Análisis de Proteínas

Electroforesis, Transferencia e Inmunodetección

advansta
 Análisis de Proteínas

Análisis de Proteínas:
Electroforesis, Transferencia e Inmunoprecipitación.
Un manual de laboratorio de la empresa Advansta

Western Blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada, para el estudio de proteínas.
Este método, descrito por primera vez por Towbin, et. al1, permite la detección de una sola
proteína dentro de una muestra biológica. La especificidad de Western Blot se logra me-
diante la utilización de un anticuerpo que reconoce y se une a un epítopo único de la pro-
teína de interés.
Con la técnica de Western Blot se puede estimar el tamaño de una proteína, confirmar la
presencia de modificaciones post-traduccionales como la fosforilación,
y ser utilizado para comparar cuantitativamente los niveles
de proteína entre muestras.
Esta guía de laboratorio describe los pasos
involucrados en la realización de un Western
blot, incluyendo la preparación de muestras,
la separación de proteínas, la transferencia y
la detección.

Índice de Contenidos Página

1. Western Blot: Visión General 2

2. Preparación de las muestras 4

3. Electroforesis en gel de Poliacrilamida 5

4. Transferencia Electroforética 11

5. Hibridación Anticuerpos 13

6. Detección 15

7. Solución de Problemas 17

8. Herramientas y Referencias Técnicas 21

1. Towbin, H. et. al. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some appli-
cations. Proc Natl Acad Sci U S A. 76(9):4350-4.

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 Western Blot:
Visión General

1. Western Blot: Visión General

Consulte los capítulos siguientes para obtener más detalles acerca de cada paso.

a. Preparación de la muestra Los materiales de partida incluyen La disrupción mecánica

Extracción de las proteínas de
las muestras biológicas me-
diante disrupción mecánica o
química.
planta, tejidos animales, células con un homogenizador
cultivadas, levadura, o bacterias. disgrega los tejidos.
Procesos adicionales
logran el fraccionamien-
to subcelular

Se usan tampones con-

teniendo detergentes
para la lisis celular

Figura 1. Preparación de muestras

b. Electroforesis en gel de
Acrilamida Se añade un coloran-
te de carga. Así, la Se utiliza una pipeta para
migración de la mues- cargar las muestras en los
Las proteínas en el extracto se tra se puede monitori- pocillos del gel Una fuente de ali-
separan de acuerdo a su ta- zar. mentación propor-
maño mediante electroforesis. ciona el voltaje
Se prepara un gel de acrilami-
da, bisacrilamida.
El dodecilsulfato de sodio
(SDS) añadido al gel se une a
las proteínas y confiere, de
forma proporcional a la masa
El gel se coloca dentro de un tanque
de cada proteína, una carga
de electroforesis lleno de tampón,
negativa a cada una de ellas. que conducirá la corriente. La proteí-
nas con carga negativa migran des-
de el ánodo.

Figura 2. Electroforesis en Acrilamida

c. Transferencia electroforéti-
ca a una membrana El gel y la membrana se coloca Se aplica voltaje en el
entre papel de filtro y almohadillas tanque de transferencia y
de esponja.. las proteínas migran desde
Las proteínas son transferidas
el gel a la membrana.
electroforéticamente a un
soporte rígido o membrana,
dónde quedan inmovilizadas.

Un cartucho aplica presión y

mantiene un estrecho contacto
entre el gel y la membrana.

Figura 3. Transferencia de Proteínas a la Membrana

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Análisis de Proteínas

a. Hibridación del Anticuerpo

La membrana con las proteí-

nas inmovilizadas debe tratar-
Los materiales de partida incluyen
se para bloquear las zonas tejidos vegetales, tejidos animales,
con ausencia de proteínas y células en cultivo, levadura, o bac-
así evitar la unión no específi- terias.
ca de los anticuerpos.
A continuación se incuba con
un anticuerpo primario dirigi-
do contra el epítopo específi-
co de la proteína diana.
Tras varios lavados de la mem-
brana, se adiciona un anti-
Figura 4. Hibridación de Anticuerpo
cuerpo secundario marcado
que se unirá de forma especí-
fica al anticuerpo primario,
proporcionando una forma
de detección.

e. Detección de las Bandas

Después de un lavado de la
membrana para eliminar el
anticuerpo no unido, se pro-
cede a detectar la localiza-
ción de la banda en la mem-
brana. Para la detección de
quimioluminiscencia, se utiliza
un anticuerpo secundario
conjugado con el enzima pe-
roxidasa (HRP); la adición de
un sustrato de HRP provoca
una reacción enzimática que
da como resultado final la
emisión de luz. Dicha luz pue-
de ser detectada en una pelí-
cula de rayos X, o de forma
digital, mediante un sistema
de captación de imágenes.
La detección de fluorescen- Figura 5. Detección quimioluminiscente de las bandas de proteínas
cia se basa en la captación
de luz emitid por sustancias
fluoróforas conjugadas con el
anticuerpo secundario.

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 Preparación
de la muestra

2. Preparación de la muestra
Una adecuada preparación de la muestra es Tabla 1. Métodos físicos para la dirupción de muestras
esencial para tener éxito en un ensayo de Wes-
Método Descripción Tipo de muestra
tern Blot. En la mayoría de ensayos, las proteínas
se extraen mediante procesos químicos y/o Licuadora La muestra se tritura Gran cantidad de
mecánicos. El método elegido dependerá del mediante cuchillas tejido
rotatorias
tipo de muestra de partida, de la localización
subcelular de la proteína y de las condiciones Homogenizador Tubo de vidrio con Células tisulares; útil
óptimas que requiera el anticuerpo para recono- Dounce pistón ajustado maja para protocolos de
las células por ac- enriquecimiento de
cer el epítopo proteico. En la tabla 1 se resumen ción de corte. proteínas mitocon-
los métodos mecánicos que habitualmente se driales o nucleares
utilizan en la extracción de proteínas para inmu- Homogenizador de Ondas de sonido Células, tejidos, bac-
notransferencia. ultrasonidos emitidas por una terias.
sonda para romper
A menudo, en muestras tisulares de plantas y ani- las membranas celu-
males, se requiere el uso de un proceso mecáni- lares
co para la disrupción de la compleja matriz celu- Pulverización en La muestra se pulve- Tejido animal o o
lar. Disrupción mecánica que suele preceder a un Nitrógeno líquido riza utilizando un vegetal
proceso químico de lisis celular, mediante el uso mortero y una almi-
rez refrigerados
de solución tampón que contiene detergentes,
que va dirigida a enriquecer la proteína de interés Perlas de vidrio La ruptura celular se Levaduras
produce por agita-
dentro del extracto final. Las células en cultivo,
ción de las perlas de
frecuentemente, se suelen lisar utilizando una so- vidrio
lución tampón con detergente y sin la aplicación
de métodos mecánicos.

