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OFICINA NACIONAL DE ACREDITACIÓN

Política Para la Validación de Métodos de Laboratorios


de Ensayos y Calibración.
DOC-ONA-12-011 Versión №:01 Revisión №:00

1. OBJETO

Establecer una guía para las actividades de validación de métodos de ensayo y calibración no
normalizados, desarrollados o diseñados por el Laboratorio, métodos normalizados
empleados fuera del alcance previsto, ampliaciones y modificaciones de los métodos
normalizados y para las verificaciones necesarias para confirmar que el laboratorio puede
aplicar correctamente los métodos normalizados antes de utilizarlos para los ensayos.

Sistematizar los procedimientos para la realización de la validación de los métodos de ensayo


y de calibración facilitando implementación de este aspecto por parte de los laboratorios así
como su evaluación por parte del personal de la ONA o sus evaluadores.

Evitar las discrepancia respecto a cuándo validar y la extensión de la validación según sea el
caso.

2. ALCANCE

Esta guía aplica a todos los laboratorios de ensayo y de calibración acreditados por ONA y a
aquellos que soliciten la acreditación, aplica, además, a los evaluadores y expertos técnicos
que actúan en los procesos de acreditación, y a todos los métodos de ensayo establecidos
dentro del alcance de acreditación.

3. TÉRMINOS / ABREVIACIONES

Adecuación al propósito: ‘Grado al cual los datos producidos por un proceso de medición
permiten a un Usuario tomar decisiones técnica y administrativamente correctas para un
Propósito establecido.’ (Guía EURACHEM)
Control de Calidad Interno: ‘Serie de procedimientos asumidos por el personal de un
laboratorio para el continuo seguimiento de las operaciones y de los resultados de las
mediciones con el fin de decidir si los resultados son lo suficientemente confiables como para
ser emitidos‘. (Guía EURACHEM)

Especificidad: Capacidad de un método analítico para obtener una respuesta debida


únicamente al analito de interés y no a otros componentes de la muestra.’(Guía de validación
de métodos analíticos, Colegio de Químicos Farmacéuticos Biólogos México, A.C.)

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Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:
Equipo Técnico de la ONA Ing. Eduardo Zamora Lic. Adela Miranda Espinoza
Consultor de la ONA Responsable de ONA
Fecha: 2012-01-09 Fecha: 2012-05-29 Fecha: 2012-11-26
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Incertidumbre de medida: Parámetro, asociado al resultado de una medición, que caracteriza


la dispersión de los valores que podrían ser razonablemente atribuidos al mesurando (VIM
3.9).
Estabilidad analítica de la muestra: Propiedad de una muestra, preparada para su análisis,
de conservar su integridad física o química y la concentración del analito, después de
almacenarse durante un tiempo determinado durante condiciones específicas. (Basado en la
Guía de Validación de Métodos analíticos del Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos,
Biólogos, México A.C. Edición 2002)
Exactitud de una medición: Es la proximidad de concordancia entre el resultado de una
medición y el valor de referencia aceptado. (Guía EURACHEM)
Intervalo: ‘Concentraciones incluidas entre la concentración superior e inferior del analito
(incluyendo estas), para las cuales se ha demostrado que el método analítico es preciso,
exacto y lineal.‘ (Guía de validación de métodos analíticos, Colegio de Químicos Farmacéuticos
Biólogos México, A.C.)
Límite de detección: ‘El menor contenido que puede medirse con una certeza estadística
razonable o ‘La menor concentración del analito en una muestra que puede detectarse, pero
no necesariamente cuantificarse bajo las condiciones establecidas de la prueba.’ (Guía
EURACHEM)

Límite de cuantificación: ‘La menor concentración de un analito que puede determinarse con
una precisión (repetibilidad) y una exactitud aceptables bajo las condiciones establecidas de
la prueba.’ (Guía EURACHEM)

Linealidad: ‘Define la habilidad del método para obtener resultados de la prueba


Proporcionales a la concentración del analito. (Guía EURACHEM)
Nota: Se deduce que el intervalo lineal es el intervalo de concentraciones del analito dentro
del cual los resultados de prueba obtenidos por el método son proporcionales a la
concentración del analito.’
Material de Referencia (MR): ‘Material o sustancia en la cual uno o más valores de sus
propiedades son suficientemente homogéneos y bien definidos como para ser utilizados en la
calibración de aparatos, en la evaluación de un método de medición o para asignar valores a
otros materiales. (Guía EURACHEM)

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Material de Referencia Certificado (MRC): ‘Material de referencia acompañado de un


certificado, en el cual uno o más valores de sus propiedades están certificados por un
procedimiento que establece trazabilidad a una realización exacta de la unidad en la cual se
expresan los valores de la propiedad y en el que cada valor certificado se acompaña de una
incertidumbre con un nivel declarado de confianza.’ (Guía EURACHEM)
Mensurando: Magnitud particular sometida a medición (VIM 2.6)

Métodos no normalizados: Se refiere a los métodos que son proporcionados por el


proveedor de un equipo y no provienen directamente de un libro oficial, por lo que no pueden
considerarse como desarrollados por el laboratorio, pero sí pueden ser validados por él.

Repetibilidad (de los resultados de las mediciones): ‘Precisión en condiciones de


repetibilidad, es decir, condiciones según las cuales los resultados independientes de una
prueba se obtienen con el mismo método, sobre objetos de prueba idénticos, en el mismo
laboratorio, por el mismo operador, usando el mismo equipo y dentro de intervalos de tiempo
cortos.’ (Guía EURACHEM).

Precisión: ‘Es la proximidad de concordancia entre los resultados de pruebas independientes


obtenidos bajo condiciones estipuladas.’ (Guía EURACHEM)

Nota 1: La precisión depende sólo de la distribución de los errores aleatorios y no se relaciona


con el valor verdadero o valor especificado. La medida de la precisión generalmente se calcula
como una desviación estándar de los resultados de la prueba. “Resultados de prueba
independientes” significa que los resultados fueron obtenidos de tal forma que no son
influenciados por cualquier otro resultado previo sobre el mismo o similar objeto de prueba.
Las mediciones cuantitativas de la precisión dependen en forma crítica de las condiciones
estipuladas. La Repetibilidad y la Reproducibilidad son series particulares de condiciones
extremas.

Precisión intermedia: ‘La precisión intermedia expresa la variación dentro de un laboratorio


en: diferentes días, diferentes analistas, diferente equipo, etc.’ (Guía EURACHEM).
Protocolo de Validación: Descripción de pruebas especificas para demostrar que un proceso
da resultados que cumplen con los criterios preestablecidos de manera consistentes Guía de
validación de métodos analíticos, Colegio de Químicos Farmacéuticos Biólogos México, A.C.)

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Prueba de Robustez: ‘Estudio dentro del laboratorio para evaluar el comportamiento de un


proceso analítico cuando se efectúan pequeños cambios en las condiciones ambientales y/o
de operación, semejantes a aquéllos que pudieran surgir en los diferentes ambientes de
prueba. La prueba de robustez permite obtener información de los efectos de cambios
menores de una forma rápida y sistemática (Guía EURACHEM).

Rango: Se define como el intervalo entre la concentración superior e inferior para las cuales
se ha demostrado la correcta precisión, exactitud y linealidad del método. (Validación de
métodos analíticos; A.E.F.I.) 2001.

Reproducibilidad: ‘Precisión bajo condiciones de reproducibilidad, es decir, condiciones


según las cuales los resultados de prueba se obtienen con el mismo método, sobre objetos de
prueba idénticos, en diferentes laboratorios, por diferentes operadores, usando diferentes
equipos. (Guía EURACHEM)
Recuperación: ‘La fracción de analito adicionada a una muestra de prueba (muestra
fortificada o adicionada) previa al análisis que es determinada efectivamente por el método;
el porcentaje de recuperación (%R) entre las muestras fortificadas y sin fortificar se calcula
como sigue:
%R = [(CF-CU)/CA] x 100

Donde CF es la concentración de analito medida en la muestra fortificada; CU es la


concentración de analito medida en la muestra sin fortificar; CA es la concentración del
analito adicionado (valor medido, no determinado por el método) en la muestra fortificada.’
(Guía EURACHEM).

