LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA

FACULTAD DE INGENIERÍA-2018-II.
Presentado a
Carolina Díaz Cárdenas.

INFORME DE LABORATORIO NO 6 Martes , 30 de octubre.

Cultivo discontinuo de​ E. coli​ en caldo BHI.

Laura Natalia Sandoval Núñez 0000123454

Javier David Claros Bermudez 0000052879

Resumen:
Los parámetro cinéticos permiten tener un punto de partida para la optimización en procesos, en este
laboratorio se usa el método espectrofotométricos para determinar la variación de la concentración
del sustrato (glucosa), constante de proporcionalidad para la ecuación de velocidad de aparición de
la biomasa (velocidad específica) y el tiempo necesario para duplicar la población en un cultivo
discontinuo de ​E. coli ​en caldo BHI.

Palabras clave: ​Cinética, cultivo discontinuo, sustrato, biomasa,​ E. coli.

Objetivo:
Objetivo general: Determinar parámetros cinéticos de crecimiento y consumo de sustrato durante un
cultivo discontinuo de E. coli en caldo BHI.

Objetivos específicos:
➢ Determinar la formación de biomasa en función del tiempo, empleando la relación entre la
densidad óptica (DO) a 540 nm y la densidad celular (g/L).
➢ Determinar el consumo de sustrato en función del tiempo por la técnica del ácido 3,5
Dinitrosalicílico.
➢ Determinar la velocidad específica de crecimiento y el tiempo de duplicación a partir de los
datos experimentales obtenidos.

Introducción:
El conocimiento de la cinética del cultivo permite predecir el desarrollo de la reacción y evaluar
rendimientos y productividades, datos importantes en el diseño de estrategias de producción y
optimización de procesos.

En un cultivo por lotes usado para el estudio del crecimiento microbiano se requiere de un desarrollo
sin intercambio con los alrededores, excepto por flujo de gases como CO​2 e H​2​. Con condiciones
ambientales adecuadas y nutrientes que permiten el crecimiento de de biomasa y la obtenciòn de un
producto de interés. (Universidad de Sonora, 2018). Estos estudios han permitido observar que los
microorganismos tienen etapas de crecimiento, siendo primero el periodo de adaptaciòn de la células
por los cambios de su ambiente, despuès un periodo de crecimiento acelerado donde la velocidad de
crecimiento de la biomasa aumenta desde un valor cero hasta un máximo, dando paso al periodo de
crecimiento exponencial gracias a un medio sin limitaciones de sustancias nutritivas a la máxima
velocidad compatible con las condiciones del medio de cultivo. En el periodo desacelerado la
velocidad disminuye al encontrarse con una limitación de nutrientes. El periodo estacionario se da por
agotamiento de las sustancias nutritivas o por tolerancia de las células a los productos resultantes.
Por último el periodo de decaimiento ocurre en aquellos cultivos en condiciones de inaniciòn, por la
formaciòn de enzimas autolìticas. (Torres Duarte, A. 1995).

El medio de cultivo por lotes según (Espinoza,2013) se emplea usualmente en la industria

farmacéutica, alimentaria y biotecnológica. Al ser el tiempo de operación corto en relación con el
continuo, se puede asegurar de forma fácil las condiciones asépticas durante todo el proceso de
reacción. Las principales desventajas son: la pérdida de rendimiento debido a los periodos de
arranque y parada, la falta de homogeneidad del producto obtenido en cargas consecutivas y la
dificultad de implementación de esquemas de integración energética. Estos tipos de reactores operan
con una baja concentración celular, sobretodo en el instante inicial donde los microorganismos
permanecen en fase de adaptación. Y por este motivo se ha de controlar la concentración de
nutrientes en el sustrato ya que sino se podía ralentizar el proceso de fermentación.

1
 LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA
FACULTAD DE INGENIERÍA-2018-II.
Presentado a
Carolina Díaz Cárdenas.
En la obtención de productos en reactores discontinuos de interés industrial o de laboratorio el mismo
provee todos los servicios que son necesarios para el cultivo, tales como mezclado, termostatización,
suministro de oxígeno, entradas para adición de nutrientes, control del pH, etc. Los biorreactores o
fermentadores son sistemas de cultivo celular que proporcionan entornos de crecimiento adecuados.
Un sistema de cultivo también puede operar de forma discontinua, continua o semicontinua según las
condiciones de producción o interés. (Bibing, 2018).

Metodología:
● Producción del inóculo

● Fermentación discontinua

● Determinación de los azúcares reductores en los extractos obtenidos.

Resultados:
Para determinar la concentración de sustrato se realiza una curva patrón DNS graficando abs vs
concentración de azúcares reductores, esto se hace porque en el medio de cultivo la glucosa está
presente como azúcar reductor.

En el laboratorio se midió la absorbancia a 600 nm por duplicado, para realizar la curva patrón se
tomó el promedio de los resultados eliminando un dato atípico. Los datos de concentración del patrón
y absorbancia se muestran en la tabla 1 y la curva de calibración en el gráfico 1.

