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Efectos protectores de la melatonina en la competencia de desarrollo in vitro de los

ovocitos bovinos.

RESUMEN

El presente estudio investigó los efectos de la melatonina en la maduración de


ovocitos bovinos y el posterior desarrollo embrionario in vitro. Los resultados
mostraron que la maduración nuclear y citoplásmica, caracterizada por la primera
extrusión del cuerpo polar, la distribución normal de los gránulos corticales y las
mitocondrias, así como el aumento del potencial de membrana mitocondrial,
mejoraron significativamente en ovocitos tratados con melatonina 10 - 9 mol / L. La
suplementación con melatonina redujo el nivel de especies de oxígeno reactivo
intracelular y mejoró la producción de glutatión. Mientras tanto, la presencia de
melatonina (10-9 mol / L) durante la maduración de los ovocitos resultó en una
disminución de la tasa de apoptosis temprana en los ovocitos. Después de la
fertilización in vitro, los ovocitos que recibieron suplementos de melatonina
mostraron una tasa de formación de blastocistos significativamente mayor y
produjeron un número notablemente menor de células apoptóticas. Las
exploraciones mecánicas mostraron que la adición de melatonina 1-9 mol/L a los
medios de maduración in vitro atenuó significativamente el nivel de transcripción de
caspasa-3, mientras que las expresiones de BCL-2, XIAP, CAT y HSP70 se
reforzaron significativamente en los embriones resultantes. En conjunto, la
melatonina mejora el potencial de maduración de ovocitos bovinos y los efectos
beneficiosos pueden afectar el desarrollo embrionario posterior. El papel protector
de la melatonina puede deberse a sus actividades anti-apoptóticas y antioxidantes.

INTRODUCCIÓN

Aunque la maduración in vitro de ovocitos (MIV) se usa de manera rutinaria para la


producción in vitro de embriones en especies domésticas, especialmente en el
ganado, solo una pequeña proporción del grupo original de ovocitos inmaduros
colocados en un sistema de MIV es capaz de completar el desarrollo embrionario
preimplantación (Krisher 2013). Esto sugiere que las condiciones actuales de
maduración no apoyan el desarrollo de un ovocito totalmente competente (Yuan et
al. 2012). Los sistemas de cultivo in vitro subóptimos, específicamente la tensión de
oxígeno más alta, cuando se comparan con las condiciones in vivo, siempre se han
asociado con la generación de grandes cantidades de especies reactivas de
oxígeno (ROS), que pueden inducir efectos perjudiciales sobre componentes
celulares como la fragmentación de ADN, proteína oxidación, peroxidación lipídica
y daño mitocondrial (Balasubramanian et al. 2007; Lopes et al. 2010). Para prevenir
el daño a los ovocitos inducido por ROS, se han complementado varios eliminadores
de radicales libres en los medios de IVM para mejorar la maduración de los ovocitos
y el desarrollo del embrión (Ali et al. 2003; Kang et al. 2009; Mukherjee et al. 2014).

La melatonina (N-acetil-5-metoxitriptamina), un derivado del triptófano, se conoce


como un potente antioxidante, anti-apoptosis y agente antiinflamatorio (Cruz et al.
2014a; Asghari et al. 2017). La naturaleza lipófila e hidrófila de la melatonina le
permite pasar fácilmente a través de todos los compartimentos celulares y proteger
las células contra el estrés oxidativo causado por las ROS (Cruz et al. 2014b). Entre
la gran cantidad de antioxidantes que se han identificado, la melatonina proporciona
las características más deseables, ya que la melatonina y sus metabolitos funcionan
de manera secuencial en la desintoxicación de radicales (Manchester et al. 2015).
Varios estudios han observado que la melatonina mejora la maduración de ovocitos
in vitro en una amplia gama de especies, incluidas las porcinas (Kang et al. 2009),
bovinas (El-Raey et al. 2011) y ratones (Nikmard et al. 2016). En bovinos, la
suplementación con melatonina mejoró significativamente la maduración nuclear de
los ovocitos, la expansión de las células del cúmulo y alteró los patrones de
distribución mitocondrial (El-Raey et al. 2011). También se informa que la
melatonina protege a las células del cúmulo de la fragmentación nuclear y aumenta
la expresión de enzimas antioxidantes, así como disminuye los niveles de ROS en
ovocitos bovinos (Rodrigues-Cunha et al. 2016).

A pesar de los efectos beneficiosos de la melatonina sobre el potencial de


maduración de los ovocitos, el mecanismo subyacente aún no ha sido bien aclarado.
Por lo tanto, este estudio se llevó a cabo para investigar el papel de la melatonina
en el potencial de maduración de ovocitos bovinos y el posterior desarrollo de
embriones in vitro. Es importante destacar que también se abordó una exploración
preliminar del mecanismo relevante.

MATERIALES Y MÉTODOS:

Todos los protocolos experimentales se realizaron de acuerdo con las directrices


del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Academia China de
Ciencias Agrícolas.

Productos químicos:

Todos los productos químicos utilizados en este estudio se adquirieron de Sigma-


Aldrich Chemical Company (St. Louis, MO, EE. UU.), A menos que se indique lo
contrario.