NOTA 2: La recuperación también puede evaluarse comparando estadísticamente las


pendientes de las curvas de calibración obtenidas por adición de la solución patrón (AP) y la
obtenida con las soluciones del patrón puro (PP). El cálculo del porcentaje de recuperación se
realiza utilizando la siguiente fórmula (ANALISIS, Validación de Métodos Analíticos: detección
del sesgo, Vol 22, N° 5, 1994):

pendiente ( AP )
%R  100
pendiente ( PP )

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Revalidación: La revalidación de un método analítico consiste en repetir de forma total o


parcial su validación, ya sea debido a modificaciones en el método, equipos, en la muestra a
analizar, etc. para garantizar la obtención de resultados fiables. (Validación de métodos
analíticos; A.E.F.I.) 2001.
Sesgo: ‘La diferencia entre el valor esperado (x) de los resultados de prueba y un valor de

de la muestra de referencia. El sesgo se puede evaluar como porcentaje:

NOTA 3:

a) La veracidad puede calcularse como el complemento del sesgo: %V = 100 - E% (guía de


validación de la Unión Europea).

b) Si no se tiene la muestra de referencia, el sesgo puede ser el complemento de la


recuperación. Se puede calcular como porcentaje: %E = 100 - %R.

Sensibilidad: El cambio en la respuesta de un instrumento de medición dividido por el


correspondiente cambio del estímulo. (Guía EURACHEM).

Nota 4: El estímulo puede ser por ejemplo, la cantidad del mensurando presente. La
sensibilidad puede depender del valor de estímulo. Aunque esta definición se aplica
claramente a un instrumento de medición, también puede aplicarse al método analítico como
un todo, tomando en cuenta otros factores tales como el efecto de los niveles de
concentración.

Validación: Confirmación mediante el suministro de evidencia objetiva de que se han


cumplido los requisitos para una utilización o aplicación específica prevista. (ISO
9000:2008/3.8.5)
Validación de un Método:

1. El proceso de establecer las características de desempeño y limitaciones de un método y la


identificación de las influencias que pueden modificar esas características y hasta qué punto.
¿Qué analitos puede determinar el método, en qué matrices, en presencia de qué

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interferencias? ¿En esas condiciones, qué niveles de precisión y de exactitud pueden


alcanzarse?
2. El proceso de verificación de que un método es adecuado a su propósito, o sea, para
resolver un problema analítico particular. (Guía EURACHEM)
Nota 5: La definición 1. Es aplicable cuando un método se desarrolla sin tener en mente
ningún problema en particular.

La definición 2. Es aplicable cuando el método se está desarrollando con un propósito


específico. En química analítica otro uso comúnmente encontrado del término de validación
es en el contexto de instrumentación. La Validación de Instrumentos se usa para describir el
proceso de establecer que un instrumento en un momento dado es capaz de desempeñarse de
acuerdo a la especificación diseñada. Estos procesos podrán alcanzarse, por ejemplo,
mediante calibraciones o verificaciones de desempeño.

Verificación: Confirmación mediante la aportación de evidencia objetiva de que se han


cumplido los requisitos especificados. (ISO 9000:2008/3.8.4)
Valor verdadero convencional (de una magnitud): Valor atribuido a una magnitud
particular y aceptado, algunas veces por convención, por tener una incertidumbre apropiada
para un propósito dado. (Guía EURACHEM)
Nota 6: “Valor Verdadero Convencional” algunas veces es denominado “valor asignado”,
“mejor estimado” del valor, “valor convencional” o “valor de referencia”. Frecuentemente, se
utiliza un cierto número de resultados de medición de una magnitud para establecer un valor
verdadero convencional.

4. INTRODUCCIÓN

La validación ha sido objeto de atención por ser requerida en normas sobre sistemas de
gestión de la calidad, sobre software y particularmente en la norma ISO/IEC 17025 sobre
requisitos generales para laboratorios de calibración y ensayo.

La aplicabilidad del requisito sobre validación de métodos, particularmente en la norma


ISO/IEC 17025, ha sido frecuentemente materia de controversia dado que cabe la
interpretación de que cuando se menciona o se describe un método en una norma, entonces
denominado método normalizado, no es ya necesaria la validación del mismo.
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El propósito de este trabajo es discutir el concepto de validación, los elementos que lo


constituyen y los procesos para llevarla a cabo, con la esperanza de reducir las controversias
respecto a este tema.

Para que un resultado analítico concuerde con el propósito requerido, debe ser lo
suficientemente confiable para que cualquier decisión basada en éste pueda tomarse con
confianza. Así, el desempeño del método debe validarse y debe estimarse la incertidumbre del
resultado a un nivel de confianza dado. La incertidumbre deberá ser evaluada y establecida de
una forma que sea ampliamente reconocida, consistente de forma interna y fácil de
interpretar. La mayor parte de la información requerida para evaluar la incertidumbre se
puede obtener durante la validación del método.

La validación es el proceso establecido para la obtención de pruebas documentadas y


demostrativas de que un método de análisis es lo suficiente fiable y reproducible para
producir el resultado previsto dentro de intervalos o parámetros definidos y para el propósito
requerido.

Esta guía aplica a todos los laboratorios de ensayo y de calibración acreditados por ONA y a
aquellos que soliciten la acreditación, aplica, además, a los evaluadores y expertos técnicos
que actúan en los procesos de acreditación, y a todos los métodos de ensayo establecidos
dentro del alcance de acreditación.

5. REQUISITOS GENERALES

5.1. Pasos para la validación

Cada validación de un procedimiento consiste en tres pasos:

5.1.1 Establecimiento del protocolo de validación


5.1.2 Realización de la validación,
5.1.3 Elaboración del informe de validación

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5.1.1. Establecimiento del protocolo de validación

El protocolo de validación deberá contener al menos la siguiente información:

 Debe incluir una identificación única ó código


 El objetivo y alcance
 Responsables de las actividades de validación
 La definición del sistema a validar
 Procedimiento para la identificación de los parámetros a validar
 El diseño del plan experimental (incluyendo el muestreo si aplica)
 Equipos y su calificación adecuada al uso (incluye trazabilidad)
 Descripción del método
 Los criterios de aceptación.
 Debe ser específico para cada tipo de muestra y método.
 Debe ser firmado y fechado por las personas responsables de la validación y
aprobación.

A. Objetivo: Exposición de la finalidad de la validación y propuestas de fechas de inicio y


finalización de la evaluación.)

B. Alcance: Delimitación de tipo de muestra, matriz, analito, rango de concentración, técnica


analítica, etc.) Formula cuali-cuantitativa cuando aplique. Aplica en casos de análisis de
formulación conocida

C. Responsables: Personal a cargo de la validación: Analista(s), responsable(s) de la


Validación, Jefe de Laboratorio, Responsable de Calidad. Debidamente autorizado para tal
fin.

D. Procedimiento para la determinación de los parámetros a validar: Los parámetros


de desempeño a estudiar se seleccionan en función de las características de la muestra, tipo
de método analítico y rango de concentración del analito.

Se puede hacer una tabla que permita visualizar los parámetros de desempeño, como se
hará la determinación de cada parámetro de desempeño y que se reportara para la
evaluación final

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Ejemplo de algunos parámetros, algunas determinaciones y estadísticos a calcular.

PARAMETRO
DE DETERMINACION REPORTAR
DESEMPEÑO
Un analista prepara solucione de estándar al
Precisión del
100% de la concentración del analito desde una Coeficiente de
sistema
solución más concentrada y la lee o inyecta 6 variación %
instrumental
veces en forma consecutiva
Un analista debe preparar por lo menos por Coeficiente de
triplicado 5 niveles de concentración de la determinación (r2)
solución de referencia por dilución (a partir de
una solución más concentrada).La concentración Pendiente (b)
Linealidad central debe ser la concentración que representa
del sistema el 100% en la muestra procesada para su
(1) medición. El intervalo debe incluir la
especificación. Medir la respuesta analítica bajo Intervalo de confianza
las mismas condiciones de medición, reportar la de la pendiente IC (β1)
relación concentración vs respuesta analítica
(Ejemplo. 60%,80%,100, 120%,140%)
Rango lineal
Y de igual forma los otros parámetros

E) muestreo: El muestreo se realiza de acuerdo con procedimientos escritos, (si aplica) en


los cuales se indican los sistemas de identificación y tratamiento previo de las muestras, si se
precisan placebos. (en caso de análisis de formulación conocida)

F) Equipos involucrados en la validación: se mencionan los equipos implicados en el


proceso de validación (pHmetros, balanzas, cromatógrafos, etc.), y documentar que están
convenientemente calificados y adecuados a la mediciones a realizarse y calibrados,
referenciando estos datos en el informe de validación.

