Bioquímica:

Un estudio práctico de las biomoléculas

Patricia Cuéllar Mata

Universidad de Guanajuato

Luis Felipe Padilla Vaca

Universidad de Guanajuato

Universidad de Guanajuato

1
Bioquímica: Un Estudio
Práctico de las Biomoléculas

© Universidad de Guanajuato
Lascuráin de Retana No. 5
C. P. 36000
Guanajuato, Gto., México

Impreso en México

ISBN:

Revisión Técnica
Q. Fernando de Jesús Amézquita López
Facultad de Química, Universidad de Guanajuato

2
 PRESENTACIÓN

En esta edición de prácticas de Bioquímica se incorporan algunos aspectos novedosos que apoyarán a los

alumnos para afianzar los conceptos aprendidos en su Curso de Bioquímica I, tales como la estructura de

los carbohidratos, los lípidos, los ácidos nucleicos y las proteínas. La sección dedicada a las enzimas

pretende no sólo mostrar las propiedades catalíticas de estas proteínas sino calcular los parámetros

cinéticos básicos como la Km y la Vmax, con lo cual el alumno podrá entender con mayor claridad el

significado de éstas.

Este material también contribuye a que los alumnos del curso consoliden los fundamentos sobre diversas

metodologías para aislar moléculas tan sencillas como un disacárido y un lípido y moléculas más complejas

como un polisacárido, un ácido nucleico o una proteína. Además, en este compendio se consideran

algunas técnicas para identificar estas moléculas, así como su cuantificación. Los alumnos adquirirán o

reforzarán sus habilidades aplicando técnicas de separación tan diversas como la cromatografía en

columna, la de exclusión molecular, la de afinidad y la de intercambio iónico así como la de separación

por electroforesis en geles de poliacrilamida, transferencia a nitrocelulosa y la Reacción en Cadena de la

Polimerasa (PCR).

El trabajo en equipo, la disciplina en el laboratorio, el manejo apropiado de los residuos generados en

cada práctica y la forma ordenada de reportar los resultados y sus interpretaciones son, entre otras, las

actitudes que los alumnos deberán cultivar durante este curso. Los alumnos encontrarán en este libro un

apoyo muy valioso para reforzar sus conocimientos en temas básicos de la Bioquímica al tiempo que

desarrollarán actitudes más acordes con su futuro desempeño profesional.

J. de Jesús García Soto

3
 INDICE
TEMA Página
CARBOHIDRATOS
Aislamiento de lactosa 5
Aislamiento de glucógeno 8
Identificación de carbohidratos y cuantificación de carbohidratos 12
LÍPIDOS
Aislamiento de triglicéridos 19
Extracción de lípidos de cerebro 16
Identificación de ácidos grasos a través de la saponificación 19

PROTEÍNAS
Propiedades químicas y cuantificación de proteínas 22
Purificación de proteínas I: Intercambio iónico y cromatografía de
28
exclusión
Electroforesis de proteínas 31
Actividad enzimática en geles 37
Cinética enzimática 40
ÁCIDOS NUCLEICOS
Aislamiento de ácidos nucleicos 44
Análisis y cuantificación de ácidos nucleicos 48

51
REGLAS EN EL LABORATORIO
SEGURIDAD EN EL LABORATORIO 52
BIBLIOGRAFÍA ADICIONAL 53

4
 P R Á C T IC A 1 A
A IS LA M IE N TO D E LA C TO S A

OBJETIVO
Obtener un carbohidrato de origen natural atendiendo a sus propiedades físico-químicas, mediante
técnicas sencillas de laboratorio.

FUNDAMENTO
La lactosa O--D-galactopyranosyl-(1→4)-D-glucopyranose o azúcar de la leche se encuentra
naturalmente en la leche en un rango de concentración entre 0 y 7%, dependiendo de la especie. Los niños
tienen la enzima intestinal -D-galactosidasa o lactasa que hidroliza la lactosa para que sus componentes
puedan ser absorbidos hacia la sangre. La mayoría de los adultos, en cambio, tienen un bajo nivel de esta
enzima. Por ello, la lactosa se mueve sin hidrolizarse por el tracto intestinal hasta el colon donde su
fermentación bacteriana produce grandes cantidades de CO2, H2 y ácidos orgánicos irritantes. El resultado
es la difundida intolerancia a la lactosa en la edad adulta.
La lactosa se recupera del suero restante en la leche después de precipitar y remover las proteínas. El
carbono anomérico libre de su residuo de glucosa lo hace un azúcar reductor. Bajo hidrólisis del enlace
glicosídico la lactosa produce una molécula de glucosa y una de galactosa.

MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO

✓ Probeta de 100 mL,
✓ Termómetro,
✓ Agitador de vidrio,
✓ Embudo Büchner,
✓ Embudo de vidrio,
✓ Parrilla de calentamiento,
✓ Dos matraces Kitasato de 250 mL con trampa de vacío,
✓ Bomba de vacío,
✓ Manguera de látex,
✓ Vaso de precipitados de 250 mL,
✓ Vidrio de reloj,
✓ Papel filtro,
✓ Adicionalmente: cada equipo aportará gasas

5
REACTIVOS EMPLEADOS
✓ Leche descremada en polvo,
✓ Carbonato de Calcio,
✓ Acido acético al 10% (V/V),
✓ Etanol al 96% (V/V),
✓ Agua destilada

PROCEDIMIENTO
1. Coloca 25 g de polvo de leche descremada en un vaso de 250 mL.
2. Adiciona 75 mL de agua caliente y agita. Ajusta la temperatura de la mezcla a 50ºC.
3. Agrega 10 mL de solución de ácido acético al 10% (V/V) y agita la mezcla por 15 min para coagular
la caseína. La precipitación es completa cuando el color del líquido cambia de blanco lechoso a
amarillo transparente.
4. Remueve la caseína precipitada filtrando la mezcla por gravedad a través de cuatro capas de gasa
doblada. Colecta el filtrado en un matraz de 250 mL. Este lleva la lactosa.
5. Adiciona 2 gramos de CaCO3 en polvo, agítalo bien y hierve la suspensión por 10 minutos.
6. Agita y filtra a vacío esta suspensión sobre papel filtro en un embudo Büchner. Elimina el residuo
sólido.
7. Transfiere el filtrado a un vaso de precipitados y concéntralo a un volumen de 30 mL
aproximadamente, por ebullición en la parrilla eléctrica. Evita proyecciones agitando frecuentemente.
8. Retíralo de la fuente de calor y agrega 125 mL de etanol al 96% (V/V)
9. Agita la mezcla y fíltrala nuevamente.
10. Transfiere el filtrado a un vaso de precipitados, tápalo y déjalo en reposo durante 24 h.
11. Retira el sobrenadante por succión y entrégalo al maestro para su recolección. No lo viertas a la
tarja.
12. Colecta los cristales. Estos pueden ser lavados nuevamente con un poco de etanol al 96% (V/V).
Permite que se sequen.
13. Pesa los cristales obtenidos y calcula el rendimiento obtenido.
14. Conserva la lactosa obtenida para las prácticas posteriores.

INVESTIGACIÓN PREVIA
1. Cita dos propiedades físicas y/o químicas de los carbohidratos que permitan su separación y su
purificación.
6
2. ¿Qué porcentaje de carbohidratos contiene la leche descremada que utilizarás en esta práctica?
3. ¿Cuánto de ese porcentaje corresponde a lactosa?
4. ¿Cuál es el rendimiento teórico esperado?

REFERENCIAS
• Ault, Addison, Techniques and Experiments for Organic Chemistry. 6° Edición. University Science Books.
1998.
• Nelson, David L. and Cox, Michael M. Lehninger: Principles of Biochemistry. 4º Edición. Ed. Worth
Publishers. 2004.

7
 P R Á C T IC A 1 B

A IS LA M IE N TO D E G L UC Ó G E N O

OBJETIVO
Obtener un carbohidrato de origen natural atendiendo a sus propiedades físico-químicas, mediante
técnicas sencillas de laboratorio.

FUNDAMENTO
El glucógeno es la forma de almacenamiento de la glucosa en los tejidos animales. Se encuentra
principalmente en hígado y en músculo representando hasta el 10% y del 1 al 2% de su peso húmedo,
respectivamente. Está formado por unidades de glucosa unidas por enlaces (1-4) y ramificaciones (1-
6). Ya que actúa como almacén, forma parte importante del sistema de regulación de la glucosa sanguínea.
Las propiedades físicas y químicas de los polisacáridos neutros permiten su fácil aislamiento. El glucógeno
se puede liberar del hígado por calentamiento con una base fuerte hasta la destrucción total del tejido. Al
añadir ácido tricloroacético al homogenizado anterior, precipitan numerosas sustancias de peso molecular
elevado, como las proteínas y los ácidos nucleicos, en tanto que el glucógeno continúa disuelto. El
glucógeno puede separarse de los monosacáridos y otros compuestos hidrosolubles por precipitación con
alcohol porque los polisacáridos son mucho menos solubles en alcohol acuoso que los monosacáridos.

MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO

✓ Baño de agua hirviendo, ✓ Guantes de látex,
✓ Hielo, ✓ Pipetas automáticas (0.2 y 1,0 mL)
✓ Centrífuga, ✓ Puntas para micropipeta,
✓ Balanza, ✓ Pipetas de plástico de 5 y 10 mL,
✓ Agitador de tubos, ✓ Propipeta,
✓ Tubos de ensayo y gradilla, ✓ Papel de filtro,
✓ Tubos de centrífuga cónicos de plástico ✓ Pinzas para tubo de ensayo,
con tapón, ✓ Bisturí

REACTIVOS
✓ Hígado de cerdo (aportado por el equipo),
✓ Solución de hidróxido de potasio al 30% (P/V),
✓ Solución de ácido tricloroacético al 10% (P/V),
✓ Solución saturada de sulfato de sodio
8
 ✓ Etanol,
✓ Agua destilada.

