Metabolismo de eliminación del arsénico y daño genotoxico en humanos

relacionados con el consumo de aguas altamente mineralizadas conteniendo

arsénico.

Introducción
Millones de personas en el mundo están expuestas al arsénico a través de la ingesta de agua potable.
El arsénico interactúa con la ADN de diferentes maneras y es probable que aquellas interacciones
expliquen la mayor parte de la toxicidad del arsénico.

Este proyecto es un extenso ensayo para estudiar los diferentes aspectos de la interacción entre el
arsénico y la ADN los cuales nos darán información sobre los mecanismos responsables de las
diferencias interindividuales en la quinética y toxicidad del arsénico, como también la
caracterización de los efectos del arsénico en la metilación de la ADN y expresión del gen. Esta
información es de gran importancia, no solamente para entender los mecanismos de la toxicidad del
arsénico, sino también para desarrollar biomarcadores que puedan detectar los efectos de la
exposición al arsénico. Además, sería útil para las evaluaciones de riesgo y para la identificación de
personas susceptible y de grupos determinados en una población.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN

Millones de personas en el mundo están expuestas al arsénico a través del agua potable,
contaminada con valores altos de arsénico que son superiores al límite máximo permisible por la
Organización Mundial de la Salud (10 µg/L). En América Latina, alrededor de 4 millones de
personas dependen de agua potable que contienen valores tóxicos de arsénico, originados por
fuentes geogénicas (Bundshuh. J, 2005).
En un estudio realizado por Garcia M.E y col. 2008 se reportó una concentración de As de 2,7
mg/L en la cuenca del lago Poopó.

El arsénico inorgánico es carcinogénico en los humanos y los riesgos de desarrollar cancer a la piel,
pulmones y vejiga como tambien diabetis y enfermedades respiratorias, nerviosas, cardiovasculares

1 (15)
y lesiones al hígado y riñones por causa de la exposición crónica al arsénico, están bien
documentados (IARC 2004). Resultados de los estudios que estamos llevando a cabo en países
ubicados en el oeste de Europa (Lindberg et al 2006), muestran elevados riesgos de cáncer a la piel,
vejiga y riñones a una exposición de arsénico en el agua inferior a 30 µg/L (IARC 2004). Tambien
los resultados de una investigación que estamos realizando en Bangladesh muestran asociaciones
entre niveles bajos de arsénico en el agua potable (inferior a 50 µg/L) y efectos en la mortalidad
fetal e infantil (Rahman et al 2007). Sin embargo, el conocimiento de los mecanismos responsables
de la toxicidad del arsénico es limitado. No obstante, está claro que el arsénico interactúa con la
ADN de diferentes maneras y se puede hipotetizar que son aquellas interacciones las que explicarían
la mayor parte de su toxicidad.

Los estudios hidroquímicos de contaminación en la subcuenca de los lagos Poopó y Uru­Uru de

Bolivia (Quintanilla y col. 2001, Hermansson y col., 2004) reportaron una contaminación natural

por arsénico y plomo por encima del valor permisible. 

Las  intoxicaciones  por metales  pesados y arsénico son causas  de trastornos cerebrales,  anemia,

problemas   nerviosos,   afectación   de   la   presión   sanguínea,   problemas   renales   y   del   aparato

reproductor, disminución de los glóbulos rojos y reflejos más lentos, entre otros síntomas. Además,

en la zona de Oruro se han observado tasas de hasta 9,5 por mil r.n.v. con malformaciones, muy

probablemente ligadas a problemas de contaminación (tanto del agua como de aire) por metales

pesados.
La zona se caracteriza por tener los niveles de salud más bajos de Latinoamérica: elevados índices
de morbi-mortalidad, sobre todo en madres y niños; baja expectativa de vida al nacer, alta incidencia
de enfermedades infecciosas originadas por las propias condiciones ambientales y situación de
extrema pobreza, convirtiendo a los habitantes en un grupo más vulnerable a enfermedades y
alteraciones genéticas. Frente a esta situación, la zona tiene uno de los más bajos índices de
atención a la salud, con promedios de 1,3 a 1,7 médicos y 3,1 a 7,7 camas por cada 10.000
habitantes, cuando los promedios nacionales en Perú son de 4,6 y 16,6 respectivamente.
Existe  una gran  preocupación  sobre las  consecuencias  de   ésta contaminación  en  la salud  de la

población  y los efectos en suelos y aguas de uso doméstico, de riego y agrícola, por cuanto muchos

2 (15)
estudios   internacionales  in   vitro  e  in   vivo  han   confirmado   los   efectos   tóxicos,   citotóxicos   y

genotóxicos de los metales pesados como el plomo y arsénico sobre la salud y el medio ambiente. 