Recolección de ovocitos y IVM

Los ovarios bovinos se recolectaron en mataderos locales y se transportaron al


laboratorio en solución salina fisiológica estéril a 28-30 ° C dentro de las 2 h de la
recolección. Se aspiraron los complejos de cúmulo-ovocitos (AOC) de folículos que
variaban de 2 a 6 mm de diámetro. Los ovocitos rodeados por al menos tres capas
de cúmulos compactos se seleccionaron para experimentos adicionales.

Los AOC se lavaron tres veces en medio de maduración: medio de cultivo tisular
modificado TCM-199 que contiene sales de Earle (Gibco, Life Technologies Inc.,
Grand Island, NY, EE. UU.) Suplementado con 0,01 UI / ml de hormona estimulante
del folículo, 10 UI / ml hormona luteinizante, 1 lg / ml de estradiol y 10% (v / v) de
suero bovino fetal (FBS) (Gibco, Life Technologies Inc.), y luego se colocan en
placas de cuatro pocillos (Nunclon, Roskilde, Dinamarca). Se cultivaron
aproximadamente 50 AOC por pozo durante 22 a 24 h en 750 lL de medio de
maduración a 38.5 ° C en aire humidificado con 5% de CO2.

Evaluación de la maduración citoplásmica y nuclear de ovocitos.

Después de la maduración, los ovocitos fueron despojados de las células del cúmulo
circundante mediante vórtice suave en hialuronidasa al 0,1% (p / v). Los ovocitos
desnudos se examinaron directamente bajo un estereomicroscopio para detectar la
presencia del primer cuerpo polar que indicaba la maduración nuclear (Dominko y
First 1997).

La maduración citoplásmica se examinó de acuerdo con la distribución de los


gránulos corticales (CG) como se describió anteriormente (Mo et al. 2014). En
resumen, los ovocitos denudados se trataron con pronasa al 0,5% (p / v) para
eliminar la zona pelúcida, luego se fijaron en solución salina tamponada con fosfato
(PBS) que contenía paraformaldehído (PFA) al 4% a 37 ° C durante 30 min.
Después de tres lavados con solución de bloqueo (PBS con albúmina de suero
bovino al 0,3% (BSA) (p / v) y 100 mmol /l de glicina), los ovocitos se permeabilizaron
en PBS que contenía Triton X-100 al 0,1% (v / v) a 37 ° C durante 5 min. Después
de tres lavados en la solución de bloqueo, los ovocitos se transfirieron a 20 lg/ml de
isotiocianato de fluoresceína conjugado a aglutinina culinaris de lente durante 30
minutos en la oscuridad a temperatura ambiente, y luego se trituraron otras tres
veces. La fluorescencia se examinó con un microscopio de barrido láser confocal
(BX61; Olympus, Tokio, Japón). Se pudieron identificar cuatro patrones de
distribución de CG: (i) periféricos, CG distribuidos adyacentes a la membrana
plasmática como ovocitos madurados citoplásmaticamente; (ii) cortical, la mayoría
de los GC localizados en la región de la corteza como ovocitos parcialmente
madurados; (iii) homogéneos, CG dispersos en todo el citoplasma como ovocitos
inmaduros citoplasmáticos; (iv) agrupamiento, grandes agregados de GC
distribuidos en el citoplasma como ovocitos degenerados.

TINCIÓN MITOCONDRIAL EN OVOCITOS BOVINOS.

Para determinar el patrón de distribución mitocondrial, los ovocitos se tiñeron con


MitoTracker x Red CM Ros (Molecular Probes, Eugene, OR, EE. UU.) Según una
publicación anterior (El-Raey et al. 2011). Brevemente, los ovocitos denudados se
incubaron con 100 nmol/L de MtTracker durante 20 minutos a 37 ° C en la oscuridad.
Después de tres lavados con 0,1% de alcohol polivinílico (PVA) / PBS, los ovocitos
se fijaron durante 15 min a 37ºC en PBS que contenía PFA al 4%. Después de tres
lavados más, las muestras se montaron en portaobjetos bajo cubreobjetos y se
examinaron inmediatamente bajo un microscopio de epifluorescencia. Se pudieron
distinguir tres patrones de distribución de las mitocondrias: (i) distribución
homogénea, las mitocondrias se dispersaron por todo el citoplasma; (ii) distribución
semiperiférica, las mitocondrias se distribuyeron de manera desigual dentro del
citoplasma; (iii) distribución periférica, las mitocondrias se ubicaron debajo de la
membrana plasmática.

El potencial de membrana mitocondrial (MMP) se estimó mediante un kit de ensayo


MitoProbeTM JC-1 (Molecular Probes) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Después de 22 h de maduración, los COC se desnudaron de células de
cúmulos y se tiñeron con 4 lmol / L de solución de JC-1 a 37 ° C durante 30 minutos
en la oscuridad. Después de tres lavados con 0,1% de PVA / PBS, las muestras se
montaron en portaobjetos bajo cubreobjetos y se examinaron inmediatamente bajo
un microscopio confocal (TCS SP8; Leica, Heidelberg, Alemania). MMP se expresó
como la relación de intensidades de fluorescencia roja a intensidades de
fluorescencia verde.