PROCEDIMIENTO
1. Coloca 3 mL de la solución de hidróxido de potasio al 30% en un tubo de ensayo de vidrio grueso.
2. Pesa 4 gramos de tejido e introdúcelo en el tubo anterior. Anota el peso.
3. Caliéntalo en un baño de agua en ebullición durante 20- 30 minutos agitando con cuidado para
acelerar el proceso de digestión. USA PINZAS PARA MANIPULAR LOS TUBOS Y
TRABAJA CON PRECAUCIÓN PUES ES UN ÁLCALI HIRVIENDO.
4. Una vez enfriado el tubo de ensayo, añade 0,2 mL de la solución saturada de Na2SO4 y mezcla
fuertemente. Déjalo reposar 5 minutos.
5. Precipita el glucógeno que se encuentra en solución adicionando 7 mL de etanol al 96%. Agítalo
y enfríalo sobre hielo durante 5 minutos.
6. Pasa la solución a tubos de centrifuga cónicos de plástico con tapón y centrifuga a máxima
velocidad (5000 x g) durante 5 minutos. Elimina el sobrenadante en el frasco para residuos
que se te proporcionará y coloca el tubo invertido sobre papel filtro.
7. Añade 5 mL de la solución de TCA al 10% al tubo y disuelve totalmente el sedimento agitando
fuertemente.
8. Centrifuga de nuevo 5 minutos a 5000 x g y vierte el sobrenadante a un tubo de ensaye
conteniendo 10mL de etanol al 96%. Elimina el sedimento.
9. Deja reposar la mezcla anterior durante 5 minutos para que se produzca la precipitación del
glucógeno.
10. Pesa un tubo de centrífuga cónico de plástico vacío y anota el peso. Márcalo para identificarlo.
11. Traslada la solución al tubo de centrifuga de plástico, previamente pesado y centrifuga durante 5
minutos más a 5000 x g.
12. Elimina el sobrenadante al frasco de residuos. El sedimento obtenido representa el glucógeno
prácticamente exento de sustancias contaminantes. Déjalo secar en la estufa a 35°C hasta su
utilización.

INVESTIGACIÓN PREVIA
1. Cita dos propiedades físicas y/o químicas de los carbohidratos que permiten su separación y
purificación.
2. ¿Qué porcentaje de glucógeno tiene el hígado? ¿Cómo varía éste con el ayuno?

REFERENCIAS:
• Diez Dapena, J. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus Universitario de Rabanales,
Edificio Severo Ochoa, 14071-Córdoba.
• Alemany M, Font S (1983): “Prácticas de Bioquímica”, 1ª Edición. Editorial Acribia (Zaragoza, España), pag.
40-42.
• Nelson, DL, Cox, MM (2001): Principios de Bioquímica. 3°Edición. Editorial Omega (Barcelona, España),
pag. 304-305.

9
• Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL (2003): “Bioquímica” 5ª Edición. Editorial Reverté (Barcelona, España), pag.
577-580.

10
 P R Á C T IC A 2

I D E N T IF IC A C IÓ N Y C UA N TIF IC A C IÓ N D E C A RB O HID RA TO S

OBJETIVO
Comprobar las propiedades químicas más comunes de los azúcares y determinar la concentración de
una muestra de carbohidratos obtenida previamente, mediante el método de DNS

FUNDAMENTO
Los carbohidratos son las biomoléculas más abundantes en la tierra. Cada año, la fotosíntesis convierte
más de 100 000 billones de toneladas de CO2 y H2O a celulosa y otros productos de plantas. Así también
algunos carbohidratos son alimentos básicos en la dieta y la oxidación de estas biomoléculas es el camino
de obtención de energía en la mayoría de células no fotosintéticas.
Polímeros insolubles de carbohidratos sirven como elementos de estructura y protección en la pared
celular de bacterias, plantas y tejidos conectivos de animales. Otros polímeros lubrican articulaciones y
participan en el reconocimiento y adhesión entre células.
Los carbohidratos son predominantemente aldehídos o cetonas polihidroxíclicos, o substancias que
producen dichos compuestos en hidrólisis. Varios, mas no todos los carbohidratos poseen la fórmula
empírica (CH2O)n algunos también poseen N, P o S.

Existen diversas pruebas para identificar azúcares. La prueba de Selivanoff es específica para específica
para las cetosas. Las cetosas se deshidratan más rápidamente que las aldosas, dando furfurales. Estos se
condensan con el resorcinol produciendo un complejo coloreado. Si el tiempo de ebullición se prolonga,
puede dar también positivo para otros azúcares.

11
La prueba de Tollens es análoga a la anterior pero para el reconocimiento de galactosa y sus derivados.
La galactosa, algunas pentosas y el ácido glucurónico dan un color rojo con el HCl y floroglucina. La
glucosa da también un color rojo con la floroglucina, pero muy opaco, en contraste con el color rojo
transparente de la galactosa.
El método del ácido dinitrosalicílico (DNS) se encuentra entre los métodos más comunes para cuantificar
azúcares. Este procedimiento se fundamenta en la reacción de los grupos reductores de los azúcares con
el reactivo oxidante DNS. El reactivo consiste en una disolución formada por ácido dinitrosalicílico (ácido
2-hidroxi-3,5-dinitrobenzóico), Sal de Rochelle (tartrato sódico-potásico), que impide la disolución de
oxígeno en el reactivo e hidróxido sódico, que aporta el medio alcalino requerido para que se produzca la
reacción redox. De esta forma, el ácido 2-hidroxi-3,5-dinitrobenzóico se reduce, en presencia del grupo
reductor de la glucosa, formando el ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, mientras que el grupo aldehído
reductor se oxida, para formar un grupo carboxílico. En este método analítico el DNS está en exceso
frente a los grupos reductores y en todas las muestras se adiciona la misma cantidad, de tal forma que
mayores concentraciones de azúcares reductores provocan una mayor coloración de la muestra. Estas
diferencias de coloración pueden determinarse por espectrofotometría visible, a la longitud de onda de
máxima absorbancia de 540 nm

MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO

✓ Vasos de precipitados de 250 mL, ✓ Micropipetas,
✓ Parrilla eléctrica, ✓ Puntas para micropipeta.
✓ Gradilla y tubos de ensayo, ✓ Espátula,
✓ Pinzas para tubo de ensayo, ✓ Vórtex
✓ Papel filtro, ✓ Agitadores o varilla de vidrio,
✓ Probetas de 10 y 100 mL, ✓ Embudo de vidrio,
✓ Vidrio de reloj, ✓ Papel aluminio,
✓ 20 tubos Eppendorf, ✓ Pipetas Pasteur,
✓ Gradilla para tubos Eppendorf, ✓ Bulbos de goma
✓ Placas de 96 pozos,

REACTIVOS
✓ Lactosa ó glucógeno obtenido en la práctica anterior (prepara 2,0 mL al 2% en agua destilada),
✓ Miel Karo natural
✓ Soluciones al 1% de glucosa, fructosa, galactosa, lactosa, sacarosa, D-ribulosa, almidón y miel
(2ml de cada solución, por equipo)
✓ Reactivo de Benedict (citrato de sodio, carbonato de sodio anhidro, sulfato de cobre)
✓ Agua destilada.
12
 ✓ Solución patrón de glucosa de 1 mg/ mL (10 mL),
✓ Papel encerado,
✓ Papel aluminio
✓ Reactivo DNS

PROCEDIMIENTO
Parte A. Identificación de azúcares
1. Identificación de azúcares reductores
a) Coloca 0,5 mL de cada una de las soluciones de azúcar que preparaste en tubos de ensayo. Incluye la
solución de lactosa que obtuviste en la sesión anterior.
b) Añade 0,5 mL de la solución de Benedict a cada uno de ellos. Observa la formación de color o
precipitado. Si en ninguno de ellos se forma, calienta el tubo de ensaye hasta ebullición en un baño de
agua. La formación de un precipitado rojo, amarillo o verde amarillento indica la presencia de un
azúcar reductor.
c) Anota tus resultados en una tabla. Señala cuáles son reductores y cuáles no lo son.
d) Colecta los residuos en el frasco que te indique tu maestro. No los viertas a la tarja.
2. Identificación de azúcares no reductores
1. Tomar 0.5 ml de solución de sacarosa y de los azúcares que no te dieron positiva la prueba anterior
2. Añadir 10 gotas de HCl diluido.
3. Calentar en un baño de agua hirviendo durante unos 5 minutos.
4. Añadir 0.5 ml de solución alcalina.
5. Realizar la prueba de Benedict como se indica en el experimento1.
6. Observar y anotar los resultados
3. Prueba de Selivanoff
1. En un tubo de ensayo se añade:
- 1 ml del reactivo de Selivanoff (resorcinol/HCl)
- 1 ml de la disolución de azúcar
2. Hervir durante 1 minuto en un baño de agua a ebullición.
La aparición de un color rojo o un precipitado rojo es indicativa de la presencia de cetosas.
4. Identificación de almidón
1. Colocar en un tubo de ensayo 3ml de la solución de almidón.
2. Añadir 3 gotas de la solución de lugol. Observa y anota

13
3. Calentar suavemente, sin que llegue a hervir, hasta que pierda el color.
4. Enfriar el tubo de ensayo y observar cómo, a los 2-3 minutos, reaparece el color azul. Explica por qué
ocurren estos cambios.
5. Reactivo de Molish
Precaución: el ácido sulfúrico concentrado puede causar quemaduras graves en la piel.
Manéjalo con mucho cuidado.
1. Pipetear en un tubo de ensayo 0.5 ml de la solución de azúcar problema
2. Añadir 2 gotas de α-naftol al 1% y mezclar bien.
3. Con una pipeta se deja resbalar por la pared del tubo de ensayo 1 ml de ácido sulfúrico
concentrado con mucho cuidado procurando que no se mezcle para que forme una capa bajo
la disolución de azúcar.
En la superficie de separación de ambas capas se producirá la deshidratación del azúcar y su
reacción con el α-naftol formándose un anillo de color oscuro en la interfase. Molisch
positivo: anillo oscuro.

Parte B. Cuantificación de azúcares

- Prepara una solución de glucógeno/lactosa a 10 mg/mL en agua con el azúcar que obtuviste.
Sólo requieres 60 µL.
- Preparar dos series de microtubos:

Tubo Vol Solución Estándar Vol H20 destilada Vol DNS (µL)
de glucosa (10 (µL)
mg/mL) (µL)
1 0 100 120
2 3 97 120
3 5 95 120
4 10 90 120
5 20 80 120
6 40 60 120
7 60 40 120
8 80 20 120

9 5 (Solución 80 120
problema)

- Mezcla y coloca en baño de agua en ebullición durante 15 min

- Agrega 1.2mL de agua a cada tubo y mezcla
- Transfiere 200µL de cada tubo a una placa de 96 pozos

14
 - Lee la absorbencia de cada pozo a 540nm.
- Grafica absorbencia contra µg de glucosa
- Determina los µg de azúcar reductor en la solución problema de glucógeno/lactosa a partir de
los valores de la pendiente y la ordenada al origen de tu gráfica. Considera el volumen que
tomaste para la reacción.