Es por esto, que consideramos imprescindible realizar estudios de genotoxicidad y metabolismo de

eliminación   del   arsénico   que   permitan   evaluar   el   riesgo   potencial   de   desarrollar   enfermedades

crónicas, como ser cáncer e infertilidad, y efectos teratogénicos (malformaciones congénitas) entre

otras. 

Igualmente, es urgente realizar investigaciones documentales y generación de evidencia científica,

sobre la relación entre la contaminación por metales  pesados y la salud humana, con el fin de

suministrar bases para el diseño de proyectos específicos de control y seguimiento, enmarcadas en

propuestas de políticas y acciones de salud.

MARCO TEÓRICO
Metabolismo del arsénico y genotipo
Entre los individuos hay una gran variación en la susceptibilidad a la toxicidad del arsénico
inorgánico. Probablemente esto en parte está relacionado con las variaciones en la sensibilidad hacia
la toxicidad inducida por el arsénico, por ejemplo, la defensa antioxidativa (Mei et al, 2003), pero
tambien en parte por las diferencias indivuales en la biotransformación del arsénico, que causan
heterogeneidad en la retención y distribución de los metabolitos tóxicos en los tejidos. Existe una
creciente evidencia de que factores hereditarios parecen ser importantes para esta variación
interindividual en el metabolismo (Vahter, 2000; Egström et al 2007), pero el conocimiento del
efecto-modificación genética es hoy día limitado.

En los humanos, el mayor mecanismo de biotransformación del arsénico es la conversión

enzimática del arsénico inorgánico a los metabolitos mono- y dimetilados. El ácido
monometilarsínico (MMA) y el ácido dimetilarsónico (DMA) son los principales metabolitos que se
excretan en la orina (10-20 % MMA, 60-70% DMA). Un gran número de estudios epidemiológicos
indican una asociación entre los metabolitos de MMA en la orina y efectos en la piel, incluyendo
cáncer a la piel, cáncer a la vejiga y aberración cromática (Chen et al, 2003; Maki-Paakkanen et al,
1998; Yu et al 2000). Tambien hay indicaciones de que individuos con un alto porcentage de MMA

3 (15)
en la orina tienen una alta retensión de arsénico (Vahter 2002). Por esa causa son importantes los
ensayos dirigidos a estudiar factores que influyen los niveles de MMA.

La biotransformación del arsénico implica diferentes tipos de enzimas, pero el cuadro sigue
incompleto. La metiltransferasa AS3MT es la enzima que mejor está caracterizada (Lin et al, 2002,
Thomas et al 2004), pero probablemente existen otras metiltranferasas que aún no han sido
identificadas y que pueden metilar el arsénico inorgánico (Hayakawa et al 2005; Lindberg et al,
2007).

Hace poco se demostró tres polimorfismos en la enzima AS3MT asociada con un porcentage bajo de
MMA y un porcentage alto de DMA en la orina de la población de San Antonio de los Cobres
(Egström et al 2007). Aquella población ha estado expuesta al arsénico hace alrededor de mil años
(Figueroa et al 1992; Núñez et al 1991) así que uno puede especular que aquello ha resultado en una
selección positiva en los genotipos que metabolizan el arsénico de una manera menos tóxica. Poco
se sabe sobre la prevalencia de los efectos de la salud asociados al arsénico en aquella población.
Sin embargo no se ha encontrado ningún caso de hiperqueratosis ya sea en las palmas de las manos
o en la planta de los pies en alrededor de 150 mujeres expuestas en San Antonio de los Cobres.