La estructura química de los detergentes permite

romper las membranas celulares y solubilizar las
proteínas. Estas substancias tienen una parte po-
Tabla 2. Soluciones Tampón y detergentes, según el tipo de pro-
lar y otra no polar y se pueden clasificar según las teína de interés y la localización subcelular
características del grupo polar: iónicos si el grupo
Tipo/Localización Detergente o Solu- TComentarios
polar tiene carga positiva o negativa, no iónicos si Proteína de interés ción Tampón
no poseen carga o zwiteriónicos si poseen carga
Nativa (no desnatu- Detergente suave Evitar detergentes
negativa y positiva y la carga neta es 0. ralizada) no iónico desnaturalizantes
(SDS, Deoxicolatos)
La elección de la substancia detergente, depen-
de en parte de la localización, dentro de la célu- Citoplasmáticos Tris-HCl Puede combinarse
(soluble) con métodos mecá-
la, de la proteína de interés, citoplasmática, uni-
nicos, tales como el
da a la membrana, dentro de orgánulos celulares homogenizador
como el núcleo y las mitocondrias, etc...Las pro- Dounce
teínas citoplasmáticas se pueden unir a las proteí- Citoplasmático Tris-Triton Los detergentes
nas del citoesqueleto, afectando así a los proce- (unida a citoesque- Triton son suaves y
sos de fraccionamiento subcelular. leto) no iónicos
Membrana mitocon- NP-40, RIPA Para antígenos con
En la tabla 2 se clasifican las soluciones tampón y drial o nuclear (multiples detergen- niveles bajos de
detergentes, más utilizados habitualmente, según tes), Triton X-100 expresión pueden
el tipo de proteína y localización subcelular. ser necesarios pro-
cesos de enriqueci-
miento
Lisado total de célu- NP-40, RIPA,
las Triton X-100

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Análisis de Proteínas

Con la rotura celular, se liberan enzimas proteasas Tabla 3. Inhibidores de fosfatasas y proteasas utilizans en la ex-
tracción de proteínas.
que pueden degradar la proteína de interés. Por
tanto, es importante evitar, durate la preparación Inhibidores Protea- Concentración en Enzimas diana
de la muestra, cualquier actividad proteásica. sas el Tampón de lisis

Aprotinina 1-2 µg/ml Proteasas de Serina

La siguiente estrategia ayuda a evitar la degra-
dación de proteínas: EDTA 1-10 mM Mg++/Mn++ Metalopro-
teasas
 Evitar excesivos ciclos de congelación/
EGTA 1-10 mM Ca++ Metaloproteasas
descongelación.
Leupeptin 1-2 µg/ml Proteasas de Serinas,
 Trabajar rápido y mantener las muestras en Cisteinas
frío durante todo el proceso. Pepstatina A 1µg/ml Proteasas de Aspartico
 Añadir inhibidores de la proteasa en el PMSF (17-170 µg/ml) Proteasas de Serina
tampón de lisis. O,1—1 mM

Además de inhibir la actividad de la proteasa, Inhibidores Concentración en Enzimas diana

puede ser interesante reducir la actividad de la Fosfatasas el Tampón de lisis
fosfatasa alcalina, en particular en estudios de
 - Glicerofosfato 1 mM Fosfatasas Serina/
fosforilación. Treonina
En la tabla 3 se muestran los inhibidores deprotea- EDTA 1-10 mM Mg++/Mn++ Metalopro-
sa y fosfatasa de uso más habitual. teasas

EGTA 1-10 mM Ca++ Metaloproteasas

Leupeptin 1-2 µg/ml Proteasas de Serinas,

3. Electroforesis en Acrilamida Cisteinas

Pepstatina A 1µg/ml Proteasas de Asparti-

Las proteínas del extracto se separan mediante co
electroforesis en gel de poliacrilmaida (PAGE). En
PMSF (17-170 µg/ml) Proteasas de Serina
primer lugar, las proteínas, se revisten con carga O,1—1 mM
negativa, mediante la acción del detergente Do-
decilsulfato Sódico (SDS), así Las proteínas, se
pueden separar en el gel según su tamaño (SDS-
PAGE).

Medición de proteína total

Previamente a la electroforesis, es importante de-

terminar la concentración de proteínas por las
siguientes razones:

1. Asegurar la carga de la cantidad correcta de

proteínas en el gel.

La cantidad de proteína óptima a cargar de-

penderá de la prevalencia de la proteína de
interés y de la sensibilidad del anticuerpo pri-
mario.
Cargar mucha cantidad puede dar lugar a un
mayor ruido de fondo y unión no específica de
los anticuerpos. A menudo, para determinar la
carga de proteína apropiada, se requiere
hacer experimentos preliminares con cantida-
des seriadas de proteínas.
Nota: con el kit Afyon ™ SDS-PAGE de preparación de
muestra, se puede controlar la cantidad de carga de la pro-
teína mediante la cantidad de resina utilizada, evitando la
necesidad de determinar la concentración de proteína. Por
ejemplo, para 5 µg de proteína se utilizan 20 µl de resina Af-
yon.
Información para pedidos
K-02101-025 Afyon ™ SDS-PAGE ssmple preparation kit

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 Electroforesis
en Acrilamida

2. Realización de Western Blots cuantitativos o Tabla 4. Métodos físicos para la dirupción de muestras
semi-cuantitativos. Ensayo Descripción Ventajas Inconvenientes

Si la cantidad de proteína cargada por carril Bradford El colorante La realización  Interferencia

es la misma, se pueden comparar los niveles azul de Coo- de los ensayos de SDS o de
masie se une a son general- otros deter-
relativos de la proteína de interés. Un experi- las proteínas y mente rápidos gentes a
mento de Western Blot cuantitativo es útil para sufre un cam- y sencillos altas con-
estudio de cambios de expresión de proteínas bio de absor- centraciones
o de modificaciones proteicas como la fosfori- vancia .
 Rango lineal
lación. pequeño.
Descripción del método BCA Reducción de  Compatible Interferencia
iones de Cu2+ con la mayo con agentes
Existen diversos métodos para medir la proteína mediante inter- - quelantes o
total de una muestra. Los más habituales son los ación con las ría de deter- reductores del
proteínas, el gentes Cobre
métodos Lowry, Bradford y Ácido Bincocinico BCA se une a  Comercial-
(BCA) (Tabla 4). Estos ensayos colorimétricos se los iones de mente dispo-
basan en las reacciones que se producen entre Cu1+ y forman nible en for-
las proteínas de la muestra y los reactivos de de- un producto mato com-
coloreado que patible con
tección. se puede me- agentes
dir espectrofo- reductores.
Con el fin de determinar la concentración de pro- metricamente  Menos varia-
teínas totales en una muestra, se debe realizar (reacción de ción proteí-
una curva estándar en cada ensayo. Esto se logra Biuret) na-proteína
con la realización de un ensayo de concentra- que en el
método
ción crecientes, de proteína pura. El estándar utili- Bradford.
zado con mayor frecuencia es la albúmina de
Lowry Similar al BCA Muy bien cita-  El tiempo de
suero bovino (BSA), aunque se puede utilizar cual- (reacción de da en literatura ensayo pue-
quier proteína producida en el laboratorio o dis- Biuret) de ser mayor
ponible comercialmente. que en otros
métodos
En la figura 6 se muestra un ejemplo de una curva  No es prácti-
estándar. Los valores de absorvancia se trazan en co para
grupos gran-
función del contenido conocido de la proteína des de
estándar utilizada. El contenido de la proteína de muestras
interés en la muestra (línea verde) se puede de-  Se pueden
terminar mediante la extrapolación de la absor- formar preci-
pitados
vancia obtenida a la cantidad o concentración
de proteína correspondiente.

Elección de un ensayo de proteínas

Hay muchos kits de determinación de proteínas

Absorvancia

disponibles comercialmente. La elección depen-

de de muchos factores:

 El equipo de lectura disponible en el labora-

torio (espectrofotómetro, lector de placas,
etc…).

