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Bacteriología
Curso de Bacteriología
Curso de Bacteriología
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En 1931, Jones y Little aislaron a partir de bovinos con En 1957 E. King
disturbios intestinales “un vibrión” microaerófilo, al que Estudia las características de
denominaron Vibrio jejuni. Vibrios aislados de diferentes
En 1944 Doyle describió “un vibrión” aislado del intestino de fuentes.
cerdos con diarrea y lo denominó Vibrio coli. Estableció que no todos
correspondían a Vibrio fetus .
Determinó dos grupos con
características serológicas y
bioquímicas diferentes
Algunos eran capaces de crecer a
25 y 37°C
Otros lo hacían a 42°C, a estos
† Elizabeth King 1966
los consideró como “Vibrios
“related Vibrio” relacionados” y se comprobó que
eran agentes causantes de diarrea
aguda.
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Taxonomía
PFEIFFER 1987
REINO Procaryotae
DIVISION Gracillicutes
CLASE Proteobacteria Describe:
FAMILIA Campylobacteraceae - hallazgos clínicos post-mortem en
GENEROS Campylobacter intestino grueso compatibles con
Arcobacter enteritis por Campylobacter
Sulfospirillum - bacterias espiraladas, de 2 a 3 vueltas
ESPECIE Bacteroides ureolyticus regulares, móviles, no cultivables
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Vandamme y col. 1992
Campylobacter
Bacteroides ureolyticus
Campylobacteraceae
Campylobacter cinaedi Helicobacter cinaedi
Arcobacter
C. fenneliae H. feneliae
C. nitrofrigilis Arcobacter nitrofrigilis
Flexispira
C. cryaerophila A. cryaerophilus
Wolinella
rRNA superfamilias I a V Wolinella recta Campylobacter rectus
Helicobacter
W. curva C. curvus
Organismos “Campylobacter-like” de vida libre
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Vandamme y col. 1992 ESPECIES DEL GÉNERO ARCOBACTER
CARACTERÍSTICAS
• bacilos gram negativos curvos
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Especies de Campylobacter
ESPECIES DE CAMPYLOBACTER
con patogenicidad conocida
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IDENTIFICACIÓN PRESUNTIVA
IDENTIFICACIÓN DEFINITIVA (determina especie)
CARACTERÍSTICAS DE CRECIMIENTO
• 42ºC – 48 h de incubación TEMPERATURAS DE CRECIMIENTO
• Microaerofilia • crecimiento a 26 – 37 y 42ºC
MORFOLOGÍA DE LA COLONIA
(Colonia invasora) SUSCEPTIBILIDAD A CEFALOTINA Y
MORFOLOGÍA MICROSCÓPICA ÁCIDO NALIDÍXICO
• Gram (bacilo Gram – curvo)
PRUEBAS BIOQUÍMICAS
• Contraste de fase (bacilo curvo, móvil)
• hidrólisis del hipurato
• hidrólisis del indoxil acetato
CATALASA (+) • producción de H2S
• reducción de NO3 y otras
OXIDASA (+)
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V = variable Curso de Bacteriología
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Patogenicidad de Campylobacter Infección Intestinal
Mecanismos de virulencia
Adhesinas
• ENTEROTOXINA • Flagelo
• CITOTOXINAS
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Campylobacter: producción de
enterotoxina
Demostrada utilizando:
• Perfusión intestinal en ratas
transporte de electrolitos al intestino
Dr. Heriberto FernándezUniversidad Austral de Chile / Facultad de Medicina / Instituto De Microbiologia Clinica Dr. Heriberto FernándezUniversidad Austral de Chile / Facultad de Medicina / Instituto De Microbiologia Clinica
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CDT +
Célula CHO normales C. jejuni 74.2%
Célula VERO normales
C. coli 64.7%
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BIOTIPIA Y SEROTIPIA DE
BIOTIPIA DE Campylobacter
Campylobacter
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Esquemas propuestos para Esquema de Biotipia del Dr. Hermy Lior
biotipia de Campylobacter
Hidrólisis del Hipurato y la Prueba Rápida para H2S.
M.B. Skirrow and J. Benjamin. 1980. Differenciation of enteropathogenic campylobacter. J. Clin. Path.
33:1122
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Hidrólisis del Hipurato
H2O
PRUEBA RAPIDA DE Ácido hipúrico Benzoato de sodio + Glicina
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PRUEBA
RAPIDA DE
HIDROLISIS
DEL
HIPURATO
Hidrólisis del Hipurato positivo Hidrólisis del Hipurato negativo
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Preparación del Medio FBP Agar Prueba Rápida de H2S
modificado
1 mL sol B
Mezcla B+C+D PROCEDIMIENTO
+
1 mL sol C Coloque un inóculo grande semejante a una bolilla (con un asa de 5
1 mL sol B
mm de diámetro) de un cultivo de 24 horas en el tercio superior del
medio de cultivo. NO MEZCLE.
A Medio base
Caldo Brucella (GIBCO) 2.9 g
Incube en bañomaría a 37°C por 2 horas.
Na2HPO4 (anhidro) 0.118 g
K H2PO4 (Anhidro) 0.023 g
Agar (L28-Oxoid)
H2O
0.2 g
97 mL El ennegrecimiento alrededor de la masa bacteriana representa una
1 mL
reacción positiva, usualmente comienza aparecer entre los 30-45
sol B
+
Medio minutos.
1 mL
1 mL
sol B
sol C Base
Mezclar +
+
bien 1 mL
sol D
A USE SOLO CULTIVOS DE 24 HORAS. La reproducividad con cultivos
1 mL
sol B
1 mL
sol C
B Sulfato ferroso 7H2O
C Metabisulfito de sodio
10%
10%
de 48 horas es muy pobre.
