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La producción de pectinasa por Aspergillus niger LB-02-SF está influenciada por

la composición del medio de cultivo y la adición del inductor enzimático


después de crecimiento de biomasa

RESUMEN
La producción de pectinasa por Aspergillus niger LB-02-SF se centró en un cultivo
sumergido, antes de que fuera evaluado en un proceso de estado sólido. Este estudio
implicó la creación de un medio de cultura definido y una evaluación de los efectos de
la adición del inductor enzimático, pectina cítrica, al medio después del intenso fase de
crecimiento de biomasa. Un medio de cultivo formulado sin glucosa permitió una
reducción del crecimiento de la biomasa. Y una mayor producción de pectinasa,
facilitada por el control de los parámetros del proceso, como la mezcla, el pH y el
oxígeno suministro. La adición de pectina cuando se alcanzó un pH mínimo de 2.7 a las
22 h de cultivo no afectó al hongo crecimiento. La concentración máxima de biomasa
fue de 11.0 g / L a las 48 h, un valor similar al observado para el control, en el que la
pectina se incluyó en el medio al comienzo del proceso (11.5 g / L, a las 41 h).
Sin embargo, esta condición favoreció la producción de 14 U / mL de pectinasa, que fue
aproximadamente un 40% mayor que el valor observado para el control. Estos
resultados muestran que la producción de pectinasa por A. niger en un el cultivo se ve
fuertemente afectado por la composición del medio, así como por el retraso en la adición
de pectina a la caldo de fermentación.

Introducción
Los biocatalizadores son cada vez más importantes en la industria. Procesos debido a
sus características especiales, tales como alta especificidad, sus efectos sobre la pureza
del producto y la facilitación de reacciones bajo condiciones suaves. Las enzimas
pectinolíticas, también conocidas como pectinasas, están disponibles comercialmente y
desempeñan un papel relevante en la descomposición de los polisacáridos que
comprenden sustancias pécticas. Las enzimas pectinolíticas se utilizan principalmente
en la industria alimentaria. Esta el complejo enzimático se utiliza ampliamente para la
producción de zumo de frutas y vino y para textiles, papel y constituyentes de alimentos
para animales.
Varias clases de microorganismos producen pectinasas, tales como Bacterias, hongos
filamentosos y levaduras. Sin embargo, la mayoría de los comerciales las pectinasas
son producidos por hongos filamentosos, principalmente del género Aspergilo. Estos
hongos ofrecen la ventaja de segregar el 90% de las enzimas que producen en el medio
de cultivo, lo que simplifica Recuperación y purificación.
Además, A. niger es el más ampliamente organismo usado para la producción industrial
de pectinasas porque recibió la clasificación General Reconocido como Seguro (GRAS)
de la Administración de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA), el gobierno
agencia responsable de la regulación de alimentos y medicamentos. En un industrial
escala, la producción de pectinasa se realiza principalmente en un sumergido cultivo
(SmC) , pero el cultivo en estado sólido (SSC) también ha sido investigado a escala de
laboratorio y piloto . Según Dias-Godinez una razón por la que la síntesis de pectinasas
es mejorado en SSC es la alta concentración de biomasa que se puede lograr en este
sistema de cultivo junto con baja represión catabólica. Sobre el, por otro lado,
especialmente en operaciones a gran escala, SmC es ventajoso.
Porque permite la mezcla eficiente de reactivos y facilita el Control de parámetros
importantes del proceso, como pH y oxígeno la concentración y la fácil eliminación del
calor del medio de cultivo.
En un estudio previo realizado por nuestro grupo de investigación, Aspergillus niger LB-
02-SF Fue aislado por Sandri et al. Estos autores y posteriormente Poletto et al.
evaluaron el uso del conjunto enzimático producido por esta cepa para la clarificación
de zumos de diversas frutas, informa. Resultados similares a los obtenidos con
pectinolíticos comerciales de alta calidad preparativos. Sin embargo, hasta ahora, la
producción de pectinasa por A.niger LB-02-SF se ha evaluado en detalle solo en SSC,
y el nuevo aún se requiere estudios en SmC para evaluar aspectos como los
biorreactores,
Tabla 1
Composición del medio de cultivo evaluado para el cultivo de Aspergillus niger LB-02-
SF en matraces agitados.

condiciones operativas, la formulación del medio de cultivo, y la regulación de la


inducción y represión catabólica. Además de procesar parámetros, tales como pH,
temperatura y suministro de oxígeno, pectinasa. La producción de Aspergilli en SmC
depende en gran medida de la cultura medio. La composición del medio está
directamente correlacionada con la síntesis de enzimas pectinolíticas, ya que estas
enzimas pueden ser tanto Inducida e inhibida. Como regla general, el medio de cultivo
utilizado para producir las pectinasas de los hongos incluye fuentes de carbono y
nitrógeno, además a inductores, tales como pectina o residuos agrícolas e industriales
con un alto nivel de pectina.