G) Descripción del método analítico: debe describirse el método tal cual será puesto en
el uso rutinario, detallando todos los elementos abajo mencionados, y haciendo énfasis en
puntos críticos de la metodología, condiciones instrumentales y número de repeticiones,
verificación de idoneidad de las condiciones operatorias definidas, formulas para el cálculo de
resultados y su tratamiento estadístico si es necesario, bibliografía y referencias.
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 Reactivos
 Estandares
 Materiales
 Instrumentaciòn
 Condiciones ambientales
 Medidas de seguridad para el uso de reactivos
 Preparacion de reactivos
 Preparaciòn de estandares
 Preparacion de la muestra
 Procedimiento
 Calculos

H) Criterios de aceptación: se establecerá a priori para cada uno de los parámetros,


basándose en las necesidades o finalidad del método y en la información recogida durante
la fase de desarrollo del procedimiento analítico.

Ejemplo de algunos parámetros, estadísticos a reportar y sus límites.

PARAMETRO DE
REPORTAR LIMITE
DESEMPEÑO
Coeficiente de variación
Precisión del sistema ≤ 1.5%
Coeficiente de determinación ( r 2 ) ≥ 0.98
Pendiente (β1) ≠0
No debe
Linealidad del sistema Intervalo de confianza de la pendiente IC (β1) incluir el
cero
Rango lineal --------
Y de igual forma los otros parámetros

5.1.2. Realización de la validación.

Una vez se ha aprobado el protocolo se procede a hacer la validación de acuerdo al mismo.


Aquí se incluye el proceso de cálculo estadístico de los distintos parámetros evaluados.

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5.1.3. Elaboración del informe de validación.

El informe de validación contendrá la información suficiente para poder concluir acerca de


la validación que se ha desarrollado. Debe incluir:

 Protocolo de validación (o hacer referencia al mismo a través de un código),


 Resultados Analíticos,
 Resultados Estadísticos,
 Interpretación de resultados,
 Conclusiones,
 Declaración de aptitud del Método al uso previsto y
 Cuando aplique el certificado de validación el cual podrá incluir:

- Analito evaluado
- Matriz o matrices ensayadas
- Técnica utilizada
- Documentos relacionados (protocolos, procedimientos, instrucciones de trabajo)
- Rango Validado
- Cuadro resumen con los resultados de los parámetros de desempeño evaluados.
- Analistas autorizados para la realización del ensayo.

Además será autorizado por o las personas asignadas por el laboratorio.

5.2. Establecimiento de las condiciones y alcance de la validación

5.2.1. Establecimiento de las condiciones

El laboratorio responsable del análisis o ensayo debe definir las condiciones y el alcance de la
validación de acuerdo a lo definido por esta guía y a su caso en particular.

En el caso de que el cliente lo solicite, el responsable del análisis o ensayo deberá ponerse de
acuerdo con el cliente sobre este aspecto.

5.2.2. Establecimiento del alcance de la validación

Se diferencian tres casos, en los que la dificultad de la validación aumenta del primero al
tercero:
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1. Se trata de un método de ensayo estandarizado y normalizado, que se aplica


exactamente como está descrito en la norma/procedimiento.

2. Se trata de una modificación a un método de ensayo normalizado o cuando se use un


método proporcionado por el proveedor de un equipo o sistema analítico. Ejemplos: un
método de extracción diferente u otra matriz, rangos distintos de trabajo.

3. Se trata de un método de ensayo desarrollado en el laboratorio y que no se encuentra


en normas u otras colecciones de métodos.

La validación en los casos descritos en el numeral 5.2.2 tiene objetivos distintos como lo
establece la tabla siguiente (tabla a).

Tabla a: Objetivos de la validación según el tipo de procedimiento de ensayos

Método de ensayo Objetivos de la Validación


Caso 1: método
Comprobación de que el laboratorio domina el ensayo y lo
Normalizado
utiliza correctamente (Verificación)
Comprobación de que la modificación introducida en el
método original no afecta la capacidad del laboratorio para
Caso 2: Método proporcionar resultados confiables. Ejemplos: Cambio del
normalizado modificado o método de extracción, otra matriz, cambios en el pH.
uno no normalizado Demostrar que el método proporcionado por el fabricante es
capaz de dar resultados confiables para el fin propuesto.

Caso 3: método
Comprobación de que el método cumple con las características
Desarrollado / interno.
necesarias para dar resultados confiables para el fin propuesto.

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Tabla b: Alcance de la validación según el tipo de procedimiento de ensayo

Métodos Normalizados
Identificación Cuantificación Cuantificación de Evaluación de
de componentes características
Parámetros
componentes minoritarios o establecidas*
mayoritarios impurezas en trazas
Selectividad/ Especificidad Sí + + +
Estabilidad analítica de la
+ + + +
muestra
Linealidad del Sistema No Sí Sí +
Linealidad del Método No + + +
Rango No + + +
Exactitud No Sí Sí +
Repetibilidad No Sí Sí Sí
Precisión Intermedia No Sí Sí Sí
Reproducibilidad No ++ ++ ++
Límite de Detección + No No No
Límite de Cuantificación No + + +
Robustez + + + +
+: Puede o no requerirse, dependiendo de la normativa de referencia o la naturaleza del
análisis
++: Dependerá de la disponibilidad de laboratorios.
*: En esta categoría se hace alusión a procesos previos a la cuantificación (ej: disolución,
liberación de analitos, etc) el método usado para la cuantificación (cuando aplique) se
validará de acuerdo a columnas 2 ó 3.

Métodos Normalizados Modificados o No Normalizados


Identificación Cuantificación Cuantificación de Evaluación de
de componentes características
Parámetros componentes minoritarios o establecidas*
mayoritarios impurezas en
trazas
Selectividad/ Especificidad Sí + + +
Estabilidad analítica de la
+ + + +
muestra
Linealidad del Sistema No Sí Si +
Linealidad del Método No Sí Sí +

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Rango No Sí Sí +
Exactitud No Sí Sí +
Repetibilidad No Sí Sí Sí
Precisión Intermedia No Sí Sí Sí
Reproducibilidad No ++ ++ ++
Límite de Detección + No Si No
Límite de Cuantificación No + Sí +
Robustez + + + +
+: Puede o no requerirse, dependiendo de la normativa de referencia o la naturaleza del
análisis o de las modificaciones que se le hagan al método.
++: Dependerá de la disponibilidad de laboratorios.
*: En esta categoría se hace alusión a procesos previos a la cuantificación (ej: disolución,
liberación de analitos, etc) el método usado para la cuantificación (cuando aplique) se
validará de acuerdo a columnas 2 ó 3.

Métodos Desarrollados / Internos


Identificación Cuantificación de Cuantificación de Evaluación de
componentes componentes características
Parámetros mayoritarios minoritarios o establecidas*
impurezas en
trazas
Selectividad/ Especificidad Sí Sí Sí +
Estabilidad analítica de la
Sí Sí Sí +
muestra
Linealidad del Sistema No Sí Sí +
Linealidad del Método No Sí Sí +
Rango No Sí Sí +
Exactitud No Sí Sí +
Repetibilidad No Sí Sí Sí
Precisión Intermedia No Sí Sí Sí
Reproducibilidad No ++ ++ ++
Límite de Detección Sí No + No
Límite de Cuantificación No + Sí +
Robustez + Si Sí +
+: Puede o no requerirse, dependiendo de la normativa de referencia o la naturaleza del
análisis.
++: Dependerá de la disponibilidad de laboratorios.

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*: En esta categoría se hace alusión a procesos previos a la cuantificación (ej: disolución,


liberación de analitos, etc) el método usado para la cuantificación (cuando aplique) se
validará de acuerdo a columnas 2 ó 3.

6. DOCUMENTOS DE REFERENCIA

 Vocabulario Internacional de Términos Básicos de Metrología (VIM), Segunda edición


1993.
 ISO 9000:2008 Sistema de Gestión de la Calidad – Conceptos y Vocabularios.
 Norma NSR ISO/IEC 17025:2005 (NSR 03.00.07:06) Requisitos Generales para la
Competencia de los Laboratorios de Ensayo y Calibración
 Métodos Analíticos Adecuados a su propósito 2 Edición de la Eurachem, Publicación
técnica CNM-MRD-PT-030, CENAM
 Guía para la Validación de métodos de ensayo del OAA DC-LE-05
 Validación de métodos analíticos; Asociación Española de Farmacéuticos de la Industria
A.E.F.I., Barcelona marzo del 2001.
 The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation
and Related Topics. First Edition 1998. EURACHEM.
 Guía de Validación de Métodos Analíticos. Colegio Nacional de Químicos Farmacéuticos
Biólogos. México Primera Edición mayo de 2002.

7. REGISTROS

No aplica.