 Los reactivos del tampón de lisis - revisar el

protocolo del fabricante para identificar
Proteína (mg)
sustancias interferentes.

 La cantidad de muestra disponible. Figura 6. Ejemplo de la curva estándar de un ensayo de pro-

 La facilidad/rapidez del ensayo.
teínas. Se representa la absorvancia de las soluciones estándar
que contienen la proteína conocida (línea roja). La concentra-
ción de la proteína de interés se puede determinar extrapolan-
do la absorvancia obtenida en la curva patrón o estándar
(línea verde de puntos).

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Análisis de Proteínas

Tampón de carga de muestras La proteína se encuentra en su

estado conformacional, mante-
Una vez se tienen las muestras de proteína, se niendo su carga intrínseca
pueden conservar congeladas, teniendo cuida-
do en evitar ciclos repetitivos de congelación/
descongelación. Alternativamente, se pueden
SDS
utilizar inmediatamente, combinándolas con un
tampón de carga y cargar la muestra en un gel
de electroforesis. Los componentes del tampón
de carga varían, dependiendo de las condicio-
nes deseadas. Los ingredientes típicos de un
tampón de carga para detectar proteínas bajo
El SDS se une a la proteína y da
condiciones desnaturalizantes/reductoras se des- lugar a una linearización y a una
criben en la Tabla 5. No se utilizarán ni SDS, beta uniformidad de la carga negativa
mercaptoetanol o ditiotreitol, si se necesitan con- de ésta.
diciones no desnaturalizantes /no reductoras.
Figura 7. Mecanismo de desnaturalización por SDS de las proteí-
nas.
Previamente a la carga del gel, las muestras se
someten a una incubación a 95ºC durante 5-10
minutos, para asegurar que la desnaturalización/
reducción es total. En condiciones no desnaturali-
zantes/no reductoras, esta incubación no es ne-
cesaria. En la Figura 7 se ilustra cual es el mecanis-
mo de desnaturalización del SDS. Tabla 5. Componentes del tampón de carga.

Reactivo Propósito

Glicero. Aportan Viscosidad/densidad para arrastrar

la muestra la fondo del pocillo y evitar que se
extienda a los pocillos adyacentes.
Azul de Bromofe- Molécula colorante pequeña:
nol  Da color a la muestra para ayudar a
la carga.
 Migra por delante de las proteínas, de
modo que se puede hacer el segui-
miento del movimiento de las muestras
en el gel.
SDS Detergente desnaturalizante
 Cola hidrofóbica que rodea la esque-
leto peptídico.
 Unión a la proteína de forma regular,
Nota: Los tampones de carga permiten ahorrar tiempo y aportando carga negativa de forma
garantizan que las muestras se separan de forma reproduci- proporcional al tamaño de la proteí-
ble, carril a carril y gel a gel. Advansta dispone de tampones na.
de carga reductores y no reductores.  Evita las interacciones hidrofóbicas y
rompe los enlaces de hidrógeno.
 Destruye la estructura secundaria/
Información para pedidos terciaria y lineariza la proteína.

R– 03018-B10 Non-reducing protein sample loading buffer (2x) Beta Mercaptoe- Agentes reductores
tanol o DTT  Evita la oxidación de cisteínas.
R-03019-B10 Reducing protein sample loading buffer (2x)  Completan la linearización de la pro-
teína al romper los puentes disulfuro.
Tampón Tris Peps- Mantiene el pH adecuado
tatina A

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 Electroforesis
en Acrilamida

Gel de Electroforesis Tabla 6. Componentes del gel de acrilamida en las electroforesis

de proteínas
Si se requieren condiciones naturales para que el
Reactivos Propósito
anticuerpo pueda detectar el epítopo, en la
electroforesis no se añadirá SDS ni en el gel ni en
Acrilamida Moléculas que polimerizan para formar
el tampón de electroforesis. En esta situación, cadenas.
también conocida como PAGE nativo, las proteí-
Bisacrilamida Forman uniones con las cadenas de acri-
nas mantienen su estructura tridimensional y la lamida para formar un entramado.
migración en el gel depende de su masa: rela-
SDS Mantiene la linearidad y la uniformidad
ción de carga de la proteína por encima de su de carga de las proteínas según la elec-
tamaño. Sin embargo, la mayoría de ensayos troforesis.
Western Blot, se realizan en geles de poliacrilami-
Tampón Tris Mantiene el pH adecuado.
da conteniendo SDS (SDS-PAGE) en condiciones
desnaturalizantes. Bajo estas condiciones desna- Persulfato de Amonio Generación de radicales libres que cata-
turalizantes y de reducción, las proteínas carga- lizan la reacción de polimerización.
das negativamente, cuando se someten a un TEMED Aumenta la generación de radicales
campo eléctrico, migran al electrodo positivo. libres por el persulfato de amonio.
Debido a que el SDS iguala la carga en todas las
proteínas, la tasa de migración viene determina-
da por su peso molecular. Las moléculas más pe-
queñas migran más rápidamente que aquellas
con pesos moleculares mayores.

Los geles de SDS-PAGE están disponibles comer-

cialmente o se pueden elaborar en el propio la-
boratorio. Los geles pre-fabricados son muy
prácticos pero debido al coste, no son tan renta-
bles como los elaborados por el usuario. En la ta-
bla 6, se describen los componentes químicos de
un gel de SDS-PAGE.

Elección del grosor del gel y del tamaño de poro

El tipo de muestra y el peso molecular de la pro-

teína de interés dictan el espesor y tamaño de
poro del gel.
Tabla 7. Rango de separación de proteínas según el porcentaje
 Los espaciadores de gel (ver Figura 8) con- de acrilamida.
trolan el espesor del gel. Están disponibles en Porcentaje Rango Peso Molecular (kDa)
diversos tamaños.
7,5 25-500
 Los geles con mayor espesor, pueden acep-
tar mayor volumen de carga. También se
10 15-300
procesarán más lentamente y requieren
tiempos de transferencia mas largos que los
12 10-200
geles más delgados

 El porcentaje del gel, según la cantidad de 15 10-45

acrilamida y bisacrilamida, determina el ta-
20 5-40
maño del poro. A más porcentaje menos
tamaño de poro.

 El tamaño de poro determina la ratio de se-

paración de las proteínas. (tabla 7).