Varios estudios han evaluado el efecto del tipo y concentración de la fuente de carbono
en medio de cultivo para hongos del género Aspergillus para la producción de pectinasa,
incluyendo glucosa, sacarosa, galacturónica ácido y glicerol. Medios de producción
líquidos normalmente contienen pectina como inductor para la síntesis de pectinasa. En
Además, la pectina también puede ser utilizada como fuente de carbono por el
microorganismo.
Malvessi y Silveira describieron el uso de un medio de cultivo preparado con salvado de
trigo y pectina como inductor de poligalacturonasa. Producción de A. oryzae en SmC.
Los autores demostraron que se mejoró el proceso en medios que contenían salvado
de trigo. Otros estudios también indicaron que el salvado de trigo promueve la
poligalacturonasa producción en SmC y SSC.
Además, varias fuentes de nitrógeno también desempeñan un papel importante en
producción de pectinasa por hongos filamentosos. La mayoría de los estudios sobre
este tema están relacionados con las sales de amonio.
Los procesos aeróbicos requieren una cantidad no limitante de disuelto oxígeno para la
respiración microbiana. El oxígeno afecta directamente a la biomasa crecimiento y es
fundamental para la producción de metabolitos.
Sin embargo, este gas es poco soluble en medios acuosos, por lo que suministra el
oxígeno para una cultura es una tarea compleja que también se ve afectada por niveles
altos de nutrientes solubles.
Los problemas de solubilidad del oxígeno se vuelven aún más problemáticos en el
viscoso media. Meneghel et al. Estudió estrategias para reducir la viscosidad causada
por la pectina en medio de cultivo de Aspegillus oryzae. Los autores informaron que el
mejor proceso incluía la adición de pectina 24 h después de la inoculación, es decir,
después del período en que la biomasa crece la tasa alcanzó su punto máximo,
momento en el cual la tasa de absorción de oxígeno fue máxima.
Esta estrategia facilitó los mecanismos de transferencia de calor y masa durante las
horas iniciales del proceso, facilitando el control de la disuelta concentración de oxígeno
y de pH.
En este escenario, el presente estudio describe la producción de pectinasa por A. niger
LB-02-SF en SmC. El objetivo era desarrollar una cultura medio adecuado para el
crecimiento de biomasa y producción de pectinasa.
Además, el momento en que se añadió el inductor enzimático al medio también fue
evaluado como un medio para mejorar el oxígeno transferencia al medio líquido.
Materiales y métodos
Microorganismo
A. niger LB-02-SF se obtuvo de la colección de cultivos de laboratorio de Bioprocesos
de la Universidad de Caxias do Sul (Caxias doSul, Brasil). Esta cepa también se
deposita en la Colección de Referencia Microorganismos de Vigilancia Sanitaria de la
Oswaldo Cruz. Fundación (Rio de Janeiro, Brasil) bajo el código INCQS 40371. A. niger
LB-02-SF se aisló y se estudió para determinar la producción de pectinasa en SSC por
Sandri et al. Durante los experimentos descritos en el presente estudio, la cepa se
almacenó en medio de agar glicerina a 4 ° C.
Medios culturales
El medio de cultivo estándar en el presente estudio (medio M) para la producción de
pectinasa por A. oryzae en SmC fue descrita anteriormente por Meneghel et al. [22] y
contenía lo siguiente en g L − 1: salvado de trigo (extracto acuoso), 40; pectina cítrica,
20; glucosa 5; extracto de levadura, 0.05; (NH4) 2SO4, 5,0; MgSO4, 0,5; KH2PO4, 2.5;
FeSO4 & 903; 7H2O, 6.3 × 10−4, ZnSO4, 6.2 × 10−4, MnSO4, 1.0 × 10−5. Basado en
la composición del medio M, otros medios con diferentes glucosa, amonio. Se evaluaron
las concentraciones de sulfato y extracto de salvado de trigo. Las composiciones de los
diferentes medios evaluados en matraces agitados son mostrado en la Tabla 1.
Tabla 1 El extracto de salvado de trigo se preparó mezclando 40 g de trigo Salvado
(Vicato Alimentos, Sananduva, Brasil) en 500 ml de agua destilada agua. La mezcla se
autoclavó a 1 atm durante 15 minutos, se enfrió, y se filtró, y se utilizó el extracto líquido
para preparar el medio.
Los medios A y B se utilizaron para evaluar el efecto de la glucosa, mientras que los
medios C y D se utilizaron para evaluar el papel del sulfato de amonio, y los medios E y
F se utilizaron para analizar el efecto del salvado de trigo.
