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XABIER

EGILUZ 3KIA2

1ª PRÁCTICA: TRANSFORMACIÓN MULTICOLOR


OBJETIVO:
En esta práctica, veremos el proceso biológico de la transformación bacteriana
utilizando E. coli y ADN plasmídico.
Al finalizar la práctica, habremos experimentado la observación y el análisis de
los rasgos adquiridos (resistencia a la ampicilina y pigmentación) como lo
demuestran las células bacterianas transformadas.
PROCEDIMIENTO

Preparación de medios de cultivo


Placas de agar de LB
A partir de una botella de agar de caldo Luria de ReadyPour preparar:
 5 placas grandes LB
 10 placas pequeñas LB
 20 placas pequeñas de LB/Amp
 10 placas pequeñas de LB/Amp/IPTG
Cómo preparar el medio:
1. Romper el agar LB ReadyPour sólido en trozos pequeños apretando
vigorosamente y sacudiendo la botella de plástico
2. Aflojar, pero no retirar, la tapa de la botella de Agar ReadyPour. Esto
permite que pueda salir el vapor durante el calentamiento.
Precaución: si no se afloja la tapa antes de calentarla, el frasco puede
romperse o explotar.
3. Calentar el Agar ReadyPour con un microondas durante 60 segundos
manteniendo la botella del agar de pie (no tumbar la botella abierta)
en el interior del microondas. Retirar con cuidado la botella del
microondas y mezclar el agar removiendo la botella. Continuar
calentando la solución en intervalos de 30 segundos hasta que el agar
esté completamente disuelto (la solución de color ámbar debe ser
transparente y libre de partículas pequeñas). Hay que tener mucho
cuidado y asegurarse de que el agar no salga de la botella. Debe
prestar mucha atención y detener el calentamiento si el agar
comienza a burbujear.
4. Enfriar el agar ReadyPour a 60ºC removiendo la solución con cuidado
para facilitar la disipación del calor.
5. Mientras el medio se está enfriando, marcar las placas de Petri
pequeñas (60 x 15 mm) con un marcador permanente.
6. Verter 15 ml del Agar ReadyPour atemperado a 60ºC en cada una de
las cinco placas Petri grandes.
7. Verter 5 ml del agar en las 10 placas Petri pequeñas marcadas como
LB
8. La ampicilina viene en polvo. Resuspenderlo en medio de
recuperación. Añadir toda la cantidad de ampicilina a la botella con el
agar ReadyPour restante. Tapar y agitar la botella para mezclar los
reactivos. Añadir los reactivos solamente en el agar atemperado a
60ºC. Reactivos como la ampicilina e IPTG se degradan a altas
temperaturas.
9. Verter 6 ml de medio LB/Amp en las 20 placas de Petri pequeñas.
10. Añadir toda la cantidad de líquido IPTG a la botella con el agar
ReadyPour restante. Tapar y agitar la botella para mezclar los
reactivos.
11. Verter 6 ml del medio LB/Amp/IPTG en las 10 placas de Petri
pequeñas.
12. Tapar las placas y esperar al menos veinte minuto para que el
agar LB de las placas se solidifiquen. Para obtener resultados óptimos,
deje las placas a temperatura ambiente durante toda la noche.
13. Almacenar a temperatura ambiente durante no más de dos días.
Las placas se deben invertir y colocar en una bolsa de plástico que
pueda cerrarse herméticamente para asegurarse de que no se
sequen. Si las placas se preparan más de dos días antes del uso, se
deben almacenar invertidas en una bolsa de plástico en la nevera
(4ºC). Sacar las placas de la nevera y calentar en una estufa
incubadora a 37ºC durante 30 minutos antes de usar.
Preparación de placas de fuente de E.coli
Para mejores resultados, las placas fuente de E. coli deben estar listas 16-20
horas antes de que se realice la práctica, este punto puede comprometer el
éxito del proceso de transformación.
1. Retirar una sola cuenta (o perla) de BactoBead del vial usando un asa
de inoculación estéril. Utilizando la técnica aséptica, transferir la
cuenta de BactoBead al borde de una placa grande de Petri (placa
fuente de LB) y volver a colocar la tapa. Cerrar el vial inmediatamente
después de usarlo para limitar la exposición a la humedad en el aire.
2. Disolver al instante la cuenta de BactoBead añadiendo sobre ella 10
µL de caldo líquido estéril o agua estéril.
3. Dibujar estrías de ida y vuelta con el asa de siembra a través del
BactoBead disuelto para hacer un estriado primario en la parte
superior de la placa. Tratar de no hundir o apretar en exceso el asa de
siembra en el medio.
4. Dibujar estrías con el asa de siembra a través del estriado primario a
una parte limpia del agar varias veces para crear un estriado
secundario.
5. Girar la placa. Dibujar estrías con el asa de siembra a través del
estriado secundario a una parte limpia del agar varias veces.
6. Girar la placa una vez
más. Dibujar estrías con el
asa de siembra a través
del estriado terciario a una
parte limpia del agar
varias veces. Esto debería
producir colonias aisladas.
7. Tapar la placa e incubar la placa en posición invertida a 37ºC durante
16 a 20 horas.

