Alteraciones fosfoproteómicas de los

receptores de glutamato ionotrópico en el

hipocampo del modelo de ratón Ts65Dn
del síndrome de Down
Macarena Gómez De Salazar, Cristina grau Francisco ciruela y Xavier
Altafaj *

 Unidad de Neurofarmacología, Instituto de Investigación Biomédica Bellvitge (IDIBELL) —

Universidad de Barcelona, Barcelona, España

El síndrome de Down (SD), la principal causa genética de la discapacidad

intelectual, se asocia con un desequilibrio de los sistemas neurotransmisores
excitadores / inhibidores. La evaluación fenotípica y las intervenciones de
farmacoterapia en modelos murinos con DS señalaron alteraciones de la
neurotransmisión glutamatérgica (que afectan especialmente a los receptores
ionotrópicos de glutamato [iGluRs]) que podrían contribuir a la fisiopatología
del DS, que está de acuerdo con la condición del DS. Los iGluRs desempeñan
un papel fundamental en la transmisión excitatoria de mediación rápida, un
proceso que subyace en la plasticidad sináptica.La plasticidad neuronal se
modula bioquímicamente mediante modificaciones postraduccionales, lo que
permite una adaptación rápida y reversible de la fuerza sináptica.Entre estas
modificaciones, los procesos de fosforilación / desfosforilación dictan
enérgicamente las interacciones proteína-proteína iGluR, el tráfico de la
superficie celular y la movilidad subsináptica. Por lo tanto, planteamos la
hipótesis de que la desregulación del equilibrio de fosforilación /
desfosforilación podría afectar la función neuronal, lo que a su vez podría
contribuir a las alteraciones del neurotransmisor glutamatérgico observadas en
la DS.Para abordar este punto, purificamos bioquímicamente las fracciones del
hipocampo subsinápticas de ratones Ts65Dn adultos, un modelo de ratón
trisómico que recapitula las alteraciones fenotípicas del DS. El análisis
proteómico mostró alteraciones significativas de la composición molecular de
los compartimentos subsinápticos de las neuronas trisómicas del
hipocampo. Además, caracterizamos iGluR phosphopattern en la sinapsis
glutamatérgica del hipocampo de ratones trisómicos. El análisis de
espectrometría de masas acoplado a fosfoalimentación reveló una firma de
fosforilación iGluR asociada a subsisáptica y trisomía específica, concomitante
con la composición de quinasa subsináptica diferencial y fosfatasa de los
compartimientos subsinápticos del hipocampo Ts65Dn. Además, los datos
bioquímicos se utilizaron para construir una matriz de fosfopattern genotipo-
kinome-iGluR en los diferentes compartimentos subsinápticos. En general,
nuestros resultados brindan un perfil preciso de las alteraciones de
fosfopattern de iGluR en la sinapsis glutamatérgica del modelo de ratón
Ts65Dn y respaldan su contribución a la sinaptopatía asociada a DS. La
alteración de los fosforosidos iGluR en el hipocampo Ts65Dn, junto con la
firma quinasa / fosfatasa, identifica posibles dianas terapéuticas novedosas
para el tratamiento de las disfunciones glutamatérgicas en la DS.
Introducción
El síndrome de Down (DS) es la causa genética más común de discapacidad intelectual
(OMIM # 190685).Los individuos con SD presentan una trisomía del cromosoma
humano 21 (Hsa21), y los genes pivotales ubicados en Hsa21 se han propuesto como
genes candidatos para la fisiopatología del DS ( Antonarakis et al., 2004 ). Para modelar la
fisiopatología de la DS, se han utilizado diferentes modelos animales, ya sea que
sobreexpresan genes homólogos a Hsa21 individuales o abarcan una trisomía parcial de
la región sinténica de Hsa21 ( Dierssen, 2012 ; Rueda et al., 2012 ). Entre los últimos, el
ratón Ts65Dn es el modelo murino DS más bien establecido y, genéticamente, consiste
en la triplicación del cromosoma de ratón sintético Hsa21 Mmu16. El ratón Ts65Dn
recapitula las alteraciones cognitivas y motoras observadas en individuos con SD ( Costa
et al., 1999 ; Galdzicki y Siarey, 2003 ; Altafaj et al., 2013 ). Estas alteraciones están asociadas
neuroquímicamente con un desequilibrio de los sistemas neurotransmisores
excitadores / inhibidores ( Belichenko et al., 2009 ), similares a los descritos en individuos
con SD ( Risser et al., 1997 ; Seidl et al., 2001 ). Este desequilibrio de neurotransmisores
resultante de la alteración de la neurotransmisión inhibitoria de GABAergic ( Fernandez
et al., 2009 ; Best et al., 2012 ; Contestabile et al., 2017 ), junto con defectos de
neurotransmisión glutamatérgica excitadora ( Siddiqui et al., 2008 ; Kleschevnikov, 2012 ),
podría alterar la plasticidad sináptica y perjudicar el aprendizaje y la capacidad de
memoria en ratones Ts65Dn. En consecuencia, se han realizado varios intentos para
restablecer el equilibrio homeostático excitador / inhibitorio. En particular, el
tratamiento Ts65Dn con memantina, un antagonista reversible del receptor de
glutamato de N -metil-d-aspartato (NMDAR), se ha demostrado que rescata
parcialmente las alteraciones electrofisiológicas críticas ( Scott-McKean y Costa, 2011 ) y
las anomalías cognitivas fenotípicas de los ratones trisómicos ( Costa et al.,
2007 ; Lockrow et al., 2011 ). Estos hallazgos se han traducido significativamente a la
práctica clínica, con una mejora de las habilidades cognitivas de los individuos con SD
( Boada et al., 2012 ). Estos datos apoyan firmemente la hipótesis de que la
sobreexpresión del gen Hsa21 (p. Ej., Los productos de los genes DYRK1A, APP, TIAM1
e ITSN1) podría desregular la expresión y / o función de NMDAR, lo que contribuye a la
patogénesis de tipo DS en ratones trisómicos ( Siddiqui et al., 2008 ) . Los NMDAR
pertenecen a la familia del receptor de glutamato ionotrópico (iGluR), junto con los
receptores de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metilisoxazol-4-propiónico (AMPAR) y los
receptores de kainato (KAR). Los iGluRs desempeñan un papel fundamental en la
transmisión mediada rápidamente, un proceso que subyace en la plasticidad sináptica y
la supervivencia neuronal ( Paoletti et al., 2013 ). El control preciso de la actividad iGluR
se ajusta mediante numerosos mecanismos postraduccionales ( Wang et al.,
2006 ; Traynelis et al., 2010 ). Entre ellos, los eventos de (des) fosforilación influyen
fuertemente en la biogénesis de iGluR (ensamblaje, tráfico, acoplamiento, difusión de la
superficie e internalización) y en la activación de canales de receptores. Estos procesos
modulan la fuerza sináptica y, por lo tanto, modulan la plasticidad neuronal ( Lee,
2006 ; Lau y Zukin, 2007 ; Goebel-Goody et al., 2009 ; Pahl et al., 2014 ). El patrón de
fosforilación de iGluR resulta de la actividad de varias proteína quinasas canónicas
(PKA, PKC, CaMKII) (revisado por Lussier et al., 2015 ) y proteína fosfatasas (STEP,
PP2A, PP1, calcineurina) ( Westphal, 1999 ; Chan y Sucher, 2001 ; Braithwaite et al.,
2006 ; Sanderson et al., 2016 ) que modularon colectivamente la ubicación de la puerta y
subcelular de iGluR. Se ha propuesto que la ubicación subsináptica específica de los
NMDAR (sináptico versus extrasináptico) desempeña un papel dicotómico relacionado
con la plasticidad sináptica y la supervivencia neuronal ( Hardingham y Bading,
2010 ). Recientemente, hemos demostrado que el producto génico del gen candidato a
DS DYRK1A (quinasa 1 regulada por fosforilación de tirosina de especificidad dual)
también influye en la expresión superficial de NMDAR y funciona de manera similar a
la regulación NMDAR por los productos del gen Hsa21 ( Grau et al., 2014 ). En resumen,
estos datos sugieren que la sobreexpresión de los genes Hsa21 afecta la transmisión
glutamatérgica en la DS. Esta posible alteración funcional podría asociarse
molecularmente y / o resultar de una reorganización compleja de la composición del
proteoma sináptico y la proteína fosfopattern, con desregulación específica de la
proteína (subconjuntos de proteínas subrepresentadas, representadas en exceso, con
expresión conservada y con proteína y cambios de fosforilación específicos del
sitio). Para identificar estos posibles cambios moleculares, en este estudio, hemos
optimizado un método de subfraccionamiento bioquímico que permite la purificación
de los compartimentos subsinápticos (fracciones pre, extra y postsinápticas) para un
análisis proteómico y fosfoproteómico adicional del hippocampi de ratones adultos
Ts65Dn. El análisis de espectrometría de masas acoplado a fosfito reveló una firma
iGluR phosphopattern asociada a enfermedad subináptica y asociada a
enfermedad. Este phosphopattern está de acuerdo con el aumento concomitante
subsináptico específico de la expresión de quinasa y la regulación negativa de fosfatasa
en hipocampos de ratones Ts65Dn. En general, nuestros resultados demuestran una
alteración de fosfopattern en la sinapsis glutamatérgica, junto con la identificación de
una firma bioquímica de la proteína quinasa / fosfatasa en el modelo murino Ts65Dn,
que puede representar nuevas dianas terapéuticas para la sinaptopatía por DS.