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8. ANEXOS

ANEXO 1: Ejemplos para la Determinación de Parámetros de Validación para Métodos


Químicos de Análisis.

1. Selectividad/ Especificidad

Procedimiento de la evaluación de la selectividad

En el estudio de la selectividad, como norma general se comparan los resultados del análisis
de muestras con y sin analito en presencia o ausencia de impurezas, productos de
degradación, sustancias relacionadas, excipientes (matriz o placebo), y dependiendo del tipo
de muestra, tipo de técnica analítica, instrumento de medición.

Partiendo de la experiencia en el análisis de la muestra, se deben establecer las posibles


sustancias y/o elementos y adicionar cantidades conocidas de éstas, solas o combinadas a la
muestra y evaluar su respuesta al método, bajo las mismas condiciones de análisis.
Para métodos de Identificación

- Se deben seleccionar sustancias que potencialmente interfieran en la determinación


con base en la estructura molecular del analito, precursores, sustancias relacionadas,
vías degradativas, entre otros.

Para métodos de Contenido/Valoración de impurezas.

- Si se dispone de las impurezas se deben adicionar éstas al analito y/o a la muestra


analítica en niveles que incluya la especificación. Analizar como lo indica el método.

- Cuando no se dispone de las impurezas, la muestra que contiene el analito debe


someterse a condiciones que generen su inestabilidad química (luz, calor, humedad,
hidrólisis, ácido-básica y oxidación) y aplicar el método a la muestra resultante.

Para métodos de límite de impurezas

Proceder a analizar, como lo indica el método los siguientes:

- Muestras individuales de la impureza (orgánicas, inorgánicas, o solventes residuales).


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- El producto (de pureza aceptable)


- Y la mezcla de estos.

Para métodos indicadores de estabilidad

Si se cuenta con los productos de degradación, preparar muestras

- La matriz sola
- con matriz adicionada de estos
- la matriz adicionada del analito
- la matriz adicionada analito y de productos de degradación.
- Analizar como lo indica el método.

Para análisis farmacéuticos si no se tienen los posibles productos de degradación se pueden


emplear, dependiendo de la naturaleza química del analito y si es posible, las siguientes
condiciones para favorecer la inestabilidad del analito en la muestra:

Condiciones
1. En un horno desde 70ºC a 120 ºC o a 20 ºC por
debajo del punto de fusión del analito 2 a 4
semanas
2. Exponer a luz UV, fluorescente y/o humedad
relativa, por un tiempo apropiado
Analito, matriz y muestra
3. Hacer soluciones, ajustando el pH de 1 a 2 (HCl
0.1N) y/o de 10 a 12 (NaOH 0.1N) y someterlas a
60 ºC por un tiempo apropiado
4. Para muestras liquidas o semisólidas (formas
farmacéuticas) adicionar peróxido de hidrogeno
(3%) para favorecer la oxidación del analito.

Estos estudios no se deben llevar a cabo para analitos que según la bibliografía, tengan
propiedades reactivas que puedan dar lugar a condiciones inseguras al someter las muestras
a las condiciones antes mencionadas.

El tiempo y las condiciones se seleccionan con el fin de degradar al analito a niveles de un 15 a


30%.

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En el caso de métodos no selectivos, como por ejemplo los métodos que utilizan sistemas de
medición volumétricas, la especificidad para los componentes de una muestra, es sustentada
con los resultados de exactitud y linealidad del método cumplidos los criterios de aceptación.

Cuando haya duda en la demostración de la especificidad de un método analítico, se sugiere


que sea investigada por otra metodología de soporte.

Los resultados del estudio de selectividad están vinculados principalmente al origen de


la muestra, su preparación y las condiciones instrumentales. Cualquier cambio en estos
factores supone reconsiderar el estudio realizado.

Criterios de aceptación

La respuesta del método debe ser únicamente debida al analito.


2. Estabilidad analítica de la muestra

El analista debe establecer la etapa de análisis en la cual se desea evaluar la estabilidad,


además de determinar si en dicha etapa es posible fraccionar (muestras dependientes) o no
(muestras independientes) y las condiciones de almacenaje.

Muestras dependientes

 El analista debe procesar hasta la etapa preestablecida por lo menos por triplicado una
muestra homogénea.
 Fraccionar cada una de las preparaciones de acuerdo a las condiciones de almacenaje
(Ambiente, Refrigeración, t ºC , etc. durante un tiempo determinado ) de interés.
 Terminar el análisis de una de las fracciones de cada preparación.
 Proseguir el análisis de cada una de las fracciones al término de cada condición de
almacenaje, utilizando una solución de referencia recientemente preparada, si el
método contempla el uso de una solución de referencia.
 Reportar el resultado.

Muestras independientes

 A partir de una muestra homogénea, el analista debe analizar por triplicado hasta
completar el análisis y obtener el resultado.

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 Simultáneamente y de la misma muestra, procesar el número de muestras necesarias


para cada condición de almacenaje hasta la etapa preestablecida (preparaciones) por
triplicado.
 Proseguir el análisis de cada una de las preparaciones al término de cada condición de
almacenaje, utilizando una solución de referencia recientemente preparada, si el
método contempla el uso de una solución de referencia.
 Reportar el resultado

Cálculos

 Calcular la media aritmética del análisis inicial y de cada condición de almacenaje

 Calcular la diferencia absoluta de la media aritmética de cada condición de almacenaje


respecto del análisis inicial

Criterios de aceptación

 │di │≤ 2% para métodos cromatograficos y volumétricos

 │di │≤ 3% para métodos químicos o espectrofotometricos

 │di │≤ 5% para métodos biológicos

 No mayor a una magnitud preestablecida, acorde a la especificación del analito en la


muestra.

 Otros criterio de aceptación, deben ser justificado.

3. Linealidad del Sistema

 Un analista debe preparar por lo menos por triplicado 5 niveles de concentración


(Intervalo o rango) de la solución de referencia ya sea por dilución (a partir de una
misma solución concentrada o por pesadas independientes (cuando no sea posible
prepararlas por dilución).
 La concentración central debe ser igual a la que se prepara la solución de referencia en
el método.

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 El intervalo debe incluir la especificación para el caso de aquellos métodos utilizados


para evaluar muestras que se conoce el contenido estimado de activo (ejemplo formas
farmacéuticas, Principios activos)
 Medir la respuesta analítica bajo las mismas condiciones de medición, reportar la
relación concentración vs. respuesta analítica (Ejemplo: Concentración vs. Área,
Concentración vs. Absorbancia).
 Calcular el valor de la pendiente (b), la ordenada en el origen (a), el coeficiente de
determinación ( r2 )y el intervalo de confianza para la pendiente ( IC(b)). Si el método
presenta un ajuste distinto a la línea recta, utilizar la estadística apropiada y
justificarla.

El intervalo (rango) está en función del propósito del método, y por lo general se expresa
como concentración. Es crítico que el intervalo no excluya valores de concentración que
potencialmente puedan dar lugar al contenido del analito en la muestra.

En análisis farmacéutico:

 Para Contenido/valoración/Potencia , sugiere un mínimo de ± 20%


 Para Contenido / Valoración de impurezas desde un nivel apropiado hasta un “20%
por arriba de la especificación.
 Para métodos indicadores de estabilidad desde un nivel apropiado hasta un 120%.

Criterios de aceptación

 r2 ≥ 0.98
 IC (β1), no debe incluir el cero
 Otros criterios de aceptación debe ser justificado.

4. Linealidad del método y Rango

Se conocen los componentes de la muestra y es posible preparar una matriz.

 Un analista debe preparar una matriz con el tipo de componentes que generalmente
están presentes en la muestra.

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 A la cantidad de matriz analítico equivalente a una muestra analítica por triplicado,


adicionarle la cantidad de analito (puede ser una sustancia de referencia secundaria)
correspondiente al 100% de este en la muestra.
 Seleccionar al menos dos niveles, superior e inferior de la cantidad del analito
(intervalo) y preparar el matriz adicionado al menos por triplicado a cada nivel,
manteniendo constante la cantidad de matriz analítico en los tres niveles.
 Los matriz adicionados deben ser analizados por un mismo analista bajo las mismas
condiciones, utilizando como referencia, la sustancia empleada en la adición al matriz
analítico.
 Como lo indica el método, preparar 3 soluciones estándar al 100% de la concentración
teórica.
 Realizar una determinación de cada matriz adicionado, de acuerdo a la siguiente
secuencia:

 Estándar
 Matriz adicionado nivel inferior
 Matriz adicionado 100%
 Matriz adicionado nivel superior
 Hasta terminar los 3 bloques

 Hacer cálculos, como lo indica el método para cada bloque de muestras con referencia
a su estándar respectivo.
 Determinar la cantidad recuperada del analito.