D Piruvato de sodio 10%
1 mL 1 mL 1 mL
sol B sol C
Controles : + C. jejuni LIO 6;
sol D
- C. jejuni LIO 1
Ajustar el pH a 7.3, dispensar asepticamente 3 mL en tubos estériles 13x100 con tapa
rosca. Preparar medios frescos cada dos semanas.
Lior, H. 1984. New extended Biotyping Scheme for Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, and “Campylobacter laridis”. J. Clin. Microbiol. 20:636-640
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Prueba de Hidrólisis del DNA
MATERIAL NECESARIO
Agar DNA Azul de toluidina Modificado
Ácido Desoxyrribonucleico (DIFCO DNA Cat#3321-12-1) 0.3 g
DNasa 0.01 M Cloruro de Calcio 1 mL
Cloruro de sodio 10.0 g
Ácido Desoxyrribonucleico DNA depolimerizado
Agar Oxoid L 28 6.5 mL
0.05M Buffer TRIS pH 9.0 * 1000 Ml
zonas claras alrededor Coloque todos los ingredientes en un matraz y caliente hasta que el
DNA y el agar estén completamente disueltos
de la siembra Enfríe a 50°C y agregue
Azul de toluidina "O" al 3% 2.5 mL
(Fisher Scientific Certified Stain CAT# T-161)
Mezcle bien y distribuya en placas Petri 25 mL en cada una
NO REQUIERE ESTERILIZACION.
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SEROTIPIA DE
Campylobacter
Esquemas de Serotipia de
Campylobacter
Sistema Penner y Hennessy: detecta antígenos somáticos
termoestables; puede identificar 60 serotipos de C. jejuni y C.
coli.
Penner, J.L., Hennessy, J.N. 1980. Passive hemagglutination technique for serotyping Campylobacter fetus subsp.
jejuni on the basis of soluble heat-stable antigens. J. Clin. Microbiol. 12: 732-737
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SEROTIPIA DE Campylobacter jejuni y
Campylobacter coli MATERIAL NECESARIO
Buffer Fosfato Saline 0.01M , pH 7.2 (PBS).
MATERIAL NECESARIO PBS-Merthiolate 1:10,000
DNasa (10 mg /vial DNasa Bovina pancreática Grade II N° de Catalogo 104 159 NaCl al 2%
(EC3.1.21.1)
Boehringer Mannheim, Alemania) Láminas de vidrio (300 mm x 150 mm x 3 mm)
Solución Stock DNasa – PBS 0.1% Placas de Petri 90 x 15 mm
Agregar asépticamente 10 mL de PBS al vial, mezclar bien y Asas de siembra de 2 mm de diámetro
dispensar en tubos de tapa rosca alícuotas de 1 mL, Mezcla de gases 5% O2, 10% CO2, 85 % N2
mantener congelado a -20°C.
(Skirrow)
Solución de trabajo DNasa -PBS
Medio de cultivo: Mueller Hinton con 5% de sangre
Diluir 1 mL de la solución stock con 4 mL de PBS
de carnero en placas de Petri
Dispensar alícuotas de 0.5 mL en tubos con tapa rosca
Los tubos que no están en uso se deben mantener
congelados a -20°C
PROCEDIMIENTO
Previamente antes de realizar la serotipia:
Los cultivos deberán ser sembrados en placas de
Mueller Hinton sangre (frescas y húmedas) e incubadas
a 37°C por 48 horas en atmósfera de mezcla de gases
recomendado para Campylobacters.
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SEROTIPIA DE Campylobacter jejuni y C. coli
Campylobacter en Mueller Hinton sangre 5% POR AGLUTINACIÓN EN LÁMINA
1. Verificar que el cultivo no este rugoso
En una lámina colocar una gota pequeña (10-20 mL) de DNasa y hacer una
suspensión bacteriana con el cultivo. Agregar 1 gota (50 ml) de ClNa al 2% y
chequear si autoaglutina o no.
Si el cultivo esta rugoso, resembrar y volver a probar.
2. Si el cultivo esta liso se procede de la siguiente manera:
Colocar una gota pequeña (10-20 ml) de DNasa-PBS en cada uno de 5
rectángulos en la lámina.
Emulsificar una pequeña asada del cultivo con DNasa-PBS.
Agregar (50 ml) de cada pool (1-4) de antisueros y con un mondadiente o
con el asa mezclar bien en sentido longitudinal.
Mover lámina con movimientos de vaivén por 45 segundos.
LEER LA PRUEBA DE INMEDIATO
Los resultados obtenidos después de 1 minuto o las reacciones débiles,
podrían representar reacciones cruzadas.
Si no se observa aglutinación con los pools 1 a 4, repetir el procedimiento
con los pools remanentes (5 a 16)
El título del antisuero en los pools es usualmente definido como una dilución menor que la
dilución más alta que muestre 3+ o una aglutinación más fuerte en 1 minuto. DNasa
- PBS
DNasa
- PBS
DNasa
- PBS
DNasa DNasa
- PBS - PBS
4. INTERPRETACION DE RESULTADOS
Los antisueros no absorbidos en los pools, contienen aglutininas para antígenos heterólogos de
Campylobacter jejuni y C. coli.
Podrían producir reacciones de aglutinación en más de un pool.
Los pools estan diseñados solo para screening.
Los serogrupos son identificados con antisueros monovalentes y confirmados por antisueros
absorbidos.
Los antisueros han sido agrupados en lo posible para reducir la ocurrencia de reacciones en varios
pools.
A veces las reacciones en más de un pool podría deberse a la presencia de más de un serotipo en
el mismo cultivo. Esto se puede resolver haciendo la serotipia a partir de una clona de colonias
individuales.
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