Genotoxicidad del arsénico

Un agente genotóxico es aquel que induce daño concentraciones subtóxicas o que están asociadas
con un bajo grado de toxicidad. El As se ha visto que tiene actividad genotóxica comprobada en
diferentes estudios, tanto in vitro como in vivo, siendo capaz de inducir alteraciones tales como
micronúcleos (MBN). Aberraciones cromosómicas (CA) e intercambios entre cromátides hermanas
(ICH).
Se conoce que el As+3 es más genotóxico que el As+5. En distintos estudios se han analizado por
separado los compuestos de As metilados, tanto trivalentes como pentavalentes, y parece ser que los
compuestos pentavalentes, MMA+5 y DMA+5, son menos genotóxicos que el AS +3, pero sus análogos
trivalentes, MMA+3 y DMA+3, son por lo menos tan citotóxicos como el AS+3 (Gebel, 2001). Esto
indicaría que el As trivalente es altamente tóxico aunque este metilado (Petrick et al. 2000, Styblo
et al 2000).

4 (15)
 +3
Hasta el momento, tanto el MMA , como el DMA+3, el MMA+5, y el DMA+5, no han sido
correctamente en cuanto a su capacidad para producir AC, ICH o citotoxicidad en cultivos de
linfocitos humanos de sangre periférica y tampoco han sido evaluados en cuanto a su mutagenicidad
en Salmonella o para inducción del profago en E. Coli. Para llegar a caracterizar la genotoxicidad
del As, deben generarse todavía más datos, sobre todo mediante ensayos de mutación cromosómica.
Para poder identificar las formas más genotóxicas del As hay que comparar los datos ya existentes
con nuevos datos y entender mejor las vías de toxicidad y de detoxificación (Kligerman et al. 2003).

Genotoxicidad de los compuestos de arsénico in vivo

En relación a los estudios realizados en animales, la frecuencia de MN aumenta en ratones
expuestos a arsenito de sodio y arsenito potásico mediante administración intraperiotoneal (Tinwell
et al. 1991, Deknudt 1986) o por vía oral (Tice et al. 1997), mientras que el As 2S3 no es capaz de
inducir MN, presumiblemente debido a su solubilidad y, por lo tanto, de su escasa biodisponibilidad
(Tinwell et al. 1991). Estudios realizados en ratas han demostrado que después del tratamiento con
As+3 por vía oral se produce un aumento de la frecuencia de CA (Das et al. 1993, Roy-Choudhury et
al. 1996). Otros investigadores (Kashieada y col. 1998) encontraron que las ratas, después del
tratamiento con DMA, presentaban un elevado número de células aneuploides.
Existen bastantes estudios que evalúan los efectos genotóxicos del As ocasionados por exposiciones
humanas crónicas a través del consumo de agua contaminada. Sin embargo, los estudios de
exposiciones laborales son menos frecuentes. En la mayoría de estos trabajos se estudia la
exposición al As+3, pero como en el hombre el As es metilado metabólicamente, se estudia a la vez
la exposición al As+5, al MMA y al DMA.
Los estudios de biomonitorización de poblaciones laboralmente expuestas a As han determinado que
el riesgo de contraer cáncer aumenta en los trabajadores debido a su exposición a compuestos de As
(Welch et al. 1982, Pershagen 1985, Gerhardsson y Nordberg, 1993, Buchet y Lison 1998, Lubin et
al. 2000). A pesar de que el MMA y DMMA son utilizados como herbicidas, pesticidas o
conservantes de la madera, entre otros usos, no hay estudios de evaluación de la genotoxicidad de
estos compuestos después de la exposición laboral. Esto se debe en parte, a que normalmente se
dan exposiciones a mezclas más o menos complejas de distintos compuestos, lo que dificulta el
análisis de los efectos individuales de los distintos elementos o compuestos (Gebel 2001).
Los estudios de biomonitorización de poblaciones humanas expuestas a As en su mayoría muestran
frecuencias elevadas de MN ( Warner et al. 1994, Dulot et al 1996, Biggs et al 1997, Gonsebatt el al

