10/12/2018 Laboratorio Microbiologia

Microbiología General y Bucal

Práctica 4: Diagnóstico microbiológico directo
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En el Laboratorio de Microbiología el microorganismo o sus productos pueden detectarse a través de:

1.- Visualización
Uno de los procedimientos básicos y no por ello menos importante es la visualización del microorganismo en las muestras.

El microscopio óptico es el más utilizado en los laboratorios de microbiología de forma rutinaria. También pueden emplearse el de campo
oscuro, contraste de fases, fluorescencia o electrónico.

El examen microscópico requiere la utilización del microscopio. Puede hacerse una visualización microscópica en 2 momentos: a)
directamente de la muestra clínica y b) a partir de los microorganismos obtenidos por cultivo como primer escalón en la identificación.
¿Cómo se pueden ver los microorganismos?

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Puede realizarse

1-Directamente: examen en fresco. Se estudian las bacterias "al natural", sin teñir. Tiene el inconveniente de que las bacterias tienen una
densidad óptica similar a la del agua (transparentes) por lo que es difícil examinarlas.

2-Mediante una técnica denominada gota pendiente que se utiliza para observar la movilidad.

3-Tinciones negativas (Tinta china). No son una verdadera tinción. Se llaman así porque lo que realmente se tiñe es el fondo sobre el que
están los microorganismos apareciendo los microorganismos sin teñir. Se emplea para ver la cápsula de S. pneumoniae y Cryptococcus
neoformans en LCR.

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4-Tinciones. Existen muchas y en general se pueden clasificar en:

4.1. simples (utilizan un solo colorante). Por ejemplo: azul de metileno para observación de levaduras y protozoos intestinales
4.2. diferenciales (utilizan más de un colorante y permiten la agrupación de las bacterias de acuerdo a su diferente afinidad tintorial).
Destacan la tinción de Gram que agrupa a las bacterias en dos grandes bloques, bacterias grampositivas y bacterias gramnegativas, y la de
Ziehl-Neelsen utilizada, entre otros, para la tinción de micobacterias.

4.3. especiales: tinciones fluorescentes, tinciones de determinadas estructuras como la tinción del esporo, tinción de flagelos...

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Tinción de Gram:

PASOS GRAMPOSITIVAS GRAMNEGATIVAS

Colorante principal: cristal Violeta Violeta

violeta

Mordiente: Lugol Violeta Violeta

Decolorante: alcohol- Violeta “Transparente”

acetona

Colorante de contraste: Violeta Rojo

safranina

¿Cómo se ven las bacterias tras realizar una tinción de Gram?

A través de la tinción de Gram pueden valorarse la afinidad tintorial, forma y agrupaciones de las bacterias.
-Afinidad tintorial. Permite dividir a las bacterias en 1) grampositivas (violetas) que retienen el colorante principal tras la
decoloración con alcohol o alcohol-acetona y 2) gramnegativas (rojas) que pierden el colorante principal tras la decoloración por lo que es
necesario aplicar un colorante de contraste para visualizarlas. Esta diferencia de coloración está basada en la diferencia estructural de la
pared. En las grampositivas el colorante se fija fuertemente al peptidoglicano que lo "retiene" e impide que "salga" con el decolorante. En
las gramnegativas el colorante es retenido con menos fuerza al ser más delgada la capa de peptidoglicano. Además la mayor cantidad de
lípidos presentes hace que el colorante se elimine al solubiliarse los lípidos en el alcohol.

- Pueden tener diferentes formas:

- esféricas: cocos (Streptococcus spp., Staphylococcus spp., etc)
- cilíndricas: bacilos (enterobacterias, Pseudomonasspp., etc...)
- espiroquetas: Treponema pallidum, Borrelia burgdorferi
- Pueden aparecer aisladas o asociarse en parejas [diplococcos: (Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae)], cadenas
(estreptococcos), tetradas, sarcinas, racimos (estafilococos), "letras chinas" (corinebacterias), etc
- Tamaño: las bacterias se miden en µmetros (1µmetro = 10-3 mm) y, en general y como ejemplo, las bacterias esféricas tienen un
diámetro de 1µm y las bacterias alargadas 1.5-8 µm de longitud, aunque este parámetro varía en función de los diferentes géneros
bacterianos.

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Cocos grampositivos

Bacilos grampositivos Bacilos gramnegativos

Visualización de la tinción de Gram

2.- Aislamiento en cultivo y posterior identificación por sus características fenotípicas (morfología, características metabólicas -pruebas
bioquímicas y enzimáticas-, etc.)

¿Cómo se cultivan en el laboratorio?