Página 8
Análisis de Proteínas
Elaboración del gel
Si el gel de acrilamida esta elaborado en el labo-
ratorio, los distintos reactivos se mezclan y se vier-
te en el molde, formado por el conjunto de dos
cristales, espaciadores lateral, espaciador inferior,
peines y un sistema de sujeción (Figura 8), dónde
la acrilamida se polimeriza en aproximadamente
30 minutos. Para mejorar la nitidez de la banda el
gel resolutivo se corona con una acrilamida de
menor porcentaje (stacking gel).
Diseño Experimental; Controles y Estándares
Antes de la carga del gel, es importante diseñar
el experimento incorporando los controles y
estándares necesarios para la validación de los
resultados. Los tipos de estándares y controles utili-
zados incluyen:
1. Marcadores de Peso Molecular.
 Son una mezcla de proteínas purificadas de
peso molecular conocido.
 Se utilizan para verificar si la proteína de in-
terés está dentro del rango de tamaño apro-
piado.
 Disponible en diversos intervalos de pesos
moleculares, así como teñidos o incoloros.
Las versiones preteñidas se utilizan para
controlar el progreso de la electroforesis y
comprobar la eficacia de la posterior trans-
ferencia.
 Pueden estar marcadas por la detección
por fluorescencia o quimioluminiscencia.
2. Controles Positivos.
 Para verificar si el anticuerpo primario se une
a la proteína correcta.
 Generalmente, si está disponible, son una
muestra de la proteína de interés purificada.
 Puede ser una línea celular que sobreexpre-
se la proteína de interés.
 Puede ser una muestra de tejido del que se
conozca que expresa altos niveles de la pro-
teína de interés. Se pueden utilizar otras es-
pecies como tejido de control si el anticuer-
po tiene reactividad cruzada apropiada.
Página 9
1. Colocar los espaciadores de la parte inferior y laterales entre
los cristales.
2. Tras fijación de los lados, verter el gel resolutivo y esperar que
el gel se polimerice.
3. Colocar el peine en la parte superior del gel.
4. Verter el ―stacking gel‖ y quitar el peine una vez el gel haya
polimerizado. Lavar los pocillos con ddH20. El gel está listo
para cargar las muestras y la electroforesis.
Figura 8. Preparación del gel de electroforesis para la separa-
ción de proteínas.
Controles de carga
 Como norma general se utilizan proteínas con
niveles de expresión constante para todas las
muestras. Similar a los ―housekeeping genes‖
en Biología Molecular.
 Algunos tratamientos pueden alterar la expre-
sión de estas proteínas ―housekeeping‖.
 Se utiliza para verificar que la carga de proteí-
na por carril es más o menos igual, así los nive-
les de proteínas se pueden comparar de forma
cuantitativa.
 La expresión cuantitativa de la proteína de in-
terés puede normalizarse con la del control de
carga para cada muestra.
Péptidos de bloqueo
 Algunos proveedores ofrecen péptidos de blo-
queo para sus anticuerpos.
 El péptido de bloqueo se mezcla con el anti-
cuerpo primario antes de la incubación con la
membrana y evita la uníón del anticuerpo a la
proteína diana. Por tanto no se detectará nin-
guna banda.
 Estos estudios demuestran que el anticuerpo
utilizado se une de forma específica a la proteí-
na de interés.
 Electroforesis
en Acrilamida

Inicio de Electroforesis
Muestra (pH 6,8)
Las muestras se cargan en los pocillos del gel me-
diante una pipeta. Normalmente se cargan de 20
a 40 µg de proteína total por carril. Es importante
conocer de antemano, el volumen que se puede
cargar por pocillo, para así evitar sobrecargas
Gly
que pueden dar lugar a la pérdida de muestra o Proteinas Stacking Gel
derrames en pocillos adyacentes. Una vez finali- CL- pH 6,8
zada la carga, el gel se somete a un campo eléc-
trico generado por una fuente de alimentación. El
tampón utilizado durante la electroforesis, contie-
ne Tris (mantiene el pH), Glicina (conductor elec-
tricidad) y SDS (mantiene las proteínas cargadas
Gly Resolving Gel
negativamente). El progreso en el gel se monitori- Proteinas pH 8,8
za observando el frente coloreado por el coloran-
te presente en el tampón de carga y la posición
de los marcadores de tamaño siempre que estos
estén teñidos.

La técnica de electroforesis más habitualmente

utilizada es la de Laemmli. En este método, los
valores de pH de la capa de gel de apilamiento Tampón de Electroforesis (pH 8,3)
o concentración (Stacking Gel) y el gel de resolu-
 La glicina tiene carga negativa en el tampón de electrofo-
ción (Resolving Gel) son diferentes. La figura 9 ilus- resis a pH 8,3.
tra el flujo de iones durante la electroforesis.
 Con la aplicación de un campo eléctrico, la glicina, en el
Stacking Gel, se aleja del electrodo negativo.

 La glicina empieza a perder su carga a pH 6,8 y ralentiza

su movimiento. Los iones de cloruro avanzan por delante
de la Gly. El aumento de la resistencia, obliga a las proteí-
nas a alejarse, de forma apilada, del electrodo negativo.

 La glicina, debido a un mayor pH del ―Resolving Gel‖, au-

menta su carga negativa y se mueve por delante de las
proteínas.

 Las proteínas se separan según su peso molecular por el

Figura 9. Concentración de bandas de proteínas por el flujo

iónico en el sistema discontinuo de Laemmli.

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Análisis de Proteínas

4. Transferencia a una Membrana

Una vez la electroforesis del gel ha terminado, las
proteínas se transfieren a una membrana. La
membrana es un soporte sólido que une e inmovi-
liza las proteínas, permitiendo así que la hibrida-
ción de un anticuerpo las pueda detectar. La
mayoría de los sistemas de transferencia utilizan la
generación de un campo eléctrico para condu-
cir a las proteínas desde el electrodo negativo al
positivo. Los sistemas de transferencia están dispo-
nibles en formato semiseco o húmedo. Los siste-
mas semisecos son más rápidos y requeiren menor
cantidad de volumen de Tampón que los siste-
mas húmedos, sin embargo no son apropiados
para transferencia de proteínas de gran tamaño
(>70 kDa) y pueden causar, según el sistema de
detección, un mayor ruido de fondo. Ambos
métodos requieren, para una transferencia efecti-
va de las proteínas, un estrecho contacto entre el
gel y la membrana.

Aunque ambas funcionan bien en experimentos

de inmunotransferencia, las diferencias en sus ca- Figura 8. Transferencia de proteínas a una membrana.
racterísticas puden influir a la hora de la elección.
La membrana de PVDF, ofrece una mayor resis-
tencai mecánica, resistencia la SDS y una mayor
unión que la nitrocelulosa. La membrana de nitro-
celulosa tiene la ventajas de proporcionar un me-
nor ruido de fondo y que no requieren un pre-
tratamiento con metanol. Recientemente se han
desarrollado, con el objetivo de reducir el ruido
de fondo al utilizar métodos de detección de fluo-
rescencia, membranas PVDF de baja autofluores-
cencia.

Previamente a la transferencia, tanto el gel como

la membrana se equilibran en una solución
tampón pre-enfriada. Típicamente, el tampón de
transferencia contiene Tris, Glicina, SDS (opcional)
y metanos (para membranas de nitrocelulosa). La
figura 10 ilustra como se ensamblan el gel y la
membrana en un transferencia semiseca o húme-
da.
Nota: Advansta suministra membranas de transferencia pre
-cortadas de nitrocelulosa o PVDF aptas de tamaño de mini-
gel. El uso de membranas pre-cortadas permite ahorrar tiem-
po y elimina la contaminación accidental de las membranas
con guantes o tijeras contamindas.
Información para pedidos
L-08001-010 Membrana PVDF baja fluorescencia 7x9 cm

