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CAPÍTULO 5

ANOMALÍAS LISOSOMALES Y FILAMENTOS EN RATONES


TRANSGÉNICOS DE TAU CON MUTACIONES DE FTDP-17

FILIP LIM1, FÉLIX HERNÁNDEZ1, JOSÉ J. LUCAS1


PILAR GÓMEZ-RAMOS2, M.ASUNCIÓN MORÁN2,
JESÚS AVILA1
1
Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa”
(CSIC-UAM), Universidad Autónoma de Madrid
2
Departamento de Morfología, Facultad de Medicina
Universidad Autónoma de Madrid

Introducción

Un gran impedimento en la comprensión del mecanismo de la enfermedad


de Alzheimer (EA) y el desarrollo de terapias ha sido la ausencia de modelos
animales que recapitulen todos de los aspectos claves de esta enfermedad
neurodegenerativa. La identificación de genes y sus mutaciones que provo-
can varias enfermedades neurodegenerativas y los avances en la transferen-
cia génica ha posibilitado la generación de animales transgénicos que no
solamente reproducen la patología molecular de las enfermedades humanas
sino otros aspectos clínicos como las respuestas especificas de diferentes teji-
dos y cambios de comportamiento.
La enfermedad de Alzheimer (EA) se caracteriza por el deterioro cogni-
tivo con afectación progresiva de la memoria junto con el desarrollo de las
lesiones clásicas del hipocampo y corteza: ovillos neurofibrilares de la prote-
ína Tau y placas seniles de péptidos amiloide-beta Aβ. Aunque la distribu-
ción temporal y espacial de los ovillos neurofibrilares correlaciona mejor con
la neurodegeneración observado1, curiosamente aun no se ha vinculado nin-
gún defecto genético en el gen de tau con la EA. En cambio, en casos de EA
familiar, se han identificado varias mutaciones (en los genes que codifican
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para la APP, PS1 y PS2) que producen un aumento en los niveles de pépti-
dos Aβ (revisado en 2). Esto ha posibilitado la generación de modelos trans-
génicos conteniendo formas mutadas de APP o la presenilinas, algunos
recapitulando ciertos aspectos de la patología de la EA como placas de ami-
loide, gliosis y déficits de memoria. Sin embargo, en ninguno de estos mode-
los se ha observado la presencia de ovillos neurofibrilares y/o la pérdida
neuronal que se desarrolla en los cerebros de los pacientes con EA.
La forma patológica de la proteína Tau en los victimas de la EA se distin-
gue histológicamente por la tinción de los ovillos neurofibrilares con reacti-
vos como la tioflavina S o plata, y bioquímicamente con la extracción de
filamentos insolubles en la presencia del detergente sarkosil. El análisis de
los cerebros de los pacientes con otras enfermedades neurodegenerativas
utilizando estas técnicas ha identificado un grupo de demencias llamado las
taupatías (Tabla 1), por la presencia de inclusiones de Tau filamentoso en los
tejidos afectados.

Tabla 1
Las taupatías: enfermedades con inclusiones neurofibrilares de Tau

• Degeneración corticobasal
• Demencia de granos argirofílicos
• Demencia frontal y parkinsonismo ligados al cromosoma 17
• Demencia pugilística
• Distrofia miotónica
• Enfermedad de Alzheimer
• Enfermedad de Gerstmann-Straussler-Scheinker
• Enfermedad de Hallervorden-Spatz
• Enfermedad de Niemann-Pick, tipo C
• Enfermedad de Pick
• Esclerosis lateral amiotrófica / parkinsonismo-demencia de Guam
• Parálisis supranuclear progresiva
• Parkinsonismo postencefalítico
• Syndrome de Creutzfeld-Jakob
• Syndrome de Down

FTDP-17 y un modelo transgénico para las taupatías

Incluido en el grupo de las taupatías es la demencia frontal y parkinsonismo


ligados al cromosoma 17 (FTDP-17), una forma familial de las demencias
frontales. En 1998 se identificaron mutaciones en el gen de tau asociadas a la
FTDP-17 3, indicando que defectos en tau podrían ser suficientes para provo-
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car neurodegeneración (revisado en 4 ). Esto aportó otra estrategia para gene-


rar modelos animales de las taupatías y decidimos generar ratones transgé-
nicos para tau, conteniendo las 3 primeras mutaciones identificadas: G272V,
P301L y R406W. Elegimos la isoforma mas larga del sistema nervioso central
de tau humano porque en FTDP-17 se había identificado mutaciones que
aumentan la proporción de esta isoforma. Para dirigir la expresión específi-
camente a las neuronas se insertó el tau mutado en el gen murino de thy1,
reemplazando la región codificante de thy1. Con este transgen se generó la
línea VLW de ratones transgénicos5 y se observó que estos animales acumu-
lan niveles de expresión elevados de la proteína transgénica en hipocampo y
corteza y bajos niveles en otras regiones del sistema nervioso como la
médula espinal. En los ratones examinados hasta la edad de un año y medio,
no se han observado anomalías motoras obvias.