INVESTIGACIÓN PREVIA
1. ¿Cómo debe estar formado el enlace glucosídico de un disacárido reductor?
2. Investiga otros métodos para cuantificar azúcares.
3. Ventajas y desventajas del método DNS

REFERENCIAS
• Lehman, John W. Operational Organic Chemistry. 3°ed. Prentice Hall, Upper Saddle River, NJ. 1999.
• Ault, Addison. Techniques and Experiments for Organic Chemistry. 6°ed. University Science Books. 1998.
• Nelson, David L. and Cox, Michael M. Lehninger: Principles of Biochemistry. 4°Edición. Worth Publishers.
2004.

15
 P R Á C T IC A 3
E X TR A C C IÓ N D E L ÍP ID O S D E C E R E B RO

OBJETIVO
Obtener los lípidos de la corteza cerebral y encéfalo y fraccionarlos de acuerdo a su solubilidad en
diferentes solventes orgánicos.

FUNDAMENTO
El cerebro en la especie humana pesa 1,3 kg y es una masa de tejido gris rosáceo compuesto por unos
100 000 millones de células nerviosas o neuronas, conectadas unas con otras y responsables del control
de todas las funciones mentales.
La corteza cerebral presenta una capa denominada sustancia gris, de unos 2 a 3mm de espesor, compuesta
por capas de células amielínicas (sin vaina de mielina) que cubren una sustancia interior de fibras mielínicas
(con vaina blanca), la sustancia blanca.
Los componentes típicos del sistema nervioso son los lípidos, contenidos principalmente en los cilindro-
ejes de los nervios. El contenido total alcanza del 12 al 15% del peso fresco, aproximadamente la mitad
del peso seco. Para los distintos grupos de lípidos se han obtenido los siguientes valores (por ciento del
peso en fresco):

❖ Fosfátidos 6% , Cerebrósidos 2%, Esteroles 4%.

• En la sustancia blanca. 9%, 4%, 1-2 %, respectivamente.
• En la sustancia gris: 4%, 1%, 1-2%, respectivamente.

El colesterol se encuentra ampliamente distribuido en todas las células del organismo, pero especialmente
en las del tejido nervioso. Es el constituyente de mayor importancia en las membranas celulares y de las
lipoproteínas plasmáticas. El nombre químico es 3-hidroxi-5-6 colesteno. El hígado sintetiza más o menos
el 10% del total en los seres humanos, el intestino cerca de 15% y la piel una gran porción del resto.
Los fosfolípidos son lípidos complejos, contienen además de ácidos grasos y un alcohol, un residuo de
ácido fosfórico; con frecuencia tienen bases nitrogenadas y otros sustituyentes. Por ejemplo, los
glicerofosfolípidos: donde el alcohol es el glicerol, y los esfingofosfolípidos, cuyo alcohol es la esfingosina.
Son los principales constituyentes lipídicos de las membranas.

16
Los glucolípidos complejos, lípidos que contienen un ácido graso, esfingosina y carbohidratos. Los
glucolípidos están distribuidos ampliamente en cada tejido del cuerpo, en particular en el tejido nervioso
(en cerebro).
Los glucolípidos principales en los tejidos animales son los glucoesfingolípidos. Éstos contienen ceramida
y uno o más azúcares. Los dos más sencillos son la galactosiceramida y la glucosilceramida.

MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO

✓ Un vaso de precipitados,
✓ Cinco pipetas de plástico,
✓ Tres pipetas Pasteur,
✓ Cuatro tubos de centrífuga,
✓ Una varilla de vidrio,
✓ Una parrilla de calentamiento,
✓ Una centrífuga.

REACTIVOS EMPLEADOS
✓ 2,5 g de cerebro de pollo,
✓ Etanol,
✓ Eter,
✓ Acetona.

PROCEDIMIENTO
1. Pesa tres tubos de 15 mL, márcalos como fracción I, II y III.
2. Pesa en un papel aluminio 2,5 g de cerebro de pollo, pícalo y colócalo en un tubo de centrífuga,
adiciona, 1 mL de acetona por cada 0,5g de cerebro, homogeniza el tejido por un minuto y
centrifuga a 3 000 rpm. Decanta el sobrenadante en el tubo fracción I, y añade al residuo 2 mL
de acetona y homogenizando nuevamente. Centrifuga y coloca el sobrenadante con la fracción I.
Esta fracción corresponde colesterol.
3. Deja el residuo a temperatura ambiente durante cinco minutos para evaporar la acetona.
4. Adiciona 3 mL de éter al residuo, centrifuga por 2 minutos a 3 000 rpm.
5. Coloca el sobrenadante en otro tubo de centrífuga con la leyenda fracción II. Ésta contiene
fosfolípidos, nuevamente realiza una extracción con éter y adiciona el sobrenadante a la fracción
II.
6. Elimina los residuos de éter permitiendo su evaporación a temperatura ambiente bajo la campana
de extracción y adiciona 3 ml de etanol caliente al 95% (70 oC aprox).

17
 7. Agita y centrifuga durante 2 min a 3 000 rpm. Colecta el sobrenadante en el tubo de la fracción
III, la cual corresponde a glucolípidos. Realiza nuevamente una extracción con 3 mL de etanol.
8. Calcula el volumen del residuo y agrega dos volúmenes de acetona, homogeniza y centrifuga (2
min a 3 000 rpm). Coloca el sobrenadante con la fracción I. Adiciona al residuo 3 mL de éter y
agita por 4 minutos.
9. Centrifuga (2 min a 3000 rpm) y coloca el sobrenadante en el tubo de la fracción II (fosfolípidos).
Esta extracción se repite dos veces más y los sobrenadantes van al mismo tubo.
10. Cada tubo se evapora a sequedad sobre la parrilla. NO PERMITAS QUE LOS RESIDUOS SE
QUEMEN.
11. Pesa los tubos nuevamente y calcula la cantidad de producto obtenido en cada fracción.

INVESTIGACIÓN PREVIA
1. ¿Cuál es el efecto de los solventes orgánicos polares como el metanol o el etanol sobre los
lípidos de membrana?
2. Elabora una lista de disolventes orgánicos en los cuales puedes disolver los productos obtenidos.
3. ¿ Cuál es el rendimiento teórico esperado para cada uno de los lípidos obtenidos en esta práctica?
4. ¿Dónde y cómo se degradan los fosfolípidos en el organismo?

REFERENCIAS
• Stevens, Alan, Texto y Atlas de Histología. Editorial Mosby/Doyma libros, 1995.
• Mathews y Van Holde. Bioquímica. Editorial Mc Graw Hill-Interamericana. 2ª Edición, 2001.

18
 P R Á C T IC A 4
SA P O N IF IC A C IÓ N

OBJETIVO
Identificar lípidos que contengan ácidos grasos mediante la saponificación.
FUNDAMENTO
En los seres vivos la grasa se descompone por una reacción de hidrólisis catalizada por enzimas lipasas,
dando glicerina y ácidos grasos. En el laboratorio, se puede descomponer haciendo reaccionar los ácidos
grasos con un álcali formando sales orgánicas con propiedades detergentes como los jabones. Esta
reacción se llama saponificación (formación de jabón).
La glicerina se puede identificar químicamente porque reacciona con bisulfato sódico dando un
compuesto acroleína con un color ocre (agrio) característico. Los lípidos derivados de los ácidos grasos
(ácidos monocarboxílicos de cadena larga) dan lugar a sales alcalinas (jabones) y un alcohol, mediante un
proceso de hidrólisis alcalina denominada saponificación.
El número de saponificación representa los miligramos de KOH necesarios para saponificar un gramo de
materia grasa. Esta es otra prueba cualitativa que podemos aplicar a los lípidos; permite ver si el tipo de
lípido es saponificable (contiene ácidos grasos) o no (no contiene ácidos grasos).

MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO

✓ Parrilla eléctrica
✓ Vasos de precipitados
✓ Gradilla y tubos de ensayo
✓ Pinzas para tubo de ensayo
REACTIVOS EMPLEADOS
✓ Aceite vegetal o grasa animal
✓ Hidróxido de sodio al 20%
✓ Glicerina
✓ Bisulfato de sodio
✓ Etanol absoluto
✓ Cloruro de sodio
✓ Hielo

PROCEDIMIENTO
PARTE A: SAPONIFICACIÓN: FABRICACIÓN DE UN JABÓN

19
1. Disuelve 0,5g de hidróxido de sodio en una mezcla de 2 mL de agua y 2 ml de etanol (96%) en un vaso
de 25 mL. Con una pipeta Pasteur adiciona 1 g de aceite vegetal agitando continuamente la solución
mediante un agitador magnético.
2. Calienta la solución a 100º C durante 30 minutos agitando constantemente y agregando una mezcla
equivalente de 2 mL de agua y 2 mL de etanol para mantener el volumen constante.
3. Disuelve 5 g de cloruro de sodio en 15 mL de agua vertiendo la mezcla en un vaso de precipitados de
50 mL. Caliéntala, si es necesario, para disolver la sal. Enfría esta disolución y adiciona rápidamente a la
mezcla que contiene el jabón.
4. Enfría la mezcla en baño de hielo. Filtra por succión el precipitado que se forme y lava con dos
porciones de 1 mL de agua fría.
5. Deja secar el jabón.