L-08002-010 Membrana Nitrocelulosa 0,45 µm 8x10 cm

L-08003-010 Membrana Nitrocelulosa 0,22 µm 8x10 cm

Página 11
 Electroforesis
en Acrilamida
A continuación se describen algunas sugerencias
para la consecución exitosa de una transferen-
cia:
 Evitar la manipulación de las membranas con
las manos desnudas. Las proteínas y aceites de
la piel pueden adherirse a la membrana y pue-
den dar lugar a manchas no deseadas en la
membrana.
 Las burbujas de aire entre el gel y la membra-
na pueden causar transferencia defectuosa y
desigual. Se pueden eliminar haciendo rodar
suavemente una pipeta Pasteur por encima
del ―sándwich‖ formado por el gel/
membrana/papel de filtro.
 No permitir un sobrecalentamiento durante la
transferencia. Es aconsejable utilizar tampón
frio, un sistema de refrigeración o hacer la
transferencia en una cámara fría. Disminuir el
voltaje o el tiempo si fuera necesario.
 Ajustar las condiciones de transferencia al ta-
maño de la proteína. Las proteínas más peque-
ñas se transferirán más rápidamente y pueden
atravesar la membrana. Reducir o eliminar el
SDS o utilizar una membrana con un tamaño
de poro menor puede ayudar a una mayor
retención de la proteína. Incrementar la canti-
dad de SDS y disminuir la concentración de
Metanol pueden facilitar la transferencia de
proteínas de gran tamaño.
 La aparición de marcadores de tamaño prete-
ñidos en la membrana es indicación que se ha
completado la transferencia.
 El colorante Ponceau S puede utilizarse para
teñir la membrana y asegurarse de la eficacia
de la transferencia. La membrana debe ser
desteñida antes del proceso de transferencia.
La tinción con Coomassie puede usarse para
la tinción del gel una vez realziada la transfe-
rencia y comprobar los residuos de proteína en
el gel.
Bloqueo
El bloqueo de la membrana se lleva a cabo incu-
bando con una solución diseñada para reducir los
lugares de unión no específicos al anticuerpo. A me-
nudo, son soluciones a base de proteínas, como la
leche descremada en polvo o la albúmina de suero
bovino (BSA). La primera elección, cuando se inicia
un nuevo protocolo, es la utilización de la leche des-
cremada en polvo, ya que es más rentable que el
BSA, sin embargo y debido a la presencia de biotina
en las fosfoproteínas, puede que no sea la mejor
elección cuando se van a utilizar anticuerpos fosfo-
específicos o en métodos de detección de biotina.
Es preferible, para estas y otras situaciones, el uso
de agentes bloqueantes no proteicos.
 El agente bloqueante se diluye en TBS (Tampón
Tris salino) o en PBS (Tampón Fosfato salino); se
puede añadir también detergente Tween 20.
Una incubación durante una hora
(temperatura ambiente o a 4ºC) suele ser sufi-
ciente para un bloqueo de los lugares de unión
no específicos del anticuerpo. Si los niveles del
ruido de fondo son demasiados altos, se pue-
den seleccionar otras soluciones de bloqueo
alternativas.
Nota: Advansta ofrece soluciones optimizadas de bloqueo
y de lavado para su línea de reactivos de detección, Wes-
ternBright, así como soluciones tampón en polvo de PCS, TBS,
...que facilitan una rápida y fácil preparación
Información para pedidos
R-03024-D50 AdvanWashTM, 500 ml
R-03023-D20 AdvanBlockTM-PF, 200 ml
R-01038-020 AvantTM Buffer Pouches - PBS
R-01039-020 AvantTM Buffer Pouches - TBS
Página 12
Análisis de Proteínas

5. Hibridación del Anticuerpo.

Después del proceso de bloqueo, la membrana Tabla 8. Anticuerpos Policlonales vs Monoclonales.
se incuba con el anticuerpo primario. En general, Anticuerpos Anticuerpos
los anticuerpos reconocen una secuencia de Monoclonales Policlonales
aminoácidos pequeña (epítopo) que queda ex-
Reconocimiento  Reconocimiento  Reconocimiento
puesta al eliminar la estructura tridimensional de epitopo y de un único epí- múltiples epítopos
la proteína en condiciones desnaturalizantes y sensibilidad topo en una proteína
reductoras. Los geles nativos se pueden utilizar  Menos sensibili-  Más sensible debi-
cuando los anticuerpos requieren de la proteína dad debido a do a los multiples
que sólo un anti- lugares de unión
plegada para el reconocimiento del antígeno. cuerpo se une a de anticuerpo en
cada proteína cada proteína.
 Bueno para proteí-
nas poco abun-
dantes.
Anticuerpos Primarios: Reactividad cruza-  Reactividad cru-  Reactividad cruza-
Monoclonal vs Policlonal. da potencial zada menos da más probable.
probable.  Mayor ruido de
 Potencial para fondo potencial
En la transferencia Western se pueden utilizar, tan- reconocer otras debido al recono-
to anticuerpos primarios monoclonales como poli- proteínas que cimiento de multi-
clonales. Los dos tipos tienen distintas ventajas y contengan el ples epítopos.
desventajas y se diferencian según la forma en la epítopo.  Reactividad cruza-
da con otras espe-
que se sintetizan. El primer paso en la producción cies más probable.
de ambos anticuerpos, es la inyección de un antí-
Tiempo requerido Largo Más corto
geno en un animal, para provocar una respuesta para su producción
inmune. Los anticuerpos policlonales se obtienen
Coste de Prepara- Mayor coste - re- Menor coste
directamente a partir del suero del animal,
ción quiere personal
comúnmente conejo, cabra, burro u oveja y son capacitado y equi-
finalmente purificados y probados. Los anticuer- pamiento especiali-
pos policlonales reconocen múltiples epítopos del zado.
antígeno y en cambio los monoclonales recono- Variabilidad Los lotes de un mis- Propenso a cierta
cen un único epítopo de la proteína. Para la sínte- mo hibridoma son variabilidad entre
sis de un anticuerpo monoclonal, las células que muy estables. lotes.
sintetizan anticuerpos se aíslan del bazo del ani- Tolerancia a condi- Poca tolerancia - Más tolerante a con-
mal y se fusionan con células del mieloma. Lo ciones variables puede dejar de diciones variables.
reconocer al antí-
hibridomas resultantes secretan anticuerpos al
geno en condicio-
medio de cultivo, el cual se analiza y determina nes de desnaturali-
la afinidad al antígeno. Los hibridomas con secre- zación/reducción
ción más estable se seleccionan y pueden ser cul- de la proteína, o
por modificaciones
tivados indefinidamente. Algunas características
químicas
de los anticuerpos monoclonales y policlonales se (glicosilación fosfori-
describen en la Tabla 8. lación) o por dife-
rencias en la se-
cuencia peptídica
debido a la presen-
cia de polimorfis-
mos.

Página 13
 Hibridación
Anticuerpos

Incubación de los anticuerpos

El anticuerpo primario se diluye en tampón de

bloqueo, TBST o en un tampón de disolución de
anticuerpo comercial. El fabricante puede reco-
mendar una cantidad inicial, pero a menudo la
concentración óptima de anticuerpo debe deter-
minarse empíricamente. La afinidad del anticuer-
po, la abundancia de la proteína en la muestra y
la sensibilidad del sistema de detección afec-
tarán a la cantidad de anticuerpo a utilizar.

 Generalmente, un periodo de incubación

de 1 hora a temperatura ambiente suele ser
suficiente. También es posible una incuba-
ción a 4ºC durante toda la noche.

