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Cryptococcus

Definición:
Micosis de curso agudo, subagudo o crónico causada
por un hongo levaduriforme oportunista denominado
Cryptococcus neoformans.
Afecta inicialmente los pulmones y posteriormente
se disemina a piel y vísceras con una clara
predilección hacia el SNC
1884 San Felice Aisla del jugo de durazno una Saccharomyces neoformans
levadura encapsulada
1884 Busse y Aislan el mismo hongo de una Saccharomyces hominis
Buschke lesión
1901 Vuilleman Transfiere la levadura al género
Cryptococcus
1916 Stoddan y Describen los primeros casos Torula histolitica
Cutter clínicos
1935 Benham Establece las diferencias con
Blastomicosis
1952 Lodde Establece la prioridad del Cryptococcus neoformans
nombre
1955 Emmons Demuestra su asociación con
las excretas de palomas
1975 Kwong- Describe los estados perfectos Filobasidiella neoformans
Chung y F. bacillispora
✓ Antes 1981.- Enfermedad rara. Solo casos
esporádicos.
✓Sida.- Susceptibilidad del 5-10% en países
desarrollados hasta 20- 30% en Africa y Tailandia
✓1991 New York > 1200 casos meningitis.
✓ Desde 1989 Conferencia Internacional C/ 3 años.
Solo en EU más de 15 grupos de trabajo.
✓ Es la segunda micosis mas comun en personas
infectadas con VIH
• 45% Sistema Nervioso Central
• 39% Limita a los pulmones,
• 31% Cryptococemia,
• 4% Cryptococemia sola
• Masculino / femenino% 64:36
C. neoformans var neoformans
COMPLEJO C.neoformans var gattii
con 2
C. gattii ESPECIES
C. neoformans
Caracteristicas C, neoformans C. neoformans
var. neoformans var. gattii

Distribución Mundial Tropical y Subtropical*


Fuente ambiental Excreta aves* Eucalyptus
Cápsula Sí Sí
Serotipos A,D, y AD ByC
Estado perfecto F. n. var neoformans F. n. var bacillispora
Agar CGB No crecimiento Crecimiento
Prevalencia Sida Común Rara
Asimilación D- No Sí
Prolina
Distribución de los Frecuencia de Serotipos
Aislamientos clínicos (%)
A D B C
Pacientes no SIDA:
E.U.(excepto California) >80 4 4 2
California >40 <1 37 14
Mundial(clima templado) 50-95 3-70 5 1
Mundial(clima tropical) 30-45 <1 55 <15

Pacientes SIDA
Mundial (excepto Francia) 99 <1 <1 <1
Francia 80 17 0 0
C. neoformans es un organismo de vida libre

¿Cómo ha desarrollado sus mecanismos


de virulencia y su potencial patógeno
para sobrevivir a un parasitismo
accidental?
➔ Leucemias
➔ Linfomas
➔ Sarcomas
➔ Enfermedad de Hodgkin
➔ Tratamientos con esteroides
➔ SIDA más del 90% de los casos en
la actualidad.
Pulmonar

Meningitis
Del SNC Meningoencefalitis
Criptococomas
Cutánea Primaria
Secundaria
Ósea
Diseminada
Manifestaciones cutáneas de la criptococosis sistémica

Pápulas de tipo molusco contagioso


Pápulas acneiformes
Vesículas de aspecto herpetiforme
Pústulas
Lesiones de tipo piodermia gangrenosa
Nódulos subcutáneos con/sin ulceración
Placas eritematosas de tipo erisipeloide o celulitis
Úlceras tórpidas, fístulas (¿osteomielitis subyacente?)
Abscesos, que no suelen ser fluctuantes
Pápulas purpúricas de aspecto vasculítico
Úlcera genital (buscar al criptococo en la orina)
Ulcera oral o rectal
• No es única para los receptores de trasplante
• Sospechoso en pacientes con celulitis que no
responden al tratamiento antibiótico
convencional
• Sitios de participación incluyen extremidad
inferior bilateral, el muslo y la extremidad
superior. Las lesiones ulcerosas son
comunes.
• El diagnóstico es sencillo:
• piel biopsia,
• antigeno de cryptococos positivo en suero
Datos clínicos que sugieren criptococosis visceral

Lesiones cutáneas nodulares subcutáneas


Ausencia de adenopatía regional sugiere
criptococosis sistémica
Presencia de lesiones cutáneas múltiples
Lesiones cutáneas únicas en áreas corporales
cubiertas de ropa
Presencia de signos de afectación visceral
• Pulmonar: Puerta de entrada
Etapa temprana vida
Reactivación

Manifestaciones clínicas y radiológicas:


•Son inespecíficas
•80% no desarrollan síntomas
•Lesiones nodulares
• Inmunodeprimidos:
Pulmonar: •Rápida diseminación SNC
•Casos fulminates
•Más frecuentes infiltrados
Alveolares e intersticiales
• Sistema Nervioso Central:

Es la más frecuente. Se origina a


partir de un foco pulmonar .
Criptococoisis del sistema nervioso central
Los síntomas : cefalea frontal intermitente, aumenta de intensidad
Vomito,
Vahído,
Vértigo, y
Rigidez y dolor del cuello.
Trastornos mentales con depresión, desorientación, apatía, inquietud,
irritabilidad, delirio.
Los signos físicos son: meningitis crónica que se manifiesta con :
rigidez en la nuca y signos de kernig y Brudzinski positivos.
La ambliopía en ocasiones aparece estrabismo, nistagmo, ptosis,
diplopía, Ataxia y hemiplejia
Neurorretinitis y edema papilar.
Perdida de peso y fuerzas
Estupor
Coma y
Muerte por insuficiencia respiratoria.
• Sistema Nervioso Central:
Las lesiones cutáneas , subcutáneas y glandulares suelen diagnosticarse
por biopsia y cultivos sistemáticos.