Medición de ROS intracelular y glutatión (GSH)

Los niveles de ROS de los ovocitos intracelulares se examinaron con 20, 70-
diclorodihidrofluoresceína diacetato (DCHFDA) como se describió anteriormente
(Hashimoto et al. 2000). Los ovocitos se incubaron con 10 umol/L de DCHFDA en
la oscuridad durante 30 minutos a 37 ° C, y luego se lavaron tres veces en 0.1% de
PVA / PBS. Las muestras de cada grupo se transfirieron a portaobjetos idénticos y
se analizaron bajo un microscopio de epifluorescencia. La intensidad de la
fluorescencia de las imágenes se cuantificó utilizando el software ImageJ 1.45s
(National Institutes of Health, Bethesda, MD, EE. UU.).

Los niveles intracelulares de GSH de los ovocitos se analizaron utilizando el reactivo


de detección GSH violeta ThiolTrackerTM (Invitrogen / Molecular Probes, Carlsbad,
CA, EE. UU.) De acuerdo con el protocolo del fabricante. Los ovocitos de cada grupo
de tratamiento se incubaron con 20 lmol / L de solución de tinte ThiolTrackerTM
Violet precalentado durante 30 minutos a 37 ° C en la oscuridad y se lavaron tres
veces en PVA al 0,1% / PBS. Las muestras se montaron en portaobjetos bajo
cubreobjetos y se observaron inmediatamente bajo un microscopio de
epifluorescencia. La intensidad de fluorescencia de las imágenes se cuantificó
utilizando el software ImageJ 1.45s (National Institutes of Health).

ENSAYO APOPTÓTICO TEMPRANO

Se utilizó el kit de apoptosis de anexina V / células muertas de isotiocianato de


fluoresceína (FITC) (Invitrogen / Molecular Probes, Carlsbad, CA, EE. UU.) Para
detectar la apoptosis temprana en ovocitos bovinos según las instrucciones del
fabricante. Los ovocitos denudados se lavaron tres veces en 0,1% de PVA / PBS,
luego se incubaron en 100 l de tampón de unión que contenía 5 l de FITC Annexin
V y 1 l de la solución de trabajo de yoduro de propidio (PI) de 100 ug / mL durante
15 min a temperatura ambiente oscuro. Después de tres lavados más en PVA / PBS
al 0,1%, las muestras se transfirieron a portaobjetos idénticos y se analizaron con
un microscopio confocal (TCS SP8; Leica, Heidelberg, Alemania).

FERTILIZACIÓN IN VITRO (FIV)

Los ovocitos se desnudaron parcialmente de las células del cúmulo circundante


mediante un pipeteo suave, y luego se transfirieron a una gota de 50 uL de medio
de fertilización Brackett and Oliphant (BO) (Brackett & Oliphant 1975) que contenía
10 ug/mL de heparina y 4 mg/mL de ácido graso libre BSA a una densidad de 15 a
20 AOC por grupo. El semen congelado se descongeló en un baño de agua a 37 °
C durante 30 s, se enjuagó dos veces mediante centrifugación a 615 g durante 8
minutos en 6 ml de medio BO que contenía 10 mmol/L de cafeína y 4 mg / ml de
BSA sin ácido graso, y se diluyó a una concentración final de 10 x 10 6
espermatozoides por ml. Para la FIV, se añadió una alícuota de 50 uL de suspensión
de esperma a cada gota de fertilización, y la mezcla se incubó durante 8–18 horas
a 38.5 ° C en aire humidificado que contenía 5% de CO2. Se extrajeron los cigotos
presuntos de las células del cúmulo y los espermatozoides adherentes mediante
vórtice suave. Se cultivaron aproximadamente 25 a 30 cigotos presuntos durante 2
días en gotitas de 100 litros de medio CRlaa (Rosenkrans y First 1994)
suplementado con 6 mg/ml de BSA libre de ácidos grasos. Los embriones
escindidos se seleccionaron al final del día 2 y se incubaron en medio CRlaa que
contenía un 10% (v/v) de FBS durante 5 días adicionales. La mitad del medio fue
reemplazado cada 2 días. Las tasas de escisión y formación de blastocistos se
midieron en los días 2 y 7, respectivamente.

ENSAYO DE APOPTOSIS

Los blastocistos del día 7 se fijaron y se permeabilizaron simultáneamente mediante


incubación a 37 °C durante 45 minutos en PBS que contenía PFA al 4% y Triton X-
100 al 0,5%. Se utilizó un kit de detección de muerte celular in situ (Roche,
Mannheim, Alemania) para evaluar la presencia de células apoptóticas en los
embriones. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, los embriones fijos se
incubaron con mezcla de reacción durante 1 hora a 37 °C en la oscuridad. Después
de detener la reacción, los embriones se lavaron, se transfirieron a 2 µg/ml de
dihidrocloruro de 40,6-diamidina-20-fenilindol (DAPI; Vector Laboratories,
Burlingame, CA, EE. UU.) Y se montaron en portaobjetos. El número de núcleos
apoptóticos y el número total de núcleos se determinaron bajo un microscopio de
epifluorescencia.