PARTE B: IDENTIFICACIÓN DE ÁCIDOS GRASOS

1. Prepara en un tubo de ensayo 2 mL de aceite y 2 mL de hidróxido sódico al 20%.
2. Agita la solución hasta que se forme una emulsión lo más homogénea posible.
3. Coloca el tubo en un baño de agua hirviendo; agita la solución periódicamente calentándola durante
más de 15 minutos.
4. Deja el tubo en reposo sobre la gradilla unos minutos. La reacción se llevará a cabo en la interfase entre
el aceite y la sosa, aunque el jabón que se forme tenderá hacia arriba al solidificar y la glicerina quedará
abajo.
5. Para identificar la glicerina, extrae la capa inferior y añade a la muestra unos cuantos cristales de bisulfato
sódico. Haz lo mismo en otro tubo con glicerina pura que servirá como control. Calienta ambos tubos y
observa el color.
Prueba de Salkowski. Prepara tres tubos de ensayo, uno de ellos con 0,5 mL de cloroformo, otro con
0,5 mL colesterol en solución y el tercero con 0,5 mL de manteca. Añade lentamente a cada uno 0,5 mL
deH2SO4 concentrado. Observa y dibuja los resultados.
Prueba de Lieberman-Burchard. En cuatro tubos perfectamente secos coloca 2 mL de cada una de
las siguientes soluciones: cloroformo, colesterol en solución clorofórmica, aceite comestible y manteca.
Añade 1 mL de anhidrido acético a cada uno y mezcla perfectamente. Adiciona 1 mL de ácido sulfúrico.
Observa los cambios de color al cabo de 10 y 30 min y esquematiza los resultados en una tabla
comparativa.

20
 10 min después 30 min después
Cloroformo
Colesterol
Aceite
Manteca

INVESTIGACIÓN PREVIA
1. Escribe la reacción de saponificación que tiene lugar en esta práctica.
2. ¿Qué es un jabón y cómo lleva a cabo su función limpiadora?
REFERENCIAS
✓ Necker y Doyle, “Química Orgánica”, 2ª edición, Ed C.E.C.S.A
✓ Nelson, David L. and Cox, Michael M. Lehninger, “Principles of chemestry” 3ª edición, Ed. Mc Graw
Hill.

21
 P R Á C T IC A 5

P RO P I E D A D E S Q U Í MI C A S Y C UA N T IF IC A C I Ó N D E P RO T E Í N A S

OBJETIVO
Conocer algunas de las propiedades químicas comunes a las proteínas, especialmente aquellas por las
cuales las proteínas pueden ser distinguidas unas de otras.

FUNDAMENTO
Existen veinte aminoácidos en las proteínas que varían en forma, tamaño, carga y reactividad química.
Cada uno tiene al menos un codón en el código genético. Diecinueve de ellos son - aminoácidos (esto
es, los grupos amino están unidos al átomo de carbono adyacente al grupo carboxilo) con la fórmula
general RCH (NH2)COOH, donde R es un grupo alifático, aromático o heterocíclico. La única excepción
es prolina, el cual es un aminoácido en el que el grupo amino está incorporado en un anillo de cinco
miembros. Con excepción del aminoácido más sencillo, la glicina (R=H), los aminoácidos encontrados
en las proteínas contienen un átomo de carbono asimétrico, de aquí que son ópticamente activos y tienen
la L-configuración.
La combinación de estos veinte aminoácidos dentro de una proteína es muy variada y por ello es bastante
difícil interpretar su comportamiento químico. Para propósitos de identificación, puede decirse que la
proteína refleja las propiedades químicas de los aminoácidos que contiene. La mayoría de las reacciones
coloridas de las proteínas dependen de la presencia de un aminoácido específico en ellas.
La determinación de la concentración precisa de proteínas requiere de la hidrólisis ácida de una porción
de la muestra seguida del análisis de aminoácidos en el hidrolizado. Sin embargo, este método emplea
mucho tiempo. En la práctica, generalmente no se necesita gran exactitud en la cuantificación y por lo
mismo, se prefieren métodos más rápidos que dan resultados aceptables. La mayoría son métodos
colorimétricos donde una parte de la solución de proteínas reacciona con un reactivo que produce un
producto colorido. La cantidad de este producto colorido se mide espectrofotométricamente y la cantidad
de color se relaciona con la cantidad de proteína presente en la muestra mediante una calibración
apropiada.
Ninguno de estos métodos es absoluto, ya que el desarrollo del color es frecuentemente dependiente de
la composición de aminoácidos de las proteínas. La presencia de grupos prostéticos (por ejemplo,
carbohidratos), también influencia los ensayos colorimétricos.
22
MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO
✓ Gradilla y tubos de ensaye,
✓ Parrilla eléctrica,
✓ Vaso de precipitados de 400 mL,
✓ Placas para ensayos de ELISA,
✓ Vórtex,
✓ Tubos para microcentrífuga
✓ Micropipetas de 2, 50, 200 y 1000 uL,
✓ Pipetas de 5 mL,
✓ Espectrofotómetro y/o lector de ELISA.
✓ Gasa o algodón.

SOLUCIONES Y REACTIVOS EMPLEADOS

✓ Sol. de albúmina al 1%, sol. de gelatina al 1%, sol. de peptona al 1% (todas P/V),
✓ Soluciones de tirosina, triptofano, fenilalanina, cistina y arginina al 0,5% (todas P/V),
✓ Acido oxálico (sol. saturada),
✓ NaOH conc.,
✓ Acido acético glacial,
✓ H2SO4 conc.,
✓ Piridina,
✓ BaCl2 al 5%, NaCl al 5%, HgCl2 al 5% (todas P/V),
✓ Acetato básico de plomo al 5% (todas P/V),
✓ NaOH al 10% (V/V), CuSO4 al 0,5% (P/V), HNO3 conc, NH4OH conc.,
✓ Ninhidrina al 0.1% en etanol (P/V),
✓ (NH4)2SO4 sólido y en solución saturada,
✓ Etanol al 96% (V/V),
✓ Oxido rojo de mercurio,
✓ Nitrato de sodio al 30%,
✓ Magnesio metálico en polvo,
✓ Regulador de acetatos pH 4.7,
✓ Clara de huevo
✓ Albúmina sérica de bovino 1 mg/ mL,
✓ Reactivo de Bradford
✓ Agua destilada.

Reactivo de Millon. Añade 15 g de óxido rojo de mercurio a una mezcla de 11,25 mL de HNO3 y 12,5
mL de agua. Cuando el óxido se ha disuelto se añaden 12,5 mL de una solución de nitrito de sodio al
30%. El reactivo de Millon contiene nitritos y nitratos mercúricos.

Reactivo de Hopkins-Cole. Añade 5 g de magnesio en polvo a 10 mL de agua destilada. Adiciona

lentamente 125 mL de solución fría y saturada de ácido oxálico. La reacción se produce con gran rapidez
23
y es sumamente exotérmica, por lo que el matraz debe enfriarse al chorro del agua mientras se añade el
ácido. Agita suavemente y filtra para separar el oxalato de magnesio insoluble. Acidifica la solución para
evitar la precipitación durante el almacenamiento y afora a 500 mL con agua destilada.

Regulador de acetatos pH 4.7. Mezcla 1 L de ácido acético 0,05 M (2,88 mL de ácido acético glacial en
1 L de agua) con 1 L de acetato de sodio 0,05 M (6,8 g de acetato de sodio en 1 L de agua). Verifica el pH
y ajústalo si es necesario.

* Colecta todos los residuos de las pruebas realizadas en el frasco que se te indique. No los viertas
a la tarja.

A. IDENTIFICACION
I. REACCIONES COLORIDAS
1. Reacción de Biuret. Prueba general para proteínas y polipéptidos de cadena no menor de tres unidades
de aminoácidos. El valor principal de esta reacción es seguir el proceso de una hidrólisis proteica, la cual
será negativa cuando la hidrólisis sea completa.
A 1 mL de la solución problema añade 1 mL de NaOH al 10% y de 3 a 5 gotas de solución al 0,5% de
CuSO4. Mezcla bien y observa la formación de un color violáceo o precipitación de hidróxido cúprico. Si
el color de la reacción de Biuret no se presenta enseguida, deja reposar la solución de 10min a 15 min.
2. Reacción xantoproteica. Esta reacción es positiva, tanto para proteínas en solución como al estado
sólido y es mucho más sensible cuando estas se encuentran perfectamente secas. Esta reacción depende
de la nitración de anillos bencénicos activados, de aquí que la prueba resulta negativa para proteínas que
no contienen aminoácidos aromáticos.
A 1 mL de las soluciones problema añade 1 mL de HNO3 concentrado y calienta. Permite que se enfríe
la solución. Estratifica cuidadosamente con NH4OH concentrado. Se desarrolla un color naranja en la
interfase.
3. Reacción de Millon (para tirosina). El reactivo contiene una mezcla de nitritos y nitratos mercúricos
y mercuriosos en ácido nítrico concentrado.
A 1 mL de la solución problema adiciona de 2 a 5 gotas del reactivo de Millon y caliéntalo en un baño de
agua. La cantidad de reactivo necesario es variable según la naturaleza de la muestra. Se desarrolla un color
de rosa a naranja.

24
4. Reacción para azufre de cistina y cisteína.
A 1 mL de la solución problema adiciona 1 mL de NaOH al 40% y calienta ligeramente. Adiciona de 3
gotas a 5 gotas de acetato de plomo y calienta nuevamente hasta ver que la solución se oscurece. Anota
tus resultados en la tabla.
5. Reacción de la ninhidrina. Es una reacción característica para grupos amino libres. A 1 mL de las
soluciones problema adiciona 5 gotas de piridina y 0,5 mL de solución de ninhidrina. Calienta en un baño
de agua durante 10 min. Aparece un color azul o rojo debido a los grupos amino libres. La reacción se
desarrolla mejor en solución neutra. Si es necesario, mide el pH y ajústalo a 7 antes de adicionar la
ninhidrina.
6. Reacción de Hopkins-Cole (para triptofano).
A 1 mL de las soluciones problema añade 5 gotas del reactivo de Hopkins-Cole (solución de ácido
glioxílico) y mezcla. Estratifica cuidadosamente con ácido sulfúrico concentrado procurando que se forme
el límite bien definido entre ambos líquidos. Se formará un anillo violeta-rojizo en la interfase.
Hopkins-
Biuret Xantoproteica Millon Cys Ninhidrina Cole

Gelatina

Peptona

Albúmina

Tyr

Trp

Phe

Cis

Arg

Agua

II. DESNATURALIZACIÓN CON METALES PESADOS

1. Adiciona 5 gotas de solución de cloruro mercúrico al 5% (P/V) a 1 mL de la solución problema
de albúmina de huevo (diluída 1:4). Observa el resultado.

