, and “Campylobacter laridis”. J. Clin. Microbiol. 20:636-640

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BIOTIPIA DE Campylobacter BIOTIPIA DE Campylobacter


Esquema del Dr. H. Lior
 Para todas las pruebas de debe tener en
cuenta:
 PRUEBA RAPIDA DE HIDROLISIS DEL HIPURATO
 Utilizar cultivos que hayan crecido en Agar
Mueller Hinton Sangre.  PRUEBA RAPIDA DE H2S
 Incubadas a 37°C o a 43°C y Bajo condiciones
de microaerofilia o con mezcla de gases  PRUEBA DE HIDROLISIS DEL DNA
recomendado para Campylobacters.

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Hidrólisis del Hipurato
H2O
PRUEBA RAPIDA DE Ácido hipúrico Benzoato de sodio + Glicina

HIDRÓLISIS DEL HURATO Hipuricasa


(hidrolasa)

Hidrólisis del ácido Hipúrico:


 Detección del benzoato cloruro férrico al 7%
 Detección de glicina ninhidrina (oxidante)

Color púrpura ninhidrina residual + NH3 CO2

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PRUEBA RAPIDA DE PRUEBA RAPIDA DE


HIDROLISIS DEL HIPURATO HIDROLISIS DEL HIPURATO
 MATERIAL NECESARIO
PROCEDIMIENTO
 Hipurato de sodio al 1% en H2O  Colocar una pequeña asada de cultivo de 24 a 48 Hrs. en el tubo con
la solución de hipurato de sodio.
 Ninhydrina al 3.5% en butanol acetona (1:1)
preparación fresca, cada semana.  Mezclar bien e incubar por 2 horas a 37°C en baño maría.

 Luego, lentamente se agrega 0.2 mL del reactivo nynhidrina.


Hipurato de sodio (0.1%) NO SE DEBE MEZCLAR, reincubar por otros 10 minutos y leer.
 Dispensar 0.4 mL de la solución de hippurato
 Un color púrpura intenso (similar al cristal violeta) representa una
de sodio en tubos de 10 x 75 mm reacción positiva y la ausencia de color o un color púrpura tenue indica
 Mantener los tubos tapados y congelados una prueba de hidrólisis del hipurato negativa.
(-20°C) hasta su uso. Controles : + C. jejuni LIO 6;
 Los tubos Antes de ser usados, deben ser - C. coli LIO 8
descongelados y puestos a temperatura
ambiente.
•Lior, H. 1984. New extended Biotyping Scheme for Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, and “Campylobacter laridis” J. Clin. Microbiol. 20:636-640
•H. wang, M.N. 1975. Rapid hippurate hydrolysis method for presumptive identification of Group B Streptococci. J. Clin. Microbiol. 1:114-115
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PRUEBA
RAPIDA DE
HIDROLISIS
DEL
HIPURATO
Hidrólisis del Hipurato positivo Hidrólisis del Hipurato negativo

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Prueba Rápida de H2S


MATERIAL NECESARIO
El medio FBP Agar ha sido modificado como sigue
A : Caldo Brucella (GIBCO) 2.9 g
PRUEBA RÁPIDA DE H2S Na2HPO4 (anhidro)
K H2PO4 (Anhidro)
0.118 g
0.023 g
Agar (L28-Oxoid) 0.2 g
H2O 97 mL
Esterilizar en autoclave por 15 minutos a 15 lb y dejar enfriar a 45°C.

Prepare separadamente las siguientes soluciones en agua destilada y


esterilice con filtro:
B Sulfato ferroso 7H2O 10%
C Metabisulfito de sodio 10%
D Piruvato de sodio 10%

