Universidad de La Serena Laboratorio de Bioquímica

Facultad de Ciencias Profesora Verónica Plaza

Enfermería 9 de noviembre 2016

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

Gloria Hernández; Javiera Medina; Macarena Rojas; Nicole Saavedra; Brayan Vásquez
E-mail: ghernandezm@alumnosuls.cl, javicon96@hotmail.com, mak.rojasv@hotmail.com,
salinas.saavedra@outlook.com, brayan.comoselee@gmail.com

RESUMEN

La presente experiencia de laboratorio estuvo compuesta por 3 experimentos. En el primer caso el objetivo era
determinar la influencia de la temperatura en la actividad de la β-fructofuranosidasa cuyo sustrato es la sacarosa,
para ello se dispusieron 7 tubos en iguales concentraciones de la enzima y del sustrato, se mantuvo constante la
concentración de DNS que actúa como inhibidor enzimático y reconoce los productos de la reacción, pero se
mantuvo variable la temperatura de la reacción en un rango de entre 0° y 70° C. Al analizar
espectrofotométricamente las muestras de solución se determinó que la temperatura a la cual la enzima es más
eficaz es a los 60° C donde se alcanzó la mayor densidad óptica de 0,022, es decir donde fue mayor la
concentración de producto. El segundo experimento consistió en determinar la influencia de la concentración de
la enzima en la reacción, para ello se dispuso de 9 tubos donde la concentración de la β-fructofuranosidasa fue
diferente en cada uno. Al analizar las muestras en el espectrofotómetro se determinó que la concentración más
eficaz fue la del tubo N° 6 ya que presento la densidad óptica más elevada de 0,408 permitiendo una actividad
enzimática más eficaz y una mayor velocidad de reacción en comparación al resto de los tubos.
Finalmente, el tercer experimento buscaba determinar la influencia de la concentración del sustrato en la reacción,
para ello se dispusieron diferentes concentraciones de sacarosa en 7 tubos, manteniendo constante las demás
variables. Al analizar las muestras en el espectrofotómetro se determinó que la concentración de sacarosa más
efectiva para la reacción es de 0,20 M ya que obtuvo la densidad óptica más alta con 0,991 y fue donde se generó
la mayor concentración de producto.
Palabras claves: β-fructofuranosidasa, actividad enzimática, eficiencia catalítica, factores enzimáticos, velocidad
de reacción.

ABSTRACT
The following laboratory experience consisted of 3 experiments. In the first one the aim was to determine the
influence of temperature on the activity of the β-fructofuranosidase whose substrate is sucrose. For that, we placed
equal concentrations of enzyme and substrate in seven tubes, we also kept the DNS concentration constant, with
a variable reaction temperature in a range between 0° and 70° C. Through an spectrophotometric analysis of the
samples was determined that the temperature at which the enzyme is more effective is at 60 ° C which is where
the highest optical density, of 0.022, was achieved therefore where the product concentration was the highest.
In the second experiment the aim was to determine the influence of the enzyme concentration in the reaction, for
that case we had nine tubes wherein the concentration of the β-fructofuranosidase was different in each. When
analyzing the samples in the spectrophotometer it was determined that the most effective concentration was in
the sixth tube because it presented the highest optical density of 0.408, enabling more efficient enzyme activity
and a fastest reaction rate compared to the rest of the tubes . Finally, the third experiment aimed to determine the
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influence of substrate concentration on the reaction. For that, different concentrations of sucrose were disposed
in seven tubes, keeping constant other variables. When analyzing the samples in the spectrophotometer it was
determined that the most effective sucrose concentration for the reaction is 0.20 M as it obtained the highest
optical density of 0.991 therefore it produced the highest concentration of product.
Keywords: β-fructofuranosidase, enzymatic activity, catalytic efficiency, enzymatic factors, reaction rate.