Métodos
Ratones
Ts65Dn colonia de ratones hembras B6EiC3Sn a / A-Ts (1716) 65Dn (Ts65Dn) y
machos B6C3F1 / J se compraron en el Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). La
colonia de ratones se alojó y se crió en las Instalaciones de Animales del Parque de
Investigación Biomédica de Barcelona (PRBB, Barcelona, España, UE). Todos los
procedimientos con animales cumplieron con las directrices de la Directiva 86/609 /
CEE de la Comunidad Europea y fueron aprobados por el Comité de Ética Local. Los
ratones se alojaron en un horario claro-oscuro de 12:12 h (luces encendidas a las 8:00
am) en condiciones ambientales controladas de humedad (60%) y temperatura (22 ± 2
° C) con comida y agua ad libitum . Tanto los ratones Ts65Dn como los euploides
fueron genotipados por qPCR, siguiendo el protocolo de los laboratorios Jackson
( https://www.jax.org/research-and-faculty/tools/cytogenetic-and-down-syndrome-models-
resource/protocols/cytogenic- qpcr-protocolo ).

Anticuerpos
Los anticuerpos se obtuvieron de proveedores comerciales como sigue: anti-PSD95
(Neuromab, # P78352), anti-sinaptofisina (Sigma-Aldrich, S5768), anti-β-actina
(Sigma-Aldrich, A5316), anti-GluN2A (Sigma- Aldrich, M264), anti-GluN1 (Millipore, #
AB9864R), anti-CaMKIIα (CST, # 50049), anti-Fyn (CST, # 4023), anti-pS890 GluN1
(CST, # 3381), anti-pS1284 GluN2B (CST, # 5355), peroxidasa de rábano picante IgG
de conejo (HRP; Dako, # P0448), y IgG-HRP anti-ratón (Dako, # P0447).
Fraccionamiento Subsináptico y Western Blot
El protocolo de fraccionamiento subsináptico se adaptó del protocolo desarrollado por
Philips y colaboradores ( Phillips et al., 2001 ). Este protocolo permite la obtención de las
fracciones extrasinápticas enriquecidas (Extra), postsinápticas (Post) y presinápticas
(Pre) de las regiones del cerebro. En resumen, el tejido congelado se descongeó en
tampón A frío (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, sacarosa 0,32 M, EDTA 5 mM, EGTA 1 mM,
aprotinina 1 μg / ml, leupeptina 1 μg / ml, 1/2500 PMSF, ZnCl 2 20 μM, NaF 50 mM,
ortovanadato de sodio 1 mM, pirofosfato de sodio 2,5 mM y un cóctel de inhibidores de
la proteasa [Complete, Roche] y homogeneizados mecánicamente con un alfarero. El
homogeneizado se centrifugó durante 10 minutos a 1.400 g, y se recogió el
sobrenadante. Para aumentar el rendimiento de la recuperación de proteínas, este paso
se repitió tres veces. Los sobrenadantes recogidos se agruparon y se centrifugaron
durante 10 minutos a 700 g. El sobrenadante resultante se centrifugó de nuevo durante
15 minutos a 21.000 g. El sedimento resultante que contenía la fracción de membrana
bruta se mantuvo para un subfraccionamiento adicional, como sigue. La fracción bruta
de membrana se solubilizó en tampón B (sacarosa 0,32 M, Tris-HCl 50 mM, pH 7,4) y
se cargó en un gradiente de etapa de sacarosa discontinua (0,85 M / 1,0 M / 1,2
M). Además, después de la centrifugación a 82.500 g durante 2 h, los sinaptosomas
(Syns) se recogieron de la interfaz 1.0 M / 1.2 M y se diluyeron en Tris-HCl 50 mM, pH
7.4, y se centrifugaron una vez más durante 30 minutos adicionales a 21.000 g. Luego,
se recogió este sedimento y se resuspendió en tampón de resuspensión sinaptosomal,
que consiste en sacarosa 36 mM 0,1 mM CaCl 2+ 10 mM NaF + ortohidrato de sodio 1
mM, EDTA 2 mM, proteasa y cóctel inhibidor de fosfatasa (Halt TM, ThermoFisher), lo
que lleva a la fracción sinaptosomal purificada (P2) para un fraccionamiento
subsináptico adicional, como sigue. En resumen, los sinaptosomas se solubilizaron
resuspendiendo en Tris-HCl 40 mM, pH 6.0 que contenía Triton X-100 al 1% y se
incubaron a 4 ° C durante 30 minutos bajo agitación. Después de la centrifugación a
40.000 g durante 30 minutos, la fracción de sobrenadante (correspondiente a la
fracción extrasináptica) se precipitó con acetona. El sedimento, que contenía la unión
sinaptosomal, se resuspendió en tampón Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, suplementado con
Triton X-100 al 1%. Después de 30 minutos de incubación a 4 ° C, las fracciones se
separaron por centrifugación a 40,000 g durante 30 minutos. El sobrenadante
resultante, correspondiente a la fracción presináptica enriquecida, se precipitó con
acetona. El sedimento, que contenía la fracción postsináptica enriquecida, se
resuspendió en tampón Tris 50 mM - SDS al 2%, así como las fracciones subsinápticas
precipitadas con acetona resultantes.

Para el análisis de transferencia de Western, se cargaron cantidades de proteína iguales

de cada muestra y se separaron usando SDS-PAGE al 8 y 10%. Las proteínas se
transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Invitrogen) utilizando el sistema de
transferencia semiseco iBlot (Life Technologies). Después de la tinción transitoria de las
proteínas transferidas mediante la tinción con Ponceau S, las membranas se
bloquearon con leche desnatada al 10% en TBST (Tris-HCl 10 mM, NaCl 100 mM,
Tween-20 al 0,1%) durante 1 h. Las membranas se incubaron durante la noche a 4 ° C
con los anticuerpos primarios correspondientes (diluidos en TBST / leche desnatada al
5%) y seguidos de incubación con anti-ratón conjugado con HRP, IgG-HRP anti-cobaya
o IgG anti-conejo. Anticuerpos secundarios (Dako) durante 1 hora a temperatura
ambiente. La detección se realizó con quimioluminiscencia utilizando el reactivo de
detección de transferencia Western Amersham ECL Prime (GE, Amersham) de acuerdo
con las instrucciones del fabricante. Las bandas inmunoreactivas se visualizaron
usando un ChemiDoc MP (BioRad), y las señales inmunoreactivas se analizaron usando
el software Image Lab Biorad.
Sistema de espectrometría de masas Nano-UPLC y
enriquecimiento de fosfopéptidos
Se realizaron experimentos de espectrometría de masas a partir de dos réplicas
biológicas independientes.Cada réplica consistió en un conjunto de hipocampos ( N = 4
ratones / genotipo) que se fraccionaron posteriormente para obtener fracciones
subsinápticas, ya sea de ratones euploides o de ratones trisómicos.Después de la
resuspensión y la cuantificación de proteínas, las fracciones subsinápticas (70–200 μg)
se diluyeron en SDS al 1% y se digirieron con la proteasa única específica de secuencia
tripsina, siguiendo el protocolo FASP descrito anteriormente ( Wiśniewski et al.,
2009 ). Los péptidos digeridos se sometieron a enriquecimiento de fosfopéptidos
utilizando el kit de enriquecimiento de fosfopéptidos de TiO 2 de High-Select ™ (Thermo
Fisher Scientific). Aproximadamente el 45% de cada muestra enriquecida se analizó
utilizando un Orbitrap Fusion Lumos con un nano fuente EASY-Spray acoplado a un
sistema nano-UPLC (cromatografía líquida EASY-nanoLC 1000) equipado con una
columna C18 de 50 cm (EASY-Spray; 75 μm id, PepMap RSLC C18, partículas de 2 μm,
45 ° C). Los gradientes cromatográficos comenzaron con un 5% de tampón B con un
caudal de 300 nl / min y aumentaron gradualmente hasta un 22% de tampón B en 79
minutos y hasta un 32% en 11 minutos. Después de cada análisis, la columna se lavó
durante 10 minutos con un 95% de tampón B (tampón A: ácido fórmico al 0,1% en agua
y tampón B: ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo). El espectrómetro de masas funcionó
en modo de adquisición dependiente de los datos, con escaneos de MS completos en un
rango de masa de m / z 350–1500 con detección en Orbitrap (resolución 120-K) y con
control de ganancia automático (AGC) establecido en 100,000. En cada ciclo de análisis
de adquisición dependiente de datos, después de cada exploración de la encuesta, se
seleccionaron los iones más intensos por encima de un conteo de iones umbral de
10,000 para la fragmentación con HCD a una energía de colisión normalizada del
28%. El número de iones precursores seleccionados para la fragmentación se determinó
mediante el algoritmo de adquisición "Velocidad máxima" (tiempo de ciclo máximo de
3 s), y se estableció una exclusión dinámica de 60 s. Los espectros de iones de
fragmentos se adquirieron en la trampa de iones con un AGC de 10,000 y un tiempo de
inyección máximo de 200 ms.
Procesamiento de datos sin procesar y análisis de datos
Los datos adquiridos se analizaron utilizando el paquete de software Proteome
Discoverer (v2.0, Thermo Fisher Scientific) y el motor de búsqueda Mascot (v2.5.1,
Matrix Science) se usó para la identificación de péptidos. Los datos se buscaron en una
base de datos de proteínas Mus musculus derivada de SwissProt e incluyeron los
contaminantes más comunes. Se utilizó una tolerancia a la masa de iones precursores
de 7 ppm al nivel de MS1, y se permitieron hasta tres escisiones perdidas para la
tripsina. El fragmento de tolerancia a la masa iónica se ajustó a 0,5 Da de oxidación de
metionina; La acetilación de proteínas N-terminal y la fosforilación en serina, treonina
y tirosina se definieron como modificación variable; y la carbamidometilación de las
cisteínas se estableció como modificación fija. Los péptidos identificados se filtraron
con FDR al 5%, y solo las proteínas identificadas en ambas réplicas biológicas (para
cada condición) se retuvieron para análisis adicionales (Tabla complementaria 1).
Análisis bioinformático de datos proteómicos.
La firma proteómica de los grupos experimentales se representó utilizando diagramas
de Venn. Estos diagramas se crearon utilizando el software gratuito VENNY 2.1
( http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/ ; Oliveros et al., 2007–2015 ). Esta interfaz gráfica
permitió la representación de proteínas superpuestas entre grupos, junto con la
visualización de proteínas expresadas diferencialmente en los diferentes grupos /
fracciones.