No se conocen los componentes de la muestra

 Un analista debe analizar la muestra con el método, para determinar el contenido del
analito.
 El mismo analista debe preparar por lo menos 3 muestras adicionadas, por ejemplo
utilizando la mitad de la muestra analítica que originalmente requiere el método y
adicionar el analito (puede ser una sustancia de referencia secundaria) hasta
completar lo que represente el 100% de éste en la muestra.
 Seleccionar al menos dos niveles, superior e inferior de la cantidad del analito
(intervalo) y preparar la muestra adicionada al menos por triplicado a cada nivel,
manteniendo constante la cantidad de muestra en los tres niveles.

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 Las muestras adicionadas deben ser analizadas por un mismo analista bajo las mismas
condiciones utilizando como referencia la sustancia empleada en la adición de la
muestra.
 Realizar una determinación de cada preparación de muestra, de acuerdo a la
siguiente secuencia :

 Estándar
 Muestra adicionada nivel inferior
 Muestra adicionada 100%
 Muestra adicionada nivel superior
 Hasta terminar los 3 bloques

 Hacer cálculos, como lo indica el método para cada bloque de muestras con referencia
a su estándar respectivo.
 Determinar la cantidad recuperada del analito.

Cuando no sea posible adicionar de manera directa el analito a la muestra, la adición pude ser
llevada a cabo en alguna etapa del método. Se recomienda que la adición se lleve a cabo en las
primeras etapas del método, para poder asegurar que las etapas posteriores, no den lugar a
resultados incorrectos.

Por ejemplo, si una muestra se debe extraer, filtrar y diluir, es conveniente que la adición se
lleve a cabo antes de extraer; ya que si existiera algún problema con la extracción o con la
filtración, puede dar lugar a resultados incorrectos si el analito se adiciona a la muestra o
matriz analítico hasta antes de diluir.

El intervalo (rango) de la concentración del analito adicionado, depende del propósito del
método y debe incluir la especificación, los limites según una normativa en particular.

En análisis farmacéutico según la guía ICH Q2A se recomienda los rangos según el
propósito de método cuantitativo.

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Propósito del Rango recomendado para


Especificación
método estudiar la linealidad
Valoración del En especialidades farmacéuticas de 80 -120%
contenido de 90 – 110% a caducidad respecto al
principio valor nominal
activo En materia prima 98 – 102% o 99 –
101%
Uniformidad 85 -115% 70 -130% (*)
de contenido
Disolución de Siendo Q la especificación ± 20% respecto a la especificación
principio establecida .(según USP) Rango= (Q+20%, Q-20%)
activo
Cuantificación Depende de cada impureza Desde el límite de cuantificación o
de Impurezas desde el 50% de la especificación
limite de cada impureza hasta un
120% de dicha especificación
(*) En el caso de que el procedimiento analítico para el análisis del contenido y el de uniformidad
coincidan, puede aprovecharse el mismo rango y evaluar la linealidad una sola vez entre el 70 –
130%
Reportar la relación cantidad adicionada vs cantidad recuperada o señal obtenida

Utilizando el método de estimación por mínimos cuadrados, calcular el valor de la pendiente


( b ), la ordenada en el origen ( a ), el coeficiente de determinación ( r2 ), el intervalo de
confianza para la pendiente ( IC(b)), el intervalo de confianza para la ordenada al origen (
IC(a)), y el coeficiente de variación de regresión (CV y/x ).

Calcular
Promedio aritmético, la desviación estándar (S), el coeficiente de variación (CV) y el intervalo
de confianza para la media poblacional IC ( μ ) del porcentaje de recobro (recuperación)

Criterios de aceptación
Cantidad adicionada vs cantidad recuperada

r2 ≥ 0.995 (El criterio de aceptación definido por el laboratorio dependerá del tipo de análisis
y del nivel de concentración del analito en la matriz.)
IC (b), debe incluir la unidad

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IC (a), debe incluir el cero


El (CVy/x) coeficiente de variación de regresión (del porcentaje de recobro) no > 2% si el
método es volumétrico o cromatográfico, no > 5% si el método es químico o
espectrofotométrico

Criterios de aceptación

Cantidad adicionada vs. señal obtenida

r2 ≥ 0.995 (El criterio de aceptación definido por el laboratorio dependerá del tipo de análisis
y del nivel de concentración del analito en la matriz.)
IC (b), no debe incluir el cero

El (CVy/x) coeficiente de variación de regresión (del porcentaje de recobro) no > 2% si el


método es volumétrico o cromatográfico, no > 5% si el método es químico o
espectrofotométrico

CRITERIOS DE DECISIÓN SOBRE LA LINEALIDAD:

 treg >> ttab. Correlación significativa.


 tint < t tab. Intercepto significativamente diferente de cero.
 tpend > ttab. Pendiente significativamente diferente de cero.

CÁLCULOS ESTADÍSTICOS INVOLUCRADOS EN LA EVALUACIÓN DE LA LINEALIDAD

ENSAYO DE HIPÓTESIS PARA LA CORRELACIÓN

Suposiciones: Ausencia de dependencia lineal entre las variaciones de la señal analítica y la


concentración del analito.

Hipótesis Nula: H0: r = 0

Alternativa: H1, dos colas: r  0.

Una cola: r < 0 y r > 0.

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r (n  2)
ESTADÍSTICO DE PRUEBA: t 
1 r2

CRITERIOS DE DECISIÓN:

 Si tcalculado > tCrítico: La correlación entre la variación de la señal analítica y la variación de la


concentración es significativa.

 Si tcalculado < tCrítico: La correlación entre la variación de la señal analítica y la variación de la


concentración no es significativa.

CONCLUSIONES:

 Si la correlación entre la variación de la señal analítica y la variación de la concentración es


significativa: La linealidad es adecuada.

 Si la correlación entre la variación de la señal analítica y la variación de la concentración es


significativa: La linealidad no es adecuada

ENSAYO DE HIPÓTESIS PARA LA PENDIENTE (b).

Suposiciones: Ausencia de linealidad.

Hipótesis Nula: H0: b = 0

Alternativa: H1, dos colas: b  0.


b
ESTADÍSTICO DE PRUEBA: tcalculado 
Sb

CRITERIOS DE DECISIÓN:

 Si tcalculado > tCrítico: La pendiente se diferencia significativamente de cero.

 Si tcalculado < tCrítico: La pendiente no se diferencia significativamente cero.


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CONCLUSIONES:

 Si La pendiente se diferencia significativamente: La pendiente y la linealidad son


adecuadas.

 Si La pendiente no se diferencia significativamente: La pendiente y la linealidad no son


adecuadas.

ENSAYO DE HIPÓTESIS PARA EL INTERCEPTO

Suposiciones: El valor numérico del intercepto (a) no se diferencia significativamente de cero.

Hipótesis Nula: H0: a = 0

Alternativa: H1, Dos colas: s  0.

a
ESTADÍSTICO DE PRUEBA: tcalculado 
Sa

CRITERIOS DE DECISIÓN:

 Si tcalculado < tCrítico: El intercepto no se diferencia significativamente de cero.

 Si tcalculado > tCrítico: El intecepto se diferencia significativamente cero.

CONCLUSIONES:

 Si el intercepto no se diferencia significativamente de cero: El efecto de fondo de los


reactivos sobre la señal analítica no es significativo y la linealidad es válida.

 Si el intercepto se diferencia significativamente de cero: El efecto de fondo de los


reactivos sobre la señal analítica es significativo y la linealidad no es válida.

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Porcentaje de recobro. De acuerdo al anexo 2.

5. Intervalo o Rango

Para cualquier método cuantitativo es necesario determinar el intervalo de concentraciones


del analito o los valores de la propiedad relacionada, sobre los cuales el método puede
aplicarse. En el extremo inferior del intervalo de concentración los factores limitantes son los
valores del límite de detección y/o de cuantificación. En el extremo superior del intervalo de
concentración las limitaciones serán impuestas por varios efectos que dependen del sistema
de respuesta del instrumento. (perdida de linealidad)

Análisis Tratamiento de datos Comentarios


Fortificar alícuotas de un A partir de los resultados El límite de cuantificación
blanco de muestra a varias calcular el límite de forma efectivamente el
concentraciones del analito cuantificación extremo inferior del rango ó
cercanas al límite de intervalo de trabajo.
detección.
Es aconsejable investigar la varianza a lo largo del intervalo de trabajo. La relación entre la
respuesta del instrumento con la concentración no tiene que ser perfectamente lineal para
que un método sea efectivo, pero la curva debe ser repetible día con día. Observe que los
intervalos de trabajo pueden ser diferentes para distintas matrices de acuerdo al efecto de las
interferencias que produce la matriz.(7)

6. Exactitud :

6.1 Veracidad

La evaluación práctica de la veracidad se fundamenta en la comparación de la media de los


resultados de un método con relación a valores conocidos, es decir, la veracidad se determina
contra un valor de referencia.