INTRODUCCIÓN estudiar los factores que afectan la actividad

Sin duda los seres humanos son catalogados como
organismos estructural y funcionalmente complejos,
principalmente porque llevan a cabo un sin número
de funciones con el fin de asegurar su subsistencia.
En este sentido son capaces de alimentarse,
reproducirse, mantenerse en alerta, responder a
innumerables estímulos que se van generando en
cada etapa de su ciclo vital. Sin embargo, es
necesario preguntarse cómo se mantiene este
desarrollo y quienes son los agentes que participan
en este. Uno de los principales protagonistas en estos
procesos vitales, son los catalizadores biológicos
conocidos como enzimas.
Las enzimas son estructuras globulares que se
caracterizan por poseer un centro activo y por ser
altamente específicas. “Cada enzima es designada
por un nombre recomendado, generalmente corto y
apropiado para su uso habitual; por un nombre
sistemático, que identifica la reacción que cataliza y
por un número de clasificación.” (Lehninger, 2003,
pág. 190)
Es importante señalar que estos catalizadores,
principalmente de origen proteico, disminuyen la
energía de activación haciendo posible reacciones
más rápidas y eficientes, conservándose inalterables.
He ahí su gran contribución al desarrollo humano.
Asimismo, es necesario cuestionarnos sobre la
respuesta de las enzimas frente a una enfermedad,
donde se producen desequilibrios y alteran factores
como la temperatura corporal, el pH del organismo,
y la homeostasis en condiciones normales. Por esta
razón, nuestro informe de laboratorio se centrará en
enzimática y la cinética enzimática.
Comprobaremos nuestra hipótesis de que si factores
como la temperatura, la concentración del sustrato o
de la enzima, mientras se encuentren en un valor
adecuado, tendrán un efecto positivo en la actividad
enzimática. A estos factores se agrega la presencia de
inhibidores, los cuales son efectores que aumentan la
energía de activación y disminuyen la velocidad de
reacción.
Para lograr un óptimo desarrollo de las actividades
experimentales en el laboratorio y con el objetivo de
llegar una respuesta certera respecto a la
problemática planteada, se establecieron una serie de
objetivos, tales como: conocer los factores que
influyen en la eficiencia de la actividad enzimática,
profundizando el efecto que implica la concentración
del sustrato, la concentración de la enzima y la
temperatura. De esta forma se podrá determinar la
actividad enzimática de la B-fructofuranosidasa ante
las diferentes variables ya mencionadas. La principal
razón de conocer estos sucesos relacionados con la
actividad enzimática, es que se logra comprender el
funcionamiento, estructura y tipos de enzimas que se
encuentran presentes en nuestro organismo. Se
logrará comprender el rol que poseen las enzimas en
las actividades tan complejas que se generan en el ser
humano. Además de cómo factores como los
anteriormente señalados modifican la actividad
enzimática, de forma directa. Esta serie de
información ayudará a entender porque en sucesos,
como las enfermedades hay un incremento o déficit
de una determinada enzima, según los resultados de