Necesario para el diagnostico diferencial con linfoblastoma

➢Lesiones pulmonares : tuberculosis


actinomicosis
blastomicosis
coccidioidomicosis
candidiasis

➢Crytococosis del sistema nervioso central – meningitis


encefalitis
tumor cerebral
absceso del cerebro
psicosis demencial
demencia paralítica
Antígenos (aglutinación de partículas
SUERO Y de látex) Positivos
LCR en 77 a
ORINA (anticuerpos fluorescentes 99%
Anticuerpos indirectos)

❖ Fijación de complemento
❖ ELISA
•Incremento de la presión
•Leucocitosis predominante linfocitaria
LCR ALTERACIONES •Aumento de proteínas
SON LEVES •Hipoglucorraquia

Tinta
china
Es positiva 50%

Aglutinación
en látex
Es positiva 90%
1. Toma de muestras: Depende de la variedad clínica (esputos,
LBA, LCR, exudados, biopsias).
2. Examen directo con Tinta China: El objetivo es resaltar la
cápsula. Se observan células levaduriformes redondeadas
rodeadas por una cápsula que puede variar en grosor. Es
importante buscar levaduras gemantes.
Los cambios histologicos puede ser de dos tipos,
y ambas pueden hallarse en la misma muestra.
❖La reacción gelatinosa se caracteriza por la
abundancia de esporas y la escasa reacción
inflamatoria acompañante.
❖La reacción granulomatosa, se caracteriza por
un número escaso de organismos distribuídos en
el seno de zonas de dermis necrótica, rodeadas Granuloma con necrosis central rodeada de
de una empalizada de células epitelioides y células epiteloides y linfocitos.
multinucleadas

❖Las blastoconidias de C. neoformans son


redondas u ovoidales y miden entre 2 y 12 um
en función del tamaño de la cápsula celular
❖El grosor de la cápsula es tanto mayor cuanto
menor es la reacción inflamatoria circundante.
Tinción PAS en la que se aprecian estructuras redondeadas
Eosinófilas correspondientes a C. neoformans.
Cryptococcus en LCR
Test de tinta china
3. Cultivo: Colonias limitadas, mucoides, convexas, blanco
amarillentas.
Medios de cultivo:
ADS
Extracto de levadura
Agar BHI
nunca usar Micosel.

•Medios diferenciales con sustratos fenólicos


Agar ácido caféico
Staib Colonias
AESG color café
Agar semillas de Niger
4. Pruebas morfolológicas y fisiológicas:

❖ Crecimiento a 37ºC

❖ Tubo germinativo

❖ Filamentación
Crecimiento en agar CGB (canavanina-glicina-azul de bromotimol), útil para
diferenciar a los agentes etiológicos de la criptococosis: C. neoformans (Cn) y C.
gattii (Cg).
5. Identificación bioquímica:

• Producción de ureasa

• Asimilación de azúcares (lactosa e inositol)

• Fermentación de azúcares
 Criptococosis
 La detección de antígeno capsular en líquidos orgánicos y
especialmente en LCR ante la sospecha de meningitis
criptocócica.
 Ello se debe en gran parte a la rapidez, sencillez técnica y
especificidad de la prueba.
 Permite el diagnóstico, en 10-15 min, de aproximadamente
el 99% de las meningitis criptocócicas y el 67% de las
criptococosis diseminadas.
 El aislamiento de C. neoformans puede requerir varios días.
 Se utilizan dos tipos de técnicas, una cualitativa y otra
cuantitativa.
 La técnica cualitativa se emplea para diagnosticar nuevos
casos de criptococosis o para confirmar reinfección
especialmente en el sida.
 La técnica consiste en la detección de antígeno capsular
criptocócico mediante anticuerpos monoespecíficos dirigidos
frente a él y unidos a partículas de látex. La aglutinación de
las partículas de látex tras la reacción antígeno-anticuerpo se
detecta a simple vista..
 La técnica cuantitativa se emplea habitualmente para el
seguimiento
 de la evolución de pacientes ya diagnosticados mediante el
título de antígeno capsular presente en la muestra clínica, que
generalmente es suero o LCR.
 Es útil para conocer la eficacia del tratamiento antifúngico
aplicado.
 FUNDAMENTO
 Consiste en la precipitación de particulas de latex
sensibilizadas con anticuerpo anti-polisacarido capsular de C.
neoformans en muestras de LCR, suero y orina.
 Esta prueba posee una sensibilidad del 99% para LCR de
pacientes con criptococosis meníngea.
 El limite de detección es de 3.2 ng/ml a 12.5 ng/ml .
 Una reaccion negativa no descarta infección.
 La prueba tiene valor diagnostico y pronostico, un aumento
progresivo de titulo es de mal pronostico.
 Cuando la terapia es inadecuada se observa aumento o
mantenimiento de los titulos sobre muestras consecutivas.
 Para evitar falsos negativos se tratan los especimenes clínicos
con pronasa (DE) previa a la prueba, esta enzima cuya funcion
es separar los complejos inmunes circulantes y destruir el
factor reumatoideo, elimina los falsos positivos y aumentar la
sensibilidad de la prueba.
 LECTURA DE RESULTADOS
 La lectura es visual y se debe realizarse de la
siguiente manera:
 Negativo: suspensión granular muy fina con
ausencia de aglutinación
 Positivo +: suspensión con escasos grumos contra
un fondo homogeneo lechoso.
 Positivo ++: suspensión con escasos a moderados
grumos contra un fondo moderamente
homogeneo.
 Positivo +++: suspensión con moderados a
abundantes grumos contra un fondo claro.
 Positivo ++++: suspensión con abundantes
grumos contra un fondo totalmente claro
CRYPTOCOCOSIS LATEX
 Cuando la prueba es positiva + o mas, se debe
realizar titulaciones para el seguimiento de
tratamientos.
 Las diluciones recomendadas son:
◦ positivo ++ se recomienda comenzar al 1:2;
◦ positivo es +++ o ++++ se suguiere comenzar en 1:100
 Posteriormente para muestras seriadas del mismo
paciente se debe utilizar el mismo esquema de
dilucion.
 El seguimiento se debe realizar hasta la
negativizacion de la aglutinación.
 Cuando se realiza titulaciones para seguimiento de
tratamientos es conveniente realizarlas con el
mismo equipo para evita variaciones.
La sensibilidad varía entre el 93% y el 100% con un 93-98% de
especificidad.
Puede haber falsos positivos:
 Presencia de factor reumatoide

 Pacientes con lupus

 Pacientes con sarcoidosis,

 Arrastre medio de cultivo de agar chocolate,

 Asas de platino o desinfectantes.