 Durante la incubación, la membrana debe

someterse a agitación suave y sumergida en
la disolución, e incubar en un agitador de
vaivén. Un menor volumen puede utilizarse si
la membrana se sella dentro de una bolsa e
incuba en un agitador orbital.
Nota: Advansta ofrece una línea completa de anticuerpos
secundarios marcados para detección mediante quimiolu-
 En algunos casos, la disolución con el anti- minscencia o fluorecencia.
cuerpo, puede reutilizarse. Si se utiliza acida
sódica como conservante, debe ser total- Información para pedidos
mente lavada de la membrana, ya que
R-05051-050 IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo, 50 µl
puede eliminar la actividad de la peroxidasa
e interferir en los métodos de detección. R-05051-250 IgG conjugado APC-cabra-anti-conejo, 250 µl

Después de la incubación con el anticuerpo pri- R-05052-050 IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratón, 50 µl

mario, se procede a la eliminación del excedente
mediante tampones de lavado (TBS, PBS, TBST o R-05051-250 IgG conjugado RPE-cabra-anti-ratón, 250 µl
PBST). En métodos de detección indirectos R-05071-500 Anticuerpo Secundario conjugado HRP
(sección 6), es necesario un anticuerpo secunda- cabra-anti-ratón, 500 µl
rio apropiado. A continuación se describen las
consideraciones a tener en cuenta a la hora de la R-05072-500 Anticuerpo Secundario conjugado APC
cabra-anti-conejo, 500 µl
elección de un anticuerpo secundario:

 Las especie del primer Ac dicta la elección

del Ac secundario. Si el primer Ac es de co-
nejo, el segundo Ac debe ser anti-conejo, o
sea, deber ser producido en otra especie
distinta a conejo.

 Para anticuerpos monoclonales se debe

considerar la clase de Inmunoglobulina (IgG,
IgM, IgA, IgD, IgE) y posiblemente la subclase
(IgG1, IgG2a,…). Un anticuerpo con amplia
especificidad inmunoglobulínica debería ser
suficiente, ya que los anticuerpos específicos
para sub-clases se utilian mayoritariamente,
en experimentos de doble etiquetado u
otras aplicaciones.

Página 14
 Análisis de Proteínas

6. Detección.
La detección de la proteína se puede hacer me-
diante métodos directos o indirectos, cada uno
con sus ventajas e inconvenientes. Los métodos
directos utilizan un anticuerpo primario conjuga-
do con un marcaje detectable, como un enzima,
biotina o molécula fluorescente. Los anticuerpos
se pueden marcar mediante kits disponibles en le
mercado u obtenerlos ya marcados. Lo métodos
indirectos utilizan dos anticuerpos; un anticuerpo
primario y un anticuerpo secundario contra la es-
pecie del primer anticuerpo. En la detección indi-
recta, es el anticuerpo secundario el que está
conjugado con un marcaje detectable. La figura
11,ilustra los métodos de detección directos e in-
directos y en la Tabla 9 se resumen las ventajas e
inconvenientes de los dos métodos. Figura 11 . Detección directa e indirecta de proteínas

Tabla 9. Ventajas e Inconvenientes de los métodos de detec-

ción
Métodos de detección.
Indirecto Directo

Los métodos más comúnmente utilizados para Ventajas  Amplificación de  Menos pasos.
detectar proteínas son: 1. Quimioluminiscencia, 2. señal debido a la  Menos posibilida-
unión de múlti- des de unión no
Fluorescencia y 3. Colorimetría. ples Ac secunda- específica.
rios a cada Ac
1. Quimioluminiscencia. primario.
 Versátil - el mis-
Los métodos de detección de quimioluminiscen- mo Ac secunda-
cia utilizan comúnmente anticuerpos secundarios rio puede utilizar-
conjugados con peroxidasa (HRP). La reacción se para diversos
anticuerpos de
entre el encima y el substrato produce luz, que la misma espe-
puede ser detectada mediante la exposición de cie.
la membrana a una película de rayos X o capta-
Inconvenientes  Mayor posibili-  Puede ser más
da de forma digital utilizando una cámara CCD. dad de unión no costoso.
inespecífica.  La inmunorreactivi-
Ventajas: muy sensible, la membrana puede tra-  Más pasos. dad del Anticuer-
tarse para re-utilizarse, se pueden hacer multiples po puede estar
exposiciones en películas de rayos X, fácil de do- afectada por el
marcaje.
cumentar.

Inconvenientes: requiere una habitación oscura

(película rayos X) o sistemas de imagen caros, se-
micuantitativa - porque se basa en una reacción
enzimática, la película tiene un rango dinámico
limitado, la intensidad de la señal puede variar
con la incubación o el tiempo de exposición, no
son posibles detecciones multiplex (detección de
mas de una proteína, sólo un color de reacción)

Nota: LucentBlueTM es una película que ha sido optimizada para Información para pedidos
la detección de señales de quimioluminiscencia en experimentos
L07014-100 Película Rayos X LucentBlueTM , 20x25 cm, 100 uds
realizados con los substratos WesternBright HRP, incluyedo Western-
BrightTM ECL, Westernbright Quantum y WesternBright Sirius. L07013-100 Película Rayos X LucentBlueTM , 13x18 cm, 100 uds

Página 15
 Detección
2. Fluorescencia.
El anticuerpo secundario se une a un fluoróforo,
que cuando es ―excitado‖ emite luz. La luz emiti-
da, se detecta mediante un dispositivo capaz de
medir la fluorescencia o mediante una cámara
CCD provista con los filtros de longitud de onda
apropiada. La imagen se digitaliza para su análi-
sis.
Ventajas: sensibilidad (la sensibilidad puede incre-
mentarse utilizando el sistema streptavidina/
biotina), apto para ensayos multiplex con múlti-
ples colorantes, amplio rango dinámico, no se
requiere el uso de una cámara oscura, aporta
datas cuantificables, fácil documentación de re-
sultados, pueden usarse Ac primarios marcados
(para proteínas abundantes) y eliminar pasos.
Inconvenientes: los reactivos y el equipamiento
pueden ser costosos, no es tan sensible como la
quimioluminiscencia (puede no ser apropiado
para proteínas poco abundantes).
3. Colorimetría.
Los métodos colorimétricos utilizan un Ac secun-
dario que ha sido conjugado previamente a un
enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina). El enzi-
ma convierte el colorante en un producto insolu-
ble que es visible en la membrana. La cantidad
de colorante convertido es proporcional al canti-
dad en la muestra. La intensidad de la tinción
puede ser medida por espectrofotometría o por
un densitómetro.
Ventajas: sencilla de realizar, no requiere cámara
oscura, las membranas se pueden documentar
fácilmente mediante fotografía.
Inconvenientes: no es tan sensible como los otros
dos métodos, el color se desvanece con el tiem-
po.
Re-utilización de la membrana
Después de captar la imagen, la membrana pue-
de ser tratada para volver a ser utilizada para la
detección de otra proteína. Este procedimiento
puede conservar las muestras, pero consume mu-
cho tiempo. Con la detección multiplex de fluo-
rescencia, se pueden detectar múltiples proteínas
de forma simultanea, es ideal para comparar la
proteína de interés con un control de carga, o
diferentes isoformas de la proteína. Las membra-
nas PVDF son preferibles a la de nitrocelulosa en
protocolos de lavados para reutilización.
Nota: WesternBright TM MCF permite la detección, mediante la
detección fluorescente multicolor, de dos proteínas en una
sola membrana. Perfecto para aquellos experimentos en los
que se necesite comparar la proteína de interés con un control
de carga.
Información para pedidos
K-12021-010 WesternBrightTM fluorescent Western blotting kit
Nota: Advansta suministra una línea completa de reactivos
de detección de quimioluminiscencia optimizados para los
diferenentes métodos, concentración de muestra y tipos expe-
rimentales.
Información para pedidos
K-12042-D10 WesternBrightTM Quantum Western Blotting HRP
Substrate (para 1000 cm2 de membrana)
K-12042-D10 WesternBrightTM Sirius Western Blotting HRP Subs-
trate (para 1000 cm2 de membrana)
K-12045-D20 WesternBrightTM ECL Western Blotting HRP Substra-
te (para 2000 cm2 de membrana)
K-12042-D10 WesternBrightTM ECL Spray
Página 16
Análisis de Proteínas

