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Kinetic mathematical model for ketone bioconversion using Escherichia coli TOP10

pQR239

R. Melgarejo-Torres a, O. Castillo-Araiza b, P. López-Ordaz a, D. Torres-Martínez d, M. Gutiérrez-


Rojas a, G.J. Lye c, S. Huerta-Ochoa a,⇑

a Departamento de Biotecnología, Universidad Autónoma Metropolitana, P.A. 55-535,


09340 Iztapalapa, México D.F., Mexico

b Grupo de Procesos de Transporte y Reacción en Sistemas Multifásicos, Departamento de


Ingeniería de Procesos e Hidráulica, Universidad Autónoma Metropolitana, México D.F., Mexico

c Department of Biochemical Engineering, University College London, London WC1E 7JE,


United Kingdom d Universidad Politécnica de Tlaxcala, San Pedro Xalcaltzinco Tepeyanco, Tlaxcala,
Mexico

hlights

Se desarrolló un modelo cinético pseudointrínico no informado sobre reacciones básicas.

El mecanismo de reacción propuesto siguió el formalismo de Langmuir-Hinshelwood.

Se explican los complejos de formación de inhibición del sustrato y la inactivación de oxígeno.

Las constantes de afinidad e inhibición se obtuvieron a partir del modelo cinético.

Este es el primer informe de la constante de inactivación de oxígeno (22.3 lM).

información del artículo

Historia del artículo:

Recibido el 20 de septiembre de 2013

Recibido en forma revisada el 18 de noviembre de 2013

Aceptado el 23 de noviembre de 2013

Disponible en línea el 1 de diciembre de 2013.

Palabras clave:

Bioconversión

Ciclohexanona monooxigenasa
Modelado

Parámetros cinéticos

Inactivacion de oxigeno

Escherichia coli

resumen

El objetivo del presente trabajo fue desarrollar un modelo cinético seudointrínseco, basado en
reacciones elementales.

Para describir el comportamiento de la bioconversión de cetonas usando Escherichia coli TOP10


pQR239. Ya que

no hay informes de la constante de inactivación de oxígeno en la literatura, este estudio


proporcionó nuevas perspectivas para

Encontrar las condiciones óptimas de un suministro de oxígeno adecuado durante la


bioconversión. En este modelo la reacción.

El mecanismo propuesto siguió el formalismo de Langmuir-Hinshelwood y consideró ambos


sustratos.

Inhibición e inactivación del oxígeno por la formación de complejos intermediarios. Por lo tanto,
aproxima-

Las condiciones de pseudo equilibrio de las tasas de reacción o de las especies intermedias de
estado estacionario no se consideraron

Esto permitió identificar el papel de cada paso de reacción involucrado en la bioconversión. Esta

El modelo cinético describió adecuadamente las observaciones con y sin inhibición del sustrato y /
o oxígeno.

inactivación del gen. Y la regresión y los parámetros estimados fueron estadísticamente


significativos, haciendo que

Estos análisis son confiables respecto al comportamiento cinético de CHMO. Entonces, el sustrato
y la afinidad con el oxígeno y

Se obtuvieron constantes de inhibición a partir de los parámetros cinéticos del modelo. Se observó
que el oxígeno

El gen y el sustrato presentaron valores de constante de afinidad similares. La inhibición del


sustrato (KIS) y el oxígeno.

se determinó que las constantes de inactivación (KIO2) eran 9.98 lM y 22.3 lM, respectivamente,
mostrando que
La enzima CHMO era dos veces más sensible a la inhibición por un exceso de sustrato que el
oxígeno.

2013 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.

Introducción

Las lactonas tienen amplias aplicaciones en aromas, como precursores de

Medicamentos anticancerígenos y antihipertensivos y en la farmacéutica.

industria [1]. Las lactonas han sido obtenidas por la reacción de Baeyer-Villiger

El proceso catalítico [2] o la bioconversión de células enteras con una

ciclohexanona monooxigenasa (CHMO) expresada en Escherichia

coli TOP10 pQR239 [3]. El uso de células enteras permite que la enzima cofac-

Para la regeneración para la producción de componentes enantioméricamente puros.

libras [4]. Sin embargo, se ha informado [5, 6] que la cetona

bioconversión utilizando CHMO es inhibida por el sustrato y

Producto en concentraciones superiores a 0,4 y 4 g L? 1

, respectivamente. Addi-

Bennett [7] informó que la inactivación de la enzima puede ocurrir

Debido a la oxidación de residuos de dos serinas cercanas al sitio activo. UNA

Se han propuesto varias estrategias para evitar estos tipos de

Inhibición, como la alimentación del sustrato y la eliminación in situ del producto.

utilizando la resina Lewatit [8], encapsulación de biocatalizador para prevenir

Oxidación de CHMO [9], el uso de líquidos iónicos como una fase inmiscible

Depósito de sustrato y remoción y mantenimiento de productos in situ.