ANÁLISIS DE PCR CUANTITATIVO EN TIEMPO REAL

Los embriones de FIV se recogieron el día 7, se lavaron tres veces en PBS y se


almacenaron en nitrógeno líquido hasta el análisis. Se utilizó un kit de células a
ADNc (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) Para producir ADNc sin
aislamiento previo de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los
embriones se lisaron en un tampón de lisis celular II y se calentaron a 75 °C durante
10 minutos usando un ciclador térmico tipo bloque. Los lisados celulares se
suplementaron luego con 2 litros de DNasa I por 100 uL de tampón de lisis celular
II, se incubaron a 37 °C durante 15 minutos y luego se calentaron a 75 °C durante
5 minutos para inactivar la ADNasa I. La transcripción inversa se realizó utilizando
dos -proceso de paso. Brevemente, se mezclaron 10 uL de lisado celular, 4 uL de
mezcla de trifosfato de desoxinucleótido y 2 uL de cebadores de oligo (dT) 18 en un
tubo de microcentrífuga sin nucleasas, se calentaron a 70 °C durante 3 min y se
enfriaron en hielo durante 1 min. Luego, se agregaron 2 uL de tampón 109 RT, 1 uL
de la transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney y 1 ul de
inhibidor de la ARNasa, y la mezcla se incubó a 42 °C durante 30 minutos, seguido
de 95 ° C durante 10 minutos. El cDNA resultante se almacenó a 20 ° C hasta su
uso.

Las mezclas de amplificación de PCR en tiempo real constaron de 1 uL de cDNA, 5


uL 2 x Power SYBR Green PCR Master Mix (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE.
UU.), y 0,2 uL de cada cebador directo e inverso (Tabla 1) en un volumen total de
10 uL El programa de PCR fue el siguiente: 95 °C durante 10 min; 40 ciclos C a 95
°C con adquisición de fluorescencia a 65 °C y mediciones obtenidas cada 10 s hasta
que se alcanzó una temperatura de 95 °C; y un paso final de enfriamiento a 4 °C.
Se realizaron tres réplicas para cada reacción y se analizaron 10 -12 blastocistos
por réplica biológica para cada grupo experimental. La abundancia de ARN
mensajero (mARN) se normalizó a nivel de GAPDH en cada muestra. El método 2 -
DDCT se usó para comparaciones, donde DCT = (gen CT - CT GAPDH) y DDCT =
(control DCT tratado con DCT).

DISEÑO EXPERIMENTAL

Experimento 1: Efectos de la suplementación con melatonina sobre el potencial de


maduración de los ovocitos bovinos.

Se añadió melatonina en cada medio IVM en cuatro concentraciones (0, 10-11, 10-9
y 10-7 mol /L). Después de 22 a 24 h de IVM, se registraron la primera tasa de
extrusión del cuerpo polar, la distribución de los GC y el estado de las mitocondrias
de los ovocitos bovinos.

Experimento 2: Efectos de la melatonina en el nivel de ROS intracelular, nivel de


GSH y el fenómeno apoptótico temprano de los ovocitos bovinos

Se midieron los niveles de ROS y GSH intracelulares y el fenómeno apoptótico


temprano de los ovocitos bovinos expuestos a diversas concentraciones de
melatonina (0, 10-11, 10-9 y 10-7 mol/L).

Experimento 3: Efectos de la melatonina en el medio de maduración sobre la


capacidad de desarrollo de los ovocitos bovinos
Los ovocitos tratados con diferentes concentraciones de melatonina se utilizaron
para la FIV. Se registraron la tasa de escisión, la tasa de blastocistos, el número
total de núcleos y los núcleos apoptóticos.

Experimento 4: Efectos de la melatonina en las expresiones relativas de los genes


asociados con apoptosis, antioxidantes y estrés en embriones de FIV bovinos

Los blastocistos del día 7 en el Experimento 2 se usaron en este experimento. Se


realizó una PCR cuantitativa en tiempo real para analizar la abundancia relativa de
transcripción de los genes asociados a la apoptosis caspasa-3, Bax, BCL-2 y XIAP,
el gen asociado al antioxidante CAT, junto con el gen asociado al estrés HSP70.

Análisis estadístico

Todos los experimentos fueron repetidos al menos tres veces. Los resultados en
cada experimento se expresaron como errores estándar. Los datos porcentuales se
sometieron a transformación de arcosina antes del análisis estadístico. Los datos
se analizaron mediante análisis de varianza de una vía (ANOVA), seguido de la
prueba de rango múltiple de Duncan utilizando un software de sistema de análisis
estadístico (SAS Institute Inc., Cary, NC, EE. UU.). Las diferencias con P <0.05
fueron consideradas estadísticamente significativas.

RESULTADOS

Efectos de la suplementación con melatonina sobre el potencial de maduración de


los ovocitos bovinos.