Se utilizan medios de cultivo compuestos por una mezcla de nutrientes (proteínas, hidratos de carbono, minerales,
oligoelementos...) que permiten el crecimiento de las bacterias en el laboratorio, in vitro.
Los medios de cultivo pueden clasificarse atendiendo a varios parámetros:

a) Según su origen pueden ser 1) naturales: constituidos por sustancias naturales de composición compleja y en ocasiones variable
(extracto de carne, extracto de levadura, patata...), 2) sintéticos o químicamente definidos en los que se conoce la participación exacta de
hidratos de carbono, aminoácidos.... y 3) semisintéticos.
b) Según su consistencia pueden ser 1) líquidos, 2) sólidos: son medios líquidos a los que se les añade para darles consistencia una
sustancia gelificante (agar-agar) obtenida de algas marinas y 3) semisólidos: líquidos a los que se les añade menor concentración de agar
que a los sólidos.
Cada uno tiene sus finalidades. En la superficie de los medios sólidos es posible ver las colonias resultantes de la multiplicación
bacteriana. Los medios líquidos facilitan el crecimiento de las bacterias pero en ellos no se ven colonias, el crecimiento suele detectarse por
turbidez. Los medios semisólidos suelen utilizarse para valorar la movilidad de los microorganismos.

c) De acuerdo a su finalidad y aplicación pueden ser:

1.- Básicos: aquellos que llevan todos los elementos básicos para el desarrollo de los microorganismos no exigentes.

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2.- Enriquecidos: incorporan diferentes sustancias para permitir el crecimiento de microorganismos más exigentes. Ej.: agar sangre, agar
chocolate,...

3.- Selectivos: medios a los que se añaden diferentes sustancias (colorantes, sales biliares, antibióticos...) que son capaces de inhibir a
determinados microorganismos y permitir el crecimiento de otros. En general se utilizan para inhibir el crecimiento de la flora
acompañante y permitir el crecimiento del patógeno. También colaboran en la identificación pues proporcionan un parámetro más: “no se
inhibe por...”
4.- Diferenciales: se les añade un hidrato de carbono y un indicados de pH de forma que si el microorganismo es capaz de utilizar ese
hidrato de carbono se produce un cambio de pH que hace que el indicador cambie de color y evidencie la reacción. Así las colonias son
fácilmente reconocibles por su color.

5.- Otros medios: de enriquecimiento (son medios líquidos a los que se les añades sustancias que inhiben el crecimiento de
microorganismos acompañantes favoreciendo el crecimiento de otros (los patógenos buscados), de transporte, etc.

Siembra de los medios de cultivo

Lo primero que hay que hacer es sembrar la muestra en los medios de cultivo reseñados. Una vez cultivada se procede al
aislamiento en cultivo y posterior identificación por sus características fenotípicas (morfología, características metabólicas -pruebas
bioquímicas y enzimáticas-, etc.).

Prodecimientos de siembra 1
Procedimientos de siembra 2

Esquemas

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Cuando la siembra se realiza a partir de un cultivo debe obtenerse una pequeña porción del mismo.
Condiciones de cultivo

-Temperatura: la mayoría crecen bien a temperaturas entre 35-37ºC aunque hay excepciones

-Tiempo de incubación: depende del tiempo de generación (tiempo requerido para que el número de bacterias se duplique) de cada
microorganismo. Generalmente 18-24 h. Otros requieren más tiempo de incubación: Brucella spp. , M. tuberculosis.

-Atmósfera de incubación. Los microorganismos respecto al tipo de respiración pueden ser:

1.- Aerobios: requieren la presencia de oxígeno molecular.

2.- Anaerobios facultativos: pueden vivir y multiplicarse en presencia o en ausencia de oxígeno.

3.- Anaerobios: el oxígeno libre es tóxico para ellos (algunos son aerotolerantes).
4.- Microaerofilos: necesitan la presencia de oxígeno libre pero a una concentración menor que la atmosférica (2-10%).

Este hecho tiene como consecuencia que haya que incubarlos en estas condiciones. Otros hay que incubarlos en una atmósfera con
un 5-10% de CO2 (no es tipo de respiración sino un requerimiento): se denominan capnófilos

Identificación

Se valoran entre otros parámetros:

1) morfología y aspecto de las colonias (masa constituida por bacterias que es visible a simple viste en la superficie de los medios
sólidos).

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2) capacidad de crecer a una determinada temperatura

3) crecimiento en medios selectivos y diferenciales

4) presencia de hemólisis que en los medios con sangre da lugar a la aparición de un halo alrededor de la colonia. Puede ser
transparente (hemólisis total o ß-hemólisis), verdoso (hemólisis parcial o α-hemólisis o no aparecer (no hemolíticas o γ–hemólisis)

5) pruebas bioquímicas y enzimáticas adecuadas para la bacteria que se sospeche por las pruebas preliminares

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6) movilidad

3.- detección de productos estructurales: antígenos (reacciones antígeno-anticuerpo), ácidos nucleicos (hibridación, PCR, etc)

3.1. detección de antígenos se verán con más detalle al estudiar las reacciones antígeno-anticuerpo

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3.2. técnicas genéticas de detección de ácidos nucleicos: hibridación, Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), etc.

3.2.1. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR):

En 1983, Kary Mullis dio a conocer la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa que es una técnica para la síntesis in vitro de
secuencias específicas de DNA evitandop de esta forma uno de los principales problemas que se planteaban que era la insuficiente cantidad
de ADN para realizar ciualquier procedimiento de laboratorio.