5 (15)
1997, Moore et al 1997 a y b, Seoane eta al 1998, Tian et al 2001), ICH ( Lerda 1994, Hsu et al
1997, Mahata et al 2003) y AC ( Beckman et al 1977, Nordenson et al 1978, Norderson y Beckman
1982, Maki-Paakkenen et al, 1998, Mahata et al 2003)., tanto en linfocitos de sangre periférica
como en células uroteliales. De lo expuesto se deduce que en humanos se ha demostrado claramente
que, en casos de alta exposición, el As actúa como mutágeno a nivel cromosómico, a pesar de que
su potencial para inducir mutaciones puntuales es bajo.
Está reportado que el Arsénico causa modificaciones en el DNA tales como aneuploidias, formación
de micronúcleos, aberraciones cromosómicas, deleciones, intercambios entre cromátides hermanas y
entrecruzamientos entre DNA proteínas (Price B. L et al 2012). Se han propuesto algunos
mecanismos para explicar la genotoxicidad del arsénico, así como también la inducción del stress
oxidativo y patrones alterados de la reparación del DNA (Martínez V.D et al 2011)

Biomarcadores de sensibilidad individual

Los biomarcadores de sensibilidad individual se utilizan para identificar aquellos individuos dentro
de una población que, por sus características genéticas, son más susceptibles a los daños causados
por diversos agentes ambientales. Algunos individuos tiene las probabilidades más altas que otros
de sufrir los efectos de una exposición debido a que tienen más activos los procesos de
bioactivación o a que tienen disminuidas las capacidades de detoxificar , excretar y/ o reparar
daños..
Se ha comprobado que los genes polimórficos que codifican para las GSTs participan en el
metabolismo del As (Chiou et al 1997, Taningher et al 1999, Chouchane y Snow 2001, Susuki et al
2001, Maiti y Chaterjee, 2001). Esto significa que hay distintos alelos en los loci que codifican estas
enzimas metabolizadoras, los cuales definen la susceptibilidad individual frente a una misma
exposición. Es por esta razón que en los estudios sobre genotoxicidad del As se puede usar como
biomarcadores de susceptibilidad individual, tales como algunos genes de las GSTs (Chiou et al
1997).

Asociación del estrés oxidativo del ADN con la exposición al arsénico

El mayor mecanismo propuesto hasta ahora de la cancerogenidad del arsénico es el estrés oxidativo,

especialmente el daño oxidativo al ADN y cambios en el patrón de la metilación del ADN. 8­

hidroxideoxiguanosina (8­OHdG) es aceptado como uno de los marcadores más sensible que detecta

6 (15)
daños en la ADN. Algunos estudios han demostrado que la exposición al arsénico se refleja en

niveles altos de 8­OHdG en la orina (Wong et al 2005; Fujino et at 2005). Sin embargo, se sabe muy

poco sobre los niveles de daño a la ADN en gente crónicamente expuesta al arsénico y asociaciones

entre el patrón de los metabolitos del arsénico y los niveles de 8­OHdG en la orina.

También se ha pensado que el arsénico actúa a través de mecanismos epigenéticos que modifican la

metilación de la ADN (Cui et al 2006, Marsit et al, 2006; Reichard et al 2007). También se ha

sugerido que el arsénico puede agotar la  S­adenosilmetionina, la mayor donadora celular de grupos

metilo,   en   todo   caso   pareciera   que   esto   ocurre   a   una   exposición   alta   de   arsénico.   La   hipo­   e

hipermetilación de la ADN no ha sido bien estudiada. Encontrar genes que metilan y que desmetilan

nos ayudará a entender el mecanismo responsable de la toxicidad del arsénico. Cambios en el estado

de la metilación puede ser un útil biomarcador de efectos tempranos de exposición al arsénico. 

Arsénico y expresión del gen

Estudios recientes han mostrado una inducción aberrante que es potencialmente importante en la

expresión del gen por el arsénico en células humanas o de animales usando una tecnología moderna

de cDNA microarray (Argos et al 2006, Bae et al 2002; Kigriya et al 2007, Yih et al 2002). En un

estudio  que estamos  realizando,  hemos  ocupado  éste  nuevo método  en 30,000 genes  que están

relacionados con cánceres, y hemos encontrado que ratones expuestos a 1 mg de arsénico por litro

de agua durante 4 meses, muestran un mayor cambio en la expresión del gen. Por eso, el poder

identificar el patrón específico del arsénico en la aberración de la expresión del gen, podría ser una

herramienta más para poder entender los mecanismos de la toxicidad del arsénico en relación con la

dosis, tiempo y modo de exposición y los factores de la susceptibilidad individual, por ejemplo el

metabolismo. También sería esencial para poder desarrollar biomarcadores sensibles y específicos

que puedan detectar efectos tempranos y susceptibilidad a la toxicidad del arsénico.  