Para clasificar funcionalmente las proteínas expresadas diferencialmente de los

diferentes grupos (fracción subsináptica y genotipo), los datos se enviaron a la Base de
datos para anotación, visualización y descubrimiento integrado
(DAVID: http://david.abcc.ncifcrf.gov/ ). Este software, basado en el uso de la ontología de
genes (GO), se usó para agrupar las proteínas expresadas diferencialmente en procesos
biológicos, funciones moleculares y componentes celulares.
Análisis en silico de datos fosfoproteómicos
Se generó una base de datos actualizada de quinasas y fosfatasas murinas antes del
análisis de los datos fosfoproteómicos. Para este fin, se utilizó la base de datos Uniprot
como biblioteca de referencia, se clasificaron las proteínas (por ejemplo, criterios de
"quinasa" y "fosfatasa"), y la lista de proteínas se curó adicionalmente de forma
manual. Esta base de datos se utilizó para analizar las quinasas y fosfatasas expresadas
de manera diferencial entre genotipos (Tabla complementaria 2).
El análisis de las firmas de proteoma y fosfoproteoma se realizó utilizando, como
criterio de inclusión, la identificación de las proteínas y fosfósis en ambas réplicas
biológicas. Además, las fosfositas conservadas se clasificaron según su expresión
cualitativa en los diferentes compartimentos subsinápticos, así como en sus niveles de
expresión relativos. Con respecto a esto último, las proteínas y las fosfositas detectadas
en ambas fracciones se clasificaron en función de la relación TS: UE relativa, resultante
de la media del área del pico de la MS (TS) (réplicas 1 y 2) / del área del pico de la media
de la MS (EU) (réplicas 1 y 2). Las proporciones <0,75 o> 1,5 se consideraron niveles de
proteína regulados a la baja y al alza, respectivamente (ver Tabla complementaria 3).

Luego de la identificación del perfil fosfoproteómico de las fracciones subinápticas

trisómicas, se realizó un enfoque de biología de sistemas para inferir las quinasas
potenciales asociadas con el perfil fosfoproteómico. Para este fin, se utilizó la Base de
datos de referencia de proteínas humanas (Hprd.org) y se identificaron las supuestas
quinasas implicadas en el fosfoprofile. Finalmente, se realizó un análisis de la red de
interacción utilizando la herramienta de búsqueda para la recuperación de la base de
datos de genes / proteínas en interacción (STRING; http://www.string-db.org/ ). Esta
herramienta bioinformática permitió la generación de redes de interacción proteína-
proteína, integrando las quinasas / fosfatasas y el fosfoprofilo iGluR de las fracciones
subsinápticas Ts65Dn.
Análisis estadístico
La comparación de las intensidades de la señal de inmunomarcaje entre las fracciones
del hipocampo euploide y trisómico se evaluó utilizando el software GraphPad. Todos
los conjuntos de datos pasaron la prueba de normalidad de Kolmogorov-Smirnov y se
analizaron aplicando una prueba t no pareada de dos colas con la corrección de
Welch. Las barras gráficas representan la media ± SEM para cada grupo.

Resultados
Firma Proteómica Subsináptica De Los Ratones Ts65Dn
Hippocampi
La comunicación neuronal reside principalmente en la sinapsis, un compartimento
subcelular altamente especializado que yuxtapone a las neuronas de diafonía. Dentro de
las sinapsis, existe una compartimentación morfológica adicional que permite el
posicionamiento preciso de neurotransmisores y maquinaria estructural, la función
neuronal subyacente. En consecuencia, los posibles cambios específicos en la
composición de proteínas de los compartimentos subsinápticos pueden afectar la
función sináptica y, en última instancia, alterar las neuronas glutamatérgicas
Ts65Dn. Para abordar este problema, realizamos un protocolo de fraccionamiento
subsináptico hacia la obtención de fracciones de hipocampo enriquecidas
extrasinápticas, presinápticas y postsinápticas, tanto de ratones adultos euploides como
de ratones trisómicos adultos (Figura 1A ).
FIGURA 1

Figura 1 . Fraccionamiento subsináptico y análisis proteómico del hipocampo de ratón

Ts65Dn. (A)Continuación del flujo de trabajo experimental para la obtención de
fracciones subsinápticas del hipocampo y estudios de espectrofetría de masas y
fosfoproteómica (los espectros de masas de las réplicas biológicas 1 y 2 son
representaciones figurativas). Panel inferior izquierdo , análisis Western blot
representativo de las fracciones subsinápticas del hipocampo adulto. Los anticuerpos
dirigidos contra PSD95 y sinaptofisina se utilizaron como marcadores de postsinápticos
y extrasinápticos, respectivamente. Panel derecho , análisis de transferencia Western de
las subunidades GDLNA y GluN1 de NMDAR en fracciones subsinápticas (Post,
postsináptica; Extra, extrasináptica) de ratones adultos euploides (UE) y trisómicos
(TS). (B) El diagrama de Venn que representa el total de proteínas identificadas se
superpone entre las réplicas biológicas 1 y 2 (fracciones postsinápticas y extrasinápticas
de ambos genotipos). (C) Diagrama de Venn que representa el genotipo (UE, euploide;
TS, trisómico) y el compartimiento subsináptico (Post, postsináptico; Extra,
extrasináptico) efecto sobre la composición de la proteína.

El protocolo de fraccionamiento subsináptico del hipocampo fue validado por Western

blot, utilizando marcadores compartimentales subsinápticos específicos. Como era de
esperar, la fracción extrasináptica mostró una señal elevada de sinaptofisina, mientras
que la fracción postsináptica se enriqueció en la proteína PSD95 del andamio
(Figura 1A ). Además, observamos un enriquecimiento significativo de las subunidades
del receptor de NMDA GluN1 y GluN2A en la fracción postsináptica (Figura 1A ). En
general, estos estudios bioquímicos confirmaron la obtención de compartimientos
subsinápticos enriquecidos a partir de tejido cerebral murino, y se utilizó el mismo
protocolo para obtener fracciones de hipocampo subsinápticas enriquecidas para el
análisis de espectrometría de masas.

Las fracciones subsinápticas (postsinápticas y extrasinápticas) se sometieron a

digestión con tripsina y se realizaron estudios de espectrometría de masas. El análisis
de los datos se basó en la comparación del efecto del genotipo en la firma proteómica /
fosfoproteómica subsináptica (definida como el perfil superpuesto de las réplicas
biológicas).

El análisis proteómico permitió la identificación de proteínas de 1922 (base de datos de

proteínas de M. musculus , SwissProt) constantemente presentes en ambas réplicas
biológicas (Figura 1B ). El análisis de distribución subsináptica de estas proteínas
mostró que 938/1043 proteínas están presentes en la fracción postsináptica de ratones
euploides / trisómicos, respectivamente, mientras que 863/1059 proteínas están
presentes en las fracciones extrasinápticas de ratones euploides / trisómicos,
respectivamente (Figura 1C y Tabla Suplementaria 1). A pesar de que el perfil
proteómico mostró la presencia de proteínas conservadas en las sinapsis del hipocampo
trisómico (60,7 y 57,8% de coincidencia de proteínas para las fracciones postsinápticas
y extrasinápticas, respectivamente; Figuras 2A , 3A ), se detectaron cambios
significativos en la composición de las proteínas en el hipocampo trisómico. Además, se
realizaron análisis in silico para analizar los posibles resultados funcionales de estos
cambios proteómicos.
FIGURA 2

Figura 2 . Análisis de ontología génica del proteoma postsináptico del hipocampo del
ratón Ts65Dn.(A) Diagrama de Venn que representa la composición proteica
comparativa entre las fracciones postsinápticas de hipocampos euploides adultos (UE)
y Ts65Dn (TS). El diagrama representa proteínas detectadas en réplicas euploides
(círculo azul), en réplicas trisómicas (círculo amarillo), y comúnmente detectadas en
réplicas de muestras euploides y trisómicas (círculo blanco). (B – E)Análisis de
anotación funcional de proteínas enriquecidas en fracciones postsinápticas del
hipocampo de hipocampos euploides (B, D) y trisómicos (C, E) (B, C) . Los gráficos
de barras representan los cinco primeros términos GO enriquecidos significativamente,
según los criterios de "compartimento celular" (D, E) . En la tabla se enumeran las
cinco principales proteínas enriquecidas significativamente relacionadas con los
términos del "proceso biológico" y la "función molecular", en la fracción postsináptica
de hipocampos euploides (D) y trisómicos (E) .
FIGURA 3

Figura 3 . Análisis de ontología génica del proteoma extrasináptico hipocampal del

ratón Ts65Dn.(A) Diagrama de Venn que representa la composición proteica
comparativa entre las fracciones extrasinápticas de hipocampos euploides adultos (UE)
y Ts65Dn (TS). El diagrama representa proteínas detectadas en réplicas euploides
(círculo verde), en réplicas trisómicas (círculo rojo) y comúnmente detectadas en
réplicas de muestras euploides y trisómicas (círculo blanco). (B – E)Análisis de
anotación funcional de proteínas enriquecidas en fracciones extrasinápticas del
hipocampo de hipocampos euploides (B) y trisómicos (C) (B, C) . Los gráficos de
barras representan los cinco primeros términos GO enriquecidos significativamente,
según los criterios de "compartimento celular" (D, E) . En la tabla se enumeran las
cinco principales proteínas significativamente enriquecidas relacionadas con los
términos del "proceso biológico" y la "función molecular", en la fracción extrasináptica
de hipocampos euploides (D) y trisómicos (E) .
Ontología génica Análisis de enriquecimiento de la firma
proteómica Ts65Dn subsináptica
El efecto del genotipo sobre la composición de proteínas de las fracciones
postsinápticas y extrasinápticas se realizó después del análisis de enriquecimiento de
proteínas basado en el término de GO. Para estudios de anotación funcional, solo se
consideraron aquellas proteínas que muestran expresión de fracción subsináptica
diferencial (Figuras 2A , 3A ). El análisis estadístico de enriquecimiento del
"compartimento celular", los "procesos biológicos" y las "funciones moleculares"
revelaron la presencia de diferencias significativas dependientes del genotipo, tanto en
las fracciones postsinápticas como en las extrasinápticas (Figuras 2B-E , 3B-E ).