Concentración en el extracto acuoso.
Condiciones de cultivo
Las pruebas preliminares para definir la composición del medio fueron realizado en
matraces erlenmeyer cubiertos con gasa e hidrófobos Algodón que contenía 100 ml de
los diversos medios. Un pH inicial el valor de 4.0 se logró mediante la adición de NaOH
2.5 mol / L o H2SO4 2.0 mol / l. Posteriormente, los matraces se autoclavaron a 1 atm
para 20 min antes de la inoculación. La inoculación se realizó utilizando 108 esporas / l
de medio. Los experimentos se llevaron a cabo en un agitador recíproco (Certomat U /
H, Sartorius, Alemania), a 300 rpm y 28 ° C durante 120 h.
Además, la producción de pectinasa se evaluó en una mesa de trabajo biorreactor
(BioFlo / CelliGen 115, New Brunswick, EE. UU.) Con un 4-L Volumen de trabajo durante
135 h. El sistema permitió el control del pH, La temperatura, y la concentración de
oxígeno disuelto.
Usando las mismas condiciones de proceso que Meneghel et al. para el crecimiento de
A. oryzae, la temperatura del medio de crecimiento fue de 28 ° C y El pH inicial se ajustó
a 4.0. Durante el cultivo, el pH se ajusta automáticamente a 2.7 usando NaOH (2.5 mol
/ L) o H2SO4 (2.0 mol / L). La concentración de oxígeno disuelto se ajustó a una
concentración mínima. Corresponde a una saturación del 30% en el medio de cultivo
por variando el caudal de aire (0.5–5.0 L / minuto) y / o la velocidad de agitación (300–
750 rpm). Después de las pruebas preliminares para definir el medio de cultivo, el
organismo se cultivó en el biorreactor para evaluar estrategias para el adición del
inductor enzimático (es decir, pectina cítrica), siempre después del periodo de mayor
crecimiento de la biomasa. En condición P1, 2% (w / v) se añadió pectina cítrica cuando
la concentración de caldo TRS fue menor que 2 g / l. En la condición P2, se añadió
pectina al 2% (p / v) cuando el pH alcanzó un mínimo de 2.7. Estas corridas se realizaron
en medio A.
Métodos analíticos y cálculos.
La concentración de biomasa se determinó gravimétricamente por filtración un volumen
conocido de medio de cultivo a través de un Whatman no 1 filtro y Secándolo a 80 ° C
durante 24 h. La concentración de azúcar reductora total (TRS) se midió utilizando el
método de hidrólisis ácida descrito por Bitmann y adaptado para muestras libres de
sólidos en suspensión, seguidas del método DNS (Ácido 3,5-dinitro-salicílico).
La actividad de pectinasa total (TPA) fue evaluada por el método descrito por Maiorano
y modificado por Malvessi , que es Basado en la medida de la reducción de la viscosidad
de un 0,63%. (p / v) de solución de pectina cítrica en tampón de acetato de 0,05 mol / l
(pH 4,0). El análisis se inició mediante la adición de 3,2 ml de un diluido
convenientemente muestra a 14.8 mL de una solución de pectina cítrica a 30 ° C durante
30 min.Inmediatamente después de la reacción, la viscosidad de la mezcla fue medido
utilizando un viscosímetro (DV-II +, Brookfield Engineering, EE. UU.). Una unidad de
pectinasa total se definió como la cantidad de enzima que provocó una reducción del
50% en la viscosidad en condiciones estándar. El rendimiento de producción específico
(YP / X) se calculó a partir de la valores máximos de actividad enzimática (Pmax) y la
concentración de Biomasa (Xmax) de cada cultivo. Los rendimientos de TRS para
pectinasas. (YP / S) y biomasa (YX / S) se calcularon a partir de Pmax y Xmax valores
alcanzados durante el cultivo, y la concentración respectiva de TRS consumido durante
el cultivo previo a los tiempos en que estos valores máximos ocurridos La productividad
volumétrica (pv) representa la concentración del producto formado por una unidad de
tiempo de proceso.
Análisis estadístico
Los datos fueron evaluados utilizando un análisis de varianza de una vía (ANOVA) y la
prueba de Tukey con un nivel de confianza del 5% (P <0.05).
Resultados y discusión
Definición de la composición del medio.
Se desarrolló un medio de cultivo para encontrar una condición limitante para
Crecimiento de biomasa para facilitar la transferencia de oxígeno a los microbios
población y favorecer la producción de pectinasa. El parámetro primario en la evaluación
del proceso se consideró el rendimiento de producción específico (YP / X), que relaciona
la actividad total de pectinasa con el máximo Concentración de biomasa alcanzada en
cada experimento. Los resultados obtenidos en las pruebas con matraces agitados se
muestran en la Tabla 2.