OBJETIVOS     

7 (15)
Objetivo General:

Evaluar el metabolismo de eliminación del arsénico y el riesgo genético en las poblaciones de la

subcuenca del lago Poopó  expuestas al consumo de aguas mineralizadas con arsénico.

Objetivos específicos:
- Evaluar el posible daño genotóxico por exposición a arsénico mediante el ensayo de micronúcleos
en linfocitos de sangre periférica y en células de mucosa bucal
- Determinar la susceptibilidad genética a la toxicidad por arsénico a través de los polimorfismos de
la GSTM1 y GSTT1
- Identificar los genes implicados en la biotransformación del arsénico
- Estudiar el impacto clínico, especialmente los efectos dermatológicos de la exposición a arsénico
- Analizar la asociación entre el arsénico y el daño oxidativo al ADN (8-OHdG)
- Establecer el efecto de la(s) modificación(es) de los genes implicados en la defensa contra el daño
oxidativo en la asociación arsénico y daño al ADN
- Valorar los efectos epigéneticos del arsénico en el ADN (metilación)
- Analizar el patrón de la expresión del gen asociada con la exposición crónica al arsénico

METODOLOGIA
Diseño Metodológico del estudio
Corte Transversal Analítico

Universo y/o población de estudio

Alrededor de 120 participantes (60 expuestos y 60 controles) entre 18 y 60 años, serán

seleccionados desde listas de los habitantes de tres poblaciones (dos poblaciones expuestas y una
población de control) de la región del Sur del lago Poopó y convocadas en uno de los centros de
salud con la ayuda de los agentes sanitarios. Los participantes serán mujeres y hombres ya que se ha
visto que hay una diferencia de género en relación a la toxicidad del arsénico (Rahman et al 2006;
Vahter et al 2006).
Para expuestos

8 (15)
 Criterios de inclusión: Personas de ambos sexos, edad entre 18 ­ 60 años, expuestos a agua
contaminada con arsénico.

Criterios   de   exclusión:  Personas   con   enfermedades   crónico­degenerativas   y

neuropsiquiátrico,   alcohólicos,   uso   de   medicamentos,   personas   que   rehúsan   firmar   el
consentimiento informado.

Para Controles
Criterios de inclusión:  Personas de ambos sexos, edad entre 18 – 60 años, no expuestos a
agua contaminada con arsénico.

Criterios de exclusión: Personas con enfermedades crónico-degenerativas y

neuropsiquíatricas, uso de medicamentos, personas que rehúsan firmar el consentimiento
informado, alcohólicos.
Muestras.
Muestras de sangre serán recolectadas en tubos vacutainer con EDTA y con heparina 
Muestras de mucosa bucal:  Las muestras epiteliales de la mucosa bucal serán obtenidas por
fricción del interior de las mejillas de cada individuo con un hisopo estéril, sin tocar los dientes
ni la lengua, previo enjuague de la boca con agua potable.

      Muestras de orina: Serán recolectadas en tubos de capacidad de 25 ml.

Técnicas de recolección de datos

Se aplicará una encuesta con los siguientes datos: edad, tiempo de residencia, residencia de los
padres y abuelos, paridad, hábitos alimenticios, consumo de agua, antecedentes de fumador,
consumo de alcohol y coca. También se examinará la existencia de hiperqueratosis en la palma de la
mano y planta de los pies así como las modificaciones de la pigmentación de la piel en los brazos.

Procedimientos para el análisis de las muestras

Factores hereditarios influyentes en el metabolismo del arsénico y su toxicidad

Evaluación de los metabolitos del arsénico
Se determinarán las concentraciones de As+3, As+5, MMA, y DMA en la orina usando cromatografía
de alta resolución (HPLC) con espectrofluorofotómetro de absorción atómica con generación de
hidruros (HG-AFS). El nivel total de los metabolitos del arsénico en la orina (biomarcador de la

9 (15)
exposición) se determinaran usando espectrofotometría de absorción atómica con generador de
hidruros. Las cantidades relativas de todos los metabolitos del arsénico en la orina (% del total de
los metabolitos) y el índice de la conversión primaria y secundaria de la metilación (MMA/arsénico
inorgánico y DMA/MMA) serán calculados. La presencia de proteínas, glucosa y nitrito en la orina
y el pH será medida a través de tiras reactivas de orina (Combur N, Roche, Alemania o equivalente).
La orina será congelada y transportada a Suecia para ser analizada. Las concentraciones de arsénico
total en la orina y agua de consumo también serán determinadas.
Evaluación genotóxica
Biomarcadores de efecto:
 Prueba del cometa.