Se dispone de dos técnicas básicas:

- Verificación con respecto a los valores de referencia de un material caracterizado y


- Comparación con otro método caracterizado.

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Para verificar la veracidad utilizando un material de referencia, se determina la media y la


desviación estándar de una serie de réplicas de una prueba y se compara contra el valor
caracterizado del material de referencia. Es recomendable que el material de referencia sea
un material certificado de matriz natural, muy semejante a la muestra de interés. Claramente
la disponibilidad de éstos materiales es limitada. Los materiales de referencia para una
validación pueden ser:

a) Preparados por adición de materiales típicos con materiales de referencia con pureza
certificada u otros materiales de pureza y estabilidad adecuada.

b) Materiales típicos bien caracterizados, de estabilidad verificada internamente y


conservados para control de calidad interno.

Análisis Tratamiento de datos Comentarios


Efectuar 10 réplicas del Comparar con un contraste Contraste “t” de un valor
material de referencia estadístico adecuado el valor conocido contra una media
usando el método a medio con el valor del material poblacional
validar. de referencia utilizado.
Efectuar 10 réplicas del Comparar con un contraste Contraste “t” de
material de referencia estadístico adecuado los valores Comparación de dos medias
usando el método a medios del material de
validar y un método referencia obtenido por ambos
oficial o validado. métodos
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CRITERIO DE DECISIÓN PARA LA EXACTITUD: Si texp < ttab, el método analítico desarrollado
tiene la exactitud requerida, y ambos valores no son estadísticamente diferentes. Mientras
que, si texp > ttab significa que el método analítico no es exacto y que existe un error sistemático
por defecto o por exceso que en valor absoluto es |µ-xmed|, donde µ representa el valor
verdadero o esperado de concentración del analito.

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Política Para la Validación de Métodos de Laboratorios


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6.2 Porcentaje de Recobro

Debe evaluarse en al menos tres réplicas de tres niveles de concentración, incluidos en el


rango de trabajo del método. (Ver linealidad del método)

7. Precisión.

La precisión es medida mediante la repetibilidad, reproducibilidad y precisión intermedia.

REPETIBILIDAD: Estudia la variabilidad del método efectuando una serie de análisis sobre la
misma muestra en las mismas condiciones operativas (un mismo analista, mismos aparatos y
reactivos, etc.) en un mismo laboratorio y en un tiempo de tiempo corto.

PRECISION INTERMEDIA: Estudia la variabilidad del método efectuando una serie de análisis
sobre la misma muestra, pero en condiciones operativas diferentes (diferentes analistas,
aparatos, días, etc.) y en un mismo laboratorio.

CRITERIO DE DECISIÓN PARA LA PRECISIÓN: El coeficiente de Variación de los resultados,


tanto para los datos correspondientes a la Repetibilidad como para la precisión Intermedia no
debe ser mayor de 5%. Al aplicar el análisis de Varianza en la Evaluación de la Repetibilidad
interdía se aplicó el criterio de Fisher, en cuyo caso el valor experimental de F debe ser menor
que el valor crítico.
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CÁLCULOS ESTADÍSTICOS INVOLUCRADOS EN LA EVALUACIÓN DE LA PRECISIÓN

Desviación estándar muestral

S
 ( Xi  X) 2

N1

Desviación estándar poblacional


 ( Xi  X) 2

Desviación estándar relativa


S  S 
RSD  RSD  CV ,%  *100 CV ,%  *100
X media  X media 

COMPARACIÓN DE LAS VARIANZAS DE DOS CONJUNTOS DE RESULTADOS (APLICACIÓN


DE LA PRUEBA DE FISHER)

Suposiciones: Dos muestras independientes (1 y 2) de Distribución Aproximadamente


Normal.

Hipótesis Nula: H0: V1 = V2

Alternativa: H1, Dos colas: V1  V2.

Una cola: V1 < V2 y V1 > V2

ESTADÍSTICO DE PRUEBA: F = S12/S22

CRITERIOS DE DECISIÓN:

 Si Fcalculado < FCrítico: Varianzas no se diferencian significativamente.


 Si Fcalculado > FCrítico: Varianzas se diferencian significativamente.
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CONCLUSIONES:

 Si las varianzas no se diferencian significativamente, los dos conjuntos de resultados


presentan repetibilidades similares y se pueden unir en un solo conjunto.

 Si las varianzas no se diferencian significativamente, los dos conjuntos de resultados


presentan repetibilidades diferentes y no se pueden unir en un solo conjunto.

CÁLCULOS ESTADÍSTICOS INVOLUCRADOS EN LA EVALUACIÓN DE LA PRECISIÓN


INTERMEDIA (REPRODUCIBILIDAD)

1. Se lleva a cabo preliminarmente la comparación de las varianzas mediante la prueba de


Fisher abordada en la sección anterior.

2. Seguidamente se implementa un ensayo de hipótesis de t de Student conforme al


siguiente modelo:

Suposiciones: Dos muestras independientes (1 y 2) con Distribución Aproximadamente


Normal.

Hipótesis Nula: H0: X1 = X2

Hipótesis Alternativa: H1, dos colas: X1  X2


Hipótesis Alternativa: H1, una cola: X1 < X2 y X1 > X2

ESTADÍSTICO DE PRUEBA:

A. Si las varianzas no se diferencian significativamente:

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Si las varianzas se diferencian significativamente:

CRITERIOS DE DECISIÓN:

 Si tcalculado < tCrítico: Las medias de los dos conjuntos de resultados no se diferencian
significativamente.

 Si tcalculado > tCrítico: Las medias de los dos conjuntos de resultados se diferencian
significativamente.

CONCLUSIONES:

 Si las medias no se diferencian significativamente, no hay probabilidades de presencia de


error sistemático.

 Si las medias no se diferencian significativamente, hay probabilidades de presencia de


error sistemático.

RECOMENDACIONES:

 Tener en cuenta los “nuevos” grados de libertad (df), para el caso cuando las varianzas de
los dos conjuntos de resultados se diferencian significativamente.
 H1: X1  X2 (test dos colas) -tα/2, df < t < tα/2, df H0 aceptada
 H1: X1 < X2 (test una cola) t > -tα, df H0 aceptada
 H1: X1 > X2 (test una cola) t < tα, df H0 aceptada

REPRODUCIBILIDAD: Estudia la variabilidad método bajo condiciones operativas diferentes y


en distintos laboratorios.

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Análisis Tratamiento de datos Comentarios


10 réplicas de un material Determinar la desviación Determina la
de referencia utilizando estándar de los resultados repetibilidad.
mismo analista, equipo y
laboratorio, en un período
de tiempo corto.
10 réplicas de un material Determinar la desviación Determina la precisión
de referencia, utilizando estándar de los resultados intermedia
diferente analista, equipo,
y mismo laboratorio y
período.
10 réplicas de un material Determinar la desviación Determina la
de referencia utilizando estándar de los resultados reproducibilidad
diferentes analistas,
equipos y laboratorio en
período de tiempo
prolongado.
The Fitness for Purpose of Analytical Methods. A Laboratory Guide to Method Validation and
Related Topics. First Edition 1998. EURACHEM

Nota: ver en esta misma guía: cálculos estadísticos involucrados en la evaluación de la


precisión intermedia (reproducibilidad)

8. Límite de Detección y Límite de Cuantificación.

Estos parámetros se relacionan con la cantidad de analito requerida para dar un


resultado significativo, cualitativo o cuantitativo.

Según un resultado "positivo" no es suficiente para que el analista considere detectado un


analito. Se precisa además, conocer el límite de detección en las condiciones del método;
de lo contrario se puede incurrir en un falso positivo: suponer el analito presente en la
muestra cuando de hecho no lo está.

El límite de Cuantificación es un término cuantitativo (menor cantidad medible) mientras


que el límite de detección es cualitativo (menor cantidad detectable).

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Numéricamente es mayor el límite de Cuantificación y representa la menor cantidad de


analito que puede analizarse con un % de Coeficiente de Variación y de Recuperación
aceptables. Concentraciones menores pueden detectarse pero no cuantificarse.