25
 2. Repite la prueba utilizando AgNO3 al 2% (P/V), acetato básico de plomo al 5% (P/V), NaCl al
5% (P/V) y BaCl2 al 5% (P/V). ¿Qué resultados obtienes? ¿Cuál es la conclusión y cómo
interpretas este fenómeno de precipitación?
B. CUANTIFICACION: Método de Bradford
1. En cada microtubo o pozo agrega de 0 a 12 µL de la solución de albúmina y afora a 12 µL con
agua destilada. Realiza la serie por triplicado.
2. Adiciona 200 µL del reactivo de Bradford a cada tubo/pozo.
3. Incuba 10 min a temperatura ambiente.
4. Mide la absorbencia a 595 nm.
5. Reporta tus resultados incluyendo:
a. Gráfica de absorbancia contra microgramos de proteína
b. Concentración de proteína en tu muestra problema
Solución patrón Reactivo de
Pozo Agua destilada
(1 mg/mL) Bradford
0 0 L 12 L 200 L
1 1 11 200
2 2 10 200
3 4 8 200
4 8 4 200
5 12 0 200
5 (de la sol.
7 (problema) 7 200
problema)

* Colecta todos los residuos de las pruebas realizadas en el frasco que se te indique. No los viertas
a la tarja.

INVESTIGACIÓN PREVIA
1. Investiga el fundamento de cada una de las reacciones involucradas en la identificación de
proteínas en esta práctica.
2. Describe el fundamento, ventajas y límites de detección de otros dos métodos actuales para
determinar la concentración de proteína (método del BCA, ácido bicinchoninico, etc.).

26
• Lowry, O.H., Rosebrugh, J.F., Farr, A.L. y Randall, R.J. Protein measurement with the Folin Phenol reagent.
J. Biol. Chem. 1951. pp: 193, 265-275
• Wilson, Keith & Walker, J. Protein structure, purification and characterization in "Principles and
Techniques of Practical Biochemistry". 5° Ed. Cambridge University Press.2000, Chapter 6.
• Nelson, David L. and Cox, Michael M. Lehninger: Principles of Biochemistry. 4° Edición Worth
Publishers. 2004.
• Bradford, M. Anal. Biochem.1976. pp: 72, 248.
• Ault, Addison. Techniques and Experiments for Organic Chemistry. 6° Edición. University Science Books. 1998

27
 P R Á C T IC A 6

P U R IF IC A C IÓ N D E P R O TE ÍN A S I: I N T E RC A MB IO IÓ N IC O Y C RO MA TO G RA F ÍA D E

E XC LU S IÓ N

OBJETIVO
Ilustrar los métodos generales que se utilizan en la extracción y purificación de proteínas: centrifugación,
cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de exclusión molecular.

FUNDAMENTO
Las proteínas son esenciales para el mantenimiento de la viabilidad de los organismos vivos. Se subdividen
en varios grupos tales como: enzimas, transporte, almacenamiento, estructurales, anticuerpos y hormonas.
Ya que las células contienen miles de proteínas de diferentes características, es necesario obtener una
preparación pura de la proteína en estudio para poder realizar el análisis de sus propiedades y de su
función.
La primera etapa en cualquier procedimiento de purificación es el rompimiento de las células para liberar
todos sus componentes en una solución denominada extracto crudo u homogenado total. De ser
necesario se recurre a una centrifugación diferencial para preparar fracciones subcelulares o para aislar
organelos específicos.
A continuación el extracto se somete a un fraccionamiento que separa las proteínas según tamaño o su
carga. Las etapas iniciales pueden incluir la solubilización de la proteína con detergentes adecuados y la
precipitación con sulfato de amonio. En algunos casos se emplea un procedimiento de diálisis para separar
las proteínas pequeñas y los solventes (sales).
Los métodos más poderosos para fraccionar proteínas hacen uso de la cromatografía de columna, basada
en la diferencia que presentan las proteínas en carga eléctrica, tamaño, afinidad de enlace y otras
propiedades. Este método consta de una columna llena de un material sólido poroso con las propiedades
químicas apropiadas (fase estacionaria) y una solución amortiguadora (fase móvil). La solución que
contiene la proteína se coloca en la parte superior de la columna a través de la cual migrarán todos los
componentes. Las proteínas llegarán al extremo inferior en diferentes tiempos según sus propiedades.

MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO

✓ Columnas de vidrio y de plástico, ✓ Tubos Eppendorf,
28
 ✓ Tubos de ensaye, ✓ Micropipeta de 1 mL con puntas.
✓ Soporte y pinzas universales o pinzas
para bureta,

REACTIVOS EMPLEADOS
✓ Amortiguador de equilibrio Tris-HCl 50 mM pH 8,0 (Intercambio aniónico),
✓ Amortiguador de elusión I (intercambio aniónico: Tris-HCl 50 mM, NaCl 200 mM pH 8,0)
✓ Amortiguador de elusión II (intercambio aniónico: Tris-HCl 50 mM, NaCl 500 mM pH 8,0)
✓ Amortiguador de equilibrio: Acetato de amonio 50 mM pH 5,0 (intercambio catiónico),
✓ Amortiguador de elusión I (intercambio catiónico: Acetato de amonio 50 mM, NaCl 200 mM
pH 5,0),
✓ Amortiguador de elusión II (intercambio catiónico: Acetato de amonio 50 mM, NaCl 500 mM,
pH 5,0)
✓ Resina G-75 ó G-100 (exclusión molecular),
✓ Resina High S (intercambio catiónico),
✓ Resina High Q (intercambio aniónico)

PROCEDIMIENTO
A. Intercambio iónico
1. Coloca la resina de intercambio iónico en las columnas de plástico hasta que el volumen de la
resina compactada alcance los 2,5 mL (aprox. 1 cm de altura), manteniendo siempre al menos 1
ml de agua por arriba del nivel de la resina (NO DEJES SECAR LA COLUMNA)
2. Lava la columna conteniendo la resina con 6 volúmenes de amortiguador de equilibrio. Tris-HCl
50 mM pH 8,0 para la columna de intercambio aniónico y Acetato de Amonio 50 mM pH 5,0
para la columna de intercambio catiónico.
3. Aplica 200 µL de muestra problema en 800 µL del amortiguador de equilibrio en la parte superior
de la resina una vez que el amortiguador de equilibrio se encuentre al ras de la resina.
4. Deja que se incluya la muestra, aplica suavemente 8,5 mL de amortiguador de equilibrio y colecta
fracciones de 1 mL en microtubos (aproximadamente 10 tubos).
5. Aplica 8,5 mL de amortiguador de elusión I (intercambio aniónico: Tris-HCl 50 mM, NaCl 200
mM pH 8,0; intercambio catiónico: Acetato de amonio 50 mM, NaCl 200 mM pH 5.0) y colecta
fracciones de 1 mL.
6. Aplica 8,5 mL de amortiguador de elusión II (conteniendo 500 mM de NaCl) y colecta fracciones
de un mililitro.
7. Lava la columna con 8 volúmenes de agua destilada y colecta la resina donde se te indique.
Almacénala a 4°C
29
 8. Lee las fracciones a 280 nm en un espectrofotómetro utilizando celdas de 1 mL.
9. Grafica el número de fracción vs la Absorbencia

B. Exclusión molecular
1. Coloca la resina de exclusión molecular en las columnas de plástico hasta que el volumen de la
resina compactada alcance los 8,0 mL, manteniendo siempre al menos 1 mL de agua por arriba
del nivel de la resina (NO DEJES SECAR LA COLUMNA)
2. Lava la columna conteniendo la resina con 10 volúmenes de amortiguador de equilibrio. Tris-
HCl 50 mM pH 8,0.
3. Aplica 150 µL de muestra problema en la parte superior de la resina cuando el amortiguador de
equilibrio se encuentre al ras de la resina.
4. Deja que se incluya la muestra, aplica suavemente amortiguador de equilibrio y colecta
fracciones de 0,8 mL en tubos Eppendorf (aproximadamente 12 tubos).
5. Lava la columna con 3 volúmenes de amortiguador de equilibrio conteniendo 0,5 M de NaCl.
6. Lava la columna con 3 volúmenes de agua y colecta la resina donde se te indique. Almacénala a
4 °C
7. Lee las fracciones a 280 nm en un espectrofotómetro utilizando celdas de 1 mL.
8. Grafica el número de fracción vs la Absorbencia

INVESTIGACIÓN PREVIA
1. Describe en qué consiste el fraccionamiento celular y la centrifugación diferencial señalando qué
fracciones celulares se obtienen en cada paso.
2. Explica en qué consiste la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de exclusión

REFERENCIAS:
• Wilson, Keith & Walker, J. Protein structure, purification and characterization in "Principles and Techniques of
Practical Biochemistry". 5° Ed. Cambridge University Press.2000, Chapter 6.

30
 P R Á C T IC A 7

E LE C T RO F O R E S I S D E P RO T E ÍN A S

OBJETIVO
Realizar una separación electroforética de proteínas en un minigel de poliacrilamida según el método de
Laemmli y apreciar la migración diferencial de las proteínas según su peso molecular.

FUNDAMENTO
La electroforesis sobre geles de SDS-poliacrilamida es el método más ampliamente empleado para el
análisis cualitativo de proteínas. Particularmente es útil para monitorear la purificación de una proteína y,
ya que el método esta basado en la separación de las proteínas según su tamaño, el método puede ser
usado para determinar el peso molecular relativo de las proteínas.
Antes de someterse a electroforesis, las proteínas se hierven en una solución que contiene SDS (CH 3-
(CH2)10- CH2OSO3Na), β-mercaptoetanol, azul de bromofenol y glicerol. El SDS es un detergente
aniónico que se une fuertemente a las proteínas y las desnaturaliza. El β-mercaptoetanol reduce los
puentes disulfuro que mantienen su estructura terciaria. De esta manera, todas las proteínas se abren y
quedan con una serie de moléculas de SDS cargadas negativamente a lo largo de la cadena. El azul de
bromofenol permite el seguimiento de la migración de las proteínas a lo largo del gel, mientras que el
glicerol confiere densidad a las muestras para depositarse fácilmente en el pozo de carga.
Al aplicar corriente eléctrica, las muestras pasan primeramente a un gel concentrador al 4%-5% de
poliacrilamida para que las proteínas formen una banda definida y compacta antes de entrar al gel
separador. Una vez alcanzado el gel separador, los complejos SDS-proteína cargados negativamente
continúan moviéndose hacia el ánodo y, ya que tienen la misma carga por unidad de longitud, viajan con
la misma velocidad en el gel separador bajo el campo eléctrico aplicado. Sin embargo, las proteínas se
separan conforme migran. Si la proteína es pequeña, fácilmente pasa a través de los poros del gel mientras
que las proteínas más grandes son sucesivamente retenidas en la malla de la poliacrilamida.
Concluida la electroforesis, el gel se tiñe para observar las bandas de proteína, estimar su peso molecular
y/o transferirse para su estudio e identificación.

MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO

31
 ✓ Minicámara de electroforesis,
✓ Fuente de poder,
✓ Micropipetas y puntas,
✓ Dos vasos de precipitados, de 100 y de 250 mL
✓ Gradilla con tubos Eppendorf,
✓ Pipeta Pasteur y bulbo de goma,
✓ Guantes desechables

REACTIVOS

✓ Acrilamida/Bisacrilamida 30% (P/V),

✓ Tris 1.5 M pH 8,8,
✓ Tris 0.5 M pH 6,8,
✓ Agua desionizada,
✓ SDS al 10% (V/V),
✓ TEMED,
✓ Persulfato de amonio al 10% (P/V),
✓ Amortiguador de corrida: Tris
✓ Glicina, Metanol,
✓ Marcadores de PM,
✓ Buffer de solubilización 2x (Tris-HCl 0,5 M pH 6,8, SDS 4%, glicerol al 20%, 2-
mercaptoetanol al 10%, azul de bromofenol al 0,016% P/V).
✓ Azul de Comassie R-250 al 0,125% (P/V) en metanol al 40% (V/V) / ácido acético al 10%
(V/V)
✓ Solución para desteñir: Ácido acético 10%, metanol al 40% V/V, en agua
✓ Solución para desteñir: Acido acético al 7% (V/V), metanol al 5%(V/V), en agua

PROCEDIMIENTO
1. Prepara la cámara de electroforesis como se indica. Cerciórate de que no tiene fugas llenándola
con agua destilada.
2. En un vaso pequeño, realiza la siguiente mezcla:

Minigel separador (7.5% (P/V, 1,5 mm)

Acrilamida/ bisacrilamida al 30% 2,81 mL
(P/V)
Tris 1.5 M pH 8,8 2,85 mL
Agua destilada 5,4 mL

Agita suavemente el vaso y continúa añadiendo:

32
 SDS al 10% (P/V) 0,114 mL
TEMED 0,010 mL
Persulfato de amonio al 10% (P/V) 0,051 mL

3. Rápidamente coloca la mezcla en la cámara con ayuda de un embudo montado en una punta azul
de micropipeta o con una pipeta Pasteur.
4. Con una pipeta Pasteur, añade lentamente un poco de agua o n-butanol en la superficie y permite
que gelifique. Enjuaga con agua desionizada y escurre.
5. Prepara el minigel concentrador al 5% (P/V) de la misma manera con las siguientes soluciones:
Acrilamida/bisacrilamida 634.5 L
30%
Tris 0.5 M pH 6,8 960 L
Agua destilada 2 160 L
SDS al 10% 38,1 L
TEMED 4,5 L
Persulfato de amonio al 20,25 L
10%

6. Agita suavemente la solución y vacíala en la cámara.

7. Coloca el peine para formar los pozos evitando la formación de burbujas.
8. Déjalo gelificar por 30 min. Retira el peine y enjuaga los pozos con agua desionizada.
9. Coloca en un microtubo 30 L de la solución de proteínas y añade 15 L de BS 4X (Para tres
carriles, 90 L de la solución con 45 del buffer 4x).
10. Colócalo en ebullición durante 5 min.
11. En el primer pozo, coloca 8 L de marcadores de peso molecular
12. En los siguientes tres, coloca el volumen de la muestra como se te indique.
13. Permite la migración de las proteínas durante 30 min aproximadamente a 80 volts, y luego 1 h a
110 volts.
14. Desmonta el gel cuidadosamente y sumérgelo en el colorante azul de Comassie durante 15 min

33
 15. Destíñelo en una solución de metanol al 40% V/V y ácido acético al 10% V/V durante una hora.
Posteriormente en metanol al 5% V/V, ácido acético al 7% V/V hasta el día siguiente.

* Colecta todos los residuos en el frasco que se te indique, incluyendo los geles una vez que
realices el análisis de resultados. No los viertas a la basura.

16. Si es posible, toma una fotografía con cámara digital, digitaliza la imagen o fotocópiala. Puedes
envolverlo cuidadosamente en papel autoadherente o en una mica protectora de plástico.
17. Llena la siguiente tabla, midiendo cuidadosamente la distancia recorrida (mm) por cada marcador,
desde origen al frente del gel.
log peso Distancia recorrida
Marcador (Alto PM, BIORAD) Peso molecular
molecular (mm)
Miosina 200 000
Β-galactosidasa 116 250
Fosforilasa b 97 400
Albúmina de suero bovino 66 200
Ovoalbúmina 45 000

18. Construye una gráfica del logaritmo del peso molecular de cada marcador contra la distancia
recorrida por cada uno.
19. Determina el peso molecular de las dos bandas más intensas del homogenado que sometiste a
electroforesis.

INVESTIGACIÓN PREVIA
1. ¿Qué otros tipo de geles se utiliza para separar proteínas? ¿En qué consiste?
2. Investiga el rango de peso molecular de las proteínas que puedes separar en un gel de
poliacrilamida al 7,5, al 12 y al 16%.

REFERENCIAS:
• Laemmli, U.K, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T. Nature 1970. pp: 227:
680-685.

34
• Wilson, Keith & Walker, J. Protein structure, purification and characterization in "Principles and Techniques of Practical
Biochemistry". 5° Ed. Cambridge University Press.2000, Chapter 6.
• Nelson, David L. and Cox, Michael M. Lehninger: Principles of Biochemistry. 4° Ed Worth Publishers, 2004.

35
 P R Á C T IC A 8 A

A C TIV ID A D E N Z I MÁ T IC A E N G E LE S

OBJETIVO
Determinar la presencia de actividad proteolítica en homogenados de Trichomonas vaginalis y Entamoeba
hystolitica sobre geles de poliacrilamida copolimerizados con gelatina

FUNDAMENTO
La actividad enzimática puede ser determinada de diferentes formas, cada una con una aplicación
diferente. Para una cinética enzimática generalmente la reacción se realiza en solución utilizando un
sustrato cromogénico pero no proporciona información sobre el peso molecular o punto isoeléctrico de
la enzima o de diferentes formas enzimáticas. Lo anterior puede ser solucionado revelando la actividad
enzimática en geles de poliacrilamida donde la muestra generalmente se corre en condiciones
semidesnaturalizantes y posteriormente se renaturaliza para restaurar la actividad. Para la determinación
de la actividad proteolítica en geles pueden utilizarse sustratos específicos (péptidos sintéticos) o generales
(gelatina o hemoglobina).

MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO

✓ Minicámara de electroforesis, ✓ Gradilla con tubos Eppendorf,
✓ Fuente de poder, ✓ Pipeta Pasteur y bulbo de látex,
✓ Micropipetas y puntas, ✓ Guantes desechables.

REACTIVOS EMPLEADOS
✓ Amortiguador de reacción: Tris-HCl 50 mM pH 7,0
✓ Acrilamida/Bisacrilamida 30% P/P,
✓ Tris 1,5 M pH 8,8,
✓ Tris 0,5 M pH 6,8,
✓ Agua desionizada,
✓ SDS al 10% P/V,
✓ TEMED,
✓ Persulfato de amonio al 10% P/V,
✓ Glicina,
✓ Metanol,
✓ Acido acético,
✓ Azul de Comassie R-250 al 0,125% en metanol al 40% / ácido acético al 5% V/V,

36
 ✓ Buffer de solubilización 2x (Tris-HCl 0,5 M pH 6,8, SDS 4%, glicerol al 20%, 2- mercaptoetanol
al 10%, azul de bromofenol al 0,016%) V/V,
✓ Buffer de solubilización sin 2- mercaptoetanol.

PROCEDIMIENTO
1. Prepara la cámara de electroforesis como se indica. Cerciórate de que no tiene fugas llenándola con
agua destilada.
2. En un vaso pequeño, realiza la siguiente mezcla:

Para el minigel separador (10%):

Acrilamida/ bisacrilamida al 30% 3,33 mL
(P/V)
Tris 1,5 M pH 8,8 2,50 mL
Gelatina al 1% 1,0 mL
Agua destilada 3,02 mL

Agita suavemente el vaso y continúa añadiendo:

SDS al 10% 100 L
TEMED 5 L
Persulfato de amonio al 10% 50 L

3. Rápidamente coloca la mezcla en la cámara con ayuda de una pipeta Pasteur.

4. Añade lentamente un poco de agua o n-butanol en la superficie y permite que gelifique. Enjuaga con
agua desionizada y escurre.
5. Prepara el minigel concentrador al 5% de la misma manera con las siguientes soluciones:
Acrilamida/bisacrilamida 423 L
30%
Tris 0.5 M pH 6.8 640 L
Agua destilada 1 440 L
SDS al 10% 25,4 L
TEMED 3,0L

37
 Persulfato de amonio al 13,5 L
10%

6. Agita suavemente la solución y vacíala en la cámara.

7. Retira el peine y enjuaga los pozos con agua desionizada.
8. Coloca en cada pozo 5 a 10 L de la solución de proteínas ya preparada en amortiguador de carga,
que se te proporcionará.
9. Permite la migración de las proteínas durante aproximadamente 1 h a 110 volts, manteniendo la
cámara en hielo.
10. Desmonta el gel cuidadosamente y sumérgelo en una solución de Tritón X-100 al 2,5% V/V, en
agua durante 45 min a 4 °C
11. Lávalo dos veces con agua e incúbalo en el amortiguador de reacción (30 mL de PBS 1X con 50
μL de β-mercaptoetanol) a 37 °C durante 30 min.
12. Lávalo dos veces con agua y tíñelo con azul de Coomassie durante 15 min.
13. Destíñelo en una solución de metanol al 40% V/V y ácido acético al 10% V/V durante 15 min.
14. Si es posible, toma una fotografía en con cámara digital, digitaliza la imagen o fotocópialo. Puedes
envolverlo cuidadosamente en papel autoadherente o en una mica protectora de plástico.
15. Colecta los residuos en los frascos que se te indiquen.