El análisis de GO-term del proteoma postsináptico específico de euploides indicó la

presencia de una representación enriquecida de proteínas asociadas a dendrita,
reflejando así una proteína dendrítica subrepresentada en la fracción postsináptica
trisómica (Figuras 2B-D ). Además, el análisis GO de la fracción postsináptica trisómica
mostró cambios significativos en las siguientes funciones celulares: membranas,
citoplasma, transporte y unión a proteínas (Figuras 2C a E ).

Con respecto a las fracciones extrasinápticas, el análisis a largo plazo de la fracción

extrasináptica específica de euploides mostró la presencia de mitocondrias y proteínas
que se unen a proteínas fosfatasas, lo que indica su ausencia relativa de detección en la
fracción extrasináptica trisómica (Figuras 3B-D ). En contraste, el análisis GO de la
fracción trisómica extrasináptica indicó cambios en la membrana, el citoplasma, el
transporte de sinapsis, la fosforilación, la actividad de la proteína quinasa y la unión a
proteínas (Figura 3C – E ). En general, el análisis del término GO sugirió que el
proteoma subsináptico del hipocampo trisómico está alterado, tanto en términos de
compartimentos celulares como de resultados funcionales. En particular, el análisis
sugirió fuertemente que los procesos asociados a la fosforilación podrían verse
afectados, como se describe a continuación.
Expresión alterada de quinasas y fosfatasas en las fracciones
subsinápticas del hipocampo del ratón Ts65Dn
En función de los análisis de anotación funcional que muestran alteraciones en la
fosforilación, la actividad de la proteína quinasa y la unión de la fosfatasa en las sinapsis
de Ts65Dn, nuestro objetivo fue dilucidar los posibles cambios en la expresión de
quinasas y fosfatasas. Para este fin, se desarrolló una base de datos actualizada de
kinomas y fosfatomas de ratón, utilizando Uniprot como base de datos de referencia y
filtrando las entradas de la proteína M. musculus para la extracción de quinasas y
fosfatasas de ratón (Tabla complementaria 2). Posteriormente, el efecto del genotipo se
comparó para las fracciones postinápticas o extrasinápticas. Con respecto a los ratones
euploides, la fracción postsináptica de ratones trisómicos mostró la presencia de un
subconjunto de quinasas y fosfatasas específicas / enriquecidas (50 y 10 proteínas,
respectivamente), junto con la expresión no detectable / reducida de quinasas y
fosfatasas (21 y 7 proteínas, respectivamente) (Figura 4 y Figura 1A suplementaria). El
estudio comparativo de las fracciones extrasinápticas indicó la presencia, en muestras
trisómicas, de un subconjunto de quinasas y fosfatasas específicas / enriquecidas (37 y 7
proteínas, respectivamente), junto con la expresión no detectable / reducida de
quinasas y fosfatasas que están presentes en Muestras euploides (cinco y ocho
proteínas, respectivamente) (Figura 5 y Figura 1B complementaria). Se realizó un
análisis de transferencia Western de quinasas identificadas por MS con una expresión
diferencial putativa para validar estos hallazgos imparciales. De acuerdo con los datos
proteómicos, la transferencia Western mostró un aumento significativo de los niveles
de expresión de CamKII en la fracción postsináptica de ratones trisómicos ( p = 0,033,
prueba t de Student de dos colas), junto con una disminución significativa de los niveles
de Fyn quinasa en la postsináptica y un aumento concomitante en la fracción
extrasináptica de los ratones Ts65Dn ( p = 0.015 y 0.024, respectivamente; prueba de t
de Student de dos colas; Figura 2A suplementaria).
FIGURA 4

Figura 4 . Análisis del interactoma Kinome y cinasa-iGluR de la fracción postsináptica

del hipocampo del ratón Ts65Dn. (Arriba) Diagrama de Venn que representa el
análisis comparativo de las proteínas quinasas expresadas en la fracción postsináptica
de ratones adultos euploides (UE) y Ts65Dn (TS). El diagrama representa proteínas
detectadas en réplicas euploides (círculo azul), en réplicas trisómicas (círculo amarillo),
y comúnmente detectadas en réplicas de muestras euploides y trisómicas (círculo
púrpura). El diagrama muestra el número de quinasas no detectadas / representadas
insuficientemente en ratones Ts65Dn (en rojo), con una expresión similar (TS: relación
de expresión EU = 0.75–1.25; caracteres negros) y presente / representada en exceso en
ratones trisómicos (en verde). (Parte inferior) Red de interacción proteína-proteína
(PPI) de proteínas quinasas, proteínas de andamiaje y iGluRs regulados al alza en la
fracción postsináptica Ts65Dn. Anotación del color del nodo: rojo, actividad
quinasa; azul, quinasa asociada a la densidad postsináptica; verde, participación en
potenciación a largo plazo; y amarillo, presente en la sinapsis glutamatérgica; anotación
del color del enlace: interacciones conocidas (azul claro: bases de datos curadas; rosa:
determinadas experimentalmente), interacciones previstas (verde: vecindad del gen;
rojo: fusiones de genes; azul: coexistencia del gen), y otras (verde claro: minería de
textos; negro : coexpresión; púrpura: homología de proteínas).
FIGURA 5

Figura 5 . Análisis de kinase e interactoma quinasa-iGluR de la fracción extrasináptica

del hipocampo de ratones Ts65Dn. (Arriba) Diagrama de Venn que representa un
análisis comparativo de las proteínas quinasas expresadas en la fracción extrasináptica
de ratones adultos euploides (UE) y Ts65Dn (TS). El diagrama representa proteínas
detectadas en réplicas euploides (círculo verde), en réplicas trisómicas (círculo rojo) y
comúnmente detectadas en réplicas de muestras euploides y trisómicas (círculo verde
oscuro). El diagrama muestra el número de quinasas no detectadas / representadas
insuficientemente en ratones Ts65Dn (en rojo), con una expresión similar (TS: relación
de expresión EU = 0.75–1.25; caracteres negros) y presente / representada en exceso en
ratones trisómicos (en verde). ( Parte inferior) Red de interacción proteína-proteína
(PPI) de proteínas quinasas y iGluRs regulados al alza en la fracción extraináptica
Ts65Dn. Anotación del color del nodo: rojo, actividad quinasa;azul, quinasa asociada a
la densidad postsináptica; verde, participación en potenciación a largo plazo; y
amarillo, presente en la sinapsis glutamatérgica; anotación del color del enlace:
interacciones conocidas (azul claro: bases de datos curadas; rosa: determinadas
experimentalmente), interacciones previstas (verde: vecindad del gen; rojo: fusiones de
genes; azul: coexistencia del gen), y otras (verde claro: minería de textos; negro :
coexpresión; púrpura: homología de proteínas).

Además, nuestro objetivo fue predecir las consecuencias potenciales del kinoma
sináptico trisómico desregulado. Nos enfocamos en el análisis de silico en la familia
ionotrópica de receptores de glutamato similares a las alteraciones glutamatérgicas
reportadas en el modelo de ratón Ts65Dn. Las redes potenciales de interacción
proteína-proteína entre iGluRs y proteína quinasas reguladas al alza en las fracciones
trisómicas (ya sea postsináptica o extrasináptica) se analizaron utilizando el software
STRING. El análisis interactivo de la fracción postsináptica trisómica desentrañó la
interacción significativa de quinasa-iGluR, como lo demuestra el elevado número de
bordes (número predicho de bordes: 123 frente al número esperado de bordes: 18) y el
enriquecimiento PPI ( p-valor = 0), que indica las interacciones significativas dentro de
la red PPI. En particular, el análisis STRING identificó proteínas quinasas de la familia
CaMKII, Dlgap1, Agap2, MRCKβ que interactúan de manera distintiva con las
subunidades iGluR detectadas (GluN1, GluN2A, GluN2B, GluN2D, GluA1 y GluA2;
Figura 4 ). El análisis interactivo de la fracción extraináptica trisómica desentrañó la
interacción significativa de quinasa-iGluR, como lo demuestra el aumento significativo
de los bordes de la red (número predicho de bordes: 51 vs. número esperado de bordes:
21) y el enriquecimiento PPI ( valor p = 2.49 .10 −8), indicando las interacciones
significativas de la red PPI. Además, varias cinasas (miembros de la familia de quinasas
CaMKII, proteína quinasa dependiente de AMPc, familia de PKC y Agap2) que
interactúan de manera distintiva con las subunidades GriA1 y GriA2 de los AMPAR
también se detectaron significativamente (Figura 5 ).
Fosfatruro subináptico iGluR alterado en el hipocampo del
ratón Ts65Dn
Las fracciones subsinápticas del hipocampo se analizaron mediante espectrometría de
masas acoplada con fosfito para evaluar el modelo predictivo de interactoma kinome-
iGluR. Se analizó el fosfoproteoma de las diferentes fracciones, y se identificaron un
total de 59 iGluR fosfositas en las diferentes réplicas biológicas (Tabla complementaria
3). De estos, solo los fosfatos iGluR encontrados en ambas réplicas se conservaron para
un análisis adicional del efecto de genotipo (Figura 6y cuadro complementario 3). Esta
técnica permitió la identificación de varias fosfósis iGluR, en su mayoría
correspondientes a fosforídidos reportados previamente (15 fosfósis individuales); Se
identificaron dos nuevas fosfositas. Es importante destacar que el subopatín iGluR
phosphopattern se caracterizó en el hipocampo de ratones Ts65Dn. Usando este
método imparcial, las fosfosis reguladas al alza identificadas (que muestran picos de
EM más altos en muestras trisómicas) mostraron una representación elevada de
subunidades NMDAR (ocho fosfosis para GluN2A, siete para GluN2B y una para
GluN1), mientras que solo se detectó un fosfosito en la subunidad GluA1 (Subunidad
AMPAR) y no se identificaron fosfositos en las subunidades KAR. Realizamos un
análisis de transferencia Western en fosfositos expresados diferencialmente
identificados por MS seleccionados para validar aún más nuestros resultados.Este
análisis mostró un aumento de los niveles tanto de GluN1 (pS890) como de GluN2B
(pS1284) en la fracción postsináptica de ratones trisómicos, aunque no fue significativo,
de acuerdo con los cambios observados a lo largo del análisis fosfoproteómico imparcial
(Figura 2B complementaria). Finalmente, las quinasas putativamente fosforilaron el
consenso iGluR phosphoresidues fueronin silico predijo usar el software "Phosphomotif
Finder". Este análisis predijo una actividad enzimática potencial de CaMKII, PKC, CK1
en los fosforídidos iGluR identificados, que estaría de acuerdo con su expresión
regulada al alza mencionada anteriormente.
FIGURA 6