El biocatalizador (células completas) en la fase acuosa [4], un agitador

Tanque de partición del biorreactor utilizando líquidos iónicos como el dispersado.

La fase [10] y los cambios en la estructura molecular de CHMO para plegar el

ines susceptibles a la oxidación en el interior de la enzima [11].

A pesar de varios estudios experimentales sobre la estructura molecular.


de CHMO, su actividad catalítica y las tasas de reacción de los intermediarios

En la reacción global se dieron pasos para proponer un biocon-

Versión mecanismo de [12-14], ha habido pocos estudios sobre

Modelado cinético considerando sustrato simultáneo, producto.

y los fenómenos de inhibición del oxígeno. Alguna cinética pseudo empírica.

modelos se han reportado después de la aproximación de Michaelis-Menten

Para describir la formación de producto y el consumo de sustrato en

Cinética de monooxigenasa [15,16,17]. Sin embargo, no toman

en cuenta las reacciones elementales que representan el oxígeno como un sec-

Sustrato para bioconversión. El uso de este tipo de cinética.

los modelos reducen el número de parámetros cinéticos requeridos; Nunca-

theless, los valores cinéticos estimados dependen del catalizador con-

centrarse y volverse independiente del tamaño del reactor y su

configuración geométrica, proporcionando incertidumbres para expandir la cobertura

Bioconversión De La Cetona. En este sentido el desarrollo de una cinética.

modelo basado en un mecanismo de reacción elemental que describe

La bioconversión de Baeyer-Villiger permitirá describir,

Comprender y encontrar las condiciones óptimas para llevar a cabo este tipo.

de bioconversión pero principalmente para diseño y ampliación.

El objetivo de este trabajo fue desarrollar un pseudointrínseco.

Modelo cinético para describir el comportamiento de la bioconversión.

de cetonas utilizando células enteras. El modelo matemático era

basado en un mecanismo de reacción elemental que siguió a la

Langmuir-Hinshelwood formalismo, considerando inhibición y

Inactivación por la formación de sustrato o enzima oxigenada.

Complejos en el sitio activo de la CHMO. El modelo matematico

Se ajustó y se estimaron los parámetros cinéticos para tres.

Posibles casos de bioconversión de cetonas: (1) sin ningún tipo de

inhibición, (2) inactivación por exceso de oxígeno y (3) inhibición por


Exceso de sustrato. El modelo matemático fue validado a través de

La comparación de los datos experimentales obtenidos para

inhibición de sustrato y la inactivación de oxígeno frente a Val- calculado

Usando los parámetros cinéticos estimados. Los parámetros cinéticos.

obtuvieron valiosa información para determinar cuál puede ser

la etapa limitante en la reacción de bioconversión.

2. Materiales y métodos

2.1. Microorganismo y productos químicos.

La cepa TOP10 pQR239 de E. coli fue proporcionada amablemente por Profesion

sor John M. Ward (University College London, London, United King-

dom) para fines de investigación y académicos, y se refiere a

en adelante simplemente como E. coli. Preparar inóculos para bioconversión.

experimentos, las células de E. coli se cultivaron en matraces Erlenmeyer de

250 ml que contienen 70 ml de un medio complejo (en g L? 1

): triptona

10.0, extracto de levadura 10, NaCl 10.0, en tampón fosfato 50 mM pH

7.0, suplementado con 10 g de L? 1 glicerol. Los medios de comunicación culturales eran

esterilizado en un autoclave a 120 ° C durante 15 min y suplementado

con 100 mg de L? 1 ampicilina (filtro previamente esterilizado con un

Filtro de 0,25 lm). Los matraces erlenmeyer se incubaron a 150 rpm para

16 h a 37ºC. Después de este período de crecimiento de 16 h, ciclohexanona mono-

La expresión de la oxigenasa se indujo mediante la adición de la necesaria

Cantidad de solución de arabinosa (100 g L? 1

) para llegar a una concentración final

Tración de 2 g L? 1

. Después de 3 h de inducción, las células fueron recolectadas por

Centrifugación a 5000 rpm durante 10 min.

Bicicleta de cetona bicíclica [3.2.0] hept-2-to-6-one (P 98%) y

lactona bicíclica (1S, 5R) - (-) - 2-oxabiciclo [3.3.0] oct-6-en-3-ona


(P 99: 0%)) (Fluka, Suiza) se utilizaron como sustrato y

Estándares de producto, respectivamente. Triptona, extracto de levadura, NaCl y

glicerol fueron adquiridos de Sigma Aldrich (EUA).