 Infección sistémica por Trichosporon ashaii

Desaparecen los falsos positivos al tratar el suero con pronasa o


2-mercaptoetanol.
6. Serología:

• Aglutinación al Látex (detección de Ag)

• IFI (detección de Ac)

• ELISA
Es una infección micótica primaria o secundaria causada por
miembros del género Candida.
Las manifestaciones clínicas pueden ser aguda, subaguda o crónica
a episódica.
Participación puede estar localizado en la boca, garganta, piel,
cuero cabelludo, la vagina, los dedos, las uñas, los bronquios,
pulmones, o el tracto gastrointestinal, o convertirse en sistémica
como en la septicemia, endocarditis y meningitis.
Distribución: En todo el mundo.
Agentes etiológicos: Candida albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C.
krusei. C. parapsilosis, C. guilliermondii y C. pseudotropicalis.
Todos están en todas partes y se producen de forma natural en los
seres humanos.
Cutaneas:
Localizadaas: grandes pliegues, interdigitales y uñas
Difusas: amplias superficiales
Profundas: granulomas candidiasicos

Mucocutaneas:
Mucosa oral: muguet, queilitis, glositis
Mucosa genital: vaginitis, balanitis
Mucosa digestiva: esofagitis, enteritis
Mucosa respiratoria: bronquial , pulmonar
Candidiasis mucocutanea cronica
Localizadas
Sistema nervioso central
Endocarditis
Tracto urinario
Artritis y osteitis
Peritoneo, higado, bazo y vesicula biliar
Diseminadas
Candidiasis diseminada cronica o hepatoesplenica
Candidiasis diseminada aguda
CUANDO DEBE SER CONSIDERADA UNA
LEVADURA PRODUCTORA DE UNA MICOSIS
Se debe establecer si la levadura aislada está causando infección,
esta colonizando o es sola una contaminación.
Es necesario una correlación entre el examen directo y el
aislamiento de la levadura.

C. neoformans. Tinta china positiva o recuperada de cultivo es


significativo.

C. albicans aisladas de esputos o de orina (chorro del medio), rara


vez patógena.

En pacientes inmunosuprimidos las levaduras aisladas de sitios


estériles es indicativo de infección diseminada con probable
fungemía
El diagnóstico se refuerza si en el examen directo o
coloraciones se observan pseudohifas (p/micelio) o
blastosporas (b/conidias) aisladas o gemantes.
Hemocultivos positivos (25-50%) pueden indicar:
Candidemia transitoria debida a colonización de
catéteres.
Candidemia profunda o una invasiva
Hemocultivos negativos no descarta fungemia
Aumento de pacientes imunocomprometidos
Mayor utilizacion de procedimientos medicos
invasivos
Mayor uso de fluconazol
Sobrevida de pacientes críticos
Mejoramiento de recursos diagnósticos
Variáveis Séries
AUTOR RICHARDS et al. VINCENT et al. PFALLER et al.
(EUA) (EUROPA) (EUA)

Ano 1993 1995 1999

AGENTES 1o S. coag. neg. 1ºEnterobacterias 1o S. coag. neg.


2º Enterobacterias 2o S. aureus 2o S. aureus
3o S. aureus 3o P. aeruginosa 3o Enterococcus sp
4o Candida sp 4o S. coag. neg. 4o Candida sp
5o Enterococcus sp. 5o Candida sp. 5o Outras
6º Outras 6o Outras
Candidemia hospitalaria
Indicadores de gravedad

Total - admisiones
Candidemia

Factor de riesgo
Alto riesgo Antibioticos 1.7
Leucemia ag Cateter IV 7.2 Óbito p/
Transplantes Colonizacion Sobreviven candidíasis
Candida 10.4
Quemados
Hemodialisis 10.4
Cirugia GI Óbito p/
Prematuros enfermeda
de base

Wenzel. Clin Infect Dis 1995;20:15


Etiologia de la candidemia:
relevancia de las espécies “no-
albicans”
Espécie Europa (170) USA (203) Canadá (61)

C. albicans 53 56 53
C. parapsilosis 21 6 23
C. glabrata 12 19 11
C. tropicalis 6 7 8
C. guilliermondii 4 1 --
C. krusei 1 2 2
Candida spp 3 6 3
• Espécies Número (%)