7. Solución de Problemas

Solución de problemas con Western Blot

A. No se puede B. Tamaño inco-

C. Bandas arte- D. Problemas en E. Ruido de fon-
ver la proteína rrecto de la
factuales la electroforesis do excesivo
de interés banda

Preparación La proteína es Bandas El gel polimeriza Bloqueo

Muestra menor de lo Incompletas demasiado Insuficiente
(ver 1) esperado (ver 12) rápido o dema- (ver 24)
(ver 7) siado lento
(ver 17,18,19)

Transferencia Bandas Difusas Lavado

Inadecuada La proteína es (ver 13) inapropiado
(ver 2) mayor a lo es- (ver 25)
El gel corre de-
perado masiado rápido
(ver 8, 9) o demasiado
Rayas lento
Unión ineficien- Verticales (ver 20,21) Contaminación
te del Anticuer- (ver 14) Reactivos
po (ver 3, 4) (ver 26)
Bandas Múlti-
ples (ver 10)
Frente corre
Distorsión curvado
Problemas con Lateral Elección de
los reactivos ―smiling‖
(ver 15) Membrana
(ver 5, 6) (ver 22)
(ver 27)
Las bandas
aparecen muy
altas o muy
bajas en el gel Bandas distor- Frente corre
sionadas Unión no es-
(ver 11) inclinado
(ver 16) pecífica del
(ver 23) Anticuerpo
(ver 28)

Revelado de la
película
(ver 29)

Página 17

A. Problema
1. Preparación Muestra
2. Transferencia indadecua-
da
3. Unión ineficiente del Anti-
cuerpo primario
4. Unión ineficiente del Anti-
cuerpo secundario
5. Conjugado/Substrato Inac- Reactivos viejos o inestables
tivo
6. Reactivo de detección
(ECL)
B. Problema
7. Proteína más pequeña de
lo esperado
8. Proteína más larga de lo
esperado y/o bandas múlti-
ples
9. Proteína más larga de lo
esperado
Solución de
Problemas
Causa(s) Solución
Extracción ineficiente Intentar métodos alternativos; incluir con-
trol positivo en el gel
Baja expresión de la proteína en el tejido Cargar más cantidad de proteína total en
o las células el gel; concentrar utilizando Afyon, juntar
múltiples muestras
La proteína se ha degradado durante la Usar inhibidores de proteasa en le tampón
extracción de lisis
Tampón de transferencia preparado inco- Revisar el protocolo/disminuir metanol
rrectamente/demasiado metanol en el
tampón
Proteínas de mayor tamaño necesitan Repetir con un tiempo mayor/mayor vol-
mas tiempo/voltaje taje
Contacto insuficiente entre el gel y la Revisar la almohadilla de fibra; sustituir si es
membrana muy delgada
Baja afinidad del anticuerpo por la proteí- Incrementar la concentración del Anti-
na o el anticuerpo es antiguo/débil cuerpo; comprar un anticuerpo nuevo y
almacenarlo de forma apropiada
El Anticuerpo tiene reactividad cruzada Probar con un Anticuerpo primario de di-
débil con las especies de interés ferente origen
El Anrticuerpo se ha eliminado con el lava- Usar menor numero de lavados; disminuir
do la concentración de sales el tampón de
lavado
Antígeno enmascarado por el agente Utilizar un agente de bloqueo alternativo
bloqueante (ej.: Leche,…) (ej.: BSA,…)
Elección de especies errónea Usar Anticuerpos dirigidos contra la espe-
cie del Anticuerpo primario
Concentración insuficiente del Anticuerpo Aumentar concentración o comprar uno
o Anticuerpo antiguo Anticuerpo nuevo
Mezclar conjugado + substrato en un tu-
bo; o luminiscencia en oscuridad - conse-
guir un nuevo reactivo si no hay señal
Peroxidasa (HRP) inactiva por azida sódi- Evitar utilizar disoluciones conteniendo
ca este agente conservante
La disolución es antigua o está almacena- Comprar reactivo nuevo
da de forma inapropiada
Causa (s) Solución
Proteólisis; Congelación/descongelación Uso de inhibidores de proteasa/muestras
de la muestra frescas
Proteína variante (Splicing) Consultar literatura/utilizar controles apro-
piados
Proteínas modificadas de forma natural Consultar literatura para encontrar aditi-
(glicosilación, fosforilación, acetilación, vos que puedan eliminar grupos químicos
etc…)
Cambio de la expresión de la proteína en Utilizar cultivos anteriores; incluir un control
la línea celular positivo
Agregado de proteínas - puentes disulfuro Uso de DTT en tampón de muestra; pulso
intactos de centrífuga previo a la carga de la
muestra
Página 18
Análisis de Proteínas
B. Problema
(continuación)
10. Bandas Extras
11. La proteína aparece muy Porcentaje erróneo/no óptimo del gel
alta o muy baja en la mem-
brana
C. Problema
12. Bandas Incompletas
13. Bandas difusas
14. Rayas en los carriles
15. Distorsión lateral de las
bandas
16. Distorsión de las bandas
D. Problema
17. El gel no polimeriza
18. El gel polimeriza muy len-
to
Página 19
Causa(s) Solución
Unión no específica del Anticuerpo prima- Disminuir concentraciones; intentar un
rio o secundario experimento de bloqueo de péptido
(eliminará la proteína de interés)
Incrementar el porcentaje para proteínas
de pequeño tamaño; disminuir para pro-
teínas de gran tamaño
Causa(s) Solución
Burbujas entre el gel y la membrana Usando una pipeta, hacer rodar por enci-
ma del paquete gel/membrana para for-
zar la salida de las burbujas
Migración lenta Incrementar voltaje; asegurarse de la co-
rrecta preparación del tampón
Las muestras no se han calentado correc- Asegurarse que las muestras se han incu-
tamente bado durante 2 min a 90ºC antes de car-
garlas en el gel
El SDS del tampón es antiguo Preparar SDS nuevo para le tampón de
muestra
Alta concentración de sales en la muestra Disminuir la concentración de sal en el
tampón de muestra
Muestra muy concentrada o insuficiente Incrementar concentración/usar más SDS
SDS
Difusión de la muestra en los pocillos du- Minimizar el tiempo de carga
rante la carga
Fallo en la completa polimerización de los Incrementar TEMED/AP
pocillos
Presión aplicada excesiva a la hora de No apretar en exceso los tornillos del siste-
montar el gel ma, apretar hasta encontrar primera resis-
tencia
Burbujas en el gel debido al uso de crista- Usar guantes en la preparación de los ge-
les sucios les
Uso de Etanol y H2O desionizada en la lim-
pieza de los cristales
Burbujas introducidas en el gel por el dis- No expulsar totalmente el volumen de la
positivo de llenado (jeringa o pipeta) mezcla del gel
Burbujas de aire atrapadas por el peine Insertar el peine en ángulo y antes que se
polimerice el gel
Causa (s) Solución
Fallo al añadir el TEMED y AP Repetir con TEMED y AP
La disolución AP es estable durante dos o Preparar AP fresco
tres días a 4ºC
El oxígeno inhibe la polimerización Aplicar isopropanol antes de verter el gel
de apilamiento (stacking gel)
TEMED/AP Insuficiente Incrementar la cantidad de TEMED/AP
La disolución de AP ha perdido su activi- Preparar disolución fresca de AP
dad