La técnica se basa en la replicación del ADN inducida por la DNA polimerasa, enzima que es capaz de real9izar una síntesis de una cadena
complementaria de ADN en el sentido 5´-> 3´ usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una región de doble cadena. Para crear
esta región doble cadena se usan los denominados iniciadores (primers). Son una pareja de oligonucleótidos sintetizados de manera que
sean complementarios a cada uno de los extremos 3´ del fragmento de ADN que se desea amplificar.

Partiendo de este principio, la PCR se basa en la repetición de ciclos que están formados por tres etapas:

1.- Desnaturalización del ADN doble cadena: la doble hélice de ADN se separa en dos hebras. Para ello se realiza una incubación de la
muestra a altas temperaturas (93-97ºC). La renaturalización se producirá cuando la temperatura disminuya.

2.- Hibridación de los iniciadores a la zona 3´ específica de cada una de las hebras: los cebadores, iniciadores o primers se unen a las zonas
3´ complementarias que flanquean el fragmento que queremos amplificar. Se realiza gracias a la bajada de la temperatura (50-65º C).

3.- Extensión del cebador por actuación de la DNA polimerasa (elongación): se produce la síntesis de una cadena sencilla (produciéndose
un fragmento de doble cadena por la complementariedad) en la dirección 5´-> 3´ mediante la enzima DNA polimerasa, la cual incorpora
los desoxinucleótidos fosfato presentes en el medio siguiendo la cadena molde.

Este proceso se lleva a cabo en un equipo llamado termociclador que realiza los ciclos en los tiempos y temperaturas programadas.

Esquemas de trabajo

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Elementos químicos necesarios para realizar la PCR

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Termociclador

Carga de un gel de agarosa

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Lectura de un gel de agarosa, teñido con bromuro de etidio, bajo la luz ultravioleta

3.2.2. Hibridación
La hibridación o renaturalización de ácidos nucleicos (ARN o ADN) es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de ácidos
nucleicos antiparalelas y con secuencia de bases complementarias, en una única molécula de doble cadena, que toma la estructura de doble
hélice, donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en el interior.

Se utiliza una cadena sencilla de ADN marcada por un método físico-químico, bien sea radiactivo o con un fluorocromo. Esta cadena tiene
una secuencia de nucleótidos conocida y se utiliza como sonda para detectar otras moléculas de ARN o ADN de cadena sencilla de
secuencia parecida.

En el esquema está representado el fundamento de la técnica.

Para saber más

4.- detección de productos metabólicos: Cromatografía (anaerobios, micobacterias), ATP bacteriano (bioluminiscencia), toxinas, etc.
4.1. cromatografía se basa en la identificación de microorganismos a partir de productos de su metabolismo (alcoholes, ácidos grasos) o
de componentes de la pared celular. Se emplea sobre todo para la identificación de micobacterias y anaerobios.

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Algunas de estas técnicas como la PCR pueden utilizarse para realizar el diagnóstico directamente sobre la muestra clínica sin
necesidad de hacer un cultivo previo.

REACCIONES ANTÍGENO ANTICUERPO

Son estrategias de laboratorio que permiten detectar que una reacción antígeno-anticuerpo producida en el laboratorio ha tenido
lugar. Se basan en la especificidad de la reacción, es decir, en que un anticuerpo sólo reaccionará con el antígeno que haya dado lugar a su
formación.

Pueden utilizarse para realizar tanto diagnóstico directo como indirecto. Si conocemos el anticuerpo (están disponibles en el
laboratorio, por ej. anticuerpos monoclonales) podremos identificar el antígeno (en la muestra clínica) que reacciona específicamente con
él: diagnóstico directo.

Ejemplo de identificación serológica de estreptococos del grupo A (parte 1)

Ejemplo de identificación serológica de estreptococos del grupo A (parte 2)

La inmunofluorescencia es una técnica que emplea anticuerpos conjugados a fluorocromos. Los fluorocromos son moléculas que al ser
excitadas con la energía de una determinada longitud de onda son capaces de emitir energía de una longitud de onda mayor.

Una de las técnicas más utilizadas es la Inmunofluorescencia Directa que permite la detección de antígenos en un paso. Utiliza anticuerpos
conjugados a isotiocianato de fluoresceína. La lectura se realiza en un microscopio de fluorescencia, que emite luz ultravioleta de una
determinada longitud de onda.

Reacción positiva

Reacción negativa
La inmunofluorescencia indirecta permite la detección de anticuerpos circulantes. Si el antígeno es conocido (disponible en el laboratorio),
detectaremos los anticuerpos que se encuentran en la muestra clínica y por tanto son desconocidos y que reaccionan específicamente con
ellos: diagnóstico indirecto.

Otras técnicas que se emplean en el diagnóstico microbiológico directo son: detección de antígeno capsular mediante técnicas de
aglutinación con anticuerpos unido a partículas de látex, CIE, RIA y EIA. La descripción de estas técnicas se verán en la práctica 5.

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