C. albicans 43 (42)
C. parapsilosis 22 (21,3)
C. tropicalis 25 (24,2)
C. glabrata 8 (7,7)
Outras 5 (4,8)
Predomina en candidiasis genital, oral y cutánea
(>90%).
En candidemias y enfermedad invasora continúa
siendo la causa más frecuente, pero se ha
observado una disminución del 7%-10% (1997-
2005) en su prevalencia.
También se ha notado disminución de acuerdo con
el incremento en la edad, después de la
exposición a los azoles y en las UCI
Se ha incrementado desde 1993, su frecuencia como
causa de candidemia en Norte América.
Se ubica como la segunda especie más frecuente.
La cataloga como un importante oportunista emergente
con gran potencial para desarrollar resistencia a los
antimicóticos, especialmente al fluconazol.
Se la asocia a pacientes mayores de 60 años,
trasplantados de órganos sólidos o con cáncer.
La profilaxis con fluconazol es un factor predisponente.
En latinoamerica esta especie tiene una baja incidencia
(4-6%).
Está conformado por tres especies: C. parapsilosis, C.
orthopsilosis y C. metapsilosis.
El complejo es considerado patógeno exógeno y se
encuentra como colonizador transitorio de piel-uñas y,
ocasionalmente, de mucosas.
Se asocia a infecciones adquiridas a través de las manos y
de los ambientes hospitalarios e, igualmente, también con
nutrición parenteral, cirugías recientes que requieran
catéteres intravenosos y uso de caspofungina en
pacientes con trasplante de células madre.
En Latinoamérica esta especie está distribuida en todos
los rangos de edad, incluyendo neonatos, grupo que es el
más frecuentemente afectado por esta especie en
Norteamérica y otras regiones del mundo
Es considerada una causa importante de candidiasis
invasora en pacientes con cáncer, especialmente con
leucemia, neutropenia y en trasplante de células madre.
Se ha observado disminución de candidemias por esta
especie con el uso profiláctico de fluconazol en
pacientes con cáncer.
Esta especie disminuyó como agente de las candidemias
en Norteamérica del 10%-12% en los años noventa a
7%-8% en el año 2000.
En América Latina y Asia, su incidencia en candidemia
es mayor del 15%.
Es una especie considerada emergente debido al uso
profiláctico con fluconazol
Está asociada a pacientes con neutropenia.
La colonización por esta especie es un predictor de
candidemia.
Se trata de un microorganismo multidrogo-resistente
debido a que tiene una resistencia intrínseca al
fluconazol,
Tiene una susceptibilidad disminuida a la anfotericina y
la fluocitosina que está además, asociada a alta
mortalidad (80%-40%)
Importancia de la definicion de la
espécie

Genero Candida: mas de 163 espécies - 15 patógenas


Relevancia epidemiológica
Diversidad de susceptibilidad los antifúngicos
Base para definicion de la terapeutica
Necesidad de identificacion correcta y rápida
Para un diagnóstico correcto es necesario seleccionar,
obtener y enviar la muestra adecuada.
Existen condiciones importantes para tener en cuenta, como
sigue: las muestras deben ser recolectadas asépticamente en
frasco estéril con tapa rosca y se deben enviar al laboratorio
a la menor brevedad posible.
Su recolección y transporte varían de acuerdo con el
espécimen y sitio de la infección.
Además, cada espécimen debe estar bien rotulado, debe ir
acompañado de los datos del paciente (nombre completo,
sexo, edad) y datos clínicos (factores de riesgo, tratamiento
con antibióticos o antimicóticos, sospecha clínica), examen
solicitado y nombre, dirección y otra información de contacto
del médico que lo solicita
Los aislamientos de Candida spp.
provenientes de sitios corporales no
estériles (orina, secreciones respiratorias)
presentan dificultades en su valoración
pues no permiten establecer un diagnóstico
de candidiasis invasora y aun los cultivos
cuantitativos no logran diferenciar entre
colonización e infección; no obstante,
tienen importancia como factor de riesgo.
Criterios morfológicos:

Macroscópicos:
morfología de la colonia

Microscópicos:
Presentación de las levaduras (Blastoconidias, artrosporas
y de pseudomicelios)
Producción de Clamidosporas (Bilis Agar, Agar harina de
maiz)
Tubo germinal
Métodos disponíbles

•Método clássico
•Métodos comerciales
Kreger-van Rij, 1984
En medio líquido: Formación de sedimento, anillo o película.
En medio sólido:
Textura: cremosa, mucosa.
Color: blanco a beige; con pigmento carotenoide , naranja a rojo
(Rhodotorula sp., Sporobolomyces sp.), sin pigmento carotenoide
(Metschnikowia pulcherrima).
Superficie : lisa, rugosa, cerebriforme, etc.
Con filamentos o pseudofilamentos :
in vitro : en función del medio utilizado.
in vivo : Cándida spp. (de saprófito a patógeno).
Pseudofilamentos :
los brotes se alargan y producen cadenas ramificadas, sin separación.
Filamentos verdaderos : el brote crece continuamente.
Examen microscópico directo
fresco
Examen microscópico directo
fresco
Examen microscópico directo
fresco
Artrosporas: Esporas formadas por ciertos tipos
levaduras con filamentos verdaderos. Trichosporon.
Clamidosporas: C. albicans, esporas grandes, redondas,
de pared gruesa.
Balistosporas: Sporobolomyces esporas producidas de
una protuberancia de la célula madre, son
expulsados a gran distancia.
Macromorfologia en SGA

Colonia

Blanca/Biege Seca
Rugosa Mucoide Anaranjada
Cremosa Achatada

Candida Trichosporon Cryptococcus Rhodotorula C. krusei


Geotrichum
C. rugosa
Aspecto del cultivo en ágar Sabouraud-dextrose
Tubo germinativo
C. albicans: Formacion de tubo germinativo en blastoconídios expuestos a
suero humano o animal, luego de 2-3 h de incubacion a 37oC
Tubo germinativo

Negativo Positivo

Outras espécies de C. albicans


levedura
C. Dubliniensis
Crece a 42ºC
Microcultivo

Técnica de cultivo en lamina o placa de Petri sobre medio


ágar-harina de maiz con Tween 80
Estímula la formacion de pseudohifas a baja tension de O2
Visualizacion de: artroconídios, blastoconídios,
clamidoconídios, pseudohifas e hifas verdaderas
Presencia y disposicion entre 48 a 96 horas de incubacion
Microcultivo
Examen microscópico directo

Hemocultivo
Giemsa
Examen microscópico de
colonias levaduriformes
Cryptococcus sp

