132 QUIMICA BIOLOGICA Determinaciin de actividad enzimdtica La actividad de una enzima puede determi- jidiendo la cantidad de producto forma- de sustrato consumido, en un tiempo dado, 2, mezcla de todas los factores requeridos para la reaccién La determinacin guarda relaci6n con la can. tidad de enzima presente y no es significativa- mente influida por los cambios producidos en la mezcla durante la reaccidn, si se mide veloci- dad inicial, es decir, cuando 1a cantidad de sustrato utilizado es atin insignificante en rela- cién con el total presente en la mezcla. Se acep- ta como velocidad iniciat la determinada antes que el consumo de sustrato haya alcanzado el 20% del total originalmente presente, pero es pre- ferible fijar isn limite mas bajo (alrededor del 5%). Para definir la actividad de una preparacién enzimatica se utilizan en la practica distintas ex- presiones. La cantidad de enzima se indica ha bitualmente en Unidades Internacionales (UL). Una unidad de cualquier enzima es la cantidad que cataliza la transformacién de un micromol (J umol = 10 mol) de sustrato por minuto, bajo condiciones definidas de pH. temperatura, etc La SUBMB ha propuesto como unidad al kaval, correspondiente a la cantidad de enzima que cataliza la transformacién de { mol de sustrato por segundo. Un katal equivale a 6 por 10” Unidades Internacio- nales. Esta nueva unidad es muy poco utilizada. La forma mas comin de expresion es la de UL La cantidad de enzima presente en un deter- minado volumen de muestra 0, en otros térmi- nos, la concentracién de enzima, se expresa co rrientemente en Unidades Internacionales por ml de preparacién ‘vidad especifica es una expresion que in- ia pureza relativa de una preparacién enzimatica. Relaciona actividad enzimatica, no con el volumen de la muestra, sino con el total de protefnas existentes en la misma. La actividad especifica indica las unidades de enzima por mg de proteinas presentes en la muestra. Cuando se tiene la enzima al estado puro, se puede expresar su actividad por mg de enzima y, si ademas se conoce su peso molecular, se puede caleular actividad molar, constante catalitica 0 niimero de recambio (en inglés, turnover number), correspondiente al ntimero de molécu- las de sustrato convertidas en producto por uni- dad de tiempo (minuto) por una molécula de en- zima trabajando en condiciones de saturacion de susirato. Una de las enzimas con ntimero de re- cambio mas elevado es la anhidrasa carbénica, que cataliza la reacci6n reversible entre didxico de carbono y agua para formar dcido carbénico. La actividad molar de esta enzima es de 36,000.000. La acetilcolinesterasa, que cataliza la hidrélisis de acetilcolina, tiene un ntimero de recambio de 1.500.000. Algunos autores prefie ren expresar la actividad molar por segundo. Factores que modifican la actividad enzimdtica A. Concentracién de enzima. Cuando se de- termina Ja velocidad inicial de una reaccién catalizada por una enzima a distintas concentra~ ciones de ésta, en presencia de cantidades satu- rantes de sustrato y manteniendo constantes todos los otros factores en el medio de reacci6n, se pue- de establecer la relaci6n entre cantidad de enzima y velocidad (equivalente a actividad enzimatica) Esta relacin se mantendra si se determina real- mente velocidad inicial, La reaccién no debe pro- longarse més alld del tiempo necesario para con- sumir 5% del sustrato originalmente presente. Si los resultados se representan en un siste- ma de coordenadas (concentracién de enzima en abscisas y velocidad, o actividad, en ordenadas), se obtiene el grafico de la figura 8-4, Esta grafi- ca indica gue la velocidad es directamente pro- porcional a Ja concentracién de enzima. En esta proporcionalidad se basan los métodos utiliza- dos comtinmente para determinar la cantidad de enzima presente en una muesira B, Concentracién de sustrato. Si se efectiian determinaciones de actividad enzimética man- teniendo constantes concentracién de enzima y las otras condiciones de la reaccién, excepto con- 4 Actividad enzimatica Concentracién de enzima > 8-4, Efecto de la concentracién de enzima sobre la velocidad