Clase 4 miércoles,23 de enero de2019 10:00 La secuenciadén permite obtener mucha informacién Otros métodos también informativos ~ hibridacién ‘omper la cadena por posiciones +/- especificas RESTRICCION ENZIMATICA. «+ Fragmentacién en sitios especificos # Uso de endonucleasas de restricci o fragmentacién © anilisis de los fragmentos de restriccién EcoRI ' 6 ———————— GAATTC ————— 3 HULA TTT ———— ae :CW f s ——__ aaTTC ——____._ 3 | my mn 3) ————CTTAA o—— 6 Ejemplos * Construccién de mapas fisicos ( ubicadén de fragmentos dentro de una molécula) ‘+ Determinar secuencia de nucleotidos o parte de ‘+ Clonaje ( moléculas demasiado grandes tienen mas limitaciones) ‘+ Facilitar el manejo (moléculas grandes son mis fragiles) «= Hibridacion Actividad de las endonucleasas de restriccién (endoR) Endonucleasas especificas de restriccién Tienen tamatio definido para cortar Reconocen Cortan en las fosfodiester de dsASN, corte simetrico, si esuna cadena igual ala otra Enlaces especificos = dianas/sitios de restriccién EcoRI Endonucleasas inespecificas (Dnasa, Rnasa) de puentes fosfatoDIGESTION OF DNA NONSPECIFIC BY RESTRICTION ENDONUCLEASE 1) Bacteria produce restriction enzymes to protect against invading viral DNA/RNA. 2) ‘The enzymes cut the invading DNARNA, rendering it harmless. Las endonucleasas de restriccién forman parte de los sistemas R-M (restriccién-modificacién) 3 sistemas RM Catalizan la metilacin de los sitios de restriccidn del ADN endégeno + Distinguir ADN endégeno del exégeno Acictemac RM.Catalizan la metilacién de los sitios de restriccién del ADN endégeno « Distinguir ADN endégeno del exégeno 3 sistemas RM ‘* Clonaje: implica la manipulacién de bacterias ‘= Uso de cepas bacterianas con estos sistemas alterados Tipol Tipo ll Mas comiin en bacterias Mayor uso en lamanipulacién de DNA ‘+ Estructura sendlla, faciles de aislar, conservar y manejar ‘+ Actividad de restriccién y metliacion por suumidades diferentes ‘+ Pero reconocenlamisma Diana = Gran especificidad Tipo Il Enlaboratorio se utilizan bacterias donde el sistema RM ha sido modificado Métodos de defensa de bacterias contra DNA viral enlanaturaleza Hacen parte de los sistemas RM ( restriccién -modificacién ) para reconocimiento de DNA exégeno Restriccién . Rotura de pequefias secuencias. Modificacién. Es necesario para distinguir DNA exégeno de endégeno. Catalizan la metilacion de los sitios de restriccién del DNA endogeno yla enzima no logra realizar el corte de DNA propio, este se mantiene intacto Y si queremos cortar sitios de restriccién metilados? Hay algunas enzimas que si son capaces de recortar en sitios metilados Hpall i S'AACC GGCGTA 3° 5’ AACCGGCGTA 3° Hay guias que te caracterizan las diferentes enzimas Pararealizar una enzima hay que desarrollar un protocolo Condiciones experimentales ( tampon, sales, temperaturay tiempo } Dianas reconocidas Sensibilidad ametilacion Tipo y cantidad de fragmentos de DNA Digestion multiple Especificidad ( actividad estrella) SOUPENE..