2.2. Descripción de Stirred tank bioreactor

Un módulo con dos biorreactores de vidrio de 100 ml.

(MMBR100, UAM-I, México) se utilizó para todos los estudios de bioconversión.

Los biorreactores con camisa tenían un diámetro interno de 4,75 cm y

un volumen de operación de 70 ml (HL / DT = 0,87). Los biorreactores fueron

equipado con una sola turbina Rushton de seis palas planas, Di = 1.9 cm (Di /

DT = 0.40), ubicado a 1.9 cm de la base plana del vaso. La bio-

El reactor estaba equipado con cuatro deflectores equidistantes, 0.5 cm en

ancho, para mejorar la mezcla.

2.3. Determinación del coeficiente de transferencia de masa de oxígeno (kLa)

Minisensores de fibra óptica de oxígeno disuelto (PreSens, GmbH

Alemania) se utilizaron para determinaciones de kLa. Los sensores de oxigeno

fueron acoplados a un medidor de oxígeno OXY-4 mini de cuatro canales

(PreSens, GmbH Alemania). Coeficientes de transferencia de masa de oxígeno

(kLa) se calcularon según el método dinámico y

Modelo matemático propuesto por Fuchs et al. [18], que lleva

en cuenta el tiempo de respuesta del electrodo y el sin dimensiones

concentraciones de oxígeno disuelto en el biorreactor (ec. (1)). los

efecto de las condiciones de operación, incluida la agitación (750, 1350 y

1950 rpm) y las tasas de aireación (0,75, 1,0 y 1,4 vvm) en kLa fue

estudió.

YP ¼ KP? e? kLat? kLa? e? KP t

KP? kLa

donde YP es la concentración de oxígeno disuelto sin dimensiones en

El biorreactor definido por la ec. (2).

YP ¼ C?
PAG ? CP

¿DO?

PAG ? CP0

ð2Þ

¿donde C?

P es la concentración de oxígeno saturado (7.2 mg L? 1

, cual

fue determinado con el software del módulo OXY-4 usando el

presión atmosférica de la Ciudad de México, 1016.9 hPa), CP es el

Concentración de oxígeno disuelto, CP0 es el oxígeno disuelto inicial.

Concentración del biorreactor. KP es la constante de electrodo definida.

como el inverso del tiempo de respuesta, kLa es la transferencia de masa de oxígeno

coeficiente, y t es el tiempo. El ajuste se realizó utilizando un

Regresión de la oreja del algoritmo Levenberg-Marquardt en Polymath ™.

2.4. Medición del consumo de energía aireada (Pg)

El consumo de energía aireada (Pg) se midió utilizando los métodos

Odología discutida recientemente por Ascanio et al. [19]. Básicamente, la

El método se basa en mediciones eléctricas realizadas directamente.

en el motor del eje del agitador biorreactor por vatios metros y amperímetros.

Para tener en cuenta las pérdidas que se producen en el sistema de agitación,

El blanco de las mediciones se realizó por primera vez con una bio-

reactor. Todas las mediciones se realizaron por triplicado.

2.5. Experimentos de bioconversión

Los experimentos de bioconversión se llevaron a cabo utilizando 3.0 g de bio-

masa L? 1

. Una solución tampón que consiste en fosfato 50 mM pH 7.0

suplementado con 10 g de glicerol L? 1 se usó como el acuoso

Fase para los medios de bioconversión. Una central centrada en toda la cara.

Diseño experimental compuesto con tres factores y once.


Se utilizaron experimentos. Se estudiaron tres niveles de cada factor:

tasa de agitación (750, 1350 y 1950 rpm), tasa de aireación (0,75, 1

y 1.4 vvm) y concentración de sustrato (0.35, 0.80 y

1,0 g L? 1

). Durante experimentos de bioconversión, muestras de 500 lL.

se tomaron cada 3 minutos durante los primeros 15 minutos y luego cada

hora por tres horas Las muestras se congelaron rápidamente para detener la reacción.

cación Para el análisis de sustratos y productos, las muestras fueron centradas.

fugado a 5000 rpm durante 10 minutos para separar la biomasa y la

Se analizó el sobrenadante. El sustrato y el producto fueron cuanti-

Fied por cromatografía de gases.