Comparado con el medio M, los niveles de glucosa afectaron el crecimiento de la
biomasa, pH, y producción de pectinasa en medios de cultivo A y B. El máximo
La concentración de biomasa en el medio A (sin glucosa) fue de 9.7 g / L, por debajo de
la obtenida con medio M (10,7 g / L) y medio B (13,5 g / L) después de 120 h. La
producción de pectinasa fue mayor cuando se utilizaron los medios A y B, Con
actividades enzimáticas de 9.6 y 9.3 U / mL, respectivamente. Sin embargo, un se
obtuvo un mayor valor de YP / X utilizando medio A (0.989 U / mg), ya que el crecimiento
de la biomasa fue menor en esta condición. Cuanto más favorables la inducción de
enzimas en el medio A es bastante interesante si el anterior las dificultades
mencionadas para cultivar hongos filamentosos en SmC son tenerse en cuenta, es
decir, si una concentración de biomasa relativamente baja puede ser utilizado para
producir la misma cantidad de producto, sería más fácil proporcionar un ambiente
adecuado para el microorganismo, especialmente con respecto a la mezcla y la
concentración de oxígeno disuelto, en un biorreactor operación. Las concentraciones de
azúcar residual fueron similares para los medios M, A y B, aproximadamente 1.0 g / L,
al final de los experimentos. El efecto negativo de los carbohidratos simples en la
producción de pectinasa por A. niger ha sido descrito previamente. Solis-Pereira et al.
obtuvieron 0,8 U / mL de endo-pectinasa en medio que contiene pectina solo como
fuente de carbono e inductor, mientras que la mitad de esta actividad se encontró en
experimentos en medios que contienen sacarosa o glucosa.
Del mismo modo, Dias-Godínez et al. reportaron 40% menos de exopectinasa
producción en medio líquido que contiene sacarosa, y Maldonado y Strasser observó
una reducción de hasta el 90% de la endo-poligalacturonasaLos principales eventos
relacionados con la variación del pH en matraces agitados los experimentos se resumen
en la Tabla 2, que muestra que la más baja los mínimos se alcanzaron en medios que
contienen glucosa. Después, cuando se utilizaron medios sin o con 5 g / l de glucosa,
pH más alto se observaron niveles después de 96 h, pero este comportamiento no
ocurrió en medio B con 10 g / L de glucosa inicialmente, en el que el pH disminuyó a
1.6 y se mantuvo en este valor hasta el final del proceso. Similar el comportamiento fue
descrito por Fontana y Silveira para un A. oryzae cultivo. Estos autores observaron que
el pH bajó a un mínimo para todos los niveles iniciales de glucosa probados, pero el
incremento característico durante las horas del proceso final se observó solo cuando el
agregado la concentración de carbohidratos fue inferior a 10 g / l. Según estos los
autores y Meneghel et al, se requiere un pH cercano a 2.7 para alcanzar
Una alta actividad enzimática.
La tabla 2 muestra que la producción de pectinasa se vio afectada negativamente por
Niveles más bajos de sulfato de amonio en los medios C y D y del salvado de trigo en
los medios E y F en comparación con el medio M. El crecimiento de A. niger, sin
embargo, se demostró ser menos sensible a estas condiciones. Estas resultados
podrían asociarse con la relación carbono / nitrógeno en cada Medio, que afecta
directamente el metabolismo del microorganismo. Por ejemplo, Anupama y Ravindra
han demostrado que tanto el crecimiento de A. niger y la proteína liberada por el hongo
es dependiente en la relación C / N del medio de cultivo. Como tal, decidimos comparar
el medio A (sin glucosa) para Medio M en estudios de biorreactores debido al
significativo valor YP / X obtenido en estas condiciones. El hongo fue cultivado en el
biorreactor durante 135 h, y los perfiles cinéticos se muestran en la Fig. 1.
Las curvas de concentración de biomasa al inicio del cultivo. En los dos medios fueron
similares. Sin embargo, cuando el medio A era utilizado, se midió la concentración
máxima de A. niger (11.5 g / L) después de aproximadamente 41 h, se mantuvo
prácticamente sin cambios hasta las 72 h, luego disminuyó hasta 96 h, después de lo
cual se estabilizó a aproximadamente 8.0 g / l. Con medio M, el crecimiento de la
biomasa duró hasta las 64 h, y una se observó una fuerte disminución después de 96 h.
Posiblemente, el carbono más alto concentración en medio M debido a la adición de
glucosa permitió la Microorganismo para crecer durante más tiempo título en presencia
de glucosa.