2
 LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA
FACULTAD DE INGENIERÍA-2018-II.
Presentado a
Carolina Díaz Cárdenas.

Tabla 1. Datos de concentración y absorbancia para la curva patrón DNS

Gráfico 1. Curva de calibración para determinar la concentración de azúcares reductores.

La ecuación de la curva patrón DNS es Abs = 0,5477 (g Azúcares reductores/L) - 0,006.

3
 LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA
FACULTAD DE INGENIERÍA-2018-II.
Presentado a
Carolina Díaz Cárdenas.

Gráfica 2. Variación de las concentraciones de sustrato en función del tiempo

Gráfica 3. Consumo de sustrato en función del tiempo.

Para determinar la concentración de biomasa se toma la absorbancia a 600 nm y con la ecuación de

la curva patrón absorbancia = 0,564 (g biomasa/L)

4
 LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA
FACULTAD DE INGENIERÍA-2018-II.
Presentado a
Carolina Díaz Cárdenas.
Tabla 2. concentración de biomasa a diferentes valores de tiempo.

Gráfica 4. Variación de la concentración de biomasa en función del tiempo.

La aparición de biomasa responde a una velocidad de primer orden en su etapa de crecimiento

exponencial, es por eso que los parámetros cinéticos se deben encontrar en esta etapa de
crecimiento, al graficar concentración de biomasa vs tiempo, la velocidad de aparición de biomasa se
calcula con una tangente a un punto como (cambio de concentración de biomasa/cambio de
tiempo)(concentración de biomasa en ese punto) que en este caso resultó un valor de 0, 89 h−1

El tiempo de duplicación se calcula de la forma:

ln(2) ln(2)
tD = μx = 0,78 h−1
= 0, 88 h o 53 min ​ Ecuación 1

El rendimiento biomasa-sustrato se calcula:

ΔBiomasa 1,85−0,13
Y X/S = −ΔSustrato = 1,91−0,0694 * 100 = 93% Ecuación 2

Discusión de resultados:
De acuerdo a (Stanier, R. 1986) en cualquier sistema biológico, el crecimiento puede definirse como
el aumento ordenado de todos los componentes químicos.Durante un período de crecimiento
equilibrado, un aumento de la biomasa se acompaña de un aumento comparable de todas las demás
propiedades medibles de la población. Según (Iáñez, E. 1998) gracias a la relación entre densidad
óptica y densidad celular experimentalmente se pueden determinar parámetros cinéticos haciendo
uso de un método espectrofotométrico. En este laboratorio se usa para determinar la concentración
de azúcares reductores concentración de biomasa con una curva patrón a diferentes valores de
tiempo.

Las células en presencia de nutrientes pueden crecer y convertir esos nutrientes en nuevas células y
productos resultantes de su metabolismo. En la gráfica 2 se modela la variación del sustrato en
función del tiempo, se observan errores a los tiempos 0,5; 1 y 1,5 horas ya que se observa una
mayor concentración de sustrato que la concentración experimental inicial lo que no es posible, pero
este resultado es menor al teórico de 2g/L que es la concentración con que se realiza el caldo BHI,
entonces se considera que la causa es algún error experimental. Después del periodo de adaptación
del ​E. coli ​a las condiciones del medio hay una velocidad de consumo de glucosa requeridos para el
crecimiento microbial y la obtención de productos metabólicos.

5
 LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA
FACULTAD DE INGENIERÍA-2018-II.
Presentado a
Carolina Díaz Cárdenas.
En cuanto al comportamiento de la biomasa se puede identificar al graficar la concentración de
biomasa contra el tiempo como las células pasan por un desarrollo bajo las condiciones del medio
desde un periodo de adaptación que según los datos experimentales toma 0,5 horas, posteriormente
un periodo de crecimiento acelerado donde la velocidad de formación de biomasa aumenta desde un
valor cero hasta un máximo que se da desde 0,5 hasta 1 h, después el crecimiento exponencial
donde las células se reproducen, en un medio sin limitaciones nutritivas hasta la máxima condición
compatible con el conjunto de condiciones del medio existentes que se observa desde 1 hasta 3 h
aproximadamente. El periodo de crecimiento desacelerado se evidencia de 3 a 4 horas, faltarían
intervalos de tiempo más pequeños para definir con mayor exactitud hasta qué valor de tiempo va.
Por último se produce el periodo estacionario debido al agotamiento de una sustancia nutritiva y a la
acumulación de las células, en este periodo hay una igualdad entre el número de células que nacen
con las que mueren, según (Apella, C, 2018) la transición entre la fase exponencial y la fase
estacionaria implica un período de crecimiento desequilibrado durante el cual los diversos
componentes celulares se sintetizan a velocidades desiguales, por lo que las células en la fase
estacionaria tienen una composición química que es diferente de la de las células en la fase
exponencial. La composición celular de las células en la fase estacionaria depende del factor
limitante del crecimiento específico. A pesar de esto, ciertas generalizaciones son válidas: las células
en la fase estacionaria son pequeñas en relación con las células en la fase exponencial

La velocidad específica es un parámetro cinético que me dice ta viable es la reacción. Se puede

encontrar graficando ln(x/x0) vs tiempo partiendo de la ley de la velocidad de aparición de biomasa
como la pendiente de esa recta pero con estos datos experimentales se determinó un error
considerable por lo que se consideró un método gráfico que consiste en un punto del periodo de
crecimiento exponencial trazar una línea tangente y encontrar el cambio de biomasa/cambio de
sustrato con esa línea de tangente y multiplicarlo por 1/concentración de biomasa. (​Torres, A. 1995)
Así se obtiene un valor para la velocidad específica de 0,78 h−1 .