El papel de la melatonina en la maduración nuclear de ovocitos bovinos se investigó


por primera vez. La adición de 10-11 y 10-9 mol / L de melatonina aumentó
significativamente la primera tasa de extrusión del cuerpo polar (79.1+/-1.3% y 82.5
+/-1.7%, respectivamente) (Tabla 2) en comparación con el grupo control (74.8 +/-
2.2%) (P <0.05), mientras que no se observaron diferencias significativas entre el
tratamiento con 10-7 mol/L y los grupos de control. A continuación, se evaluó la
maduración citoplasmática examinando las distribuciones de CG al final de la
maduración. La suplementación con melatonina aumentó significativamente el
número de ovocitos madurados citoplásmicamente. La proporción de ovocitos con
GC periféricos y corticales distribuidos fue significativamente mayor en los grupos
de tratamiento con melatonina que en el grupo control (P <0.05; Fig. 1B). La tasa
más alta se encontró en ovocitos madurados con melatonina 10–9 mol/L (69.1 +/–
3.7%). El impacto de la melatonina en el estado mitocondrial de los ovocitos bovinos
se analizó más a fondo.

Se observó una proporción significativamente mayor de ovocitos con mitocondrias


distribuidas homogéneas en el grupo de melatonina 10-9 mol/L (72.7 +/- 2.7%) en
comparación con la del control (60.0 +/- 3.7%) y en el grupo de melatonina 10-11 mol
/L (64.8 4,8%; P <0,05) (Fig. 2B), pero la proporción no difirió entre el control y los
grupos de tratamiento con 10-7 mol/L. La relación de la intensidad de fluorescencia
de rojo (agregado J) a verde (monómero J), que refleja la MMP de ovocitos (Fig.
2C), fue significativamente mayor cuando los ovocitos se maduraron en el medio de
maduración suplementado con 10-11 mol/L (1.60 +/- 0.93), 10-9 mol /L (1.90+/- 1.14)
o 10-7 mol/L (1.47 +/- 0.73) de melatonina que la de los ovocitos madurados en el
medio de maduración de control (0.85 +/- 0.33) (P <0.05; Fig. 2D).

Efectos de la melatonina en el nivel de ros intracelular, nivel de gsh y el


fenómeno apoptótico temprano de los ovocitos bovinos

La exposición de los AOC a las tres concentraciones de melatonina probadas (10 -


11, 10-9 y 10-7 mol/l) durante la maduración produjo una disminución significativa de
los niveles de ROS intracelular en los ovocitos, según lo detectado por la densidad
reducida de tinción integrada de DCHFDA (P <0.05; Fig. 3A). El nivel más bajo de
ROS se observó en ovocitos tratados con melatonina 10 -9 mol/L (Fig. 3B). En
contraste, los niveles de GSH fueron significativamente más altos en los grupos de
tratamiento con melatonina que en los de control (P <0.05; Fig. 3D). El mayor
contenido de GSH se obtuvo en el grupo de melatonina 10 -9 mol/L (P <0.05). El
análisis de anexina-V mostró que la tasa de apoptosis temprana en ovocitos
expuestos a melatonina 10-9 mol / L fue significativamente más baja que en el grupo
de control (8,55 +/- 3,11% frente a 15,72 +/- 4,13%) (P <0,05; Fig. 4B), mientras que
no se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los otros dos
grupos evaluados y el grupo de control.

Efectos de la melatonina en el medio de maduración sobre la competencia de


desarrollo de los ovocitos bovinos

El desarrollo de embriones fertilizados in vitro derivados de ovocitos tratados con


melatonina no mostró diferencias en las tasas de escisión en comparación con el
grupo de control (Tabla 3). Sin embargo, los ovocitos tratados con melatonina (10 -
11, 10-9 y 10-7 mol/L) tuvieron tasas de blastocistos significativamente más altas (38.6
+/- 1.2%, 42.2 +/- 0.8% y 37.3 +/- 0.5%, respectivamente) que los controles (32.8
+/- 0.5%) (P <0.05). El número promedio de células totales en blastocistos no fue
significativamente diferente entre los grupos (Fig. 5B), mientras que la incidencia de
núcleos apoptóticos en blastocistos derivados de ovocitos tratados con melatonina
disminuyó notablemente en comparación con el grupo de control (P <0.05). La
menor proporción de núcleos apoptóticos se detectó en muestras tratadas con 10 -9
mol/L (Fig. 5C).
Efectos de la melatonina en las expresiones relativas de genes asociados con
apoptosis, antioxidantes y estrés en embriones de FIV bovinos

Se analizaron un total de seis genes mediante análisis de PCR cuantitativo en


tiempo real para evaluar la abundancia de su transcripción en embriones originados
de ovocitos tratados con melatonina. La expresión de pro-apoptosis caspase-3 fue
significativamente menor en los grupos tratados con 10-9 y 10-7 mol/L de melatonina
que en los grupos control y 10-11 mol/L (P <0.05) (Fig. 6A), mientras que la expresión
de Bax fue comparable en todos los grupos (Fig. 6B). Los perfiles de expresión de
ARNm de los genes anti-apoptóticos BCL-2 y XIAP mostraron una tendencia similar.
La expresión de estos genes aumentó notablemente en muestras tratadas con
melatonina 10-9 M mol/L en comparación con el grupo de control (P <0.05), pero la
melatonina 10-11 y 10-7 M mol/L no tuvo un efecto significativo sobre el BCL -2 y la
expresión XIAP (Fig. 6C, D). El gen de la enzima antioxidante CAT en el grupo
tratado con 10-9 mol / L de melatonina estaba significativamente regulado al alza en
comparación con el control y las muestras tratadas con 10 -11 mol/L de melatonina
(P <0.05) (Fig. 6E). Los embriones derivados de ovocitos tratados con melatonina
10-9 mol/l mostraron niveles significativamente más altos de expresión de HSP70 en
comparación con los otros grupos (P <0.05) (Fig. 6F).
Efecto de la melatonina en la distribución de gránulos corticales (GC) en ovocitos bovinos. (A)
Fotomicrografías representativas. (a) Distribución periférica. (b) Distribución cortical. (c) Distribución
homogénea. (d) Distribución del cluster. Barra = 50 lm. (B) La proporción de ovocitos con distribución
periférica y cortical de GC de cada grupo de tratamiento. Letras diferentes (a – c) indican diferencias
estadísticamente significativas (P <0.05). Los experimentos se repitieron tres veces, y n = 15-20 por
grupo en cada replicación.