Evalúa quiebras de simple y doble hebra del ADN, sitios álcali­lábiles y entrecruzamientos 

entre ADN/ADN o ADN/proteína asociados con sitios de reparación por escisión incompleta

en células individuales. Esta prueba mide la migración de los fragmentos de DNA (DNA  

cola), fuera del núcleo, dejando el DNA intacto (DNA cabeza). Las imágenes son medidas 

para determinar la magnitud del daño en el DNA (Tirado N. y col, 2009).

 Prueba   del   micronúcleos   en   linfocitos   de   sangre   periférica   (Fairbairn,   1995,   Tice,

1998).
Biomarcadores de susceptibilidad:

 Análisis de los genotipos GST: Extracción de DNA con el Kit  Qiagen’s DNA mini

extraction kit.
Polimorfismos GSTM1 y GSTT1. PCR multiplex (Adbel­Rahman et al, 1996).

Evaluación del genotipo

Para la evaluación del genotipo, la ADN será extraída de la sangre (2,5 ml) coleccionada utilizando
un kit de extracción de ADN (Qiagen’s DNA mini extraction kit). Los análisis genéticos serán
realizados con diferentes tipos de métodos enzimáticos PCR (reacción en cadena con polimerasa).
El estado de metilación de la ADN se medirá con un Promoter Methylation arrays (Panomics).
También se analizará la RNA para la expresión del gen (2,5 ml de sangre).

Evaluación de 8-OHdG

10 (15)
Niveles de 8-OHdG serán analizados en la orina. La evaluación del marcador 8-OHdG para
determinar la oxidación del ADN se realizará usando cromatografía de alta resolución (LC-
MS/MS). La creatinina de la orina tambien será evaluada.

CONSIDERACIONES ÉTICAS

Toda investigación clínica y sus riesgos tienen que ser explicados a los voluntarios, los cuales
deberán dar su aprobación de participación por escrito. Todo tipo de comunicación relacionada con
los voluntarios en éste estudio será identificada solamente con las iniciales del voluntario y el
número obtenido en el estudio.
Cabe señalar que las muestras de DNA y RNA obtenidas para este estudio serán utilizadas
únicamente para las pruebas mencionadas en procedimientos de análisis de muestras.
El envío de las muestras tanto de orina como de DNA y RNA serán enviadas al laboratorio de
Toxicología Ambiental de Lund-Suecia en coordinación con el INLASA.

11 (15)
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

ACTIVIDAD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Reuniones   de
planificación,   y
reuniones   de
coordinación   con
los   municipios   y
poblaciones   de
estudio

Adquisición   de
reactivos   y
material fungible

Toma de muestras,
Procesamiento   y
Análisis   de   las
muestras de sangre
y mucosa bucal
Evaluación,
análisis estadístico
de los resultados y
Elaboración   del
informe final
Presentación   de
los resultados

12 (15)
Científicos implicados en la investigación
Noemi S. Tirado Bustillos MSc.
Unidad de Genética Toxicológica- Instituto de Genética
Facultad de Medicina- Universidad Mayor de San Andrés
Av. Saavedra N° 2246, La Paz-Bolivia
Telefono: 2229613; noemitirado@yahoo.com

Jacques Gardon
MD, PhD epidemiologia
Institut de Recherche pour le Développement
Représentant de l’IRD en Bolivie
Av Hernando Siles, esq Calle 7 La Paz, Bolivia
278 29 69 - 75 21 59 89 jacques.gardon@ird.fr

Karin Broberg, PhD, Bióloga Molecular

Dep. of Occupational and Environmental Medicine
Lund University Hospital
SE-221 85 Lund, Sweden
Teléfono: +46-46173819; Karin.Broberg@med.lu.se
Fax: +46-46143702

13 (15)
Referencias Bibliográficas
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