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Preparación del Medio FBP Agar Prueba Rápida de H2S
modificado
1 mL sol B
Mezcla B+C+D PROCEDIMIENTO
+
1 mL sol C  Coloque un inóculo grande semejante a una bolilla (con un asa de 5
1 mL sol B
mm de diámetro) de un cultivo de 24 horas en el tercio superior del
medio de cultivo. NO MEZCLE.
A Medio base
Caldo Brucella (GIBCO) 2.9 g
 Incube en bañomaría a 37°C por 2 horas.
Na2HPO4 (anhidro) 0.118 g
K H2PO4 (Anhidro) 0.023 g
Agar (L28-Oxoid)
H2O
0.2 g
97 mL  El ennegrecimiento alrededor de la masa bacteriana representa una
1 mL
reacción positiva, usualmente comienza aparecer entre los 30-45
sol B
+
Medio minutos.
1 mL
1 mL
sol B
sol C Base
Mezclar +
+
bien 1 mL
sol D
A  USE SOLO CULTIVOS DE 24 HORAS. La reproducividad con cultivos
1 mL
sol B
1 mL
sol C
B Sulfato ferroso 7H2O
C Metabisulfito de sodio
10%
10%
de 48 horas es muy pobre.
D Piruvato de sodio 10%

1 mL 1 mL 1 mL
sol B sol C
Controles : + C. jejuni LIO 6;
sol D
- C. jejuni LIO 1
Ajustar el pH a 7.3, dispensar asepticamente 3 mL en tubos estériles 13x100 con tapa
rosca. Preparar medios frescos cada dos semanas.
Lior, H. 1984. New extended Biotyping Scheme for Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, and “Campylobacter laridis”. J. Clin. Microbiol. 20:636-640
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HIDRÓLISIS DEL DNA

H2S negativo H2S positivo

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Prueba de Hidrólisis del DNA

MATERIAL NECESARIO
 Agar DNA Azul de toluidina Modificado
Ácido Desoxyrribonucleico (DIFCO DNA Cat#3321-12-1) 0.3 g
DNasa 0.01 M Cloruro de Calcio 1 mL
Cloruro de sodio 10.0 g
Ácido Desoxyrribonucleico DNA depolimerizado
Agar Oxoid L 28 6.5 mL
0.05M Buffer TRIS pH 9.0 * 1000 Ml

zonas claras alrededor  Coloque todos los ingredientes en un matraz y caliente hasta que el
DNA y el agar estén completamente disueltos
de la siembra  Enfríe a 50°C y agregue
Azul de toluidina "O" al 3% 2.5 mL
(Fisher Scientific Certified Stain CAT# T-161)
 Mezcle bien y distribuya en placas Petri 25 mL en cada una
NO REQUIERE ESTERILIZACION.

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Prueba de Hidrólisis del DNA


PROCEDIMIENTO
 En la placa de Agar DNA- Azul de Toluidina modificado*
 Se inocula con un asa de 3 mm de diámetro y en un área circular
pequeña, a partir de cultivos de 24 - 48 horas.
 Incubar 43°C bajo condiciones de atmósfera de mezcla de gases
recomendado para Campylobacters por 24 a 48 horas.
 Una zona clara incolora o algo rosada alrededor del inoculo es
considerado una reacción positiva.
 En una placa se pueden probar varios cultivos y se debe incluir
controles, positivo y negativo.
 Control Positivo = C. jejuni LIO 36

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SEROTIPIA DE
Campylobacter

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Esquemas de Serotipia de
Campylobacter
 Sistema Penner y Hennessy: detecta antígenos somáticos
termoestables; puede identificar 60 serotipos de C. jejuni y C.
coli.
 Penner, J.L., Hennessy, J.N. 1980. Passive hemagglutination technique for serotyping Campylobacter fetus subsp.
jejuni on the basis of soluble heat-stable antigens. J. Clin. Microbiol. 12: 732-737

 Sistema Lauwers S., Vlaes L. and Butzler J.P.: detecta antígenos


somáticos termoestables; puede identificar 42 serotipos de C.
jejuni y C. coli.
 Lauwers S., Vlaes L. and Butzler J.P. 1981 Campylobacter serotyping and epidemiology, Lancet, 1,158

 Sistema Lyor: detecta antígenos flagelares termolábiles; puede


identificar más de 100 serotipos de C. jejuni, C. coli y C. lari.
 Lior, H.D. et al. 1982. Serotyping of Campylobacter jejuni by slide agglutination based on a heat-labile antigenic
factors.
 J. Clin. Microbiol. 15: 761-768.