Tabla 2
Resultados de los cultivos de Aspergillus niger realizados en matraces agitados para la
evaluación de los niveles de glucosa, sulfato de amonio y extracto de harina de trigo en
los medios.
Las medias seguidas por la misma letra no son significativamente diferentes a un nivel
del 5% (p <0.05). Xmax - concentración máxima de biomasa; Pmax - actividad máxima
de pectinasa; YP / X - rendimiento de producción específico; S0 – TRS en el tiempo de
crecimiento inicial; Sfinal - TRS al final del crecimiento período; pHmin − mínimo pH
alcanzado durante el cultivo; pH final − pH al final del cultivo. M − 5 g / L de glucosa, 5
g / L de sulfato de amonio y 500 mL / L de extracto de salvado de trigo; A − 0 g / L
glucosa, 5 g / L sulfato de amonio y 500 mL / L de extracto de salvado de trigo; B - 10 g
/ L de glucosa, 5 g / L de sulfato de amonio y 500 ml / L de extracto de salvado de trigo;
C - 5 g / L de glucosa, 1 g / L sulfato de amonio y 500 ml / l de extracto de salvado de
trigo; D - 5 g / L de glucosa, 3 g / L de sulfato de amonio y 500 ml / L de extracto de
salvado de trigo; E - 5 g / L de glucosa, 5 g / L de sulfato de amonio y 0 mL / L de extracto
de salvado de trigo; F - 5 g / L de glucosa, 5 g / L de sulfato de amonio y 250 ml / L de
extracto de salvado de trigo.

Fig. 1. - Variación de la biomasa (A) y azúcares reductores totales (TRS) (B), actividad
de pectinasa total (TPA) (C) y pH (D) en cultivos de biorreactores de Aspergillus niger
LB-02-SF con diferentes concentraciones de glucosa. (■) medio M: 5 g / L de glucosa,
5 g / L de sulfato de amonio y 500 ml / L de extracto de salvado de trigo; (□) medio A: 0
g / L de glucosa, 5 g / L de sulfato de amonio y 500 mL / L de extracto de salvado de
trigo. Los resultados representan la media de los duplicados.
La concentración inicial de TRS en medio A, que no contenía La glucosa, fue baja (8,1
g / L). Sin embargo, 20 h en el proceso, el TRS Se elevó a casi 11 g / L (Fig. 1B). Esto
puede haber sido causado por la hidrólisis de las cadenas de carbono complejas en el
salvado de trigo, como Informado anteriormente por Meneghel et al.para A. oryzae.
Entre 50 y 60 h, el TRS alcanzó 1.0 g / L en ambas condiciones, en las que se mantuvo
hasta el final del experimento. La concentración residual de TRS.
Probablemente se debió a la presencia de sustancias no metabolizables en el medio de
cultivo. La tendencia característica de menor pH en cultivos de hongos fue observado al
inicio de ambas pruebas, alcanzando 2.7 en 20 h y se controló para permanecer en ese
valor hasta el final del experimento. Los perfiles de actividad enzimática fueron similares,
mostrando una tendencia creciente. Hasta los 135 h Sin embargo, el medio A indujo una
mayor actividad enzimática (10.2 U / mL) que el medio M (8.6 U / mL), que también se
observó en el experimentos en matraz agitado (Tabla 2).
La figura 2 muestra las variaciones de oxígeno disuelto y las velocidades de agitación
durante el cultivo en los medios M y A. Cuando se utilizó el medio M, no se observó
disminución de oxígeno disuelto hasta 8 h, lo que indica la baja metabolismo fúngico
que es característico de la adaptación de la microorganismo a las condiciones de
crecimiento (es decir, la fase de retraso). De esto momento en que, el nivel de oxígeno
disuelto se redujo significativamente hasta 30% de saturación y se mantuvo en este
valor durante casi 60 h, a partir de La 18ª hora de cultivo, cuando la velocidad de
agitación era automáticamente aumentado hasta cerca del límite operacional (750 rpm)
(Fig. 2A).
Las células fúngicas filamentosas pueden dañarse por el esfuerzo cortante cuando se
utilizan velocidades de agitación excesivas, lo que afecta el crecimiento y el metabolito.
Producción. El cultivo en medio M indujo un afilado disminución de la biomasa a partir
de las 100 h y fue inferior a 4 g / L al final del experimento (Fig. 1A). En un intento por
mantener el cultivo se disuelve la concentración de oxígeno cerca del 30% de saturación
en medio A, una velocidad de agitación de 750 rpm

Fig. 2. Variación de la concentración de oxígeno disuelto y la velocidad de agitación en


el biorreactor cultivos de Aspergillus niger LB-02-SF con diferentes concentraciones de
glucosa. (UNA) medio M: 5 g / l de glucosa, 5 g / l de sulfato de amonio y 500 ml / l de
extracto de salvado de trigo; (B) medio A: 0 g / L de glucosa, 5 g / L de sulfato de amonio
y 500 ml / L de salvado de trigo extraer. (□) oxígeno disuelto; (■) velocidad de agitación.