Figura 6 .Perfil de phosphopattern de las subunidades del receptor de NMDA y AMPA

en el hipocampo de ratón Ts65Dn adulto. (A – D) Representación esquemática de
fosfositas identificadas con fosfoproteoma en subunidades NMDAR (GluN1 y GluN2A y
GluN2B) y AMPAR GluA1, en fracciones subsinápticas del hipocampo adulto. Se indica
la posición del fosforato junto con la presencia y / o la fosforilación relativa de pico MS
trisómico: euploide (negro: fosfosito presente en muestras euploides y trisómicas; verde
claro: niveles aumentados detectados en fracciones trisómicas; verde oscuro: fosfósis
detectados exclusivamente en trisómico muestras). (MI)Tabla que contiene las
fosfatasas iGluR identificadas en las fracciones del hipocampo euploides y / o
trisómicas, junto con las quinasas de fosforilación predichas. Fosfosferas previamente
reportadas en (1) Munton et al. (2007) , (2) Lundby et al. (2012) , (3) Li et al. (2016) , (4) Maki
et al. (2013) , (5) Trinidad et al. (2012) , (6) Zhang et al. (2013) , (7) Wiśniewski et al. (2010) y
(8) McQueen et al. (2017) .

Discusión
En el presente estudio, hemos realizado un análisis de espectrometría de masas
acoplado con fosfito que mostró cambios funcionales alterados en las fracciones
extrasinápticas y postsinápticas del hipocampo de los ratones Ts65Dn, un modelo de
ratón trisómico que recapitula las alteraciones fenotípicas de DS. La mayoría de las
quinasas que interactúan con iGluRs muestran notablemente un aumento general en
las muestras trisómicas, mientras que la mayoría de las fosfatasas relacionadas con
iGluR muestran reducción, con algunas excepciones en ambas categorías de proteínas.
Estos resultados son concomitantes con el mayor número de fosfopéptidos iGluR
identificados por el análisis fosfoproteómico de las fracciones postsinápticas del
hipocampo de ratones Ts65Dn. Es importante destacar que en silico.El análisis de
kinoma-iGluR phosphopattern apoyó el papel de las quinasas específicas y sus posibles
iGluR fosfosis en la fisiopatología neuronal del ratón Ts65Dn.

El análisis inicial del proteoma mostró una conservación relativa del número de
proteínas (aproximadamente 1.000 proteínas identificadas), independientemente de la
fracción subsináptica y el genotipo. El estudio comparativo del efecto del genotipo en la
composición de la fracción subsináptica mostró una coincidencia de proteínas de 60.7 y
57.8% para las fracciones postsinápticas y extrasinápticas, respectivamente. Este
análisis cuantitativo indica una composición molecular diferente de las sinapsis del
hipocampo Ts65Dn, que podría resultar de la sobreexpresión de genes triplicados. Por
lo tanto, varias proteínas se expresan diferencialmente en los compartimientos
subsinápticos de las neuronas del hipocampo Ts65Dn, lo que refleja potencialmente los
sustratos moleculares asociados con las anomalías sinápticas Ts65Dn.
Curiosamente,Además, el análisis de enriquecimiento de proteínas basado en el
término GO apoyó los resultados funcionales de los cambios proteómicos detectados en
las fracciones postsinápticas y extrasinápticas de ratones trisómicos. En particular, la
fracción postsináptica de ratones trisómicos mostró una disminución relativa de las
proteínas relacionadas con el término GO de "función dendrítica". Este hallazgo está de
acuerdo con estudios previos que muestran una reducción de la ramificación dendrítica
y la densidad de la columna vertebral en ratones Ts65Dn (Belichenko et al., 2007 ) que, en
el contexto de individuos con SD, podría recapitular el deterioro dendrítico informado
en cerebros fetales DS ( Weitzdoerfer et al., 2001 ). Además, el análisis GO reveló un
enriquecimiento diferencial de proteínas sinápticas estructurales dentro del
compartimiento extrasináptico. En particular, el compartimiento trisómico
extrasináptico mostró un enriquecimiento significativo de la "sinapsis" del término GO.
Un análisis más detallado mostró la presencia de Homer3, una de las proteínas de
andamiaje más abundantes de la densidad postsináptica en ratones euploides ( Hayashi
et al., 2009 ), En fracciones extrasinápticas de ratones trisómicos. Estos datos, junto con
estudios previos de microscopía electrónica que muestran la presencia de
espinas dilatadas en las neuronas Ts65Dn ( Belichenko, 2004; Benavides-Piccione et al.,
2004 ), sugieren que las alteraciones morfológicas de las espinas Ts65Dn podrían estar
asociadas con una composición proteica alterada de la fracción extrasináptica.
Curiosamente, el análisis enriquecido con el término GO también mostró una reducción
significativa de las proteínas mitocondriales en la fracción extrasináptica de ratones
trisómicos. Este hallazgo está en línea con estudios previos que informaron una
reducción de los complejos mitocondriales y la actividad redox en cultivos neuronales y
fetos con SD, lo que lleva a disfunciones mitocondriales graves que pueden afectar el
metabolismo, la energía y la función sináptica ( Izzo et al., 2014 ).

Además del enriquecimiento diferencial de las proteínas asociadas a la estructura y la

energía, se detectó una alteración significativa de las proteínas asociadas a la
fosforilación en los compartimentos subsinápticos trisómicos. De hecho, la fracción
trisómica extrasináptica mostró un enriquecimiento de la "fosforilación de proteínas" y
los términos de la "actividad de la proteína quinasa", mientras que la "unión de la
proteína fosfatasa" (enriquecida en la fracción extrasináptica euploide) se redujo
significativamente. Aunque estas evidencias sugirieron una actividad enzimática
alterada de quinasas / fosfatasas en el hipocampo Ts65Dn, se realizó un análisis más
detallado de los niveles de expresión subsinápticos de quinasa / fosfatasa. Este análisis
mostró aproximadamente un aumento de la expresión de la quinasa, junto con una
reducción de los niveles de fosfatasa en el modelo de ratón Ts65Dn. En nuestro
estudio,Un análisis más detallado del kinoma trisómico mostró niveles aumentados de
subunidades CaMKII (subunidades alfa, beta, delta y gamma) en las fracciones
postsinápticas y extrasinápticas del hipocampo de ratones Ts65Dn, mediante técnicas
de proteómica y WB. Este aumento podría resultar en una mayor actividad de CamKII,
similar a estudios anteriores que muestran un aumento de CaMKII fosforilado en
hipocampo Ts65Dn (Siarey et al., 2006 ). De acuerdo con este aumento de la quinasa, el
trabajo previo de Fernández y sus colaboradores mostró una mayor cantidad de
fosfopéptidos en los sinaptosomas crudos de ratones Ts65Dn ( Fernández et al., 2009). En
general, nuestros datos proteómicos y los estudios morfológicos citados anteriormente
apoyan la relación entre las alteraciones bioquímicas y los cambios estructurales de las
neuronas del hipocampo trisómico. Estas alteraciones morfológicas y bioquímicas
pueden resultar en una mala localización subsináptica de las proteínas, afectando
potencialmente la forma sináptica, cambiando la composición molecular de la densidad
postsináptica y, en última instancia, la función sináptica de la función de las neuronas
trisómicas. En resumen, estos resultados refuerzan la hipótesis de que las anomalías
dendríticas / sinápticas morfológicas y funcionales, como las detectadas en nuestro
estudio, pueden impactar directamente en la plasticidad sináptica ( Cramer y Galdzicki,
2012 ) y conducir al deterioro cognitivo.