8. Repetir los pasos anteriores para cada una de las placas fuente LB.

A. Preparativos del día 2 de la práctica


Antes de empezar, tenemos que asegurarnos de:
 Calentar el termobloque a una temperatura de 42ºC
 Encender la estufa incubadora está a 37ºC
 Realizar 10 alícuotas de 1 ml de CaCl2 y mantenerlos en hielo.
 Realizar 10 alícuotas de 1.5 ml de Luria Broth Medium (“Caldo de
recuperación”) y mantenerlos a temperatura ambiente.
 Colocar los tubos del ADN plasmídico de pChromoBlue, pChromoPink y
pChromoPurple en hielo para descongelarlos.
 Marcar 11 tubos de microcentrífuga como Mezcla de Transformación
Multicolor.
 Antes de dispensar, golpear suavemente con los dedos los tubos de
pChromoBlue, pChromoPink y pChromoPurple hasta que todos los
reactivos estén en el fondo cónico de los tubos (opcionalmente se puede
dar un golpe de centrifugación a los tubos).
 Utilizando una micropipeta, dispensar 50 µL de pChromoBlue, 50 μl de
pChromoPink y 50 μl de pChromoPurple en UNO de los tubos marcados.
Mezclar los plásmidos agitando suavemente el tubo.
 Dispensar 12 μl de la mezcla de transformación multicolor en cada uno
de los 10 tubos de microcentrífuga marcados. Cerrar los tubos y
colocarlos en hielo.

B. Transformación de E. coli con proteínas cromógenas azules,


rosadas y púrpuras

Para obtener los mejores resultados, asegurarse que las células se


resuspenden completamente. Asegurarse también de que todos los
componentes y reactivos están correctamente identificados durante toda la
práctica.
1.Marcar un tubo de microcentrífuga como “ADN+” y un segundo tubo de
microcentrífuga como “ADN-“
2.Transferir 500 µL de solución de CaCl 2 helada en el tubo de “ADN-“ usando
una pipeta estéril de 1 ml.

3. Utilizando una asa de siembra, transferir aproximadamente 15 colonias bien


aisladas (cada colonia debe tener un tamaño aproximado de 1 – 1,5 mm) desde
la placa fuente de E. coli hasta el tubo “ADN-“.
4.Girar el asa de siembra entre los dedos para liberar las células. Resuspender
las células bacterianas en la solución de CaCl 2 agitando la suspensión con un
agitador vortex hasta que no se vean grupos de células y la suspensión de
células aparezca turbia.
5.Transferir 250 µL de la suspensión celular al tubo marcado con “ADN+”.
Colocar los tubos en hielo.
6. Añadir 10 µL de la mezcla de transformación rainbow al tubo marcado
“ADN+”. No añadir el plásmido al tubo “ADN-“.

7.Mezclar las muestras golpeando suavemente los tubos con los dedos. Incubar
los tubos en hielo durante 10 minutos.
8.Colocar los tubos de transformación en el termobloque a 42ºC durante 90
segundos.
9.Volver a colocar inmediatamente los tubos al cubo de hielo e incubar durante
dos minutos.
10.Transferir 250 µL de caldo de recuperación a cada tubo usando una pipeta
estéril de 1 ml. Mezclar golpeando suavemente los tubos con los dedos.
11.Incubar las células durante 30 minutos en el termobloque a 37ºC
12.Mientras las células se están recuperando, marcar el fondo de las cuatro
placas de agar como se indica a continuación:
 1 Placa pequeña de LB + “ADN-“
 1 Placa pequeña de LB/Amp + “ADN-“
 1 Placa pequeña de LB/Amp + “ADN+“
 1 Placa pequeña de LB/Amp/IPTG + “ADN+“

1.