Saccharomyces cerevisiae

Pichia membranifaciens Candida globosa


Examen microscópico de
colonias levaduriformes

Saccharomyces cerevisiae
Candida krusei

Examen microscópico de
colonias levaduriformes
Trichosporon spp
Trichosporon cutaneum Examen microscópico de
colonias levaduriformes
Blasto-artroconidios
Examen microscópico de
colonias levaduriformes
➢ en agar harina de maíz - Tween 80
➢ agar arroz - Tween 80
25ºC por
Microcultivo ( Dalmau, 1929 ) Estudio micromorfológico de levaduras 2 a 7 días
Microcultivo:

Pseudohifas + Blastoconídios

Sin clamidoconídios Con clamidoconídios

Otras espécies de C. albicans


levadura
C. dubliniensis
Pseudohifas, blastoconídios, Clamidoconídios

C. albicans
C. dubliniensis
C. albicans C. dubliniensis

Termotolerancia (42 - 45oC)


C. albicans (+) C. dubliniensis (-)

Caldo NaCl hipertonico


C. albicans (+) C. dubliniensis (-)

Alves SH, Milan EP et al, Diagn Microbiol Infect Dis, 43:85-86, 2002
Microcultivo:

Pseudohifas
Blastoconídios
Sin clamidoconidios

Candida spp

Pruebas bioquímicas
Blastoconídios sin pseudohifas o c/
pseudohifas rudimentares
Microcultivo: ausencia de pseudohifa

Sin cápsula y urease (-) Con cápsula y urease (+)

C/ ascosporas S/ ascosporas
Cryptococcus
Rhodotorula

Pichia
Hansenula
Saccharomyces
Candida glabrata
Busqueda de cápsula

Cryptococcus spp
Produccion de ureasa
Uréa de Christensen → lectura
de 24-48h
Interpretacion:
Trichosporon spp → variáble
Cryptococcus spp → positivo
Candida spp → negativo (exceto
C. lipolytica e eventualmente C.
krusei)
Reproduccion sexuada
Estruturas de reproduccion sexuada = ascosporos
Medios que estimulan la produccion de ascosporos
V8: 7-10 dias
Ágar extrato de malte,
ágar acetato de sódio
Inoculacion de levadura en medio de cultivo apropriado
Frotis de cultivo teñido por la técnica de ácido-
resistencia visualizacion de los ascos que se colorean de
verde
Generos: Saccharomyces, Pichia, Hansenula, etc.
Artroconídios
Microcultivo:
Artroconídios

C/ blastoconídios S/ blastoconídios
y ureasa (+) y ureasa (-)

Trichosporon Geotrichum
Esquema de Identificacion
Leveduras

Crescimento rápido no estimulado por lipídios Crescimento lento estimulado por lipídios

Malassezia spp.
Colonias alaranjadas Colonias blancas

Rhodotorula spp. Blastoconídios Artroconídios

Urease (+) Urease (-)


Cápsula (+) Cápsula (-)

Trichosporon spp. Geotrichum spp.


Cryptococcus spp Ascosporas (+) Ascosporas (-)

Leveduras sexuadas Candida spp.


Saccharomyces spp. Identificação baseada em
Pichia spp. Assimilação
Fermentação
Cryptococcus Trichosporon Geotrichum Sacharomyces
Pichia
Rhodotorula Candida Hansenula

Caracteres bioquímicos
Permite la diferenciaccion el nível de espécie
Características metabólicas inherentes a cada
espécie de levadura
Asimilacion de carbohidratos (Auxanograma)

Capacidad de asimilar determinado carbohidrato como


única fuente de carbono para mantener la viabilidad celular
Medio sólido sin fuentes de carbono, con inóculo a ser
testado
Adicionarse el azúcar que se desea testar → 15 azúcares
Despues incubacion (24 - 72h), la presencia de crecimento
visíble (turvidez) indica asimilacion (+)
Capacidad de utilizar determinado
azúcar para producion de energia
en baja tension de O2 con
producion de etanol y gás (CO2)
Medio basal líquido conteniendo
solucion de un azúcar + inóculo → 6
azúcares
Visualizacion de la formacion de
CO2 en tubos de Durham invertidos
 Lectura: 24h - 14 dias
Asimilacion de nitrogeno

Algunas levaduras poseen capacidad de asimilar nitrogeno


inorganico a forma de nitrato (lectura: 24-48h)
Medio sólido basal conteniendo fuente de C, mas sin fuente
de N + inóculo
Agreguese nitrato de potássio en el campo y peptona (control
positivo) en otro campo - presencia de crecimiento visíble
(turbidez) indica asimilacion (+)
Identificacion de las principales levaduras de interes clínico
Assimilacion
Levaduras Morfologia
Gli Sac Gal Raf Xil Cel Tre Dul Mal
C. albicans Clamidocon. + V + - + - + - +
pseudohifas/Bl
C. tropicalis astoc en + + + - + V + - +
cadenas

pseudohifas
curvas/
C. parapsilosis células + + + - + - + - +
gigantes
pseudohifas
C. guilliermondii finas + + + + + + + + +
Blastocon.

pseudohifas/
C. krusei blastoc. + - - - - - - - -
alongados
C.glabrata pseudohifas + - - - - - + - -
(-)
Ph=pseudo-hifa; Gli=glicose; Sac=sacarose; Gal=D-galactose; Raf=rafnose; Xil=D-xilose;
Cel=celobiose; Tre=trealose; Dul=dulcitol; Mal=maltose; V=variáble
Limitaciones del método clásico

Técnica laboriosa

Consumo de tiempo

Requiere profesional experimentado


Métodos comerciales
Requisitos Objetivos
• Padronizados • Facilitar el trabajo
• Simples de laboratório
• Rápidos • Ampliar el
• Fácil lectura e espectro de
interpretacion
diagnóstico
• Bibliografía
• Mejorar el
• C0sto-beneficio
diagnóstico
• Identificacion
precoz
• Apoyar al clínico
CHROMAgar Candida