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SEROTIPIA DE Campylobacter jejuni y
Campylobacter coli  MATERIAL NECESARIO
 Buffer Fosfato Saline 0.01M , pH 7.2 (PBS).
MATERIAL NECESARIO  PBS-Merthiolate 1:10,000
 DNasa (10 mg /vial DNasa Bovina pancreática Grade II N° de Catalogo 104 159  NaCl al 2%
(EC3.1.21.1)
 Boehringer Mannheim, Alemania)  Láminas de vidrio (300 mm x 150 mm x 3 mm)
 Solución Stock DNasa – PBS 0.1%  Placas de Petri 90 x 15 mm
 Agregar asépticamente 10 mL de PBS al vial, mezclar bien y  Asas de siembra de 2 mm de diámetro
dispensar en tubos de tapa rosca alícuotas de 1 mL,  Mezcla de gases 5% O2, 10% CO2, 85 % N2
mantener congelado a -20°C.
(Skirrow)
 Solución de trabajo DNasa -PBS
 Medio de cultivo: Mueller Hinton con 5% de sangre
 Diluir 1 mL de la solución stock con 4 mL de PBS
de carnero en placas de Petri
 Dispensar alícuotas de 0.5 mL en tubos con tapa rosca
 Los tubos que no están en uso se deben mantener
congelados a -20°C

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Campylobacter en Mueller Hinton sangre 5%

PROCEDIMIENTO
 Previamente antes de realizar la serotipia:
 Los cultivos deberán ser sembrados en placas de
Mueller Hinton sangre (frescas y húmedas) e incubadas
a 37°C por 48 horas en atmósfera de mezcla de gases
recomendado para Campylobacters.

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SEROTIPIA DE Campylobacter jejuni y C. coli
Campylobacter en Mueller Hinton sangre 5% POR AGLUTINACIÓN EN LÁMINA
1. Verificar que el cultivo no este rugoso
En una lámina colocar una gota pequeña (10-20 mL) de DNasa y hacer una
suspensión bacteriana con el cultivo. Agregar 1 gota (50 ml) de ClNa al 2% y
chequear si autoaglutina o no.
Si el cultivo esta rugoso, resembrar y volver a probar.
2. Si el cultivo esta liso se procede de la siguiente manera:
 Colocar una gota pequeña (10-20 ml) de DNasa-PBS en cada uno de 5
rectángulos en la lámina.
 Emulsificar una pequeña asada del cultivo con DNasa-PBS.
 Agregar (50 ml) de cada pool (1-4) de antisueros y con un mondadiente o
con el asa mezclar bien en sentido longitudinal.
 Mover lámina con movimientos de vaivén por 45 segundos.
 LEER LA PRUEBA DE INMEDIATO
 Los resultados obtenidos después de 1 minuto o las reacciones débiles,
podrían representar reacciones cruzadas.
 Si no se observa aglutinación con los pools 1 a 4, repetir el procedimiento
con los pools remanentes (5 a 16)

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3. Lectura de Resultados Esquema de la Serotipia de


Utilizando iluminación indirecta sobre un fondo negro, registre el grado de aglutinación como
sigue:
± = ligera aglutinación y el fluido turbio
Campylobacter
1+ = cerca del 25% de células aglutinadas y el fluido turbio.
2+ = cerca del 50% de células aglutinadas y el fluido es moderadamente turbio.
3+ = aproximadamente el 75% de las células aglutinadas y el fluido es ligeramente turbio. Serotipo LIO 36
4+ = todas las células están aglutinadas y el fluido es claro.

El título del antisuero en los pools es usualmente definido como una dilución menor que la
dilución más alta que muestre 3+ o una aglutinación más fuerte en 1 minuto. DNasa
- PBS
DNasa
- PBS
DNasa
- PBS
DNasa DNasa
- PBS - PBS

4. INTERPRETACION DE RESULTADOS
 Los antisueros no absorbidos en los pools, contienen aglutininas para antígenos heterólogos de
Campylobacter jejuni y C. coli.
 Podrían producir reacciones de aglutinación en más de un pool.
 Los pools estan diseñados solo para screening.
 Los serogrupos son identificados con antisueros monovalentes y confirmados por antisueros
absorbidos.
 Los antisueros han sido agrupados en lo posible para reducir la ocurrencia de reacciones en varios
pools.
 A veces las reacciones en más de un pool podría deberse a la presencia de más de un serotipo en
el mismo cultivo. Esto se puede resolver haciendo la serotipia a partir de una clona de colonias
individuales.

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