perfiles bioquímicos. Tendrá una relación directa con
el diagnóstico y cuidado de una determinada
enfermedad.
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METODOLOGIA
“Determinación de la influencia de la
temperatura sobre la actividad de la β-
fructofuranosidasa”:
1. Disponer de una serie de 7 tubos de ensayo
propiamente rotulados y agregar 3 mL de la
enzima a cada uno.
2. Agregar 3 mL de Buffer acetato pH=4,7 (0,05
M) a los 7 tubos y homogenizar.
3. Iniciar la reacción catalítica incorporando el
sustrato a los 7 tubos; 1 mL de sacarosa (0,45
M).
4. Incubar por 30 minutos los tubos de ensayo
individualmente en baños termorreguladores
“Determinación de la influencia de la
a diferentes temperaturas; 0 °C, RT, 30 °C,
concentración del sustrato sobre la actividad de
40 °C, 50 °C, 60 °C y 70 °C respectivamente.
la β-fructofuranosidasa”:
5. Transcurrido la incubación incorporar 1 mL
de DNS a todos los tubos y llevarlos a
ebullición por 15 minutos.
6. Dejarlos enfriar en hielo por 5 minutos.
7. Rellenar 7 celdas de espectrofotómetro con 3
mL de la solución en cada tubo e incluir una
octava celda como patrón.
8. Medir su densidad óptica a 540 nanómetros y
determinar la temperatura más eficiente para
llevar a cabo la reacción.
“Determinación de la influencia de la
concentración de la enzima sobre la actividad de
la β-fructofuranosidasa”:
1. Disponer de una serie de 9 tubos de ensayo
propiamente rotulados.
2. Agregar 3 mL de la solución de enzima β-
fructofuranosidasa a los 8 primeros tubos y 3
mL de agua destilada al noveno tubo que
actuará como patrón.
3. Agregar 3 mL de Buffer acetato pH=4,7 (0,05
M) a los 9 tubos y homogenizar.
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4. Equilibrar los tubos a temperatura de
incubación de 27 °C durante 5 minutos.
5. Iniciar la reacción catalítica incorporando el
sustrato a los 9 tubos; 1 mL de sacarosa (0,45
M) en intervalos de 30 segundos.
6. Esperar 3 minutos y agregar 1 mL de DNS en
intervalos de 30 segundos.
7. Desarrollar el color que adoptan los tubos
llevándolos a ebullición por 10 minutos.
8. Enfriarlos en hielo por 5 minutos y diluirlos
en agua destilada.
9. Rellenar 9 celdas de espectrofotómetro con 3
mL de la solución en cada tubo.
10. Medir su densidad óptica a 540 nanómetros.
1. Disponer de una serie de 7 tubos de ensayo
propiamente rotulados.
2. Agregar a los 6 primeros tubos 1 mL de
sacarosa (sustrato) a diferentes
concentraciones; 0,45 M; 0,30 M; 0,20 M;
0,10 M; 0,05 M; 0,03 M respectivamente.
3. Agregar 1 mL de agua destilada al séptimo
tubo que actuará como patrón.
4. Incubar los tubos a 40 °C por 5 minutos.
5. Incorporar 3 mL de la enzima a todos los
tubos en intervalos de 30 segundos, sin
sacarlos del baño, y mantenerlos 10 minutos.
6. Agregar 1 mL de DNS en intervalos de 30
segundos y llevar a cabo la reacción de
coloración llevándolos a ebullición por 10
minutos.
7. Enfriar en hielo y diluir incorporando 15 mL
de agua destilada.
8. Rellenar 7 celdas de espectrofotómetro con 3
mL de la solución en cada tubo.
9. Medir la densidad óptica a una longitud de
onda de 540 nanómetros.
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RESULTADOS