DISCUSIÓN

En general, se acepta que los ovocitos madurados in vitro son de calidad inferior a
los madurados in vivo. Incluso con la mejora continua, los medios de cultivo aún no
proporcionan resultados comparables a los obtenidos en el entorno materno,
especialmente no en el caso de animales grandes (Labrecque y Sirard 2014). Las
condiciones de cultivo subóptimas pueden inducir la acumulación de ROS, lo que
puede tener un impacto negativo en el progreso meiótico de los ovocitos in vitro
(Prasad et al. 2016). Anteriormente, algunas publicaciones informaron que la
melatonina puede ser sintetizada en el líquido folicular por los ovocitos y utilizada
para protegerla contra el daño oxidativo u otros daños ambientales, lo que beneficia
el potencial de maduración de los ovocitos (Shi et al. 2009; Tamura et al. 2009; Tian
et al. 2014). En este estudio, la adición de 10 -11 y 10-9 mol/L de melatonina a los
medios de administración por vía intravenosa produjo una mayor proporción de
ovocitos que alcanzaron el estadio MII, lo que respaldó aún más el efecto
beneficioso de la melatonina sobre la maduración de ovocitos bovinos in vitro.
La maduración citoplásmica de los ovocitos implica un conjunto complicado de
reordenamientos de orgánulos y almacenamiento de ARNm, proteínas y factores de
transcripción que actúan en el proceso de maduración general, la fertilización y el
desarrollo embrionario (Ferreira et al. 2009; Krisher 2013). La exocitosis de los CG
a la corteza celular es un indicador de la maduración citoplásmica (Mo et al. 2014).
En el estudio actual, se observó un mayor porcentaje de ovocitos con distribución
periférica y cortical de CG en muestras tratadas con melatonina. Estudios anteriores
han proporcionado evidencia creciente del deterioro de la maduración citoplásmica
por ROS durante o en el período periférico de la maduración (Hashimoto et al. 2000;
Iwata et al. 2003; Ikeda et al. 2005). La melatonina es uno de los antioxidantes más
conocidos en términos de su capacidad efectiva para prevenir el daño causado por
los radicales libres (Reiter et al. 2014). Por lo tanto, es posible que la melatonina
exógena pueda ejercer sus efectos beneficiosos al proteger los ovocitos de la
citotoxidad mediada por ROS, lo que aumenta el potencial de maduración de los
ovocitos.

El orgánulo masivo y la reorganización del citoesqueleto que se producen durante


la maduración de los ovocitos son energéticamente costosos, y las mitocondrias
están sujetas a cambios en la abundancia, función y localización que son cruciales
para su capacidad de satisfacer las demandas energéticas de los ovocitos
(Coticchio et al. 2015). Se ha establecido que la organización y la actividad
metabólica de las mitocondrias son características esenciales de la maduración
citoplasmática y la reanudación de la meiosis (Stojkovic et al. 2001; El-Raey et al.
2011). Tarazona et al. (2006) informaron que la distribución mitocondrial era
insignificante en ovocitos inmaduros, mientras que la distribución se hizo difusa en
todo el citoplasma en ovocitos maduros. En el presente estudio, la suplementación
con melatonina resultó en un aumento de la agregación de mitocondrias a lo largo
del citoplasma en ovocitos bovinos, lo cual es consistente con un informe previo de
que la aplicación de melatonina alteró los patrones de distribución mitocondrial
durante la IVM (El-Raey et al., 2011). Nuestros resultados indican que la
redistribución mitocondrial desde la periferia hacia el citoplasma central puede
representar una necesidad de mayor desarrollo para la maduración citoplásmica.
La disfunción mitocondrial en ovocitos es un evento temprano en el proceso de daño
oxidativo, que se encontró que es directamente responsable del retraso en el
desarrollo y la detención de embriones de preimplantación in vitro (Thouas et al.
2004). Los estudios indican que la polaridad de la membrana mitocondrial en
ovocitos maduros se asoció con el potencial de desarrollo de los ovocitos, y la
disminución de MMP es un indicador de daño mitocondrial y la fase temprana de
apoptosis (Qian et al. 2016; Magata y Shimizu 2017). Varios informes han
demostrado que la melatonina y sus metabolitos conservan la función mitocondrial
al inhibir la fuga de electrones, reducir el potencial de membrana y mantener las
actividades de los complejos respiratorios (principalmente los complejos I, III y IV) y
la síntesis del trifosfato de adenosina (Reiter et al. 2008; López et al. 2009). En este
estudio, la exposición a melatonina durante la maduración de los ovocitos resultó
en un aumento de MMP en ovocitos madurados. Por lo tanto, podría ser posible que
la melatonina mejorara la función mitocondrial, dando como resultado una mejor
fertilización de seguimiento y el desarrollo del embrión.
Figura 2. Efecto de la melatonina sobre el patrón de distribución mitocondrial (A, B) y el potencial de
membrana mitocondrial (MMP) (C, D) en ovocitos bovinos. (A) Distribución mitocondrial. (a)
Distribución homogénea. (b) Distribución semi-periférica. (c) Distribución periférica. Barra = 50 lm.
(B) El porcentaje de ovocitos con distribución mitocondrial homogénea de cada grupo de tratamiento.
(C) Oocitos con mitocondrias de alta polarización (grupo de tratamiento con melatonina) o de baja
polarización (grupo de control) detectados por el colorante JC-1. Barra = 50 lm. (D) MMP relativa
expresada como la relación de rojo (agregados J; alto potencial de membrana) a verde (monómeros
J; bajo potencial de membrana) de intensidad de fluorescencia. Las letras en superíndice (ayb)
indican diferencias significativas (P <0.05). Los experimentos se repitieron tres veces, y n = 15-20
por grupo en cada replicación.