2.6. Análisis

Se utilizó cromatografía de gases (GC) para cuantificar la concentración.

de bicicleta [3.2.0] hept-2-en-6-one y sus correspondientes

lactonas regioisoméricas. Se inyectaron muestras (5 lL) en un XL.

cromatógrafo de gases (Perkin Elmer, Norwalk, CT) equipado con un

CYCLOSILB 113-6632 columna capilar (30 m? 530 lm) (J&W

Científico), y las concentraciones se determinaron utilizando un

Curva de calibración externa. La temperatura del inyector GC se ajustó

a 250? c. El programa de temperatura GC utilizado fue el siguiente:

La temperatura inicial del horno fue de 100 ° C, se mantuvo durante 1 minuto y se siguió

por un aumento de temperatura a 10 ° C min? 1 hasta 150 ° C, lo que

Luego se mantuvo durante 3 min. Los tiempos de retención fueron de 3.7 min.

3,95 min para el sustrato (mezcla de isómeros de cetona) y

8.5 min para el producto.

3. Modelo matemático.

3.1. Modelo cinetico

Para desarrollar un modelo cinético para la bioconversión de la cetona, la reacción

mecanismo sugerido por Sheng et al. [12] fue modificado. los


El mecanismo de reacción propuesto en este documento sigue la

muir – Hinshelwood – Hougen – Watson formalismo [20], considerando

los siguientes supuestos:

(a) El glicerol entra en la vía de fosfato de pentosa y cítrico

Ciclo ácido, generando una concentración suficiente de NADPH2 +.

para regenerar y mantener constante el sitio activo de la CHMO

en la forma reducida, FADPH2 + [21].

(b) El sustrato no se consume como energía y carbono.

fuente.

(c) Todos los pasos con la excepción de la formación del producto son

considerado reversible.

(d) La cantidad de CHMO en lg por gramo de biomasa (NT) fue

aproximado utilizando la tasa específica obtenida previamente.

[10] y un valor kcat de 6 s? 1

. Este valor kcat también fue usado

como valor inicial durante la estimación del parámetro cinético.

Sheng et al. mecanismo de reacción considera la oxidación de la

Sitio activo de CHMO (E) para formar el complejo enzima-oxígeno (EO2)

a una velocidad de reacción r1 y un coeficiente estequiométrico de 3

E þ O2 ¢

k1

k0

EO2; r1 ¼ k1NT hE½O2? ? k

1NT hEO2 ð3Þ

donde h representa la fracción enzimática compleja libre o intermedia

En el mecanismo de reacción. EO2 interactúa con el sustrato.

(S) para formar el complejo enzima-oxígeno-sustrato (EO2S) en una reacción


tasa de cesión r3 y un coeficiente estequiométrico de 2

EO2 þ S ¢

k3

k0

EO2S; r3 ¼ k3NT hEO2 ½S? ? k

3NT hEO2S ð4Þ

EO2S es el intermedio para formar el producto de interés (P) en una

velocidad de reacción r5 y un coeficiente estequiométrico de 1, y finalmente el

Regeneración del sitio activo (E) para iniciar nuevamente el ciclo catalítico.

¡EO2S!

k5

E þ P; r5 ¼ k5NT hEO2S ð5Þ

Sin embargo, este mecanismo no considera ningún tipo de inactividad.

Vación por exceso de oxígeno o inhibición del sustrato, y solo propone

La dinámica de oxidación-reducción del sitio activo del CHMO para

formación de productos. El mecanismo de reacción propuesto en este trabajo.

(Fig. 1) toma en cuenta la posible formación de dos inactivos

Complejos, uno que involucra la sobre oxidación del sitio activo.

(O2EO2) a una velocidad de reacción r2 y un coeficiente estequiométrico de 1,

EO2 þ O2 ¢

k2

k0

O2EO2; r2 ¼ k2NT hEO2 ½O2? ? k

2NT hO2EO2 ð6Þ

y otro que representa la inhibición del sustrato (EO2SS) en una reacción


tasa de cesión r4 y un coeficiente estequiométrico de 1

EO2S þ S ¢

k4

k0

EO2SS; r4 ¼ k4NT hEO2S½S? ? k

4NT hEO2SS ð7Þ

La inhibición del producto no fue considerada en la reacción propuesta.

Mecanismo desde la máxima concentración de producto, estimado.

de la tasa específica de 0,11 g de lactona g biomasa? 1 h? 1 [10], y

Las concentraciones de sustrato utilizadas en este estudio no alcanzaron

concentraciones de bición.

Las fracciones del complejo intermediario enzimático se describen por

las ecuaciones diferenciales

3.2. Modelo matemático en el biorreactor.

La transferencia de masa y el mecanismo de bioconversión fueron considerados

para el desarrollo del modelo matemático en la biore-

actor. Se hicieron los siguientes supuestos:

(a) El sistema de reacción es isotérmico y perfectamente mezclado, y

El biorreactor del tanque agitado fue operado por lotes.