D. Problema
(continuación)
19. El polimeriza demasiado
rápido
20. Tiempo de carrera in-
usualmente largo
21. Tiempo de carrera in-
usualmente corto
22. Frente curvado (smiling)
23. Frente inclinado
E. Problema
24. Bloqueo insuficiente
25. Condiciones de lavado
inapropiadas
26. Contaminación de los
reactivos
27. Elección de tipo de mem- Las membranas PVDF pueden tener más
brana ruido de fondo que las de Nitrocelulosa
28. Unión no específica del
Anticuerpo primario o secun-
dario
29. Sobreexposición de la
imagen
Causa(s)
Cantidad excesiva de TEMED/AP
Buffer de electroforesis demasiado con-
centrado
Voltaje insuficiente
Tampón demasiado diluido
Migración demasiado rápida
Generación de calor
Burbuja atrapada entre los cristales en la
parte inferior del gel
Causa(s)
La presencia de Biotina en la leche es in-
compatible con el uso de Estreptavidina,
o la leche contiene el antígeno de interés
Si utiliza AdvanBlock-PF con WesternBright
MCF, algún Anticuerpo primario puede
requerir un bloqueante proteico
La disolución está demasiado diluida
Tiempo de bloqueo muy corto
Algunos detergentes no son efectivos a
bajas temperaturas
Número insuficiente de lavados
Concentración insuficiente de detergente Incrementar la concentración de deter-
gente o usar detergentes más fuertes
(SDS, NP-40)
Crecimiento bacteriano o fúngico en los
tampones
Algunas membranas tienen alta autofluo-
rescencia
Membrana seca
Concentración muy alta del Anticuerpo o
no purificado por afinidad
Mucha cantidad de proteína en el gel
El tiempo excesivo de exposición a la pelí- Reducir los tiempos de exposición; si no es
cula o al CCD
Solución de
Problemas
Solución
Reducir la cantidad de TEMED/AP, mante-
niendo la relación entre ambos
Revisar protocolo; diluir el tampón en caso
necesario
Incrementar voltaje
Revisar el protocolo; reemplazar tampón
en caso necesario
Disminuir voltaje
Disminuir voltaje; refrigerar
Aguantar el gel en ángulo; colocar una
esquina en el tanque inferior del sistema
de electroforesis; lentamente volver a po-
sición vertical
Solución
Usar BSA
Incluir BSA o leche en la disolución Advan-
Block-PF utilizada en la dilución del Anti-
cuerpo primario
Incrementar con un 5% la disolución
Incrementar el tiempo de incubación
Incubar a temperatura ambiente en vez
de toda la noche a 4ºC
Incrementar el número de lavados o la
duración de cada uno de ellos
Revisar la turbidez de los tampones; pre-
parar nuevos
Elegir membranas de Nitrocelulosa
Utilizar únicamente membranas PVDF con
baja autofluorescencia con Western Blots
fluorescentes
Estar seguro que la membrana esta húme-
da durante todo el proceso
Disminuir la concentración de Anticuerpo;
intentar con Anticuerpo monoclonal o
purificado por afinidad
Disminuir la cantidad de proteína
posible incrementar la dilución de los Anti-
cuerpos o cargar menor cantidad de
muestra
Página 20
Análisis de Proteínas

8. Herramientas y Referencias Técnicas

g de Soluto
Molaridad de una disolución =
[Masa molecular de Soluto (g/mol) x (L de disolución)

Tabla 10. Código genético y abreviaciones de los aminoácidos

Segunda Posición
U C A G
UUU Fenilalanina UCU UAU Tirosina UGU Cisteina
UUC (Phe, F) UCC Serina UAC (Tyr, T) UGC (Cys, C)
UCA (Ser, S)
U UUA Leucina UCG UAA STOP UGA STOP
UUG (Leu, L) UAG
UGG Triptófano
(Trp, W)
CUU CCU CAU Histidina CGU
CUC Leucina CCC Prolina CAC (His, H) CGC Arginina
Primera posición

C CUA (Leu, L) CCA (Pro, P) CGA (Arg, R)

CUG CCG CAA Glutamina CGG
CAG (Gln, Q)
AUU Isoleucina ACU AAU Asparagina AGU Serina
AUC (Ile, I) ACC Treonina AAC (Asn, N) AGC (Ser, S)
AUA ACA (Thr, T)
A
ACG AAA Lisina AGA Arginina
AUG Metionina AAG (Lys, K) AGG (Arg, R)
(Met, M)
GUU GCU GAU A. Aspártico GGU
GUC Valina GCC Alanina GAC (Asp, D) GGC Glicina
G GUA (Val, V) GCA (Ala, A) GGA (Gly, G)
GUG GCG GAA A. Glutámico GGG
GAG (Glu, E)

Tabla 11. Conversión entre masa y moles de proteína Tabla 12. Absorvancia a 280 nm de Proteinas habituale
Peso molecular 1 µg 1 nmol Proteina A280 Uds por 1 mg&ml
(Da)

10.000 100 pmol o 6x1013 moléculas 10 µg IgG 1,35

20.000 20 pmol o 1,2x1013 moléculas 50 µg IgM 1,2
100.000 10 pmol o 6x1012 moléculas 100 µg IgA 1,3
150.000 6,7 pmol o 4x1012 moléculas 150 µg Proteina A 0,17
Avidina 1,5
Estreptavidina 3.4
Albumina suero bovino 0,7

Página 21
 Herramientas y
Referencias

Tabla 13. Prefijos métricos Tabla 16. Masa molecular media de los aminoácidos
M mega 106 n nano 10-9 Códigos Aminoácidos Masa molecular media
K Kilo 103 K pico 10-12 A Ala 71,08
m mili 10-3 f femto 10-15 C Cys 103,1
µ micro 10-6 a atto 10-18 D Asp 115,1
E Glu 129,1

Tabla 14. Abreviaciones F Phe 147,2

ds doble cadena ( como en dsDNA) G Gly 57,05

ss cadena sencilla (como en ssDNA) H His 137,1

bp pares de base I Ile 113,2

kb kilobase; 1.000 bases o pares de base K Lys 128,2

Da Dalton, unidad de masa molecular L Leu 113,2

M Met 131,2
mol mol
N Asn 114,1
M molaridad, moles de soluto por litro de disolución
P Peo 91,12
Q Gln 128,1
Tabla 15.. Vida media de los Radioisótopos más habituales R Arg 156,2
Radioisótopo Vida media S Ser 87,08
T Thr 101,1
Carbono-14 (14C) 5.730 años
V Val 99,07
Iodo-125 (125I) 60 días
W Trp 186,2
Fósforo-32 (32P) 14,3 días
Y Tyr 163,2
Azufre-35 (35S) 87,4 días
Tritio (3H) 12,4 años

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