Se sabe que los niveles intracelulares de ROS y GSH son factores importantes que
afectan la maduración de los ovocitos y el posterior desarrollo de embriones in vitro
(You et al. 2010). Varios estudios demostraron que la melatonina puede reducir
significativamente la formación de ROS e inhibir el índice de apoptosis en ovocitos
en comparación con las muestras no tratadas (Remiao et al. 2016; Zhao et al. 2016).
Como se esperaba, la adición de melatonina al medio de maduración disminuyó
significativamente el nivel de ROS y aumentó el nivel de GSH en ovocitos bovinos.
Este descubrimiento fue probablemente debido a las actividades directas de
eliminación de ROS de la melatonina y sus derivados metabólicos. Mientras tanto,
informes recientes han demostrado que la adición de melatonina a los medios de
IVM mejoró la calidad de los ovocitos y la capacidad de desarrollo de los embriones
al aumentar la síntesis de GSH (Li et al. 2015a; Zhao et al. 2017). Además, se
demostró que 10-9 mol / L de melatonina reduce la tasa apoptótica temprana en
ovocitos bovinos. ROS actúa como el instigador de la apoptosis en las células, con
marcadores tempranos para la apoptosis (externalización de fosfatidilserina) que
aparecen simultáneamente con el estrés oxidativo (Thouas et al. 2004; Reiter et al.
2008; Lord et al. 2013). Algunas publicaciones han informado que la melatonina
conserva la función mitocondrial y la homeostasis óptimas al reducir y prevenir el
estrés oxidativo.
Figura 3. Efecto de la melatonina sobre los niveles de oxígeno reactivo intracelular (ROS) (A y B) y
los niveles de glutatión (GSH) (C y D) en ovocitos bovinos. (A) Fotomicrografías representativas de
ovocitos bovinos teñidos con 20, 70-diclorodihidrofluoresceína diacetato (DCHFDA). Barra = 100 lm.
(B) Efecto de la melatonina sobre los niveles de ROS intracelular en ovocitos bovinos. (C)
Fotomicrografías representativas de ovocitos bovinos teñidos con colorante ThiolTracker Violet.
Barra = 100 lm. (D) Efecto de la melatonina sobre los niveles de GSH en ovocitos bovinos. (a) Oocitos
del grupo control. (b) Oocitos del grupo de melatonina 10 11 mol / L. (c) Oocitos del grupo de
melatonina 10 9 mol / L. (d) Oocitos del grupo de melatonina 10 7 mol / L. Las letras en superíndice
(a-c) indican diferencias significativas (P <0.05). Los experimentos se repitieron tres veces, y n = 15-
20 por grupo en cada replicación.

Algunas publicaciones han informado que la melatonina conserva la función


mitocondrial y la homeostasis óptimas al reducir y prevenir el estrés oxidativo, lo
que reduce los eventos apoptóticos posteriores y la muerte celular (Jou et al. 2007;
Tanabe et al. 2015). Por lo tanto, los datos actuales confirman que las
características de la melatonina en la eliminación de los radicales libres y la
estimulación de las defensas antioxidantes celulares alteran las respuestas de las
células a los estímulos apoptóticos (Sainz et al. 2003).