VL W
hu-

1a 1b 2 4
thy1

Figura 1
El diseño del transgen para generar ratones transgénicos para tau mutante. La región codificante
de tau humano (gris) lleva las 3 mutaciones indicadas con las flechas y es la isoforma mas larga
del sistema nervioso central (hu-tau[42]VLW) y contiene los 2 insertos N-terminales (punteados)
y las 4 repeticiones de unión a microtúbulos (lineadas). Para dirigir la expresión neuronal se
insertó el tau mutado entre los exones (bandas negras) 2 y 4 del gen de thy1 murino (negro).

Fosforilación

Una característica de las taupatías es la hiperfosforilación de Tau. Esto


aumento de fosforilación ocurre en varios epítopos de la proteína, algunos
como los reconocidos por los anticuerpos AT8, AT180 y AT100 presentan
niveles elevados específicamente en la EA (revisado en 6). La inmunotinción
de cerebros de ratones VLW con AT180 y AT8 reveló que los niveles de estos
fosfo-epítopos están elevados en las mismas regiones donde se observa la
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expresión del transgen (Figura 2). Curiosamente el análisis por Western blot
utilizando los mismos anticuerpos demostró que el Tau endógeno esta fosfo-
rilado tanto como el Tau transgénico. Estos datos indican que una molécula
de Tau mutada puede provocar cambios no solamente a su propia fosforila-
ción pero también a la fosforilación de otras moléculas de Tau.

H(con) H(VLW) AT180

C(con) C(VLW) AT180 C(VLW) AT8

Figura 2
Hiperfosforilación de Tau. Inmunotinciones utilizando los anticuerpos AT180 y AT8 de neuro-
nas en el hipocampo (H) y la corteza (C) de ratones de tipo silvestre (con) o transgénicos para
tau mutante (VLW).

Agregación

Con respecto a la patología neurofibrilar de los ratones VLW no observamos


ovillos con la tinción de tioflavina S en animales hasta la edad de un año y
medio. No obstante el examen ultraestructural de las neuronas expresando
niveles mas altos del transgen reveló la formación de filamentos de Tau en
las zonas perinucleares y las dendritas apicales (Figura 3). La extracción bio-
química de dichos filamentos con sarkosil nos permitió distinguir formas
helicoidales y rectos, con diametros menores que los vistos en pacientes de la
EA. Estas características indican que las neuronas de los ratones VLW mimi-
fícan el estado “pre-ovillo” descrito en las etapas tempranas de la EA7.
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B C

Figura 3
Microscopía electrónica de filamentos de Tau en neuronas de ratones transgénicos de la línea
VLW. A la izquierda se ve la intensa inmunotinción para la proteína Tau alrededor del núcleo
(N) en una neurona piramidal. La zona dentro el rectángulo se ve en un aumento mayor
(medio), donde se puede distinguir inclusiones filamentosas. Las 3 imágenes a la derecha mues-
tran ejemplos de filamentos finos, helicoidales y gruesos (arriba hacia abajo) que se obtienen en
extractos precipitados con sarkosil.

Anomalías lisosomales

Al nivel ultraestructural observamos un aumento del numero de varios


cuerpos lisosomales en las neuronas de ratones VLW comparado con las
neuronas de ratones del tipo silvestre. Para confirmar esta observación usa-
mos la tinción histoquímica para la actividad de la fosfatasa ácida, un marca-
dor clásico de lisosomas. Comparando ratones VLW con controles del tipo
silvestre de la misma edad, observamos un aumento en la intensidad de la
tinción en neuronas piramidales de la corteza y el sector CA1 del hipo-
campo, en un patrón muy similar a lo de la expresión del transgen (Figura
4). Cuantificación de la actividad de la fosfatasa ácida en extractos cerebrales
demostró que el aumento de esta enzima en la línea transgénica es específico
a las zonas corticales y hipocampales y no se observa en cerebelo.
Para entender la relevancia de los cambios lisosomales en nuestro modelo
animal se resume otras observaciones claves en el campo de la EA: 1) en la
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secuencia de la progresión neurodegenerativa de la EA, las neuronas más


susceptibles son las más pigmentadas 7. El sistema endosomal-lisosomal
tiene un papel central en el transporte de pigmentos neuronales como la
lipofucsina; 2) en cerebros de victimas de la EA se observa una activación del
sistema endosomal-lisosomal en las neuronas susceptibles 8. Estos cambios
son los mas tempranos conocidos en la EA; 3) inhibidores de proteasas liso-
somales inducen ovillos específicamente en las regiones vulnerables en la
EA9. En este estudio, se observó la simultanea inducción de distorsiones en
las neuritas de las neuronas afectadas sugiriendo un vinculo entre la agrega-
ción de Tau y la citopatología.