El análisis de Interactome reveló interacciones significativas entre las proteínas

quinasas enriquecidas en fracciones subsinápticas trisómicas y subunidades iGluR. En
la fracción postsináptica, estas quinasas interactúan con las subunidades NMDAR y
AMPAR. En contraste, el análisis del interactoma solo reveló interacciones proteína-
proteína potenciales de estas quinasas con las subunidades GluA1 y GluA2 de la
AMPAR, que están proporcionalmente más representadas en mayor medida que las
subunidades NMDAR en la fracción extrasináptica. Después de este análisis predictivo,
realizamos una caracterización precisa de iGluR phosphopattern en las fracciones
subsinápticas del hipocampo de ratones Ts65Dn. Otros análisis bioinformáticos se
centraron en la fosforilación de estos receptores para revelar cambios potenciales en
iGluR phosphopattern. En la preparación de muestras.las fracciones siguieron la
digestión tríptica con una proteasa única (tripsina) para un método de EM más
imparcial. Técnicamente, el uso de una única proteasa limita el alcance de los
fosfopéptidos detectables (Dephoure et al., 2013 ). Además, la baja abundancia de
fosfopéptidos informada ( Parker et al., 2010 ) también podría contribuir a subestimar el
fosfoproteoma completo de las sinapsis del hipocampo trisómico. A pesar de estas
limitaciones técnicas intrínsecas, en nuestro estudio se identificaron una cantidad total
de 17 fosfatosas iGluR individuales, 15 de ellas correspondientes a fosfosis informadas
previamente (PhosphositePlus, Cell Signaling Technology Inc.) ( Lussier et al., 2015 )
(Figura 6E ). En el pasado, Siarey y sus colaboradores mostraron un aumento en los
niveles de fosforilación de las fosfatasas iGluR en ratones Ts65Dn, como GluA1 (pS831)
( Siarey et al., 2006). En línea con estos, nuestros resultados mostraron una
representación excesiva de los fosforosidos iGluR en compartimientos sinápticos
Ts65Dn específicos identificados, lo que respalda la hipótesis de que iGluR
phosphopattern está asociado con la transmisión sináptica y las disfunciones
glutamatérgicas reportadas en el modelo de ratón Ts65Dn de DS. Además, el análisis
del fosfoprofilo iGluR proporcionó vínculos funcionales potenciales entre los niveles
aumentados de sububnits iGluR en las fracciones sinápticas Ts65Dn y las cinasas
predichas in silico que fosforilan esos fosforocitos. Este grupo de quinasas candidatas
contenía CaMKII, PKC y CK1, anteriormente descritas como quinasas reguladoras
iGluR ( Lan et al., 2001 ; Chergui, 2005 ; Sanz-Clemente et al., 2013 ;Lussier et al., 2015 ).
Nuestro estudio proteómico mostró significativamente una regulación positiva de estas
quinasas en hipocampos trisómicos, apoyando la asociación entre su sobreexpresión y
los cambios en iGluR phosphopattern. Con respecto a esta última, se detectó una
representación elevada significativa de fosfluéptidos de subunidad GluN2A y GluN2B
en fracciones postsinápticas trisómicas. Esta firma bioquímica sugiere una contribución
relevante de los NMDAR que contienen GluN2A y GluN2B anormalmente fosforilados
en el fenotipo Ts65Dn. De hecho, nuestro grupo y otros han proporcionado
previamente pruebas bioquímicas y farmacológicas que apoyan el papel de las
alteraciones de NMDAR en los modelos murinos de DS ( Costa et al., 2007 ; Altafaj et al.,
2008 ; Hanson et al., 2013 ;Grau et al., 2014). Se ha informado que, específicamente, la LTP
del hipocampo CA3-CA1 se reduce funcionalmente en ratones Ts65Dn ( Siarey et al.,
2006 ). Además, los ratones trisómicos exhiben un aumento de LTD dependiente de
NMDAR que puede ser rescatado farmacológicamente con memantina, un antagonista
de NMDAR ( Scott-McKean y Costa, 2011 ). Las alteraciones en la actividad de NMDAR
observadas en ratones Ts65Dn probablemente podrían verse influenciadas por los
cambios en los niveles de expresión de NMDAR y / o la firma fosfopattern de NMDAR
(y otra iGluR) descrita en el presente estudio. Del mismo modo, nuestros estudios
anteriores mostraron que en el modelo de ratón transgénico TgDyrk1A, la
sobreexpresión de DYRK1A está asociada con la regulación positiva de la
subunidad GluN2A ( Altafaj et al., 2008). Este aumento de la densidad resulta
mecánicamente de una fosforilación mediada por Dyrk1A de la subunidad GluN2A
(GluN2A (pS1048)) que reduce la internalización de NMDAR y aumenta
funcionalmente las corrientes mediadas por NMDAR y modifica las propiedades de
activación de NMDAR ( Grau et al., 2014). Desafortunadamente, la metodología seguida
en este estudio (digestión con tripsina) no fue compatible con la detección de GluN2A
(pS1048). Aunque nuestro estudio reveló la presencia de Dyrk1A en la fracción
postsináptica del hipocampo y estudios previos mostraron que la sobreexpresión de
DYRK1A en DS, nuestros datos sugieren que la fosforilación GluN2A (pS1048) mediada
por Dyrk1a (pS1048) podría contribuir a las alteraciones sinápticas de DS, una hipótesis
que podría explorarse en el futuro. Curiosamente, varias fosfatasas iGluR identificadas
en este estudio se han asociado con mecanismos de plasticidad sináptica. Entre estos, se
ha demostrado que GluN1 (pS890) altera los grupos de superficie de GluN1 ( Tingley et
al., 1997 ), y la fosforilación de GluN2A (pS929) se ha descrito como modulante de la
subunidad GluN2A que contiene la desensibilización NMDAR ( Maki et al., 2013). Con
respecto a la fosforilación de la subunidad GluN2B, se ha demostrado que la
fosforilación de GluN2B (pS1303) incrementa las corrientes de GluN1 / GluN2B ( Liao et
al., 2001 ), y la fosforilación de GluN2B (pS1116) potencia las fosforilaciones NMDAR y
la permeabilidad de Ca 2+ ( Murphy et al. 2014 ). . En general, la presencia de fosfatos de
NMDAR discretos con función relevante en la función sináptica y la identificación de su
representación excesiva relativa en ratones trisómicos apoyan la contribución de las
alteraciones de la neurotransmisión glutamatérgica en el fenotipo de ratones Ts65Dn.

Además, se describió anteriormente que algunos de los fosfositos que se encontraban

sobre representados en nuestro estudio estaban involucrados en la plasticidad
sináptica. Por ejemplo, la fosforilación de GluN1 S890 dispersa los grupos superficiales
de GluN1 ( Tingley et al., 1997 ). La fosforilación de GluN2A S929 modula la
desensibilización de los receptores GluN2A / NMDA ( Maki et al., 2013 ). La fosforilación
de GluN2B S1303 aumenta las corrientes de GluN1 / GluN2B ( Liao et al., 2001 ). La
fosforilación de GluN2B S1116 potencia las corrientes del receptor y su permeabilidad al
Ca 2+ ( Murphy et al., 2014). En consecuencia, su regulación al alza podría conducir a
alteraciones en la plasticidad sináptica. En general, estos hallazgos sugieren que el
kinome alterado y iGluR phosphopattern (que afecta principalmente a las subunidades
GluN2A y GluN2B) pueden contribuir a las disfunciones de neurotransmisión
glutamatérgica presentes en el modelo de ratón Ts65Dn de DS.

En resumen, nuestro estudio reveló una composición subsináptica alterada del

hipocampo de ratón Ts65Dn adulto. Estas alteraciones subsinápticas moleculares
podrían ser funcionalmente subyacentes al deterioro dendrítico asociado con Ts65Dn,
la organización sináptica alterada y la disfunción mitocondrial. Además, este estudio
fosfoproteómico proporciona un extenso repertorio de las fosfatasas iGluR, junto con
las respectivas quinasas pronosticadas. Es importante destacar que, aunque los estudios
mecánicos siguen siendo esquivos, la caracterización de iGluR phosphopattern y las
quinasas asociadas predichas en el hipocampo Ts65Dn pueden ayudar a identificar
nuevas dianas terapéuticas para la sinaptopatía por DS.

Contribuciones de autor
XA y MG contribuyeron a la concepción y diseño del estudio. MG realizó los análisis
experimentales y bioinformáticos, con la ayuda técnica de CG. MG, FC y XA escribieron
el manuscrito. Todos los autores contribuyeron a la revisión de la revisión del
manuscrito y también leyeron y aprobaron la versión presentada.

Fondos
Este trabajo fue apoyado por Grants La Marató (Proyecto N. 20140210), PI16 / 00851
(ISCIII), PCIN-2014-105 (MINECO) y el Programa Miguel Servet (CPII16 / 00021,
ISCIII) a XA. Los contratos MG y CG fueron financiados por la Fundació La Marató
(Proyecto N. 20140210).

Declaracion de conflicto de interes

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier
relación comercial o financiera que pudiera interpretarse como un posible conflicto de
intereses.

Expresiones de gratitud
Los autores desean agradecer a G. Gou (Hospital de la Santa Creu i Sant Santu-UAB,
Barcelona, España) y X. Morató y M. López (Unitat Neurofarmacologia, Universitat
Barcelona, España) por su apoyo técnico en los sinaptosomas. preparación. También
reconocemos al Dr. M. López Heredia (Unitat Genètica, IDIBELL), G. Gou y al Dr.
À. Bayés (Hospital de la Santa Creu i de Sant Pau-UAB, Barcelona, España) para
orientación en análisis bioinformático. Agradecemos al Dr. Eduard Sabidó y Cristina
Chiva (Unidad de Proteómica, Centro de Regulación Genómica, Barcelona, España) por
la ayuda técnica en estudios de EM y manejo de datos.

Material suplementario
El Material complementario para este artículo se puede encontrar en línea
en: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fnmol.2018.00226/full#supplementary-
material

Referencias
Altafaj, X., Martín, ED, Ortiz-Abalia, J., Valderrama, A., Lao-Peregrín, C., Dierssen, M.,
et al. (2013).La normalización de la expresión de Dyrk1A por AAV2 / 1-shDyrk1A
atenúa los defectos dependientes del hipocampo en el modelo de ratón Ts65Dn del
síndrome de Down. Neurobiol. Dis.52, 117–127. doi: 10.1016 / j.nbd.2012.11.017

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Altafaj, X., Ortiz-Abalia, J., Fernández, M., Potier, MC, Laffaire, J., Andreu, N., et
al. (2008).Aumento de la expresión de NR2A y la descomposición prolongada del
transitorio de calcio inducido por NMDA en el cerebelo de ratones TgDyrk1A, un
modelo de ratón con síndrome de Down. Neurobiol. Dis.32, 377–384. doi: 10.1016 /
j.nbd.2008.07.024

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Antonarakis, SE, Lyle, R., Dermitzakis, ET, Reymond, A., y Deutsch, S.