Figura 4 Efecto de la melatonina en el fenómeno apoptótico temprano de los ovocitos bovinos. (A) Fotomicrografías
representativas. El ovocito de anexina V-negativo solo tenía señales fluorescentes en la zona, mientras que los ovocitos de
anexina V-positivo también tenían señales fluorescentes en sus membranas. Barra = 50 lm. (B) Tasas de apoptosis temprana
después del tratamiento con melatonina. Las letras en superíndice (ayb) indican significantes

Los porcentajes se basaron en el número de embriones cultivados. Se realizaron tres experimentos repetidos por tratamiento.
Los valores medios dentro de la misma columna con diferentes letras en superíndice (a – c) difieren significativamente (P
<0.05).
Es difícil evaluar el grado de potencial de maduración de los ovocitos, aparte de la
capacidad de fertilizar y apoyar el desarrollo embrionario posterior (Vanhoutte et al.
2007). Un estudio previo informó que la suplementación con melatonina durante la
IVM porcina incrementó significativamente la proporción de ovocitos activados
partenogenéticamente que se desarrollaron para blastocistos (Kang et al. 2009). Del
mismo modo, Tian et al. (2014) mostraron que la exposición de los ovocitos bovinos
a la melatonina mejoró notablemente el desarrollo de embriones y el número medio
de células / blastocistos producidos después de la FIV. En nuestros experimentos,
la mejora dependiente de la melatonina en el potencial de maduración de los
ovocitos finalmente mejoró el desarrollo hasta la etapa de blastocisto y redujo la
tasa de apoptosis en los embriones bovinos resultantes. Nuestros resultados
sugieren que la capacidad de la melatonina para inhibir la apoptosis puede ser
responsable de su capacidad para mejorar la capacidad de desarrollo de los
ovocitos madurados in vitro.
Figura 5 Detección de apoptosis en blastocistos producidos in vitro en bovinos derivados de ovocitos tratados
con melatonina. Se usó el ensayo de marcaje de final de nudo dUTP mediado por deoxinucleotidil transferasa
(TUNEL) para investigar el efecto de la melatonina en el medio de maduración sobre la apoptosis en los
embriones bovinos resultantes. (A) Fotomicrografías representativas. Los núcleos (azul) se tiñeron con
dihidrocloruro de 40,6-diamidina-20-fenilindol (DAPI) y los núcleos apoptóticos positivos a TUNEL (cian) se
indicaron con flechas. Barra = 30 lm. (B) El número total de células en blastocistos de cada grupo de tratamiento.
(C) Tasa celular apoptótica. Las letras en superíndice (a – c) indican diferencias significativas (P <0.05). Los
experimentos se repitieron tres veces, y se evaluaron 15-20 embriones por grupo en cada réplica.

La expresión diferencial de genes implicados en diversos procesos fisiológicos,


como la apoptosis, el estrés oxidativo y la protección antioxidante en ovocitos y
embriones de desarrollo temprano, ha demostrado estar asociada con un potencial
de desarrollo (Balasubramanian et al. 2007; Ripamonte et al. 2012). Se ha
demostrado que la melatonina no solo inhibe directamente la apertura del poro de
transición de la permeabilidad mitocondrial, sino que también evita la liberación del
citocromo c de la mitocondria para inhibir la caspasa, activación y apoptosis (Asghari
et al. 2017).

Figura 6 Expresiones relativas de genes asociados con apoptosis, antioxidantes y estrés en embriones bovinos
producidos in vitro que se originan a partir de ovocitos tratados con diferentes concentraciones de melatonina.
(A) caspasa-3. (B) Bax. (C) BCL-2. (D) XIAP. (E) CAT. (F) HSP70. Las letras en superíndice (ayb) indican
diferencias significativas (P <0.05).

Nuestros resultados indicaron que la melatonina (10-9 mol/L) mejora la competencia


en el desarrollo de ovocitos al disminuir significativamente la abundancia de
caspasa-3mRNA mientras aumenta los niveles de transcripción de BCL-2, XIAP y
CAT en los embriones resultantes. Estos resultados están de acuerdo con otros
hallazgos que muestran que la aplicación de melatonina durante el desarrollo
embrionario influye en los genes relacionados con la apoptosis y los antioxidantes
(Choi et al. 2008; Wang et al. 2014; Pang et al. 2016). Además, primero informamos
que la melatonina mejoró la expresión del gen de respuesta al estrés HSP70. La
HSP70 funciona como una chaperona molecular y ayuda a la respuesta del estrés
celular al resistir la apoptosis y el estrés oxidativo (Neuer et al. 2000). La presencia
de HSP70 se ha identificado en ovarios, endometrio y placenta, lo que indica el
importante papel de HSP70 en la ovogénesis y embriogénesis (Li et al. 2015b). En
nuestra investigación, se observó una expresión del gen HSP70 significativamente
mayor en embriones originados a partir de ovocitos tratados con melatonina 10-9
mol/L que en los otros grupos. Este resultado es consistente con un estudio
publicado recientemente que la adición de coagulansina-A, un compuesto de
depuración de ROS, al medio IVM indujo la expresión de HSP70 en embriones
bovinos, y esta proteína después de inducirla en el sistema de cultivo mejoró la
calidad y eficiencia del embrión (Khan et al. 2016).

CONCLUSIÓN

En conjunto, los resultados del presente estudio demuestran que el enriquecimiento


de los medios de IVM con melatonina 10-9 mol / L mejora el potencial de maduración
de ovocitos bovinos y el posterior desarrollo de embriones in vitro. Los efectos
protectores de la melatonina sobre la competencia en el desarrollo de ovocitos
bovinos se pueden lograr a través de los mecanismos combinados de sus
actividades antiapoptóticas y antioxidantes.