A B C D

12

Corteza Hipocampo Cerebelo

Figura 4
Anomalías lisosomales en ratones transgénicos de la línea VLW. La tinción histoquímica para la
actividad de la fosfatasa ácida (A-D) revela un obvio aumento de esta enzima lisosomal en el
sector CA1 del hipocampo (A y B, flechas), y en neuronas piramidales de la corteza (C y D).
Esto aumento se observó también en extractos solubles derivados de tejidos corticales y hipo-
campales, pero no se observó en cerebelo.
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Para investigar la posibilidad de que la mera sobre-expresión del transgen


humano era responsable para las anomalías lisosomales, generamos neuro-
blastomas transfectadas de manera estable con el gen de tau normal o la ver-
sión mutada VLW. Análisis por Western blot confirmó niveles similares de
Tau total en las células transfectadas con tau mutado comparado con las sin
transfectar o transfectadas con tau normal. Sin embargo en las células expre-
sando la proteína mutada observamos un gran aumento en la actividad de la
fosfatasa ácida tanto en extractos solubles como en tinciones citoquímicas.
Estos datos indican que la inducción de las anomalías lisosomales en los
ratones VLW se debe en gran parte a las mutaciones de tau, y no a la sobre-
expresión de la proteína.

Resumen y Conclusiones

En resumen, hemos generado la línea transgénica VLW que desarrolla neu-


ronas con una morfología “pre-ovillo” en regiones del hipocampo y de la
corteza. Notablemente, estos ratones no demuestran déficits motores y por
lo tanto tienen un gran potencial para el uso en estudios de comportamiento.
De nuestras observaciones podemos concluir que mutaciones en el gen de
tau son suficientes para inducir: hiperfosforilación de la proteína Tau; agre-
gados filamentosos de la proteina Tau; anomalías en en los sistemas endoso-
males/lisosomales.
Recientemente dos grupos observaron que el aumento de niveles de pép-
tidos Aβ en ratones transgénicos expresando tau mutante puede intensificar
la patología debido a Tau solo, resultando en la formación de ovillos neuro-
fibrilares y pérdida neuronal10,11. Sin embargo, las líneas transgénicos de tau
mutante utilizados en estos estudios demuestran altos niveles de expresión
del transgen en medula espinal, dando lugar a anomalías motoras. Por lo
tanto, aunque estos animales tienen mucho potencial como modelos de his-
topatología, tienen poco utilidad en estudios de comportamiento y posible-
mente no recapitulan las modificaciones en los patrones de expresión de
proteínas específicos de regiones anatómicas que se observan en la enferme-
dad humana.
GSK3β (glycogen synthase kinase 3 beta) es una quinasa de Tau que fosfo-
rila muchos de los epítopos de Tau con niveles elevados en la EA (revisado
en 6). La pregunta si la GSK3β es necesario para la formación de filamentos
de Tau tiene una gran importancia para la definición de una diana para fár-
macos en la terapia de la EA pero ha sido difícil contestar hasta ahora debido
a la ausencia de modelos animales adecuados y la disponibilidad de inhibi-
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dores específicos de la GSK3. Actualmente varias empresas farmacéuticas


han generado compuestos que inhiben la GSK3 in vitro y necesitan verifica-
ción in vivo. Por otra parte, en nuestro laboratorio, se han manipulado los
niveles de la GSK3 mediante la sobre-expresión con vectores virales12 y en
ratones transgénicos con la expresión condicional de la quinasa13. En estos
animales se ha observado Tau hiperfosforilado, gliosis y un aumento de
apoptosis en hipocampo, apoyando la idea de que la fosforilación de Tau
tiene un papel en la pérdida neuronal.
Finalmente, con respecto al mecanismo de la neurodegeneración en la EA,
un problema practica ha sido los tiempos largos necesarios para observar
pérdida neuronal. Sin embargo existen ahora datos indicando que cambios
en los sistemas endosomales/lisosomales subyacen a la pérdida sináptica y
neuronal, y posiblemente preceden la aparición de ovillos neurofibrilares8.
La identificación de los cambios en los componentes y funciones de los siste-
mas endosomales/lisosomales será un paso importante para vincular la
patología de Tau y la neurodegeneración.
Basados en esta evidencia, proponemos la hipótesis que las causas prima-
rias de las taupatías como niveles elevados de Ab en la EA o mutaciones en
el gen de tau en FTDP-17 provocan modificaciones en la proteína Tau como
la hiperfosforilación mediado por la GSK3β. Estas modificaciones facilitan la
agregación de Tau y provocan anomalías en los sistemas endosomales/liso-
somales que acaban resultando en la pérdida sináptica y neuronal.
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