(2004). Cromosoma 21 y síndrome de down: de la genómica a la
fisiopatología. Nat. Rev. Genet. 5, 725–738. doi: 10.1038 / nrg1448

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Belichenko, PV (2004). Anomalías estructurales sinápticas en el modelo de ratón

Ts65Dn del síndrome de down. J. comp. Neurol. 480, 281–298. doi: 10.1002 /
cne.20337

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Belichenko, PV, Kleschevnikov, AM, Masliah, E., Wu, C., Takimoto-Kimura, R., Salehi,
A., y otros. (2009). Relación excitatoria-inhibitoria en la fascia dentata en el modelo de
ratón Ts65Dn del síndrome de down. J. comp. Neurol. 512, 453–466. doi: 10.1002 /
cne.21895

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Belichenko, PV, Kleschevnikov, AM, Salehi, A., Epstein, CJ y Mobley, WC

(2007). Anomalías sinápticas y cognitivas en modelos de ratón con síndrome de down:
explorando las relaciones genotipo-fenotipo. J. comp. Neurol. 504, 329–345. doi:
10.1002 / cne.21433.

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Benavides-Piccione, R., Ballesteros-Yáñez, I., Elston, G., Estivill, X., Fillat, C., et
al. (2004). Sobre dendritas en el síndrome de Down y modelos murinos de DS: una
forma espinosa de aprender. Prog. Neurobiol . 74, 111–126. doi: 10.1016 /
j.pneurobio.2004.08.001

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Best, TK, Cramer, NP, Chakrabarti, L., Haydar, TF y Galdzicki, Z. (2012). Inhibición
disfuncional del hipocampo en el modelo de ratón Ts65Dn del síndrome de
Down. Exp. Neurol. 233, 749-757. doi: 10.1016 / j.expneurol.2011.11.033

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Boada, R., Hutaff-Lee, C., Schrader, A., Weitzenkamp, D., Benke, TA, Goldson, EJ, y
otros. (2012). Antagonismo de los receptores de NMDA como tratamiento potencial
para el síndrome de Down: un ensayo piloto controlado aleatorizado. 2, e141 – e111. doi:
10.1038 / tp.2012.66

Texto completo de CrossRef

Braithwaite, SP, Adkisson, M., Leung, J., Nava, A., Masterson, B., Urfer, R., y
col. (2006). Regulación del tráfico y la función del receptor de NMDA por la tirosina
fosfatasa enriquecida en estriado (STEP). EUR. J. Neurosci. 23, 2847–2856. doi:
10.1111 / j.1460-9568.2006.04837.x

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Chan, SF, y Sucher, NJ (2001). Un complejo de señalización del receptor NMDA con
proteína fosfatasa 2A. J. Neurosci. 21, 7985–7992.doi: 10.1523 / JNEUROSCI.21-20-
07985.2001

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Chergui, K. (2005). Papel fisiológico de la caseína quinasa 1 en la transmisión sináptica
glutamatérgica. J. Neurosci. 25, 6601–6609. doi: 10.1523 / JNEUROSCI.1082-05.2005

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Contestabile, A., Magara, S., y Cancedda, L. (2017). La hipótesis de GABAergic para

discapacidades cognitivas en el síndrome de down.Frente. Célula. Neurosci. 11:54. doi:
10.3389 / fncel.2017.00054

Texto completo de CrossRef | Google Académico

Costa, AC, Scott-McKean, JJ y Stasko, MR (2007). Inyecciones agudas de los déficits de

rendimiento de rescate de memantina antagonista del receptor NMDA del modelo de
ratón Ts65Dn del síndrome de down en una prueba de acondicionamiento del
miedo.Neuropsicofarmacología 33, 1624-1632. doi: 10.1038 / sj.npp.1301535

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Costa, AC, Walsh, K. y Davisson, MT (1999). Disfunción motora en un modelo de ratón

para el síndrome de Down. Fisiol. Behav. 68, 211-220.

Resumen de PubMed | Google Académico

Cramer, N. y Galdzicki, Z. (2012). Desde la plasticidad sináptica del hipocampo

anormal en modelos de ratón con síndrome de down hasta la discapacidad cognitiva en
el síndrome de down. Plastia neural. 2012, 1–12. doi: 10.1155 / 2012/101542

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Dephoure, N., Gould, KL, Gygi, SP y Kellogg, DR (2013). Mapeo y análisis de sitios de
fosforilación: una guía rápida para biólogos celulares. Mol. Biol. Cell 24, 535–542. doi:
10.1091 / mbc.E12-09-0677

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Dierssen, M. (2012). Síndrome de Down: el cerebro en modo trisómico. Nat. Rev.

Neurosci. 13, 844–858. doi: 10.1038 / nrn3314

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Fernández, F., Trinidad, JC, Blank, M., Feng, DD, Burlingame, AL, y Garner, CC
(2009). Composición proteica normal de las sinapsis en ratones Ts65Dn: un modelo de
ratón del síndrome de Down. J. Neurochem. 110, 157-169. doi: 10.1111 / j.1471-
4159.2009.06110.x

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Galdzicki, Z., y Siarey, RJ (2003). Comprensión del retraso mental en el síndrome de
Down mediante trisomía 16 modelos de ratón.Genes Brain Behav. 2, 167–178. doi:
10.1034 / j.1601-183X.2003.00024.x

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Goebel-Goody, SM, Davies, KD, Linger, RM, Freund, RK y Browning, MD

(2009). Fosfo-regulación de receptores sinápticos y extrasinápticos de N-metil-d-
aspartato en cortes de hipocampo de adultos. NSC 158, 1446-1459. Doi: 10.1016 /
j.neuroscience.2008.11.006

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Grau, C., Arató, K., Fernández-Fernández, JM, Valderrama, A., Sindreu, C., Fillat, C., et
al. (2014). La fosforilación mediada por DYRK1A de GluN2A en Ser (1048) regula la
expresión superficial y la actividad del canal de los receptores GluN1 /
GluN2A. Frente. Célula.Neurosci. 8: 331. doi: 10.3389 / fncel.2014.00331

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Hanson, JE, Weber, M., Meilandt, WJ, Wu, T., Luu, T., Deng, L., y col. (2013). El
antagonismo de GluN2B afecta a las interneuronas y conduce a cambios inmediatos y
persistentes en la plasticidad sináptica, las oscilaciones y el
comportamiento . Neuropsicofarmacología38, 1221-1233. doi: 10.1038 / npp.2013.19

Texto completo de CrossRef

Hardingham, GE, y Bading, H. (2010). Señalización del receptor NMDA sináptico

versus extrasináptico: implicaciones para los trastornos neurodegenerativos. Nat. Rev.
Neurosci. 11, 682–696. doi: 10.1038 / nrn2911

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Hayashi, MK, Tang, C., Verpelli, C., Narayanan, R., Stearns, MH, Xu, RM, et
al. (2009). Las proteínas de densidad postsináptica homer y shank forman una
estructura de red polimérica. Cell 137, 159-171. doi: 10.1016 / j.cell.2009.01.050

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Izzo, A., Manco, R., Bonfiglio, F., Calì, G., De Cristofaro, T., Patergnani, S., et
al. (2014). NRIP1 / RIP140 atenuación mediada por siRNA contrarresta la disfunción
mitocondrial en el síndrome de Down. Tararear. Mol. Gineta. 23, 4406–4419. doi:
10.1093 / hmg / ddu157

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Kleschevnikov, AM (2012). Las deficiencias en la cognición y la plasticidad sináptica en
un modelo de ratón del síndrome de down mejoran con los antagonistas del receptor
GABAB. J. Neurosci. 32, 9217–9227. doi: 10.1523 / JNEUROSCI.1673-12.2012

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Lan, JY, Skeberdis, VA, Jover, T., Grooms, SY, Lin, Y., Araneda, RC, et al. (2001). La
proteína quinasa C modula el tráfico y la activación del receptor de
NMDA. Nat. Publ. Grupo 4, 382–390. doi: 10.1038 / 86028

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Lau, CG, y Zukin, RS (2007). Tráfico de receptores NMDA en plasticidad sináptica y

trastornos neuropsiquiátricos. Nat. Rev. Neurosci.8, 413–426. doi: 10.1038 / nrn2153

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Lee, H.-K. (2006). Plasticidad sináptica y fosforilación. Pharmacol. El r. 112, 810–

832. doi: 10.1016 / j.pharmthera.2006.06.003

Texto completo de CrossRef | Google Académico

Li, J., Wilkinson, B., Clementel, VA, Hou, J., O'Dell, TJ, y Coba, MP (2016). La
potenciación a largo plazo modula las redes de fosforilación sináptica y remodela la
estructura del interactoma postsináptico. Sci. Señal. 9: rs8. doi: 10.1126 /
scisignal.aaf6716

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Liao, GY, Wagner, DA, Hsu, MH y Leonard, JP (2001). Evidencia de la modulación

mediada por la proteína quinasa-C directa de la corriente del receptor N-metil-D-
aspartato. Mol. Pharmacol. 59, 960–964. doi: 10.1124 / mol.59.5.960

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Lockrow, J., Boger, H., Bimonte-Nelson, H. y Granholm, AC (2011). Efectos de la

memantina a largo plazo sobre la memoria y la neuropatología en ratones Ts65Dn, un
modelo para el síndrome de Down. Behav. Brain Res. 221, 610–622. doi: 10.1016 /
j.bbr.2010.03.036