Crecimiento en CHROMAgar
Candida :

C. albicans (verde)
C. tropicalis (azul)
C. krusei (rosa y rugosa)
C. parapsilosis (rosácea-lisa)
Prototheca wickerhamii (crema)
1.Enzimáticos

Medios cromogénicos:
CHROMagar Candida®
Cromogen Albicans ®
Candida ID ®
Albicans ID2 ®
CandiSelect ®
Fluoroplate Candida ®
Agar SDCA-MUAG ®
Métodos
Vantajas
✓ Rapidez en la identificacion de espécie o
espécies mas freduentes en la rutina
✓ Posibilidad de aislamiento en cultivos mixtos
✓ Facilidad de lectura y simplicidad de
procedimiento

Limitaciones
✓ Especificidad (variáble conforme o método)
✓ Costo (kit e leitura UV)
✓ Necessidad de identificacion de espécies no
albicans
Métodos manuales de
identificacion:

✓ Galerias API: ✓ Auxacolor


✓ID 32C ✓ Fungifast I Twin
✓API 20C AUX ✓ Candifast
✓ RapID Yeast Plus
System

J Med Microbiol,50:1105-10,2001; Med Mycol,37(2):11-7,1999;


J Clin Pathol,52(4):271-3,1999
Métodos Manuais

ID32C
AUXACOLOR®
C.Neg GLU MAL. SAC. GAL. LAC. RAF. INO.

CEL. TRE. ADO. MEL. XYL. ARA. ACT. POX.


Pruebas adicionales

Cápsula

Microcultivo Pigmentação
 Sistemas semi-automáticos:
 API 20C AUX®
 Galería ID 32C®
 Sistema Vitek ®
Asimilación de azúcares ID 32C (API)
Métodos automatizados de
identificacion
✓Microscan
✓WalkAway - 40
✓WalkAway - 96
✓Vitek YBC
✓Vitek 2 ID-YST

Clin Microbiol Rev, 5(3):302-27,1992; JCM,34(10):2408-


10,1996; JCM,36(5):1197-200,1998; J Clin Pathol,52(4):271-
3,1999; JCM,37(6):1967-70,1999
• Sistemas automáticos:
• Sistema Vitek 2 ID-YST Sistem
® (Identificación y sensibilidad)
• Sistema Biolog YT Microplate®
• Rapid Yeast Identification Panel
Micro Scan®
Vitek
VITEK YBC system (bio Mérieux.Vitek)
 Pruebas Rápidas

RapID Yeast Plus


Fongiscreen 4H® System®
 Criterios Inmunológicos:

Bichro-latex albicans® Krusei-color®


Cuidados en la utilizacion de sistemas comerciales
manuales y automatizados para la identificacion de
levaduras

Evaluar costo x benefício antes de adotar el


método comercial
Evaluar la correlacion del sistema comercial con el
método clásico
Guardar los kits a temperatura adequada,
respetando su plazo de validez
Realizar adecuado mantenimiento del equipo
Familiarizarse com los procedimientos y patrones
de lectura
Cuidados en la utilizacion de sistemas comerciales
manuales y automatizados para la identificacion de
leveduras
Certificarse sobre cuales espécies son identificadas por cada
método
Cuidado para obtener inóculos puros e viábles
Utilizar siempre microcultivo y otros testes adicionales.
Realizar control de calidad con organismos controle.
Conocer las espécies problema.
SUCEPTIBILIDAD
ANTIFUNGICA

METODO DE DIFUSION EN AGAR CON


LECTURA AUTOMATIZADA
Presionar el hisopo contra el
borde interno del tubo para
remover el exceso de líquido
antes de inocular

Asegurese de usar hisopos de


algodón y no de dacrón.
Después de 15 mínutos de haber ajustado el inoculo cubrir el agar
completamente con el hisopo en 3 diferentes direcciones. No
presione el hisopo sobre el agar.
Deje desaparecer la humedad de la superficie del
agar antes de colocar los discos. Asegurese que cada
disco quede firme sobre el agar. Use un dispensador
de discos si es posible.
Incube los placas por 18 horas a 35°C. El crecimiento sobre el agar
debe ser uniforme, formando una capa confluente. Para C neoformans
incubación por 72 horas.
TECNOLOGIA

Sistema lector de placas mediante análisis digital


de imagen

BIOMIC®
Cámara
Tarjeta de Vídeo
Computador
Como realizar y leer pruebas de
difusión en Agar con BIOMIC®
 Método M27-A de los NCCLS
 Método propuesto por el EUCAST
 Métodos alternativos y comercializados
◦ Sensititre YeastOne
◦ Etest
◦ Fungitest
◦ Difusión de disco
No hay tecnología y no hay máquina que substituyan
al conocimiento, la experiencia y la sensibilidad
del ser humano.
Solo él es capaz de interpretar, analizar y juzgar
correctamente.