Después del período de recuperación, retirar los tubos del termobloque y


colocarlos en una gradilla de laboratorio.
2. Utilizando una pipeta estéril de 1 ml, transferir 250 μL de células
recolectadas del tubo denominado "ADN-" en el centro de las placas
marcadas como LB + “ADN-“ y LB/Amp + “ADN-“.
3. Utilizando una pipeta estéril nueva de 1 ml, transferir 250 μL de
células recolectadas del tubo marcado "ADN+" en el centro de las
placas LB/Amp + “ADN+“y LB/Amp/IPTG + “ADN+“.
4. Extender las células sobre toda la placa utilizando un asa de siembra.
Utilice un asa de siembra estéril para extender ambas muestras de
ADN-. Utilizar un asa de siembra nueva para extender las muestras de
ADN+. Asegurarse que las células se han extendido por toda la
superficie de las placas. Cubrir las placas y esperar cinco minutos para
que la suspensión celular sea absorbida por el agar.
5. Apilar las placas una encima de otra y fijarlas juntas. Marcar las placas
con las iniciales de los estudiantes o el número de grupo. Colocar las
placas en la posición invertida (con el agar en la parte superior) en
una estufa de incubación bacteriana a 37°C para incubarlas durante la
noche (24 horas).

C. Observar las placas de transformación y control y registrar lo siguiente:

 El número de colonias en la placa.


 El color de las bacterias. Si los colores son débiles y si estan los tres,
incubar las placas a 4ºC durante 24 horas adicionales.

RESULTADOS

Podemos observar claramente los diferentes resultados obtenidos en la realizacion de la prueba.Por


un lado podemos ver que el grupo con ADN-, tendria colonias en las placas con material genetico y
medio de cultivo LB, en los cuales no se introdujo ampicilina, y sin colonias presentes en las que sí
tienen el antibiotico. De esta manera confirmamos la presencia de la bacteria y la utilizacion de la
ampicilina como metodo valido para anular la presencia de la bacteria E.Coli.fig1.
Por otro lado tendremos las placas con presencia de bacterias multicolores.En estas placas hemos
introducido material ADN+ ademas de la mezcla de material plasmidico y en una de ellas el agar
LB lleva añadido la ampicilina.
Podemos observar que en las dos placas existe la presencia de puntos de diferentes colores si bien
en una de ellas (la que contiene IPTG ) esa profusion de colores es mayor en cantidad y en numero
de colores diferentes, ademas de en intensidad.fig2.

Fig1.

Fig2.
CONCLUSIONES

Después de vistos y analizados los resultados obtenidos, podemos deducir de ellos, que el promotor
no es 100 % inducible. Por lo cual hay crecimiento y coloración en las placas que no tienen IPTG y
con ampicilina.
En el que tienen IPTG se multiplican mas y ademas sus colores son mas intensos. Ello de por si ya
tiene una expresión basal. En ese estado el promotor no esta silenciado al 100% o bien el promotor
no solo se activa con la T7.
Activación del promotor T7

El promotor del fago* T7 necesita la ARN polimerasa específica del mismo fago*. Por lo tanto si se
desea expresar genes bajo ese promotor, hay que clonar simultáneamente el gen de la polimerasa de
T7. Normalmente este gen de la polimerasa se inserta en el cromosoma de E. coli o en el profago
lamda (la versión insertada del cromosoma del lamda en las células lisogénicas) y bajo el control
del promotor de lac. Acto seguido, se procede a transformar las células con la construcción genética
dotada del gen de interés “downstream” del promotor del T7. Cuando se añade el inductor IPTG, se
induce el gen de la polimerasa de T7, proteína que transcribe a gran nivel el gen clonado.

*Fago El fago λ o bacteriófago lambda es un virus bacteriófago que infecta a la bacteria


Escherichia coli; descubierto en 1950.1
El Fago λ igualmente es utilizado como un Vector de clonación.

Resumen de la practica ADN plasmidico ( RTM )


Campana de flujo laminar del aula de biotecnologia