(b) Transferencia de masa de oxígeno (kLa) de la fase gaseosa a acuosa

Se consideró la fase. La kLa efectiva que caracteriza.

Este mecanismo se determinó con experiencia independiente.

Mentimientos en un sistema abiótico.

(c) Resistencia a la transferencia de masa entre partículas y entre partículas

Se consideraron insignificantes debido al tamaño de la célula.

(? 6 lm) y esfuerzo cortante insignificante entre la celda

y la fase acuosa, respectivamente.


(d) Debido a las tasas de aireación utilizadas, no hubo pérdida de sustrato

Por evaporación.

(e) No hubo daños por cizallamiento celular debido a la agitación de acuerdo con

Estudios realizados previamente sobre la misma bioconversión.

sistema.

Substrato [S], producto [P] y oxígeno [O2] concentraciones en el

Reactor durante la bioconversión se describen por diferencial.

ecuaciones

d½S?

dt ¼? r3? r4 ð14Þ

d½p?

dt ¼ r5 ð15Þ

d½O2?

dt ¼ kLað½O?

2 ?? ½O2? Þ? r1? r2 ð16Þ

El modelo matemático propuesto se resolvió integrando un

conjunto de ecuaciones diferenciales (EDO) con el Runge Kutta Fehlberg

método. Se presenta la estrategia de estimación de los parámetros cinéticos.

En la Fig. 2, que considera la transferencia de masa de oxígeno y las reacciones.

Que tienen lugar en la célula durante la bioconversión.

El modelo contiene nueve parámetros cinéticos, kj, que fueron

Estimado por los mínimos cuadrados ponderados de los residuos (RSS)

entre las concentraciones calculadas y experimentales de acuerdo

Ingresando a la siguiente función objetiva ponderada minimizada (ec.

(17)):

RSSðbÞ ¼ Xnexp

Xnresp

l
Wjlðyij? y ^ ijÞðyil? y ^ ilÞ?! b1; b2; ...; bp

min ð17Þ

Las respuestas utilizadas en la regresión son la concentración de

Oxígeno disuelto, lactona y cetona a través del tiempo. En la ec. (17) yij

denota el valor calculado y yˆij denota el observado

concentración en el experimento j, bj es el vector de parámetros cinéticos

(ki) para ser estimado, nexp es el número de independientes

experimentos, nresp es el número de las variables de respuesta del modelo

y Wjl es el factor de ponderación que puede usarse para dar mayor

Importancia para alguna porción de las variables de respuesta. La cinética

los parámetros fueron estimados por un programa de software (ODRPACK

2.01) utilizando regresión no lineal de respuesta múltiple y la

Método de Levenberg-Marquardt con un intervalo de confianza del 95%. A

Determinar la significación estadística de los parámetros, la prueba t

se utilizó, mientras que la prueba F se utilizó para obtener la regresión

significado. En este sentido, la confianza estadística en el desarrollo

El modelo cinético nos permitirá relacionar la cinética.

Parámetros a la tasa de formación de diferentes intermediarios que

Induce la inhibición y formación del producto en el ciclo catalítico de

la célula.

4. Resultados y discusión

4.1. Estudios de transferencia de masa de oxígeno en ausencia de bioconversión.

La transferencia de masa se estudió en un sistema abiótico a través del

Determinación de los coeficientes de transferencia de masa de oxígeno por la dinámica.

Método bajo diversas condiciones de operación. La tasa de agitación tuvo

Un efecto mayor que la tasa de aireación sobre kLa. Los valores de kLa alcanzados en

Se observaron altas tasas de aireación y agitación (1950 rpm y 1.4 vvm).

Tween 220 y 290 h? 1

, mientras que a bajas tasas de aireación y agitación.


(750 rpm y 0,71 vvm), los valores de kLa estaban entre 20 y

32 h? 1

. Estos coeficientes de transferencia de masa fueron utilizados para MMBR-100.

Modelado de biorreactores bajo diversas condiciones de reacción.

4.2. Bioconversión de cetonas en un sistema de gas acuoso.

Los resultados experimentales de bioconversión obtenidos a través de la

Diseño experimental bajo diversas condiciones de operación en términos

de tasas de agitación (750, 1350 y 1950 rpm), tasas de aireación (0,75,

1.0 y 1.4 vvm) y concentraciones de sustrato (0.35, 0.7 y

1gL? 1

) se muestran en la Fig. 3. Biocono de cetona al cien por cien

la versión se observó a 1 vvm y 1350 rpm (kLa = 180 h? 1

), con

Concentraciones de sustrato inferiores a 0,4 g L? 1 (Fig. 3a). Sin embargo,

cuando las tasas de aireación y agitación aumentaron a 1.4 vvm

y 1950 rpm (kLa = 290 h? 1

) a concentraciones de sustrato menores que

0.4 g L? 1

, la bioconversión disminuyó hasta el 42%. La Fig. 3b muestra que en

Concentraciones de sustrato mayores de 0.4 g L? 1

, y a 1 vvm y

1350 rpm (kLa = 180 h? 1

), solo se obtuvo un 20% de bioconversión.