Los resultados representan la media de duplicados
S0 – concentración inicial de TRS; Xmax - concentración máxima de biomasa; tX, max
- tiempo para Xmax; Scons, Xmax - consumo de RS a Xmax; Pmax - actividad máxima
de pectinasa; tP, max - tiempo para Pmax; YP / X - rendimiento de producción
específico; Scons, Pmax - TRS consumo hasta Pmax; Scons - consumo total de TRS;
YX / S - conversión de sustrato en células; YP / S – sustrato conversión en pectinasas;
pV - productividad volumétrica; Medio M — 5 g / L de glucosa, 5 g / L de sulfato de
amonio y 500 mL / L de extracto de salvado de trigo; Medio A — 0 g / L glucosa, 5 g / L
de sulfato de amonio y 500 mL / L de extracto de salvado de trigo.

Fue necesario por aproximadamente 40 h menos que el tiempo en el cultivo en medio


M, es decir, entre 18 y 36 h (Fig. 2B). En tono rimbombante, una baja velocidad de
agitación causa menos daño a las células durante cultiva y ahorra energía, reduciendo
el coste total del proceso. Los resultados las pruebas en los medios A y M se muestran
en la Tabla 3.
Como se observó anteriormente en las pruebas de matraz agitado, una biomasa más
alta concentración se observó utilizando medio M (12.8 g / L) debido a la Presencia de
glucosa que utilizando medio A (11.5 g / L). Sin embargo, medio A produjo una actividad
enzimática más alta (10.2 U / mL) que el medio M, y el valor de YP / X fue
aproximadamente un 30% mayor en ausencia de glucosa. Dado que la concentración
inicial del sustrato fue menor en el medio A, YX / S e YP / S fueron más altos que en el
medio M. El pv en el medio A fue más alto porque aunque la actividad enzimática
máxima se observó en el mismo tiempo durante el experimento, el valor bajo esta
condición era mayor.
La evaluación de los perfiles cinéticos y los parámetros del proceso calculado para
ambos medios reveló que el medio A sin glucosa era la mejor alternativa para la
producción de pectinasa por A. niger LB-02-SF en SmC, como lo indica el valor YP / X
más alto y el valor más favorable Condiciones de transferencia de oxígeno. Sandri
investigó SSC usando la misma cepa e informó que un medio libre de glucosa favorecía
la pectinasa producción. Solis-Pereira evaluó la producción de pectinasa por A. la cepa
CH4 de niger en SSC y SmC e informó un efecto negativo de la glucosa y la sacarosa
en la producción de pectinasa en este último, pero no el antiguo método debido a los
resultados obtenidos en las pruebas de biorreactores, subsiguientes los experimentos
se realizaron en medio A.
Evaluación del tiempo de adición de pectina al medio de cultivo.
La pectina es un inductor de la producción de pectinasa, y por lo tanto es una
componente esencial de un medio de cultivo [28]. Sin embargo, la pectina aumenta la
viscosidad del medio, lo que puede afectar a la mezcla y transferencia de oxígeno. La
viscosidad es particularmente crítica de inmediato. Después de la fase de retraso,
cuando el microorganismo tiene su mayor actividad metabólica. Así, en un intento por
minimizar los efectos de la alta viscosidad al inicio del período de cultivo, evaluamos la
adición de pectina cítrica a medio A en dos momentos diferentes, siempre después del
período de crecimiento intenso de la biomasa, en comparación con un control que
consistía en un cultivo en el que la pectina estaba presente en la inoculación.
Inicialmente, se monitorizó la concentración total de azúcar reductor, y la pectina se
agregó cuando el TRS se acercó a 2.0 g / L.
Fig. 3. Variación de la biomasa (A), azúcares reductores totales (TRS) (B), actividad de
pectinasa total (TPA) (C) y pH (D) en cultivos de biorreactores de Aspergillus niger LB-
02-SF con diferentes estrategias de adición de inductores enzimáticos. (■) Control:
pectina agregada en el momento = 0; (○) P1: adición de pectina cuando la TRS estaba
por debajo de 2.0 g / L (18 h); (▲) P2: adición de pectina cuando el pH alcanza 2.7
(22h). Los resultados representan la media de los duplicados.