Armando Fonseca
Presidente - SBPC/ML
Malasseziosis: Afecciones
producidas por Malassezia
Zona del Palmar

Dermatitis seborreica Chaco- Zona del palmar


Dermatitis seborreica

Malassez en 1874 fue el primero en asociar a Malassezia con


descamaciones del cuero cabelludo

la relación entre DS y Malassezia fue ya sugerida por Saboraud en 1932

Actualmente Malassezia
considerado importante en la etiología de la DS

• observación del alto numero de estos agentes en los materiales obtenidos de


DS
• efectividad de los tratamientos antimicóticos
• la recolonización en los casos de recurrencia
Clínicamente se presenta como descamación e
inflamación en áreas del cuerpo ricas en glándulas
sebáseas

cuero cabelludo
pecho

oídos

también en axilas e ingle

espalda Frente y surcos nasolabiales


Las lesiones son rojizas y cubiertas de
escamas aspecto grasoso
Malassezia
Produce fosfolipasas

Individuos con DS
Mayor cantidad de
lípidos sobre la piel Liberación de ac. araquidónico

Metabolitos involucrados en la inflamación en la piel

mecanismo por el cual Malassezia puede


generar una inflamación

DERMATITIS

el debate sobre el verdadero rol patogénico continua en estudio


CUERO CABELLUDO
CARA:
Frente, surco nasolabial,
zona de la barba
PECHO AXILAS
ESPALDA
OIDO
en inmuno-competentes
Incidencia
después de la pubertad

BAJA en personas normales

Estados inmunológicos deprimidos


stress físico o mental

crónica con exacerbaciones frecuentes

La DS infantil
generalmente remite espontáneamente
después de los 6 meses.
Raramente persiste pasado el año de vida
Caspa
Es una forma descamativa no inflamatoria de la DS confinada al cuero
cabelludo
Dermatitis atópica
Dermatitis atópica
Inflamación crónica de la piel, de etiología a veces discutida.

La etiología de la DA es considerada como una reactividad cutánea


anormal a alergenos, con una predisposición genética

Malassezia contacto con sistema inmune

Alergeno
factor exacervador

en lesiones de DA en zonas seborreicas


barrera cutánea afectada
Dermatitis atópica

Lesiones de DA donde Malassezia se encuentra gralmente involucrada

Lesiones eczematosas, inflamativas,


descamativas y pruriginosas

en lesiones de DA en zonas seborreicas


• Cuero cabelludo
• Cara
• Cuello
• Espalda
Dermatitis atópica
Y
Malassezia

Cara y cuello
Cuello y axila

Cara y Cuero cabelludo


Foliculitis

Humedales
Chaco
Malassezia

Produce oclusión folicular

Sobrecrecimiento en
el folículo piloso

Favorecido por factores externos y/o a la


reducida resistencia por parte del hospedador

Inflamación

productos de la levadura y a los ác.grasos libres producidos como resultado


de la actividad lipasa
Presentación clínica

pápulas foliculares y pequeñas pústulas (granos)


pruriginosas (erupciones tipo acné)
Ocurre principalmente en
Foliculitis Pecho
Espalda
Brazos
Cara

Pecho

Espalda
Factores favorecedores

FACTORES EXÓGENOS:

• Calor y humedad ambiente


• Aplicación de sustancias grasas, emolientes
oleosos (aceites)
• Oclusión (impide la aireación) Uso de ropas
sintéticas
favorecen la proliferación de Malassezia

• Piel grasa
• Stress y fatiga FACTORES ENDOGENOS:
• Diabetes
• Tratamientos con esteriodes orales (Ej: prednisona)
• Tratamientos inmunosupresivos
• Anticonceptivos
• Elevado peso, que resulta en más sudoración y zona ocluidas.
• Antibioticoterapia oral, como tetraciclinas, eliminan la capacidad de
competición entre bacteria y levaduras saprofitas de la piel, favoreciendo el
desarrollo de estas últimas
Otras asociaciones

Acné vulgaris

La foliculitis por Malassezia puede coexistir


con casos de acné
Favorecido por el incremento
de aceite en la piel

Malassezia contribuye a la inflamación


presente en las lesiones de acné.
Pacientes con acné verdadero pueden estar acompañados de Malassezia
En estos casos hay un sobrecrecimiento tanto de bacteria como de
levaduras

Se ha comprobado que la foliculitis por Malassezia a veces resulta ser la


razón de los casos de acné que no mejoran con tratamientos antibióticos
prolongados ya que ambas pueden coexistir
Asociaciones con otras afecciones superficiales

Ha sido comprobada la asociación de Malassezia con otras


afecciones superficiales, entre ellas:

• Psoriasis
• Acne vulgaris
• Dacriocistitis
• Blefaritis seborreica
• Pustulosis neonatal
• Papilomatosis confluente y reticulada
• Onicomicosis
Psoriasis
La sobre infección por Malassezia de la psoriasis pueden causar una
exacerbación

el tratamiento de ella resulta


en un
mejoramiento de la afección

Probablemente contribuye con la


inflamación asociada con esta
enfermedad.
Diagnóstico

Chaco -Zona del Palmar


Diagnóstico

Toma de muestra RASPADO

KOH - NaOH
20 – 40X
Examen directo +
Tinta Parker

Blanco de Calcofluor como método más selectivo (mejor visualización),


especialmente en DS y otras afecciones de piel
DS - DA

Elementos levaduriformes y micelios

M. globosa

Abundantes elementos levaduriformes


DS - DA

M. obtusa

M. restricta

Abundantes elementos levaduriformes


Foliculitis - acne vulgaris

Los exámenes microscópicos directos y la histopatología muestra la presencia


de abundante Malassezia en el folículo pilosebaseo.

Malassezia en folículo piloso


Cultivo
No de rutina
Requiere de ácidos grasos para su desarrollo

Medios de cultivos especiales Temp: 31º y 35º, ideal 32ºC.