Una vez más, cuando aumentaron las tasas de aireación y agitación.

a 1.4 vvm y 1950 rpm (kLa = 290 h? 1

) en el sustrato concentrado

Más de 0.4 g L? 1

, la bioconversión disminuyó al 17%. Estadístico

El análisis utilizando la caja de Pareto indicó que el sustrato tenía la


Mayor efecto sobre la bioconversión de la cetona. El segundo mas

Un factor importante fue la interacción entre agitación y

Las tasas de aireación, que relacionan la transferencia de masa de oxígeno de la

Fase gaseosa a la fase acuosa. La disminución en el porcentaje.

de bioconversión cuando se incrementó la concentración de sustrato.

De 0,4 a 1 g de L? 1 se debió principalmente a la inhibición del sustrato. por

El mismo biocatalizador, Doig et al. [22], trabajando bajo varios

Concentraciones de sustrato (0.2–6 g L? 1

), observó que mayor

la bioconversión de la cetona se logró en el rango de 0.2 a 0.4 g L - 1

en un matraz de 1,0 l con un volumen de 20 ml a 250 rpm. Modificación

y control del valor kLa (180–290 h? 1

) podría aumentar el oxígeno

Transferencia de la fase gaseosa a la fase acuosa manteniendo

una concentración constante de oxígeno disuelto; sin embargo, este

Mecanismo que provoca la oxidación en el biocatalizador y una disminución.

En bioconversión. Bennett [7] informó que el exceso de oxígeno en el

medio de reacción causó la oxidación de dos resinas de serina periféricas

cuotas para formar ácido sulfónico, causando un cambio e inaceptable

tivación de CHMO. Estos resultados también fueron observados por Opperman

y Reetz [11] que diseñaron un CHMO identificando la superficie

Aminoácidos susceptibles de oxidación y replegados en su interior.

la enzima La enzima mutada retuvo un 40% de actividad en H2O2.

(0.2 M), mientras que la enzima de tipo salvaje perdió toda la actividad en H2O2 5 mM.

4.3. Modelo matemático para la bioconversión de cetonas.

El modelo cinético propuesto basado en reacciones elementales.

incluyendo la inhibición del sustrato y la inactivación de oxígeno fue

comprometido con el modelo de biorreactor que representa una transferencia de oxígeno

Mecanismo desde el gas hasta la fase acuosa. La resultante


El modelo fue alimentado con datos experimentales de bioconversión y oxígeno.

coeficientes de transferencia de masa obtenidos de experimentos abióticos en

Der para estimar los parámetros cinéticos.

Para obtener un mínimo global, reducir las estadísticas.

correlación entre los parámetros cinéticos a estimar y,

Por lo tanto, para describir el comportamiento enzimático intrínseco dentro de la célula.

bajo diversas condiciones de reacción, la estimación de los parámetros cinéticos

Los autores consideraron la siguiente estrategia: (a) la estimación del parámetro cinético

información para la bioconversión sin inhibición del sustrato o

Se llevó a cabo la inactivación de oxígeno. Esto permitió obtener

Valores fiables de los parámetros k1, k.

1, k3, k0

3 y k5 relacionados con

Los pasos de reacción donde no hay inhibición de sustrato u oxígeno

inactivación; (b) los parámetros cinéticos k2 y k

2 fueron estimados

a partir de los datos experimentales cuando la inactivación de oxígeno estaba presente,

en relación con la etapa de reacción que considera la inactivación de oxígeno; (do)

los parámetros cinéticos k4 y k

4 fueron estimados a partir de la experiencia

datos mentales cuando la inhibición del sustrato estaba presente, en relación con

el paso de reacción que causa la inhibición del sustrato; (d) finalmente, el

El modelo cinético propuesto fue validado por observaciones predictivas.

En condiciones de reacción en presencia de inhibición del sustrato.

y la inactivación de oxígeno simultáneamente. Según t-tests y

Las pruebas F, la regresión y los parámetros mostraron significación estadística.


cance dentro del intervalo de confianza del 95%. No hubo estadística

correlación entre los parámetros estimados según la

matriz de varianza-covarianza. Los parámetros cinéticos estimados por

El modelo se muestra en la Tabla 1.