Si las concentraciones a determinar son elevadas, se puede sustituir su estudio por la


determinación de la precisión y la exactitud a la concentración más baja que presente el
analito en la práctica.

DETERMINACIÓN DE LOS LÍMITES DE DETECCION Y CUANTIFICACION.

a- Relación señal-ruido. (aplica a métodos instrumentales)

Se compara la respuesta del blanco de la muestra (matriz de la muestra conteniendo todos


los excipientes excepto el analito a estudiar) con la respuesta de muestras preparadas por la
adición de pequeñas cantidades de analito al blanco.
Se obtiene, primero el nivel medio de ruido del blanco y se multiplica por 2 ó 3 para el límite
de detección y por 6 ó 10 para el límite de cuantificación. Estos valores se comparan
con las respuestas de la serie de blancos con analito, hallándose finalmente la concentración
de analito que corresponde al valor de la señal.

b- Estudio de la menor cantidad detectable.

El límite de detección se determina mediante el análisis de muestras con cantidades o


concentraciones conocidas de analito y estableciendo el nivel mínimo en el que este puede
detectarse fiablemente.

Este se emplea en cromatografía en capa fina para hallar el límite de detección de las
impurezas y/o productos de degradación en una materia prima.

Primero se determina experimentalmente la máxima cantidad de materia prima (carga


máxima) que se separa correctamente en las condiciones cromatográficas establecidas (sin
colas, ni distorsión en la mancha). Después se halla experimentalmente la menor cantidad
de impureza o producto de degradación que puede detectarse fiablemente sin
interferencia de la mancha principal.

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Para ello, se preparan una serie de soluciones conteniendo una cantidad constante de
materia prima, del orden de la carga máxima y cantidades decrecientes del analito que se
desea estudiar.

El límite de detección se calculará a partir de la dilución en que no se pueda distinguir la


respuesta del analito de la del blanco.

El resultado se expresa en valor absoluto o bien en forma de porcentaje respecto a la carga


máxima de materia prima. Este último es el utilizado habitualmente por las farmacopeas
en los ensayos de pureza por cromatografía en capa fina.

c- Estimación del límite de detección mediante el valor de la ordenada en el origen


expresada en unidades de concentración.

Si la recta del ensayo de linealidad ( y = bx + a ) se ha confeccionado con un rango de


concentraciones bajo, se admite utilizar el término independiente "a", para estimar,
aproximadamente el límite de detección. El límite inferior de la respuesta se toma como 3 a
y el límite de detección expresado en las mismas unidades que las abscisas en la recta de
calibración es 3a b.

d- Análisis repetido del blanco de la muestra.

Se analizan una serie de blancos de la muestra (n ≥ 10) y se calcula la media y blanco y la


desviación estándar Sblanco de las respuestas obtenidas. A partir de estos valores
existen diferentes expresiones en las que interviene la sensibilidad (pendiente de la recta de
calibración) y que da una estimación de los límites de detección y cuantificación
expresados en unidades de concentración.

Las fórmulas a utilizar varían en función de:

- el procedimiento (métodos con corrección de lecturas frente al blanco o métodos sin


corrección).
- el grado de ajuste de la recta de calibración (si el ajuste es defectuoso intervienen las
desviaciones estándares de la pendiente (Sb) y del término independiente (Sa).
- del número de réplicas que se efectúan al analizar la muestra problema (medición única o n
mediciones).

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d.1- Con corrección de la lectura frente al blanco (caso de muchos procedimientos


espectroscópicos por ej. UV-VIS, espectrofluorimetría, etc., en los que la lectura problema se
obtiene por comparación con un blanco.

K  S blanco
CL  b
(A)

Donde: CL= límite de detección o cuantificación.


K = constante K = 3 para límite de detección.
K = 10 para límite de cuantificación.
Sblanco = Desviación estándar de la respuesta de los n blancos.
b = Pendiente de la recta de calibración.

d.2- No existe corrección de la lectura frente al blanco (caso de los procedimientos


cromatográficos, CG y HPLC).
y  K S blanco
C L
 blanco
(B)
b
CL, K, S blanco, b igual a la ecuación (A)
Y blanco = media de la respuesta de los n blancos.

d.3- Las fórmulas anteriores sólo son válidas si la mayor fuente de error es la desviación
estándar del blanco o sea cuando se cumple que S blanco >> Sa y Sb. Estos dos últimos
evaluados en apego al método de mínimos cuadrados

Cuando los test de linealidad y proporcionalidad de la recta de calibración revelan falta de


ajuste hay que sustituir la desviación estándar del blanco Sblanco en las fórmulas (A) y (B)
por:
2
( Sblanco  S2
a  a 2  2 )1/2 (C)
b Sb  
Esta expresión tiene en cuenta los errores por falta de linealidad y la existencia de sesgo.

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Cuando el ajuste de la recta es muy defectuoso, la estimación obtenida por (C) será poco
fiable; y al no presentar ninguna ventaja, es preferible en este caso determinar los límites
de detección y/o cuantificación por un método que suponga menos trabajo experimental
(relación señal-ruido).

Si en el método analítico se efectúa la medición final por duplicado o triplicado, disminuye


la incertidumbre de la medición y mejora la precisión.
1
Por este motivo, el límite de detección es menor y se introduce el factor
n
(n = número de mediciones) en las ecuaciones (A) y (B).

K  Sblanco 1
CL  b
x
n
(D)

yblanco  K  Sblanco 1
CL  b
x
n
(E)

e- Determinación por extrapolación a concentraciones cero de muestras conteniendo


bajas concentraciones de analito.

Los límites de detección y cuantificación pueden estimarse también por extrapolación a


partir del análisis de muestras conteniendo concentraciones bajas:

Partiendo de la respuesta de cada concentración, se extrapolará gráfica o matemáticamente la


respuesta para concentración cero, la cual se tomará como estimación de la respuesta de
un blanco hipotético ( y blanco ).

Se determinará la desviación estándar de la respuesta a concentración cero por la


extrapolación gráfica o bien por cálculo matemático, la cual se tomará como estimación de
la desviación estándar de la respuesta de un blanco hipotético. (S blanco). Conociendo y blanco y
S blanco se aplicarán las mismas fórmulas descritas anteriormente.

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Los límites de detección y/o cuantificación obtenidos por cálculos en los literales c, d y
e han de comprobarse posteriormente, mediante el análisis de muestras conteniendo el
analito en concentración igual o próxima a los límites estimados, los resultados de Porcentaje
de Coeficiente de Variación y porcentaje de recuperación deberán ser coherentes con el tipo
de análisis que se realiza y del nivel de concentración del analito en la matriz.

ANEXO 2: Criterios de precisión y exactitud en función de la concentración de analito

Concentración de analito vs precisión.


Proporción de
Analito % Unidades CV%
Analito
100 1 100% 1.3
10 10-1 10% 2.8
1 10-2 1% 2.7
0.1 10-3 0.1% 3.7
0.01 10-4 100 mg/L 5.3

0.001 10-5 10 mg/L 7.3

0.0001 10-6 1 mg/L 11

0.00001 10-7 100 µg/L 15

0.000001 10-8 10 µg/L 21

0.0000001 10-9 1 µg/L 30

(AOAC Peer-Verified Methods Program, Manual on policies and procedures, Arlington, Va., USA
(1998).

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% de recuperación de Analito a distintas concentraciones


Ingrediente Proporción Recuperación
Unidades
Activo (%) de Analito Promedio (%)
100 1 100% 98-102
10 10-1 10% 98-102
1 10-2 1% 97-103
0.1 10-3 0.1% 95-105
0.01 10-4 100 mg/L 90-107
0.001 10-5 10 mg/L 80-110
0.0001 10-6 1 mg/L 80-110
0.00001 10-7 100 µg/L 80-110
0.000001 10-8 10 µg/L 60-115
0.0000001 10-9 1 µg/L 40-120
(AOAC Peer-Verified Methods Program, Manual on policies and procedures, Arlington, Va., USA
(1998).

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ANEXO 3: Formulas y Pruebas Estadísticas



- Media de los resultados. ( X )
 x
X  i
n

- Desviación estándar de los resultados ( S )


S
 ( Xi  X )2
n 1

- Coeficiente de variación.
S
Cv   100

X
Prueba de Fischer.- Se utiliza para determinar si existe diferencia significativa entre los
resultados de los analistas que emplearon el mismo método.

Se determina como sigue:

S1 - Desviación estándar de la condición 1.


S2 - Desviación estándar de la condición 2.

