| PROCEDIMIENTO “ae Bonasertic) wivnncscioroesses vrosomcosy ns __ Piss Laboratorio, CROMOSOMA Y EN ADN HUMANO MEDIANTE AMPLIFICACION POR PCR Y DETECCION POR Rev.9 ELECTROFORESIS CAPILAR = Formato PT14508 hoja de trabajo: Yfiler PLUS Ademés junto con este procedimiento se utilizaré el manual y/o instrucciones de uso del fabricante y /o los Procedimientos de Funcionamiento y las Instrucciones de Uso de Equipos, siempre que existan, de los equipos involucrados en el procedi 4, GENERAL 4.1, Introduceién te6rica Los polimorfismos Short Tandem Repeat (STRs) son regiones de ADN no codificante que presentan un patron de dos o més nucledtidos que se repiten y las secuencias repetidas son directamente adyacentes unos con otras. El patrén puede variar en longitud de 2 a 16 pares de bases (BP) (por ejemplo el motivo (catg), repetido n veces). Estos polimorfismos son analizados mediante técnicas de PCR y estin ampliamente introducidos en los laboratorios de genética forense debido a las grandes ventajas que poseen frente a otros marcadores moleculares en el campo de la identificacién genética humana: Son susceptibles de ser analizados a partir de muestras con muy pequefias cantidades de ADN 0 con restos de ADN de baja calidad (ejemplo, restos dseos envejecidos), la gran precisién en la caracterizacién del tamafto de los alelos y la rapidez de la técnica Actualmente existen miles de STRs identificados y se calcula que en el genoma humano existe un STR por cada 10.000 pares de bases. Entre los distintos tipos de STRs, los mas comunes con fines forenses son aquellos cuyas repeticiones constan de cuatro nucledtidos o cinco. Estos presentan la ventaja, frente a aquellos con unidades de repeticién menores (dos o tres nucledtidos), de una mejor resolucién entre alelos de tamafio préximo en individuos heterocigotos, asi como una reduccién en la formacién de bandas «stutter» en la PCR. En los STRs con aplicacién en identificacién humana priman los siguientes factores: alto poder de discriminacién, alta heterocigosidad, localizacién en distintos cromosomas para evitar el ligamiento entre marcadores, robustez y reproducibilidad de resultados en reacciones miiltiplex, baja tasa de mutacién y longitud de alelos en el rango de 90-450 pares de bases. Para un intercambio y comparacién de resultados efectivo entre distintos laboratorios es necesaria 1a utilizacién de una bateria de marcadores genéticos comunes, Actualmente, los mareadores mas extendidos a nivel mundial son los 13 STRs autosémicos integrados en el sistema CODIS («Combined DNA Index System») establ creacién de un banco de datos nacional (figura 1). La probabilidad de coincidencia al azar entre individuos no relacionados mediante el andlisis de los 13 marcadores del CODIS es inferior a uno en un billén,Benasertic! werrncrcoyoesrvssvrosomcosyne |_ Pins PROCEDIMIENTO ba Laboratorio| CROMOSOMA Y EN ADN HUMANO MEDIANTE, AMPLIFICACION POR PCR Y DETECCION POR Rev. ELECTROFORESIS CAPILAR 13 CODIS Core STR Loci with Chromosomal Positions T2365 67 8 oH ce B46 wT 9 0m BX Y Figura 1 Las dos principales compaitias implicadas en identificacién humana (Life Technologies y Promega Corporation) comercializan hoy en dia kits para la amplificacién conjunta de los 13 STRs del CODIS més dos STRs adicionales, que son distintos entre ambas firmas. De esta forma, en una tinica reaccién es posible obtener un perfil genético bastante completo de una muestra Ademés de los STRs autosémicos, existen otros marcadores genéticos de especial relevancia, algunos de los cuales presentan determinadas peculiaridades que los hacen idéneos para aplicaciones concretas. Los STRs del cromosoma Y, son marcadores introducidos posteriormente pero ampliamente validados en el campo forense. El cromosoma Y esté constituido por secuencias polimorficas altamente repetitivas, situadas principalmente en la porcién heterocromética del brazo largo del cromosoma. La mayor parte del cromosoma no se recombina durante la meiosis, y la falta de recombinacién determina que todas las secuencias situadas en esta zona se hereden como un bloque, constituyendo un haplotipo, que es trasmitido de padres a hijos a través de generaciones. Por tanto estos polimorfismos contienen informacién acerca de la historia del linaje paterno. Marcadores del sexo: Amelogenina, es un locus localizado en una regin homéloga de los cromosomas sexuales. Existe una diferencia de 6 pares de bases entre el tamafio del alelo presente en el cromosoma X y el Y, que se debe a una pequefia deleccién en el cromosoma X. El resultado de la amplificacién por PCR de este locus en un ADN femenino (XX) sera de una tinica banda (de 106 pares de bases, con los cebadores mas comiinmente utilizados), mientras que si el ADN es masculino (XY), el resultado serén dos bandas de distinto tamafio (106 y 112 pares de bases, cominmente). Marcador incluido en los kits Identifiler/Identifiler_plus/NGMSElecU/Globalfiler (Life Technologies) y PowerPlex® 16 System (Promega) presentes en este PT.PROCEDIMIENTO Pras Aonasertic) wsvnecrciosoesmessvrosocosy oe | Mann? Laboratorio) CROMOSOMA Y EN ADN HUMANO MEDIANTE, AMPLIFICACION POR PCR Y DETECCION POR Rev.9 ELNCTROROMISIS CAPLAK Adicionalmente, el Kit Globalfiler incluye un indel localizado en el cromosoma Y (¥q11.221), denominado Yindel, para confirmar la amelogenina, que amplifica un fragmento en individuos varones de dos tamaiios, segin su deleccién, denominados! 6 2. La Reaccién en Cadena de la Polimerasa (PCR) es un proceso mediante el cual una parte de una cadena de ADN puede ser replicada para obtener milltiples copias. Descrita por primera vez en 1985 por Kary Mullis. La reaccién de la PCR consiste en la repeticién de un ciclo de temperaturas compuesto de tres tapas cuyo objetivo es sintetizar ADN in vitro: — En la primera etapa se desnaturaliza la doble cadena de ADN a més de 90° C. — En la segunda etapa se baja la temperatura y se consigue el anillamiento de los fragmentos de ADN unicatenarios o primers, de secuencia complementaria a las regiones que flanquean la regién de interés que nos interesa amplificar. — En la tercera etapa se produce la reaccién de extensidn, gracias a la accién de una ADN polimerasa termoestable, cuando alcanza la temperatura optima, Al finalizar los 30-32 ciclos que generalmente constituyen esta reaccién se alcanzan grandes cantidades de ADN de la regién que nos interesa analizar. Actualmente se amplifican de forma simultanea hasta 16 loci en una misma reaccién de amplificacién denominandose entonces «reacciones de PCR multiplex», gracias a que el secuenciador automatico es capaz de discriminar varios colores segin kit comercial (azul, verde, amarillo, rojo, purpura y naranja) que corresponden simulténeamente distintos fluorocromos que excitan al léser en distintas longitudes de onda (figura 2). Por lo tanto si los primers se encuentran marcados con uno de estos fluorocromos en su posicién 5’, podremos discriminar los STRs a parte de por su tamaiio, también por su color. De tal manera que se puede establecer una miiltiplex con varios marcadores. Figura 2 Por Jo tanto, los productos amplificados, ya marcados y bajo condiciones desnaturalizantes, serin separados de acuerdo a su tamafio con una gran resolucién (diferenciacién de una tinica