La tabla 2 muestra las constantes de afinidad e inhibición de los subgrupos

estrato y oxígeno obtenidos a partir de los parámetros cinéticos de la

modelo (Tabla 1), expresado en 1M para comparación con aquellos

Reportado experimentalmente por otros autores para monooxigenasas en-

zymes. Las constantes de afinidad e inhibición (ec. (18)) se definieron como

La inversa de las constantes de equilibrio del individuo.

reacciones:

K¼k

kj

ð18Þ

donde K es la constante de afinidad o inhibición, y k

j y kj son los

Parámetros cinéticos de disociación y asociación de la enzima

complejo de strate

En el estudio de caso sin inhibición del sustrato u oxígeno inactivo

Vación, las condiciones de operación fueron 1350 rpm y 1.0 vvm (kL-

a = 180 h? 1

), con 0,35 g de sustrato L? 1

. La comparacion entre

Los datos experimentales y calculados obtenidos del ajuste de la

El tiempo de modelo frente a bioconversión se muestra en la Fig. 4a. Fue ob-

Esto sirvió para que el modelo cinético describiera adecuadamente el experimento.


datos del tal. El sustrato se consumió completamente en 70 min;

asumiendo un rendimiento de producto de sustrato (YS / P) de 0.871 y 3.0 g de bio-