INVESTIGACIÓN PREVIA
1. ¿Que son las proteasas y cómo se clasifican?
2. Describe brevemente los diferentes métodos para determinar actividad enzimática en geles y en
tejidos.

REFERENCIAS:
Wilson, Keith & Walker, J. Protein structure, purification and characterization in "Principles and Techniques of
Practical Biochemistry". 5° Ed. Cambridge University Press.2000, Chapter 6.

38
 P R Á C T IC A 8 B

C IN É T IC A Q U Í MIC A

OBJETIVO
Llevar a cabo una reacción enzimática y evaluar el efecto de la concentración de enzima e inhibidores
sobre la velocidad de reacción y determinar los parámetros cinéticos.

FUNDAMENTO
La velocidad de transformación de los sustratos de una reacción en los correspondientes productos,
mediante una enzima, es dependiente tanto de las concentraciones de la enzima como de los sustratos.
Normalmente, esa dependencia puede ser expresada matemáticamente por la ecuación de Michaelis-
Menten:
v= Vmax [S] / (Km + [S])

Esta ecuación predice que la velocidad de formación de producto es saturable con respecto al sustrato, es
decir existe una concentración de sustrato a partir del cual la v no aumenta de forma significativa. La Vmax
se denomina velocidad máxima, y depende de la concentración de enzima según una relación lineal:
Vmax = k2 [E]

La Km es un parámetro que depende de la afinidad de la enzima por el sustrato y que se denomina constante
de Michaelis. El cálculo de los valores de constantes Vmax y Km se realiza mediante la representación de
Lineweaver-Burk, que es en realidad la ecuación de Michaelis-Menten en forma doble recíproca:
1/v = 1/Vmax + Km/Vmax [S]

La representación de 1/v frente a 1/S da lugar a una línea recta cuya ordenada en el origen es 1/Vmax y
cuya abscisa es -1/Km. La velocidad de reacción se suele expresar en µmoles de producto formado por
minuto.
La velocidad de reacción varía también con la presencia en el medio de determinados agentes químicos
que reciben el nombre de moduladores o efectores. Existen varios tipos, y uno de los más frecuentes son
39
los denominados inhibidores competitivos. Generalmente, éstos son sustancias de naturaleza análoga al
sustrato y que pueden competir con él por el centro activo de la enzima. La actividad catalítica de las
enzimas depende estrictamente de la conformación de la proteína, es decir de su estructura tridimensional.
Por ello, los cambios conformacionales suelen ir asociados a cambios en la eficacia catalítica de las
enzimas. En muchos casos, estos cambios conformacionales son reversibles y tienen un significado
fisiológico al permitir adaptar de forma transitoria la velocidad de una reacción a las necesidades de la
célula. En otros casos, los cambios conformacionales son irreversibles. Las proteínas también se
desnaturalizan como consecuencia de la exposición a los denominados agentes caotrópicos.
En esta práctica utilizaremos como modelo de enzima a las proteasas. Las proteasas son enzimas
ampliamente distribuidas en la naturaleza y cumplen una gran variedad de funciones de importancia
biológica e industrial. Entre las más estudiadas están las enzimas digestivas de mamíferos, las relacionadas
con la coagulación sanguínea, las subtilisinas por su aplicación en la industria y las proteasas de virus. Las
proteasas hidrolizan el enlace peptídico de las proteínas y de péptidos naturales o sintéticos. La hidrólisis
del sustrato Z-Arg-Arg-pNitroanilina libera un compuesto coloreado que hace posible la medida de la
actividad proteolítica.

MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO

✓ Espectrofotómetro,
✓ Cubetas de 1 cm de paso óptico,
✓ Tubos de ensayo y gradillas,
✓ Termoblock,
✓ Cronómetro,
✓ Pipetas automáticas,
✓ Inhibidores de proteasas
REACTIVOS
✓ PBS,
✓ 2-mercaptoetanol,
✓ Sustratos de proteasas,
✓ Inhibidores de proteasas,
✓ Amortiguador de lisis (Tris 50 mM, NaCl 10 mM, Tritón X-100 1%, pH 7),
✓ Amortiguador de reacción (PBS).

PROCEDIMIENTO

a) Efecto de la cantidad de enzima

40
A una serie de cinco tubos adiciona los siguientes reactivos (µl):
1 2 3 4 5
Amortiguador de reacción 196 195 193 187 176
Sustrato 2 2 2 2 2
2-mercaptoetanol 2 2 2 2 2
Cisteín proteasa (lisado celular) - 1 3 9 20

Lee la absorbancia de cada tubo a la longitud de onda de 405 nm, cada 2 min durante 10 min. Con los
valores calculados, representa la velocidad de aparición de p-nitroanilina frente a la cantidad de enzima.
La absortividad molar de la p-nitroanilina es de 3 700 M-1 cm-1 a 475 nm.

a) Desnaturalización térmica
Preincuba la enzima a 37 °C, 45 °C y 70 °C, realiza el ensayo de actividad como se hizo en el apartado
anterior y mide la actividad enzimática residual. Para el cálculo del % de actividad residual, toma como
100 % el incremento de absorbancia/min obtenido en el tubo control.

c) Efecto de la concentración de sustrato

Adiciona a una serie de cinco tubos los siguientes reactivos (ul):
1 2 3 4 5
Amortiguador de reacción 193 192,5 192 191 189
Sustrato 0 0.5 1 2 4
2-mercaptoetanol 2 2 2 2 2
Cisteín proteasa (lisado celular) 5 5 5 5 5

Determina la actividad como se detalló en el apartado a).

d) Estudio de la inhibición de la actividad proteolítica por E-64

1 2 3 4 5

41
 Amortiguador de reacción 196 195 193 187 176
Sustrato 2 2 2 2 2
2-mercaptoetanol 2 2 2 2 2
Cisteín proteasa (lisado celular) - 1 3 9 20
Inhibidor (E-64) 10 uM 10 uM 10 uM 10 uM 10 uM

Determina la actividad como se detalló en el apartado (a).

Utilizar los valores obtenidos, para representar las velocidades de reacción frente a la concentración de
sustrato de forma directa y en forma doble recíproca. Obtén los valores de Vmax y y Km en presencia y
ausencia del inhibidor.

INVESTIGACIÓN PREVIA
1. Explica el significado de la constante de Michaelis- Menten
2. Explica el efecto del aumento de la concentración de sustrato sobre la velocidad de la reacción
enzimática
3. Qué efecto tiene el aumento de la concentración de la enzima sobre la velocidad de reacción
4. ¿A qué se denomina errores congénitos del metabolismo? Menciona algunos.
5. ¿Qué efecto tiene la temperatura sobre la actividad enzimática?

REFERENCIAS:
• Wilson, Keith & Walker, J. Protein structure, purification and characterization in "Principles and Techniques of
Practical Biochemistry". 5° Ed. Cambridge University Press.2000, Chapter 6.
• Nelson, David L. and Cox, Michael M. Lehninger: Principles of Biochemistry. 4° Ed Worth Publishers.
2004

42
 P R Á C T IC A 9

A IS LA M IE N TO D E Á C ID O S N UC LE IC O S

OBJETIVO
Aislar DNA plasmídico a partir de un cultivo de Escherichia coli que contiene el plásmido.

FUNDAMENTO
El uso de DNA para análisis o manipulación generalmente requiere que sea aislado en cierto grado de
pureza. El DNA se recupera rompiendo las células en la forma más suave posible para evitar la
fragmentación del DNA por daño mecánico. Esto se hace en presencia de la sal disódica del EDTA, el
cual quela el magnesio que requieren las desoxirribonucleasas, enzimas que degradan el DNA. Idealmente,
las paredes celulares, si están presentes, deben ser digeridas enzimáticamente (por ejemplo, usando
lisozima en el caso de bacterias) y la membrana celular puede solubilizarse usando detergente. Una
alternativa muy empleada es la lisis alcalina.
Después de liberar los ácidos nucleicos, el RNA puede removerse con ribonucleasa (RNasa), la cual se
trata previamente para inactivar cualquier DNAsa contaminante. La proteína contaminante se remueve
con fenol equilibrado o con una mezcla de fenol-cloroformo, que desnaturalizará las proteínas pero no
los ácidos nucleicos.
La centrifugación de la emulsión anterior produce dos fases, una orgánica inferior y una acuosa superior,
separadas por una interfase de proteína desnaturalizada. La solución acuosa se recupera y desproteiniza
repetidamente hasta que no se observe ningún material en la superficie. Finalmente, la preparación de
DNA se mezcla con dos volúmenes de etanol absoluto y el DNA se precipita en congelación.
Cuando se requiere un alto grado de pureza, el DNA puede someterse a ultracentrifugación por gradiente
de densidad a través de cloruro de cesio, lo cual es particularmente útil para la preparación de DNA
plasmídico.
Para aislar RNA el procedimiento es similar, solo hay que considerar que el ácido ribonucleico es muy
vulnerable a la acción de RNAsas presentes en todos los tipos celulares e incluso en los dedos. El material
utilizado debe ser tratado previamente contra RNasas y deben emplearse guantes. Generalmente se
emplean reactivos que contienen fuertes inhibidores de RNasas y desnaturalizantes de proteína.

43
MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO
✓ Un tubo de ensayo estéril con tapón metálico,
✓ Incubador bacteriano con agitación,
✓ Microtubos nuevos,
✓ Centrífuga para tubos Eppendorf,
✓ Micropipetas de 1000 L, 200 L y 20 L con puntas nuevas,
✓ Vortex,
✓ Hielo

REACTIVOS EMPLEADOS
✓ Cultivo fresco de Escherichia coli con plásmido,
✓ Medio LB líquido con el antibiótico de selección para la bacteria empleada,
✓ Medio GTE (100 L por equipo),
✓ NaOH 10 N (100 L), SDS al 20% (250 L, agua destilada, 5 mL por equipo),
✓ Solución de acetato de potasio frío (60 mL de KAcO 5M, 11,5 mL ácido acético 5 mM y 28.5
mL de agua) (150 L por equipo),
✓ Solución de fenol-cloroformo (250 L por equipo),
✓ Etanol frío al 95% V/V (500 L por equipo),
✓ Agua destilada o T10E (30 L por equipo).