Medio de Dixon modificado


Medio de Leeming y Notman

Medio de Sabouraud + aceite de oliva


• poco rendimiento
• no desarrollan todas las especies
Métodos convencionales
Tipificación

Cultivo

Estudio Macro y
Micro-morfológico

Pruebas bioquímicas
y fisiológicas

No satisfactorio
Identificación
Pruebas bioquímicas
y fisiológicas

Crecimiento a diferentes temperaturas


Test de catalasa
Producción de pigmento (Triptofano)
Hidrólisis de la esculina
Asimilación de Tween 20,40,60,80

M. pachydermatis
M. obtusa

M. restricta
M. obtusa puede distinguirse por su morfología

M. restricta: catalasa negativa


Las nuevas especies tienen
características fisiológicas similares
a las ya estudiadas

M. dermatis y M. furfur
solo difieren en el mol %
G+C

Patrones de asimilación semejantes


Desventajas

 Colonias no diferenciables – variación en las colonias


 Micromorfología: difícil observación
 Identificación por cultivo en medios adicionados con Tween para ver
asimilación :
◦ Necesita experiencia en la interpretación de las zonas de crecimiento
(asimilación) Resultados poco claros e inespecíficos.
◦ M. furfur – M. sympodialis – M slooffiae son fisiológicamente similares,
por lo tanto tienen patrones de asimilación semejantes
◦ Lo mismo ocurre con M. globosa – M. obtusa y M. restricta.
M. obtusa puede distinguirse por su diferente morfología y M. restricta por
ser la única especie catalasa negativa.
◦ Las nuevas especies tienen características fisiológicas semejantes
M. dermatis y M. furfur solo difieren en el mol % G+C
◦ NO permite detectar asociaciones
Identificación Caracterización genotípica

Métodos de Biología molecular

PFGE (Electroforesis de campo pulsante)


RAPD (Amplificación randomizada del DNA nuclear)
PCR – RFLP (PCR – fragmentos de restricción de largo polimórfico)
PCR – REA (PCR – análisis de restricción enzimática)

• Es precisa. Analiza solo 1 región genómica


LSU rRNA.
PCR - REA • Es práctica y por lo tanto rápida.
• Menor costo
• Detección de asociaciones
Epidemiología

Incidencia y frecuencia de especies de Malassezia


➢ Diferentes regiones geográficas
➢ Distintas patologías
➢ Sitios anatómicos de las lesiones

Metodología de
✓ Recolección de muestra
✓ Aislamiento y cultivo
✓ Tipificación
Pitiriasis versicolor
Infecciones sistémicas

M. globosa, M. sympodialis y M.
furfur
Foliculitis
Dermatitis Seborreica
Dermatitis Atópica

Papilomatosis Psoriasis

2ria a otras afecciones de piel


Pitiriasis versicolor
n

100 n= 126
90
80
70 50%
60
50 25%
40 16,6%
30 58
20 36 8,4%
27
10 5
0
a

ae
os

ali

rfu

ffi
lob

di

. fu

loo
po
.g

.s
ym
M

M
.s
M
50
Foliculitis 60
50%
43% n= 21 50 Dermatitis
45
40
33% 40 atópica
35
30 30 25% 21%
25
20
20
15
4%
10
10 14% 10%
5
0
0 n= 24

cta
a

lis

fu
os

dia

tri
ur
lob

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es
po
a

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ae

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os

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M
di

M
. fu
loo
po

.s
.g

M
.s
ym

M
M

M
.s
M

Dermatitis seborreica
50
45 46%
40 n= 57
35
30
25 19%
20 12%
15 7% 14%
10 2%
5
0
sa
r

cta
a

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loo
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es

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po
.g

.r

M
.s
ym
M

M
M
.s
AUTOR Y AÑO NOMBRE CUADRO CLÍNICO
Kuchenmeister & Rabenhorst Pleurococcus beigelii Piedra humana
(1867)
Behrend
 (1890) T. ovale Piedra humana
Unna (1896) T. ovale Piedra humana
Unna (1896) T. giganteum Piedra humana
(Kuchenm. & Rabenh.) Vuillemin
(1902) T. beigelii Piedra humana
Piedra humana
Castellani (1908) T. foxi Ferida de pele
Castellani (1908) T. krusi Piedra humana
de Beurmann et al. (1909) Oidium cutaneum Piedra humana
Kambavashi (1922) Oospora granulosa Piedra animal
Kambavashi (1922) O. cerebriformis
Lambachi (1926) T. equinum

(de Beurmann et al.) Ota (1926) T. cutaneum


Piedra humana
(Kambayashi) Ota (1928) T. granulesum Piedra humana
(Kambayashi) Ota (1928) T. cerebriforme
Mazza & Nino (1933) T. humahuaquense
de Arêa Leão (1940) T. minus
 T asahii  Desde 1992 no se
 T mucoides acepta màs la
especie
 T asteroides Trichosporon
beigelii
 T cutaneum
 T inkin
 T ovoides
Levaduras con micelio que se desarticula en
artroconidios
Gemación ausente o presente.
Colonias inicialmente levaduriformes, secas.
Forman a menudo apresorios o células
meristemáticas.
Fermentación ausente. Asimilan diversos H de C.
Nitrato (-), Ureasa (+), Doliporos.
Dg diferencial: Geotrichum ureasa negativo.
Filogenia molecular: género relacionado con
Cryptococcus.
Algunas especies psicrofílicas. Varias especies
crecen a 37ºC y son consideradas como posibles
patógenos.
Seis especies de interés clínico
Localizaciones más Menos frecuentes:
frecuentes:  Hueso
 Pulmón  Médula ósea
 Hígado  Aparato digestivo
 Bazo
 Piel
T asahii (sol naciente)
T mucoides
T asteroides
T cutaneum
T inkin
T ovoides
T.
asteroides

T. inkin

T. cutaneum
1 Colonizacion de la piel - region perigenital.
2 Contaminacion en ambiente hospitalario.
3 Infeccion superficial - pelo, piel u uñas.
4 Infecciones sistemicas --> localizada -->
diseminada
 Septicemias,
 meningitis crónica,
 infección diseminada en SIDA,
 fungemia en quemados, infección relacionada a catéter o en
pacientes onco-hematológicos.
•T asahii y T mucoides: Infecciones sistémicas diseminadas o localizadas,
especialmente en leucémicos.
Trichosporon spp
Microcultivo
Artroconídios

C/ S/
blastoconídios blastoconídios
e urease (+) e urease (-)

Trichosporon Geotrichum
A B C
A B
A B