masa L? 1

, se observó una tasa específica de 0,11 g de lactona g biomasa? 1 h? 1

retenido Este valor es menor pero en el mismo orden de magnitud

que los valores reportados previamente para la misma cepa; Melgarejo-

Torres et al. [10] observaron una tasa específica de 0,45 g de lactona g bio-

masa? 1 h? 1 a 1,0 g de biomasa L? 1 y 0,5 g de cetona L? 1

. Además, Baldwin

y Woodley [6] observado un determinado tipo de 0.65 G lactona G Bio mass1 h1 a 2.0 G de
biomasa l1 y 0.5 G cetona l1. la concentración de perfiles de la estima intermedios presente
dentro de la célula durante el bioconversion versus bioconversion tiempo se muestran en la FIG. 4
ter. chmo oxidación se produce en el primer unos minutos, generar ating la [eo2] complejo que es
esencial en la formación de la [eo2s] complejo que genera el producto [p]. el análisis de la afinidad
y de cinético parámetros estimado para este estudio de caso, en el primer reversible de reacción,
se observó que K 0 1 fue menor que k1, favor de la reacción de equilibrio a la formación de la
[eo2] complejo. con estos cinética parámetros, sustrato afinidad constante (kmo2) valor de 62.72
lm se obtuvo (tabla 2), que es en el mismo orden de magnitud de los valores reportados por
Shannon et al. [25] y Torres-pazmiño et al. [16], es decir, 15-30 a 10 lm, respectivamente. en el
segundo reversible de reacción, k0 3 fue smal- LER que k3, favor de la reacción de equilibrio a la
formación de la [eo2s] complejo. con estos cinética parámetros, un sustrato afinidad constante
(km) el valor de las 70.47 lm se obtuvo (tabla 2), que es bastante similar al descrito por Torres-
pazmiño et al. [16] (tabla 2). en el último de reacción, la k5 parámetro era 56.66 s1 (tabla 1), que
es la velocidad de reacción constante (kcat) para el producto [p] la formación. kamerbeek et al.
[26] informado kcat los valores de 14 y 3.7 s1 para un tipo salvaje chmo (E. coli top10 pqr230) y su
mutante, respectivamente. en el estudio de caso donde oxígeno inactivación estaba presente
desde oxígeno masa de transferencia en el medio de reacción se aumentó, la operación
condiciones eran 1950 rpm y 1.4 vvm (kla = 290 h1), y 0.35 G sustrato l1. la comparación entre el
experimen- tal y calcula datos versus bioconversion tiempo se muestra en la FIG. 5 bis. ella se
observó que el modelo fue capaz de predecir el de- pliegue en lactona producción debido a chmo
oxidación. pertinente cinética parámetros estimado para este estudio de caso se k2 y K 0 2. se
observó que k2ok 0 2 por cuatro las órdenes de magnitud; esta alta k2 valor indica que el chmo
reacción de oxidación fue prácticamente irreversible y coincide con el que informó por Bennett
[7], que se menciona que la oxidación causas permanente de la enzima inactivación. con estos
cinética parámetros, una de oxígeno inactivación constante (kio2) valor de 22.3 lm se obtuvo
(tabla 2). no hay informes del oxígeno inactivación constante en la literatura. bajo estas
condiciones de operación, el porcentaje de experimental bioconver- Sion fue 42%. la
concentración de perfiles de la estima interme- diates presente dentro de la célula durante el
bioconversion versus bioconversion tiempo se presentan en la figura. 5b. ella se observó que la
formación de la primera [eo2] complejo fue reducido, rápidamente la formación de la [o2eo2] y
[eo2s] complejos, oxígeno inactivación complejo y un complejo esencial para la formación de los
productos [p], respectivamente. lineal tendencia en [o2eo2] complejo de formación en relación
con chmo oxidación muestra que la exposición a estas condiciones causará total enzima
inactivación. para el estudio de caso donde sustrato inhibición estaba presente debido a una
mayor sustrato concentración en el medio de reacción, las condiciones de funcionamiento fueron
1350 rpm y 1.0 vvm (kla = 180 h1), y 0.70 G de sustrato l1. la comparación entre el experimentales
y calcula los datos obtenidos a partir de la forma del modelo ver- sus bioconversion tiempo se
muestra en la FIG. 6 bis. bajo estas condiciones de operación, experimental bioconversion fue
20%. se observó servido de que el modelo también fue capaz de predecir la disminución de la lac-
tono de producción, debido a sustrato inhibición. pertinente cinética parámetros estimado para
este estudio de caso se k4 y K 0 4. estos cinética parámetros, un sustrato inhibición constante (Kis)
valor de 9.98 lm se obtuvo (tabla 2), que es la mitad de que informó por bucko et al. [9] (tabla 2).
se encontró que k4 fue tres órdenes de magnitud mayor que K 0 4; esto significa que para el
sustrato de las concentraciones trations por encima de 0.4 G l1, el Mundial de reacción se tienden
a la forma más del sustrato inhibitoria [eo2ss] complejo que el producto [p]. K 0 4 es la cinética de
disociación constante de la reversible de reacción de sustrato inhibitoria complejo [eo2ss] la
formación. se sabe que una reducción en el sustrato concentración puede revertir la inhibición
desde la enzima permanece activo, como más sustratos no se unen a enzimas por covalente
vinculante [21]. FIG. 6b muestra el estimado las concentraciones de la [eo2] complejo, que
desapareció para formar el [eo2s] complejo; esto fue transformado en el sustrato inhi- bition
[eo2ss] complejo, que conduce a la reducción de productos [p] la formación. por último, el modelo
fue validado para el estudio de caso con ambos sustrato inhibición y oxígeno inactivación; el
funcionamiento de las condiciones eran 1950 rpm y 1.4 vvm (kla = 290 h1), y 0.7 G l1 de sustrato.
la comparación entre el experimental y calculado de datos en comparación con bioconversion
tiempo se muestra en la FIG. 7 bis. biocon- versión el desempeño en virtud de sustrato inhibición y
oxígeno inactivación condiciones de operación se calcula el modelo utilizando el estimado de
cinético constante obtenidos para los otros estudios de casos. bajo estas condiciones de
operación, el porcentaje de experimental bioconversion fue 17%. la baja bioconversion porcentaje
puede ser explicado el análisis de la estima cinética parámetros valores de los complejos de
formación. el estimado intermediario complejos se muestran en la FIG. 7b; k4 fue dos órdenes de
magnitud mayor que k2, lo que indica que la formación de la tasa de la [eo2- ss] complejo de
sustrato inhibición fue mayor que el de la [o2eo2] complejo de oxígeno inactivación. ella se
observó que el [eo2] complejo desaparecido para formar la inhibición [eo2ss] y la inactivación
[o2eo2] complejos, mientras que el resto se transformó en el producto [p].

. Conclusiones

En este estudio, desarrollamos una pseudointrínseca no informada

modelo médico basado en reacciones elementales que tienen en cuenta

Inhibición de stratos e inactivación de oxígeno para la cetona bicíclica.

bioconversión. El modelo cinético fue acoplado al modelo de reactor.

teniendo en cuenta el transporte masivo de oxígeno interfacial, adecuadamente


observaciones ajustadas y fue validado en modo predictivo describiendo

Observando observaciones que no fueron utilizadas en la estimación de parámetros.

La regresión y estos parámetros estimados fueron estadísticamente

Significativo, haciendo fiable su análisis respecto a la cinética.

comportamiento de CHMO, particularmente permitiendo identificar / entender

Papel cinético de cada sustrato, producto intermedio y producto de reacción.

en la enzima CHMO. En estudios posteriores, este modelo cinético

Ser esencial para modelar y ampliar un biorreactor de partición usando

Esta enzima CHMO expresada en células completas de E. coli TOP10

pQR239.