PROCEDIMIENTO:
A. Lisis alcalina.
1. Inocula 3 mL de medio LB/ampicilina (10 ug/mL) con la bacteria que lleva el plásmido (E. coli
+ pQSP2, vector que tiene el gen de una serin proteasa de 4,84 kb. (Fragmento de la proteasa:
1,44 kb). Incuba a 37°C/ 200g.
2. Cosecha las bacterias de un cultivo de 14 h por centrifugación a 13000 x g durante 1 min.
3. Elimina el medio al tubo de crecimiento con unas gotas de cloralex y seca la boca del tubo con un
pequeño trozo de papel absorbente.
4. Resuspende las células en 100 µL de GTE (Glucosa 60 mM- Tris 125mM- EDTA 110mM, pH
8,0).
5. Adiciona 200µL de SDS alcalino (NaOH 0,2N en SDS al 1%) y mezcla 7 veces por inversión.
Incuba en hielo durante 5 min.
6. Adiciona 150 µL de AcNA 3M (acetato de sodio) e incuba en hielo durante 20 min.
7. Centrifuga 10 min a 13 000 x g.

44
 8. Transfiere el sobrenadante a un tubo limpio y agrega 200 µL de fenol y 200µL de cloroformo.
Mezcla por inversión.
9. Centrifuga a 13 000 g durante 10 min
10. Transfiere la fase superior a un tubo limpio y agregar 2 volúmenes de etanol absoluto. Mezcla por
inversión.
11. Centrifuga a 13 000 g durante 15 min
12. Elimina el sobrenadante y lava la pastilla 3 veces con 500 µL de etanol al 80% centrifugando 3
min entre cada lavado.
13. Seca la pastilla durante 10 min y resuspende en agua o TE para disolver el DNA.
Todos los tubos microtubos utilizados coléctalos en el bote que se te proporcionará. No los
tires a la basura.

INVESTIGACIÓN PREVIA
1. ¿Cuál es la diferencia en el aislamiento de DNA plasmídico y de DNA de células o tejidos?
2. Ilustra mediante un diagrama de flujo, las etapas involucradas en la extracción de RNA de células
o tejidos, señalando los pasos cruciales del aislamiento.
3. ¿Para qué se requiere un DNA puro? ¿Qué usos tiene?

REFERENCIAS
• Wilson, K. and Walker, J. Principles and Techniques of Practical Biochemistry. 5ºed. Cambridge University
Press. 2000
• Sambrook, Fritsch-Maniatis. Small-scale preparations of plasmid DNA. In Molecular Cloning. A laboratory
manual. Second edition. 1996
• Nelson, David L. and Cox, Michael M. Lehninger: Principles of Biochemistry. 4ºed. Ed. Worth
Publishers. 2004.

45
 P R Á C T IC A 10

A N Á L IS I S Y C U A N T IF IC A C IÓ N D E Á C ID O S N UC L E IC O S

OBJETIVO
Comprobar la integridad y calidad del DNA plasmídico obtenido de Escherichia coli mediante electroforesis
en un gel de agarosa.

FUNDAMENTO
Una forma de cuantificar el ácido nucleico aislado es medir la absorbancia que presentan a 260 nm. La
concentración de DNA se determina considerando que 1 unidad de absorbancia es igual a 50 g de DNA/
cm3:
50 x A260 = concentración de DNA (g cm-3)

Si la relación A260 / A280 es 1,8, la muestra está libre de contaminación proteica (las proteínas absorben
fuertemente a 280).
En el caso del RNA,
40 x A260 = concentración de RNA (g cm-3)
y la relación A260 / A280 será igual a 2.0 si el RNA está libre de impurezas.

El análisis del DNA para checar su pureza e integridad puede realizarse sobre geles de poliacrilamida o
geles de agarosa empleando el DNA obtenido y/o cortado con enzimas de restricción específicas. Es
posible observar las bandas tiñéndolas con bromuro de etidio. Este se intercala entre los pares de bases y
presenta una fuerte fluorescencia rojo-naranja cuando se ilumina con luz ultravioleta. Este método es muy
conveniente pues requiere poco tiempo y cantidades muy pequeñas de muestra. Los geles de agarosa
permiten el análisis de moléculas mayores a 100 pb.

MATERIAL Y EQUIPO UTILIZADO

✓ Cámara horizontal para geles de agarosa, ✓ Tubos Eppendorf,
✓ Matraz Erlenmeyer de 50 mL, ✓ Fuente de poder,
✓ Micropipetas de 1000L, 200L y 20 L, ✓ Guantes desechables.

46
REACTIVOS EMPLEADOS
✓ Agarosa, ✓ 3 L de marcadores,
✓ TAE 1X (60 mL por cámara), ✓ DNA control,
✓ Solución de bromuro de etidio, ✓ Enzima de restricción y amortiguador
✓ Regulador de carga con azul de específicos.
bromofenol,

PROCEDIMIENTO
A. Preparación del gel de agarosa al 1%
1. Prepara una cámara horizontal para electroforesis en gel de agarosa.
2. En un matraz Erlenmeyer coloca 0,2 g de agarosa con 20 mL de TAE 1X y 1 L de bromuro de
etidio. Caliéntalo hasta disolución y llena la cámara como se te indicará. Coloca el peine para
formar los pozos.
3. Déjalo gelificar por 20 min.
4. Toma 3 L de tu muestra de DNA cortado y sin cortar en un microtubo y añade 3 L de buffer
de carga (0,6 mL de glicerol estéril al 50%, 0,020 mL de TAE 50X, 0,380 mL de agua estéril y una
pizca de azul de bromofenol).
5. Cuidadosamente coloca la muestra en un pozo del gel previamente preparado.
6. En otro pozo, coloca 3 L de marcadores.
7. Colecta las puntas que utilizaste en un bote de plástico. No las tires a la basura.
8. Corre las muestras a 95 V por 30 min. Podrás observar el frente de la corrida por la línea del azul
de bromofenol.
9. Llévalo al procesador de imágenes y obsérvalo bajo iluminación ultravioleta. Si es posible, toma
una foto o grábalo e identifica las bandas. Desecha el gel al frasco que se te proporcionará.

B. Cuantificación de DNA
1. Toma 10 µL del DNA obtenido y colócalos en 1 ml T10E o agua destilada estéril.
2. Realiza la lectura de absorbancia a 280 y a 260 nm
3. Utiliza la ecuación correspondiente para conocer la concentración de ácido nucleico que obtuviste.
4. Calcula la pureza de tu muestra de DNA.

INVESTIGACIÓN PREVIA
1. ¿Qué son las enzimas de restricción?
47
 2. ¿Qué significa si no observas bandas de DNA en el gel de agarosa y obtienes lectura de
absorbancia de 1,8 ?
REFERENCIAS
• Wilson, K. and Walker, J. Principles and Techniques of Practical Biochemistry. 5ºed. Cambridge University Press. 2000
• Sambrook, Fritsch-Maniatis. Small-scale preparations of plasmid DNA. In Molecular Cloning. A laboratory manual.
Second edition. 1996
• Nelson, David L. and Cox, Michael M. Lehninger: Principles of Biochemistry. 4ºed. Ed. Worth Publishers. 2004.

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 REGLAS EN EL LABORATORIO

1. Revisar los antecedentes conceptuales y el protocolo de trabajo experimental correspondiente a la

sesión, previo al inicio de la misma.

2. Llegar puntualmente a la sesión. Es sumamente importante aprovechar el tiempo disponible para

el trabajo en el laboratorio.

3. Guardar todos los accesorios personales que puedan comprender riesgo de accidentes mecánicos,
químicos o por fuego, como son anillos, pulseras, collares, mochilas, etc. Evitar el uso de lentes de
contacto, usar anteojos de protección.

4. Colocar sus mochilas bajo las mesas para evitar accidentes.

5. Usar la bata cerrada durante toda la sesión. Usar lentes especiales y guantes en caso de ser necesario.

6. Emplear una bitácora de laboratorio. Esta debe contener la información sobre los reactivos, los
cálculos para preparar las soluciones que serán empleadas en la sesión y el protocolo del trabajo
experimental.

7. Contestar las preguntas de la investigación previa en la misma bitácora utilizando las hojas en blanco
adicionales que contiene el manual.

8. Revisar las medidas y el equipo de seguridad en el laboratorio.

9. Recoger con prontitud el material y los equipos para el trabajo correspondiente. Reportar cualquier
falla o irregularidad.

10. Etiquetar y rotular todos los recipientes donde coloque reactivos, productos y residuos.

11. No ingerir alimentos ni bebidas, no fumar en el interior del laboratorio. NO USAR EL

TELÉFONO CELULAR DENTRO DEL LABORATORIO

12. Dejar limpio y seco el lugar de trabajo y sin basura. No dejar material sucio en los vertederos ni en
las tarjas.

49
 SEGURIDAD EN EL LABORATORIO

1. Fuentes de riesgo en el laboratorio. Instalaciones y aparatos. Eliminación de desechos y de residuos

especiales.

2. Clasificación de los reactivos según el tipo de riesgo: explosivos, comburentes, tóxicos, nocivos,
inflamables, corrosivos, irritantes, carcinogénicos, mutagénicos y teratógenos. Etiquetas de los
reactivos. Sustancias incompatibles. Gases comprimidos. Almacenamiento de los reactivos.

3. Medidas de protección personal. Situaciones de riesgo. Material de seguridad: campanas, pipetas

mecánicas, gafas, caretas, guantes. Medidas en caso de accidentes.

4. Infecciones accidentales en los laboratorios biomédicos: agentes causales más frecuentes; tipo de
personal con mayor riesgo; identificación de las causas de los accidentes. Clasificación de los agentes
por su peligro potencial.

5. Situaciones de riesgo en el manejo de agentes infecciosos: pipeteo, apertura de recipientes

herméticos; centrifugación; homogeneización; agujas y jeringas; sistemas de vacío; liofilización;
experimentos con animales de laboratorio; otras situaciones.

6. Desinfección y esterilización. Medidas elementales en la esterilización por vapor. Desinfección con

agentes químicos líquidos o en solución: niveles de desinfección y precauciones básicas en el empleo
de agentes desinfectantes.

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