El TRS era seleccionado porque indica que se produjo un alto consumo de azúcar, pero
No se había alcanzado una limitación de sustrato. Un TRS de 1.7 g / L fue alcanzado en
18 h, cuando se añadió pectina cítrica al 2% (p / v). En la condición P2, la adición de
pectina se basó en el pH y se añadió el inductor cuando el pH alcanzó un mínimo de
2,7, a las 22 h. El razonamiento de esa estrategia, como se discutió anteriormente, fue
el bajo pH. Requisito para la secreción de pectinasa por el hongo se muestran los
perfiles cinéticos de estos cultivos y el control en la figura 3. Los perfiles de
concentración de biomasa en P1 y P2 fueron similares a los controles antes de la adición
del inductor. Esto puede indicar que el disminución de la viscosidad en el medio al inicio
del cultivo período debido a la ausencia de pectina no afectó el crecimiento de A. niger.
Los niveles máximos de concentración de biomasa, que fueron inferiores a los control
(11.5 g / L), se obtuvieron a aproximadamente 48 h en cultivos de P1 y P2 y fueron 8.5
g / L y 11.0 g / L, respectivamente. Una vez alcanzado el pico en P1, la biomasa
comenzó a disminuir hasta que se observó un mínimo de 6.0 g / L al final del proceso.
Por P2, entre 72 h y 120 h, la concentración de biomasa se mantuvo en
aproximadamente 8,0 g / l. Después de esto, la concentración de biomasa disminuyó
hasta aproximadamente 6,5 g / L y se mantuvo hasta el final del experimento.
Comparado con el control, el crecimiento de biomasa se vio afectado negativamente por
la posterior adición de pectina, principalmente en P1. Los perfiles TRS fueron similares
para P1 y P2, con un aumento en el Concentración de sustrato a aproximadamente 40
h. Un comportamiento diferente era observado para el control, en el que el TRS alcanzó
su punto máximo después de casi 20 h por P2 y el control, TRS residual por debajo de
1.0 g / L se detectaron después de 72 h. Para P1, solo se alcanzó la concentración
mínima de sustrato después de 96 h. Tanto el crecimiento de biomasa como el consumo
de sustratos. Los perfiles se vieron afectados por la pectina en el medio en las primeras
horas de la cultivo, lo que podría indicar que la pectina se utilizó como carbono Fuente
del microorganismo, que afectó la concentración de biomasa. Adicionalmente, la
actividad enzimática en P1 y P2 fue mayor en comparación con el control a las 96 h,
cuando la actividad enzimática máxima se observó para P1 (8,6 mg / l), y se mantuvo
en este valor hasta el fin del proceso. Después de 96 h, la actividad de la enzima en P2
continuó aumentar gradualmente a 14.0 U / mL a las 135 h, que fue más alto que el
control (10.2 U / mL) al mismo tiempo. Los resultados obtenidos para P2 la hipótesis de
que el pH es un parámetro crítico para la producción de pectinasas fúngicas, como se
informó anteriormente para A. oryzae, Aspergillus flavipes y A. niger , desde el inductor
se añadió cuando el pH medio era de 2,7.
Se observaron cambios en el pH después de aproximadamente 10 h para tres
condiciones comparadas. Para el control y P2, se alcanzó pH 2.7 a las 22 h, lo que
indica que el perfil de crecimiento fue similar antes de que la pectina fuera añadida como
un inductor. Meneghel et al. Reportaron una fuerte disminución en pH cuando A. oryzae
se cultivó en un medio inicialmente libre de pectina los autores notaron que la caída en
el pH a 2.7 bajo esta condición era observado casi 18 h después del inicio del proceso,
mientras que esta disminución fue detectado a solo 24 h en el cultivo que inicialmente
contenía pectina, lo que indica que el crecimiento de la biomasa es más rápido en
ausencia de pectina. En P1, el pH se redujo manualmente de 3.1 a 2.7 inmediatamente
antes se añadió pectina (18 h) porque las condiciones de mezcla se vieron afectadas,
Esto dificulta el control de este parámetro (Fig. 3).
La figura 4 muestra las curvas de oxígeno disuelto y la velocidad de agitación utilizada
en P1 y P2 en comparación con el control (Fig. 2B). Los niveles de oxígeno disuelto en
el control, P1 y P2 alcanzaron un Mínimo de 30% de saturación después de
aproximadamente 12 h. En P1 y P2, el mínimo de oxígeno disuelto se mantuvo
ajustando la agitación. Velocidad hasta el máximo de 750 rpm durante 45 y 25 h,
respectivamente. Esta El tiempo fue menor en el control, a las 18 h. En P1, aunque la
velocidad de agitación se mantuvo a un máximo de 45 h, el oxígeno disuelto estuvo
ligeramente por debajo del 30% a partir de las 24 h, lo que coincidió con el marcado
Incremento de la concentración de biomasa. La dificultad de suministrar oxígeno. Podría
haber causado la limitación del crecimiento de biomasa a partir de las 45 h. (Fig. 4A).