de reaccién. En e) eje de abscisas se representa In escala de concentraciones crecientes de enzima: sobre eleje de ordenadas, la velocidad inicial o actividad,centracién de sustrato y se representan Jos re- sultados en un sistema de coordenadas (concen- tracién de sustrato en abscisas y velocidad de reaccidn o actividad enzimética en ordenadas), en fa mayoria de los casos se obtiene una curva de tipo hiperbélico (fig. 8-5). Al comienzo, Ja actividad aumenta répidamente con el incremen- to de concentraci6n de sustrato (S}, pero a nive- les mS elevados de ésta, la velocidad crece més lentamente, y tiende a alcarzar un.mdximo. Cuarido la concentracién de sustrato es baja, Ja actividad crece en forma lineal con la concen- tacién de sustrato. En este sector de Ja curva, la reaccién es de primer orden, pues existe propor- cionalidad entre velocidad de reaccién y concen- iracién de sustrato. A medida que aumenta ésta, los incrementos de velocidad son cada vez me- nores y se llega a una situacidn en la cuai ta acti- vidad no aumenta por mas que se eleve [S]. La curva tiende a la horizontal correspondiente a velocidad maxima’(V,.4,). La curva hiperbélica es caracteristica de reacciones en las cuales par- ticipa un sustrate. Cuando intervienen dos sustratos, puede obtenerse una curva hiperbélica para uno de elJos, utilizando concentracién cons- lante y en franco exceso del otto. sta curva era conocida y analizada ya a comienzos del siglo XX; Michaelis y Menten (1913) derivaron de ella importantes conclusio- nes. En e} caso mas simple, la enzima se une al sustrato en reaccisn reversible, muy répida. Bl Actividad enzimatica Concentracién de sustrato > Fig, 8-5. Efecto de la concentracidn de sustrato sobre la actividad enzimatiea. En el eje de abscisas se ha repre- sentade la eseala de concentraciones de sustrato; sobre el de ordenadas, \a velocidad inicial o actividad enzimatica. No se reptesentan los puntos experimentales, sino la li- nea que resulta de unir esos puntos. ENZIMAS, 133 complejo formado se disocia en reaccién mas lenta que la primera y libera la enzima y el producto. El proceso se indica en la ecuacién: EB+S SES > E+P ‘A concentraciones muy bajas de sustrato, gran parte de las moléculas de enzima se encuen- ira fibre. Cuando aumenta el sustrato, mayor ni mero dé maoléculas de enzimia va siendo ocupa- do para formar ES. Si sigue creciendo [S}, llega un momento en el cual practicamente todas las moléculas de enzima estén ocupadas por susirato (recuérdese que [E} se mantiene constante), la enzima se ha “saturado” con sustrato. Si el au- mento de [S] contintia y excede largarmente a la de enzima, se alcanza un estado estacionario en el cual la velocidad de reaccién no varia. Todo aumento ulterior de sustrato ya no puede produ- cir incremento en la velocidad de reaccién: ésta se comporta como de orden cero. ‘Te6ricamente, Ia velocidad miéxima sélo se alean- za concentracién infinita de sustrato; \acurva no le~ ga nunca a la horizontal correspondiente a Via, ¥ 10 es posible predecir con exactitud la [S} a la cual sera obtenida. Para establecer alguna relacién precisa en tre velocidad inicial y concentraci6n de sustrato, Michaelis y Menten definieron una constante llamada K,, (constante de Michaelis). La K,, corresponde ala concentracién de sustrato con la cual ta velocidad de reaccién alcanza un valor igual a la mitad de la maxima. En condiciones definidas de medio, pH, tempera- tura,ete.. la K,, tiene un valor fijo para cada enzima y sirve para caracterizarla La hipérbola de saturacién de una enzima por su sustrato puede expresarse con la ecuacién deducida por Michaelis-Menten ox(S Vous (3) Hs) donde v: velocidad inicial con concentracién de sustrato igual a(S]; Vauy: velocidad maxima; K,: constante de Michaelis para el sustrato. A partir de esta ecuacién se deduce que cuando [S] esté por debajo del valor de K,,, la velocidad de seaccidn depende de la concentracién de sustrato (por- cién inicial de Ja curva en ta cual ta ceaccién es de primer orden con respecto a [S]}. Cuando [S] es muy superior al valor de K,y, la ve- locidad inicial es practicamente maxima (porcién final de la curva, reaccién de orden cero) Si {Sles igual al valor de K.,, reemplazando en la ecuacién (4) Veux {S] Ka [8] Veen ES) Vox [8]. ¥ (SI +S] 28)134 QUIMICA BIOLOGICA Es decir, cuando la concentracién de sustrato es igual ala K,,. la velocidad de reaccidn es igual a la mitad de la maxima. La ecuacién de Michaelis-Menten puede ser transformada algebraicamente en ecuaciones equi- valentes utilizables para la determinacién prdctica del valor de la K,,. Si tomamos la inversa de la ecua ci6n (J) 4 _ Ka +S) v Vou [8] Kw Esta iiltima ecuacién, obtenida por transformacién de la de Michaelis-Menten, es llamada de Lineweaver Burk y corresponde a la ecuacién de una rec! La representacién de Ia inversa de velocidad ini- al (1/v) en funcidn de la inversa de concentracién de sustrato (1/{S]) da una recta (fig. 8-6). La pendiente - de esta recta es igual a K,/Vig... !a interseccidn con el cje verticat corresponde a 1/V,,, y la interseccidn con el eje horizontal tendré el valor ~I/K,,. En consecuen- cia, la representacién de dobies reciprocas (L/v en fun: cidn de V/{S}) permite detetminar los valores de Voy Y ..a partir de mediciones de actividad enzimatica a varias concentraciones de sustrato. Exisicr otros mé~ todos grificos para calcular Vag ¥ Ky considerados superiores al de Lineweaver-Burk; sin embargo, éste se sigue utilizando, Determinado en iguales condiciones de tempera- tara, pH, etc., ¢l valor de K,, es caracteristico para cada enzima y para cada uno de los sustratos que la misma utiliza, Los valores para distintas enzimas varfan den- tro de Ifmites muy amplios; por ejemplo, ia K,, de alasa para el sustrato, peréxido de hidrégeno (H,0,}, es 25 mM, y ta de hexogurinasa, enzima que cataliza la fosforilacién de glucosa en el carbono 6, €s 0,005 mM para D-glucosa. En Ja mayorfa de enzimas, el valor de K,, guarda elacién inversa con la afinidad de la enzima por el sus- trato. En general, a mayor afinidad, menor valor de K,,. Bendiente Representacién de dobles reciprocas (Linewea- ver-Burk). No se representan los puntos experimentales, sino la linea que resulta de unit esos puntos. Cuando una enzima actia sobre varios sustratos homélogos, el valor de K,, suele ser diferente para cada uno de ellos. El sustrato con e) cual se obtiene la K,, mas pequefa es considerado el sustrato natu- ral o“fisiologico” de la enzima. C. Temperatura, Como consecuencia del in- cremento en energfa cinética, la velocidad de una reaccién quimica aumenta cuando fa temperatu- ra asciende. Dentro de ciertos limites, las reac- ciones catalizadas por enzimas siguen ese com- portamiento. La velocidad de muchas reacciones biolgicas practicamente se duplica por cada 10°C de aumento de (emperatura. El incremento de }a velocidad de reaccién cada 10°C de aumento de la temperatura, es Ila- mada Quy 0 coeficiente de temperatura Si se mantienen constantes las concentracio- nes de enzima, sustrato y otros factores del me- dio de reaccién y se determina actividad a tem- peraturas crecientes, los resultados representa- dos en un sisterna de coordenadas dan una cur- va del tipo indicado en la figura 8-7. Si bien la actividad enzimética aumenta con Ja temperatura, se llega a un valor maximo, co- rrespondiente a la temperatura Gptima. Por ent ma de ese dptimo, la actividad cae répidamente Para la gran mayoria de enzimas de animales homeotermos, la temperatura ptima esté alrede- dor de 37°C. La actividad disminuye bruscamen- te mas all de esa temperatura. Alrededor de los “60°C Ta mayor parte de las enzimas son inacti vadas completamente Temperatura ¥ optima 100 8 — 75 & & z B 50 % Acti oP 10 30" 50" 708 Temperatura Fig, 8-7. Bfecto de Ja temperatura sobre la actividad enzimitica. Las determinaciones se realizaron en cubetas termostatizadas a 5°, 10°, 15°, 20°. 25%, 30°, 35%, 40°. 45°, 50°, 55°, 60°, 65° y 70°C. La actividad enzimatica, expre- sada como porceitaje de la actividad maxima, se repre- senta en el eje de las ordenadas; la temperatura a la cual se realiz6 la determinacién, en ef eje de las abscisas. No se representan los puntos experimentales, sino la linea que resulta de unis esos puntos.