1.- ‘’Determinación de la influencia de la

temperatura sobre la actividad de la β-
fructofuranosidasa”:

La sacarosa, la cual es una molecula compuesta por

fructuosa y glucosa, se separa por medio de la β-
fructofuranosidasa la cual es una enzima que
hidrolizara a la sacarosa. Uno de los factores que
afectan a la actividad enzimática es la temperatura, la
que a su vez también afectara la velocidad de De esta forma se determino que la temperatura
reacción. (A mayor t° existe una rápida reacción; optima para la enzima fue de 60° Celcius. En ella se
pero a menor t° lo contrario). obtubo la mayor absorbancia de 0,22 y por lo tanto a
En la siguiente tabla observaremos la reacción esta temperatura fue donde se produjo la mayor
enzimática que se lleva a cabo ante diferentes cantidad de producto.
temperaturas.

Tabla N° 1

TUBO T° OD [PRODUCTO] V
Reacción
1 0°C 0,002 1,64E4 5,46E-06
2 RT 0,001 1,59E-4 5,30E-06
3 30°C 0 0 0
4 40°C 0 0 0
5 50°C 0,013 2,24E-4 7,46E-06
6 60°C 0,022 2,73E-4 9,10E-06
7 70°C 0,011 2,13E-4 7,1E-06 Mediante este grafico se puede distinguir claramente
8 20°C 0 0 0 la temperatura a la que la velocidad de la reacción
enzimática es más rápida, la cual corresponde a la
Estos resultados, para una mejor intrepretación y muestra del tubo 6.
compresión, fueron graficados en torno a dos
criterios diferentes; la absorvancia que arrojo cada
tubo en función de la temperatura y la velocidad de
reacción de cada muestra en función de la
temperatura.
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2.- “Determinación de la influencia de la 3.- “Determinación de la influencia de la

concentración de la enzima sobre la actividad de concentración del sustrato sobre la actividad de
la β-fructofuranosidasa”: la β-fructofuranosidasa”:

Tabla N° 2 Otro de los factores que afectan a la actividad

enzimática es la concentración de substrato, ya que
TUBO OD [PRODUCTO] V corresponde a un factor que es capaz de modificar la
reacción velocidad enzimática. En la siguiente tabla
1 0,038 3,61E-4 1,20E-04
observaremos la absorbancia de las muestras a
2 0,089 6,4 E-4 2,13E-04
diferentes concentraciones de sacarosa.
3 0,065 5,09 E -4 1,70E-04
4 0,069 5,31 E -4 1,77E-04
5 0,029 3,12 E-4 1,04E-04
Tabla N° 3
6 0,408 2,38 E -3 7,93E-04
7 0,230 1,41 E -3 4,70E-04 TUBO Absorbancia OD [SUSTRATO]
8 0,098 6,9 E-4 2,30E-04 1 0,455 (saturado) 0,45 M
9 0 0 0 2 - 0,30 M
3 0,991 0,20 M
4 0,744 0,10 M
A partir de esta experiencia se determinó que la 5 0,531 0,05 M
concentración de la enzima es proporcional a la 6 0,405 0,03 M
velocidad de reacción, ya que mientras mayor sea la 7 0 (blanco) 0
concentración de esta mayor será la velocidad de la
catálisis enzimática. Con los resultados es posible determinar la
concentración de producto formado a través de una
curva patrón de glucosa-fructosa como la siguiente:
V REACCIÓN vs [ENZIMA]
10
9
8 8
7
V REACCIÓN

6 6
5
4 4
3
2 2
1
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9
[ENZIMA]
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A través de la curva patrón se obtuvo la La concentración de sustrato y velocidad de reacción

concentración de los productos obtenidos mediante nos permitirá graficar según la cinética enzimática de
la ecuación de la recta de la forma: Michaelis-Menten o Lineawever Burk:
Y = 182,82x – 0,028 Tabla N°7

𝑅 2 = 0,9989
[SUSTRATO] V reacción 1/S 1/V
Tabla N°5 0,45 M 2,64E-4 2,2 3.787,87
0,30 M - - -
TUBO Absorbancia [SUSTRATO] [PRODUCTO]
0,20 M 5,57E-4 5 1.795,33
1 0,455 0,45 M 2,64E-3
0,10 M 4,22E-4 10 2.369,66
(saturado)
2 - 0,30 M - 0,05 M 3,06E-4 20 3.267,97
3 0,991 0,20 M 5,57E-3 0,03 M 2,37E-4 33,3 4.219,40
4 0,744 0,10 M 4,22E-3 0 0 0 0
5 0,531 0,05 M 3,06E-3
6 0,405 0,03 M 2,37E-3
7 0 (blanco) 0 0 Gráfica de Michaelis Menten

Luego calculamos la velocidad de reacción con los

resultados obtenidos, considerando los 10 minutos
como tiempo de reacción.
V reacción= [Producto]/Tiempo
Tabla N°6

[PRODUCTO] T V
reacción reacción
2,64E-3 10 2,64E-4
- 10 - 1/VdevsLineawever
Gráfica 1/S Burk
5,57E-3 10 5,57E-4 4,500.00
4,22E-3 10 4,22E-4 4,000.00
10 3,06E-4 3,500.00
3,06E-3
3,000.00
2,37E-3 10 2,37E-4
2,500.00
1/V