Como se espera, se puede observar una relación de la aparición de biomasa con el consumo de
sustrato respecto al desarrollo de del cultivo de ​E. coli c​ on la concentración residual de glucosa.
Considerando que el sustrato es el reactivo limitante de la reacción que se lleva a cabo, se definió
que el cambio de concentración de biomasa/cambio de concentración de sustrato como el
rendimiento biomasa sustrato que da un valor de 93% que es relativamente alto, gracias a la fase
exponencial donde hay una velocidad de reacción de 0,4 g/Lh.

El intervalo de tiempo requerido para que una población se duplique se define como tiempo de
generación o tiempo de duplicación y se representa con la letra g. (Villarreal,F. 2009). No todas las
bacterias tienen el mismo tiempo de generación. Para algunas, como ​E. coli es de aproximadamente
20 minutos (Apella,C. 2018) , aunque el tiempo de generación depende de los nutrientes y de las
condiciones fisicoquímicas del medio. El intervalo de tiempo t​D se ​ calcula como se muestra en la
ecuación 1 que tiene un desarrollo matemático desde la definición de la ley de velocidad de la
aparición de biomasa que no se discutirá en este informe, con lo discutido hasta el momento
identificamos la necesidad de un solo parámetro para caracterizar una población en fase exponencial
de bacterias y levaduras que puede ser t​D o ​ µ​x ya que se puede encontrar fácilmente uno de los dos
teniendo el otro (​Torres, A. 1995),​en este caso se obtiene un valor de t​D ​ de 0,88 horas o 53 minutos.

Conclusiones:
- Los microorganismos tienen un desarrollo que se divide en 6 etapas y que se pueden
identificar en un cultivo por lotes, que son etap lag, crecimiento acelerado, crecimiento
exponencial, crecimiento desacelerado, periodo estacionario y periodo de muerte, esto en
función de las condiciones fisicoquímicas del medio y del tiempo de reacción.
- Se puede identificar una relación directa entre el consumo de sustrato y las etapas de
​ partir de la glucosa crece y lleva a cabo su
desarrollo del microorganismo ya que el ​E. coli a
metabolismo.
- Al final de la reacción se obtuvo un rendimiento considerable del 93 % debido a la velocidad
con que se da la reacción en la fase estacionaria por estár sin limitantes de sustancias
nutritivas.
- Los parámetros de velocidad específica y tiempo de reducción permiten caracterizar el
crecimiento de bacterias y levaduras en su crecimiento exponencial.
6
 LABORATORIO DE BIOTECNOLOGÍA
FACULTAD DE INGENIERÍA-2018-II.
Presentado a
Carolina Díaz Cárdenas.
- ​ n un cultivo BHI es de 0,88 h, mayor al consultado en la
El tiempo de duplicación de ​E. coli e
teoría que es de aproximadamente 0,33h.

Referencias:
1. Universidad de Sonora. (2018). Bioreactores. Recuperado de https://goo.gl/ih9JCw y
consultado el 15 de octubre de 2018.
2. Torres, A. (1995). ​INTRODUCCIÓN A LA INGENIERÍA BIOQUÍMICA​. UNIVERSIDAD
NACIONAL DE COLOMBIA FACULTAD DE INGENIERÍA SANTAFÉ DE BOGOTÁ.
Consultado el 15 de octubre de 2018.
3. Bibing. (2018). Anexo 6 y 7- Biorreactores. Recuperado de https://goo.gl/vsPUjc y consultado
el 15 de octubre de 2018.
4. Espinoza. (2013). Diseño de una planta piloto para la obtención de bioetanol- Anexo 7. pp 7.
Recuperado de https://goo.gl/DQTeYj y consultado el 26 de octubre de 2018.
5. Stonier, R. (1986). General microbiology. Chapter 7. MacMillan Education. pp 183.
Consultado el 26 octubre de 2018.
6. Apella,C. (2018). Microbiología de agua- Conceptos. pp 7. Consultado el 26 de octubre de
2018 de https://goo.gl/5PcTj2​. 
7. Iáñez, E. 1998. Curso de Microbiología General. CRECIMIENTO A NIVEL DE
POBLACIONES. Extraído el 26 de octubre del 2018 de https://bit.ly/2zdKbxr.
8. Villarreal,F. (2009). Métodos de estudio del crecimiento microbiano. pp 15. Extraído de
https://goo.gl/ZMuqGV​ y recuperado el 27 de octubre de 2018.