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Lundby, A., Secher, A., Lage, K., Nordsborg, NB, Dmytriyev, A., Lundby, C., et
al. (2012). Mapas cuantitativos de los sitios de fosforilación de proteínas en 14 órganos
y tejidos de ratas diferentes. Nat. Comun. 3: 876. doi: 10.1038 / ncomms1871
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Lussier, MP, Sanz-Clemente, A. y Roche, KW (2015). Regulación dinámica de los

receptores de ácido N-metil-d-aspartato (NMDA) y α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-
isoxazolepropiónico (AMPA) mediante modificaciones postraduccionales. J.
Biol. Chem. 290, 28596–28603.doi: 10.1074 / jbc.R115.652750

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef

Maki, BA, Cole, R., y Popescu, GK (2013). Dos residuos de serina en las colas C-
terminales de GluN2A controlan los tiempos de decaimiento del receptor
NMDA. Canales 7, 126-132. doi: 10.4161 / chan.23968

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

McQueen, J., Ryan, TJ, McKay, S., Marwick, K., Baxter, P., Carpanini, SM, y
col. (2017). La señalización del receptor NMDA pro-muerte es promovida por el
término C de GluN2B independientemente de Dapk1. Elife 6: e17161. Doi: 10.7554 /
eLife.17161

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Munton, RP, Tweedie-Cullen, R., Livingstone-Zatchej, M., Weinandy, F., Waidelich, M.,
Longo, D., y otros. (2007). Análisis cualitativos y cuantitativos de la fosforilación de
proteínas en preparaciones sinaptosómicas de ratones sin tratamiento previo y
estimuladas. Mol.Célula. Proteómica 6, 283-293. doi: 10.1074 / mcp.M600046-
MCP200

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Murphy, JA, Stein, IS, Lau, CG, Peixoto, RT, Aman, TK, Kaneko, N. Zukin, RS, y
otros. (2014). La fosforilación de Ser1166 en GluN2B por PKA es crítica para la función
del receptor NMDA sináptico y la señalización de Ca en espinas. J. Neurosci. 34, 869–
2+

879. doi: 10.1523 / JNEUROSCI.4538-13.2014

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Oliveros, JC (2007-2015). Venny. Una herramienta interactiva para comparar listas

con los diagramas de Venn . Disponible en línea
en: http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html

Pahl, S., Tapken, D., Haering, SC, y Hollmann, M. (2014). Tráfico de receptores de
kainato. Membranas 4, 565–595. doi: 10.3390 / membranas 4030565

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Paoletti, P., Bellone, C. y Zhou, Q. (2013). Diversidad de subunidades del receptor
NMDA: impacto en las propiedades del receptor, plasticidad sináptica y
enfermedad. Nat. Rev. Neurosci . 14, 383–400. doi: 10.1038 / nrn3504

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Parker, CE, Mocanu, V., Mocanu, M., Dicheva, N. y Warren, M. (2010). "Espectrometría
de masas para modificaciones postraduccionales", en Neuroproteomics , ed O. Alzate
(Boca Raton, FL: CRC Press / Taylor & Francis).

Phillips, GR, Huang, JK, Wang, Y., Tanaka, H., Shapiro, L., Zhang, W., y
otros. (2001). La red de partículas presinápticas: ultraestructura, composición,
disolución y reconstitución. Neuron 32, 63–77. doi: 10.1016 / S0896-6273 (01) 00450-
0

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Risser, D., Lubec, G., Cairns, N. y Herrera-Marschitz, M. (1997). Aminoácidos

excitantes y monoaminas en el giro parahipocampal y el polo cortical frontal de adultos
con síndrome de Down. Vida sci. 60, 1231-1237.

Resumen de PubMed | Google Académico

Rueda, N., Flórez, J., y Martínez-Cué, C. (2012). Modelos de ratón del síndrome de
down como una herramienta para desentrañar las causas de las discapacidades
mentales. Plastia neural. 2012, 1–26. doi: 10.1155 / 2012/584071

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Sanderson, JL, Gorski, JA y Dell'Acqua, ML (2016). El LTD dependiente del receptor de

NMDA requiere la incorporación sináptica transitoria de AMPAR permeables al
Ca2 mediadas por PKA anclado a AKAP150 y calcineurina. Neuron 89, 1000–
+

1015. doi: 10.1016 / j.neuron.2016.01.043

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Sanz-Clemente, A., Gray, JA, Ogilvie, KA, Nicoll, RA y Roche, KW (2013). CaMKII
activado acopla GluN2B y caseína quinasa 2 para controlar los receptores sinápticos de
NMDA. Cell Rep. 3, 607–614. doi: 10.1016 / j.celrep.2013.02.011

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Scott-McKean, JJ, y Costa, AC (2011). Exagerada NMDA mediada LTD en un modelo de

ratón de síndrome de Down y rescate farmacológico por
memantina. Aprender. Mem. 18, 774–778. doi: 10.1101 / lm.024182.111
Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Seidl, R., Cairns, N., Singewald, N., Kaehler, ST y Lubec, G. (2001). Diferencias entre
los niveles de GABA en la enfermedad de Alzheimer y el síndrome de Down con
neuropatología similar al Alzheimer. Arco de Naunyn Schmiedebergs. Pharmacol. 363,
139-145. doi: 10.1007 / s002100000346

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Siarey, RJ, Kline-Burgess, A., Cho, M., Balbo, A., Best, TK, Harashima, C., et
al. (2006). Vías de señalización alteradas que subyacen a la plasticidad sináptica del
hipocampo anormal en el modelo de ratón Ts65Dn del síndrome de Down. J.
Neurochem. 98, 1266-1277. doi: 10.1111 / j.1471-4159.2006.03971.x

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Siddiqui, A., Lacroix, T., Stasko, MR, Scott-McKean, JJ, Costa, AC y Gardiner, KJ
(2008). Respuestas moleculares de los modelos de ratón Ts65Dn y Ts1Cje del síndrome
de Down a MK-801. Genes Brain Behav. 7, 810-820. doi: 10.1111 / j.1601-
183X.2008.00428.x

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Tingley, WG, Ehlers, MD, Kameyama, K., Doherty, C., Ptak, JB, Riley, CT, y
otros. (1997). Caracterización de la proteína quinasa A y la proteína quinasa C
fosforilación de la subunidad NR1 del receptor N-metil-D-aspartato utilizando
anticuerpos específicos del sitio de fosforilación. J. Biol. Chem . 272, 5157–5166.

Resumen de PubMed | Google Académico

Traynelis, SF, Wollmuth, LP, McBain, CJ, Menniti, FS, Vance, KM, Ogden, KK, y
otros. (2010). Canales de iones receptores de glutamato: estructura, regulación y
función. Pharmacol. Rev. 62, 405–496. doi: 10.1124 / pr.109.002451

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Trinidad, JC, Barkan, DT, Gulledge, BF, Thalhammer, A., Sali, A., Schoepfer, R., y
otros. (2012). Identificación global y caracterización de O-GlcNAcylation y fosforilación
en la sinapsis murina. Mol. Célula. Proteómica 11, 215–229. doi: 10.1074 /
mcp.O112.018366

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Wang, JQ, Liu, X., Zhang, G., Parelkar, NK, Arora, A., Haines, M., y
otros. (2006). Fosforilación de receptores de glutamato: un mecanismo potencial para
la regulación de la función del receptor y la acción psicoestimulante. J.
Neurosci. Res. 84, 1621-1629. doi: 10.1002 / jnr.21050

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Weitzdoerfer, R., Dierssen, M., Fountoulakis, M., y Lubec, G. (2001). La vida fetal en el
síndrome de Down comienza con una densidad neuronal normal pero con deterioro de
las espinas dendríticas y la estructura sinaptosomal. J. Neural Transm. 61, 59–70. doi:
10.1007 / 978-3-7091-6262-0_5

Texto completo de CrossRef | Google Académico

Westphal, RS (1999). Regulación de los receptores de NMDA por un complejo de

señalización de fosfatasa-quinasa asociado. Science285, 93-96. doi: 10.1126 /
science.285.5424.93

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Wiśniewski, JR, Nagaraj, N., Zougman, A., Gnad, F. y Mann, M. (2010). El

fosfoproteoma cerebral obtenido mediante un método basado en FASP revela la
topología de la proteína de la membrana plasmática. J. Proteome Res. 9, 3280–
3289. doi: 10.1021 / pr1002214

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Wiśniewski, JR, Zougman, A., Nagaraj, N. y Mann, M. (2009). Método universal de

preparación de muestras para análisis de proteomas.Nat. Methods 6, 359–362. doi:
10.1038 / nmeth.1322

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Zhang, F., Guo, A., Liu, C., Comb, M. y Hu, B. (2013). Fosforilación y ensamblaje de
receptores de glutamato después de isquemia cerebral. Movimiento 44, 170–176. doi:
10.1161 / STROKEAHA.112.667253

Resumen de PubMed | Texto completo de CrossRef | Google Académico

Palabras clave: síndrome de Down, receptores ionotrópicos de glutamato, receptor de NMDA,
quinasas, proteómica, fosfoproteómica.
Cita: Gómez de Salazar M, Grau C, Ciruela F y Altafaj X (2018) Alteraciones fosfoproteómicas de
receptores de glutamato ionotrópicos en el hipocampo del modelo de ratón Ts65Dn del síndrome de
Down. Frente. Mol. Neurosci . 11: 226. doi: 10.3389 / fnmol.2018.00226
Recibido: 1 de marzo de 2018; Aceptado: 11 de junio de 2018;
Publicado el 25 de julio de 2018.
Editado por:
Inmaculada Maria Gonzalez-Gonzalez , Universidad de Central Lancashire, Reino Unido
Revisado por:
Antonio Sanz-Clemente , Escuela de Medicina Feinberg, Northwestern University, Estados Unidos
Mariana Vargas-Caballero , Universidad de Southampton, Reino Unido

Copyright © 2018 Gómez de Salazar, Grau, Ciruela y Altafaj. Este es un artículo de acceso abierto
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* Correspondencia: Xavier Altafaj, xaltafaj@idibell.cat