Se calcula:

2
S de forma tal que F  1
F  12
S2
El valor critico (F tabulado) debe consultarse en las tablas estadísticas. Para emplear estas
tablas debe hallarse primero el número de grados de libertad, el cual es igual a n-1, donde n
es el número de muestras para un analista individual. Si Fexp < Ftab (F n 1-1/n 2-1, P = 0.05)
no existe diferencia significativa entre la precisión alcanzada por los analistas.

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Prueba de significación de t (student): para determinar si existe diferencias


significativas entre las medias obtenidas por las 2 condiciones.

Condición 1 Condición 2
Media  
X 1 X 2
Desviación estándar S 1 S 2
Número de muestras N1 N 2

 
( X 1  X 2)
t
1 1
S 
N1 N 2

2 2
2  ( N 1  1)  S1  ( N 2  1)  S 2
S ( N 1  N 2)  2

Si texp < ttab (P = 0.05, GL = N1 + N2 -2 ) no existe diferencia significativa entre las medias
obtenidas por las dos condiciones.

Límites de confianza (95%).-Este estadígrafo determina el rango en el cual el resultado


verdadero estará en el 95% de los casos y se calcula según:

S
t
n
Notación.

X= media de los juegos de resultados del estudio de reproducibilidad.


t = t de Student.
S = Desviación estándar del conjunto de valores.
n = número de muestras (el total de los análisis).

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S
Limite de confianza para el 95 %= X t
n
Las fórmulas anteriores se pueden utilizar también con porcentajes de recuperación, basta
sustituir el valor medio por el porcentaje de recuperación R, el valor verdadero m por 100 y
la desviación estándar S por el coeficiente de variación Cv.

100  R n
t exp 
Cv
Para determinar si el factor concentración tiene alguna influencia en los resultados se utiliza
un test de igualdad de varianzas de los grupos muéstrales del mismo tamaño.
En este ejemplo, se utiliza el test G de Cochran:
2
S
Gexp  2 max 2 2
S1  S 2  S 3
Gtab = ( P = 0.05, K = 3, n=3 )

Si Gexp < Gtab las varianzas de las tres concentraciones son equivalentes, o lo que es lo
mismo que el factor concentración no influye en la variabilidad de los resultados. En este caso
se calcula la recuperación media y el coeficiente de variación.

Tabla Diseño experimental para el estudio de la linealidad de un método analítico.

x (ug) Y xy x2 y2
x1 y1 x1y1 x12 y12
x1 y1 x1y1 x12 y12
x1 y1 x1y1 x12 y12
x2 y2 x2y2 x22 y22
x2 y2 x2y2 x22 y22
x2 y2 x2y2 x22 y22

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x3 y3 x3y3 x32 y32


x3 y3 x3y3 x32 y32
x3 y3 x3y3 x32 y32
x4 y4 x4y4 x42 y42
x4 y4 x4y4 x42 y42
x4 y4 x4y4 x42 y42
x y xy x2 y2
 
x y

Cálculo de b:

x y 
 xy 
b n
2  x 
2
x 
n
Cálculo de a:
a
 y  b x
n

Ecuación: y = bx + a

Coeficiente de correlación r.

El coeficiente de correlación refleja el grado de relación o ligazón entre las variables x


(concentración), y (respuesta). Su valor máximo es 1.

Si r es cercano a la unidad, significa que existe correlación con una probabilidad elevada.

(Existen tablas de r que dan el grado de significación del valor obtenido para el coeficiente de
correlación).

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Fórmula para hallar r.


 x y
 xy 
r n
 2 ( x) 2 

2
 x    y  ( y)
2

 n  n 
  

El cuadrado del coeficiente de correlación se denomina coeficiente de determinación e


indica la proporción de la varianza total de y, que es explicada por el modelo lineal de
regresión.

Cálculo de los factores de respuesta.

x (ug) y f (y/x)
x1 y1 f1
x1 y1 f1
x1 y1 f1
x2 y2 f2
x2 y2 f2
x2 y2 f2
x3 y3 f3
x3 y3 f3
x3 y3 f3
x4 y4 f4
x4 y4 f4
x4 y4 f4

 
Media de f:   f
f n
 

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de Ensayos y Calibración.
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( f i  f ) 2
Desviación Estándar de f: Sf 
n 1

Sf  100
Coeficiente de variación de f:

f
Significación estadística de la varianza de la pendiente b (de la recta de regresión).

La pendiente b se llama también coeficiente de regresión: a mayor pendiente, mayor


sensibilidad (respuesta del método frente a los cambios de concentración del analito).

La varianza de la pendiente Sb2 se utiliza como expresión matemática de la linealidad: a


menor varianza mejor linealidad. Se determina según:

2
2 S y ,x
Sb 
2    x
2
x n

Donde S2y, x = varianza del error experimental total.


= varianza residual.
= varianza de regresión de y sobre x.

El valor de S2y, x se obtiene según:

2
2 y  a  y  b xy
S y, x  n2

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Para expresar la linealidad también se utiliza la desviación estándar o error estándar de la


pendiente Sb y la desviación estándar relativa Sb rel (%) cuyas fórmulas son:

2
Sb  Sb
Sb  100
Sb rel (%)  b

- Los límites de confianza de la pendiente se hallan a partir de la expresión: b  t∙Sb donde t


es el valor de la distribución de Student para n-2 grados de libertad a la probabilidad escogida
(generalmente P = 0.05).

-Otro test estadístico de b se deduce de la expresión:

b
t exp 
Sb
En la tabla de t se halla el grado de significación para n-2 grados de libertad.

Hipótesis nula: b = 0.

Test de proporcionalidad.

El valor de a, intercepción con el eje de ordenadas u ordenada en el origen, indica el error


sistemático del método. En el caso ideal debe ser cero.
La varianza del término independiente se deduce de las fórmulas:

2
2 2  x2  S y ,x  x
2
Sa  Sb  
2   
n 2 n
x
x n

Siendo S2y, x la varianza del error experimental total.

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- La desviación o error estándar del término independiente es:

 2
Sa Sa
- La desviación estándar relativa del término independiente es:

S a  100
S a rel (%)  a

A.- Los límites de confianza del término independiente son:

a  t Sa

siendo t el valor de la distribución de Student para n - 2 grados de libertad a la


probabilidad escogida (generalmente P = 0.05).

Si estos límites incluyen el cero se cumple la condición de proporcionalidad.

B.- La significación estadística de a se puede establecer utilizando la expresión:

a
t exp 
Sa
En la tabla de t se halla el grado de significación para n - 2 grados de libertad.

Hipótesis nula a = 0

Límites de confianza de un valor de y en la recta de regresión para un valor determinado de


x ( x = xo ).
Para un valor dado de x = xo se obtiene (aplicando la fórmula de la recta de regresión el valor
y. Los límites de confianza se obtienen aplicando uno las siguientes fórmulas:

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2
  
Límites de tolerancia = 1  xo x
b x o  a  t S y ,x 1 
 2
n  
  x  x
 

2
   
Límite de confianza = 1  x o x
b xo  a  t S y, x 
 2
n  
  x  x
 

En ambos casos se halla t para n-2 grados de libertad y al nivel de probabilidad escogido,
generalmente P = 0.05.

Los límites de tolerancia son los límites de confianza de los valores individuales de y en la
recta de regresión.

Los límites de confianza son los límites de confianza de los valores medios de y en la recta
de regresión.

Dando a x diferentes valores xo , x1 , x2 , se obtienen los correspondientes límites de


tolerancia o confianza para los respectivos valores de y en la recta de regresión.

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BIBLIOGRAFIA DE ANEXOS.

1. Comité de expertos de la OMS en especificaciones para las preparaciones


farmacéuticas. 32 Informe, OMS, Serie de Informes Técnicos 823, Pág. 121-125;
1992.

2. NC: 92-21:79. Procedimientos para evaluar la normalidad de los resultados de las


observaciones.

3. NC: 92-16:89. Técnica de estimación y dócimas relativas a las medias y las varianzas.

4. ISO 2854:76. Interpretación estadística de datos. Técnicas de estimación y dócimas


relativas a las medias y a las varianzas.

5. ISO/DI 5725-1:1991. Accuracy. (Trueness and precisión of measurement method and


results). A basic method for determination of repeatibility and reproducibility of a
standard measurement method.

6. ISO/DI 5725-2:1991. Accuracy (Trueness and precision of measurement method and


results). General principles and definitions.

7. Validación de métodos analíticos; Asociación Española de Farmacéuticos de la


Industria A.E.F.I., Barcelona marzo del 2001.

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