0 10 0 2,000.00
1,500.00
Y= 45,24 x + 2450,17
1,000.00
500.00 𝑹𝟐 = 0,58
0.00
0 10 20 30 40
1/S
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A partir de la curva patrón graficada según
Lineawever Burk se obtuvo la ecuación de la recta de
la forma:
Y= 45,24 x + 2450,17
De la cual podemos obtener la velocidad máxima y
la constante de Michaelis-Menten (Km).
V máx= 4,08E-4
Km= 0,018
DISCUSION
Al analizar los resultados se pudo evidenciar que el
fallo experimental en la actividad que pretendía
determinar la influencia de la concentración del
sustrato sobre la actividad de la β-fructofuranosidasa
impidió la obtención de resultados óptimos.
Debido a un error en la manipulación de los
reactivos, el tubo número 2 ante la presencia del
reactivo DNS, que reconoce los productos
cambiando de color la solución de amarillo a rojo,
mantuvo su color original por lo que no se llevó a
cabo la reacción ideal. Al extrapolar los resultados
obtenidos a través de una regresión lineal, omitiendo
el tubo número 2 que debiera haber obtenido una
absorbancia cercana a los 0,800, se obtuvo un
coeficiente de correlación de 0,6 lejano al valor de 1
que idealmente debiera tener.
A pesar del error cometido en dicho experimento se
pudo determinar que contrario a lo que se tiende a
pensar una mayor concentración de sustrato no
implica una mayor producción de producto, ya que
existe un punto en que la solución se sobresatura de
sustrato e impide una actividad enzimática al
máximo potencial, debido a que no dispone de la
concentración de enzima necesaria para satisfacer el
gasto de sustrato. En este caso la reacción desarrolla
una velocidad creciente alcanzando un punto donde
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la velocidad de reacción es máxima, la cual se
mantiene constante.
En relación al experimento que pretendía determinar
la influencia de la temperatura en la actividad
enzimática de la β-fructofuranosidasa se pudo
comprobar cómo a determinadas temperaturas la
enzima ve afectada su actividad negativamente ya
que se desnaturaliza, desestabilizando sus enlaces
covalentes e imposibilitando la producción de
productos y en el caso opuesto cómo a determinadas
temperaturas alcanza condiciones óptimas para
llevar a cabo la reacción alcanzando una máxima
producción de producto.
CONCLUSIÓN
Mediante las actividades experimentales expuestas
en este informe se comprobó que los factores
estudiados de concentración de enzima,
concentración de sustrato y temperatura tienen una
gran influencia en la velocidad de reacción, ya que
afectan la actividad enzimática positiva o
negativamente.
La temperatura, donde la β-fructofuranosidasa
presenta una actividad más óptima para realizar su
función es el intervalo de entre 50° C y 70° C
principalmente a los 60 °C que fue donde se obtuvo
la mayor absorbancia, la mayor concentración de
producto y la velocidad más rápida. A la vez se pudo
demostrar como la disminución de la temperatura,
afecta la velocidad de la reacción, por lo tanto, la
actividad enzimática no es tan efectiva (decae).
Al observar la influencia de la concentración de
sustrato se pudo comprobar como determinadas
concentraciones generaban un aumento en la
velocidad de reacción de la β-fructofuranosidasa, ya
que aumentaban las colisiones efectivas
permitiéndole al sustrato unirse al centro activo de la
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enzima más fácilmente y generando una mayor

afinidad enzima-sustrato. Así también se pudo
demostrar que una alta concentración de sustrato no
supone una mayor producción de producto, sino que
genera una solución saturada ya que la concentración
de enzima no abastece al sustrato.

En contraste con el comportamiento del sustrato se

pudo determinar que una alta concentración de la
enzima favorece la catálisis enzimática. En el caso de
la β-fructofuranosidasa la concentración de la
enzima demostró una relación proporcional respecto
a la concentración de producto generado y la
velocidad de la reacción catalizada.

BIBLIOGRAFIA

Lehninger, A. (2003). Bioquímica las bases moleculares

de la estructura y función celular. España: Ediciones
Omega, S.A..