Los resultados generales para P1, P2 y el control se muestran en
Fig 4: Variación del oxígeno disuelto y velocidad de agitación en cultivos de
biorreactores de Aspergillus niger LB-02-SF con diferentes estrategias de adición del
inductor de enzimas (A) P1: adición de pectina cuando la TRS estaba por debajo de 2.0
g / L (18 h); (B) P2: adición de pectina cuando el pH alcanzó 2,7 (22 h). (□) nivel de
oxígeno disuelto; (■) velocidad de agitación. Los resultados representa la media de los
duplicados.
Tabla 4
Resultados para los cultivos de biorreactor de Aspergillus niger LB-02-SF utilizando diferentes
enzimas estrategias de adición de inductores Xmax - concentración máxima de biomasa; tX,
tiempo máximo para Xmax; Scons, Xmax – TRS consumo hasta Xmax; Pmax - actividad máxima
de pectinasa; tP, tiempo máximo para Pmax; YP / X - rendimiento de producción específico;
Consumo de Scons, Pmax - TRS hasta alcanzar Pmax; Scons - consumo total de TRS; YX / S -
conversión de sustrato en células; YP / S - conversión de sustrato en pectinasas; pV -
productividad volumétrica; Control - adición de pectina en tiempo cero; P1: adición de pectina
cuando la concentración de TRS estaba por debajo de 2.0 g / L (18 h); P2: adición de pectina
cuando el pH alcanzó 2.7 (22 h).
Tabla 4
La concentración máxima de biomasa y actividad enzimática en P1. Fueron menores
que en P2 y en el control. La adición de pectina en P1 afectó negativamente la mezcla
y la transferencia de oxígeno, que puede tener obstaculizado el crecimiento de la
biomasa y la consiguiente producción de pectinasa. En P2, la concentración máxima de
biomasa fue similar a la Control, pero la actividad enzimática máxima fue de
aproximadamente el 40% más alto que el control, lo que indica que la adición de pectina
basada en la caída en el pH favoreció la producción de pectinasa. El mayor YP / X se
registró en P2 debido a la alta enzima actividad. En P1, YP / X fue mayor que el control
debido a la menor biomasa De manera similar, se observó una mayor pV en las pruebas
en las que se administró pectina añadido en diferentes momentos.
YX / S y YP / S se calculan a partir de la concentración de sustrato inicial en el medio
de cultivo. Las concentraciones más bajas de TRS se registraron en el comienzo de P1
y P2, probablemente debido a la ausencia de pectina en el medio en la inoculación. Por
esta razón, YX / S e YP / S fueron superiores al control, indicando que el microorganismo
podría crecer y producir Pectinasa con menor cantidad de sustrato. Respecto a la
adición de un inductor, la mayor actividad de la enzima en P2 pudo haber sido porque
la concentración de biomasa alcanzó su el valor más alto En P1, la adición de pectina
después de 18 h puede no haber sido apropiado, ya que el crecimiento de biomasa y la
producción de pectinasa fueron limitado, probablemente debido a las condiciones de
mezcla menos favorables.
Conclusión
El hongo filamentoso A. niger LB-02-SF produce pectinasas en SmC. El proceso se ve
afectado por la composición del medio y por la estrategia utilizada para la adición del
enzima inductor, pectina cítrica, a el medio de cultivo. Una concentración final más baja
de A. niger se obtiene en un medio de cultivo formulado sin glucosa, pero la pectinasa
específica La producción —unidades enzimáticas por gramo de biomasa seca— es
mayor. Esta el resultado es importante para la operación del proceso en un biorreactor.
Porque el control de parámetros esenciales, como la mezcla, pH y Especialmente el
suministro de oxígeno, se vería facilitado por la menor biomasa. Concentración sin
obstaculizar la producción de enzimas. En este caso, la los hongos estarían menos
expuestos a una alta velocidad de agitación durante un largo período, Reduciendo el
efecto del esfuerzo cortante sobre el microorganismo. Porque esto, la velocidad de
agitación debe ajustarse al máximo por un corto tiempo. En comparación con el control,
en el que la pectina cítrica estaba presente en el comienzo del proceso, ninguna de las
enzimas de adición de inductor las estrategias evaluadas condujeron a la mejora de la
mezcla y el oxígeno transferir. Por lo tanto, no fue posible acortar el tiempo de proceso
utilizando maxima velocidad de agitación como medio para mantener el oxígeno disuelto
concentración mínima para satisfacer las necesidades de los microorganismos. A pesar
de este resultado, la adición de pectina al medio de cultivo cuando el pH alcanzado 2,7
aumentó la actividad de pectinasa en un 40% en comparación con la adición de pectina
al inicio del proceso.