DESNATURALIZACION DEL ADN DE ESPERMATOZOIDES

REACTIVOS

 Ácido cítrico 0.1 M (C6H8O7∙H2O) PM: 210.14 pH: 1.5

Solución 0.1 M = 19.212 g/L
Para 100 ml = 2.101 g

 Fosfato de sodio heptahidratado 0.3 M (Na2HPO4∙7H2O) PM:268.08

Solución 0.3 M = 268.08 x 0.3 M= 80.424 g/L
Para 50 ml = 4.02 g

 Solución stock naranja de acridina

1 g de N.A. en 1000 c.c. de agua destilada

VOLÚMENES DE CADA REACTIVO Y VOLUMEN FINAL REQUERIDO (ML)

1. Solución de naranja de acridina 0.5 1 2 4 5 7.5
2. Ácido cítrico 2 4 8 16 20 30
3. Fosfato sódico 0.125 0.25 0.50 1.0 1.25 3.75
2.625 5.25 10.5 21 26.25 41.25

PROCEDIMIENTO
1. Tomar 1 ml de semen y lavarlo con 5 ml de PureFresh Nidacon o PBS Dulbecco
centrifugando a 1500g por 5 minutos.
2. Resuspender el pellet y ajustar el conteo final a 10 millones de espermatozoides por
ml.
3. Hacer el extendido y dejar secar por 20 minutos.
4. Fijas las láminas en la solución de Carnoy – 3 partes de metanol; 1 parte de ácido
acético glacial preferiblemente overnight (o mínimo 2 horas)
5. Sacar las laminillas y dejar secar a T.A.
6. Colorear las laminillas con 2-3 ml de colorante por 5 minutos a 56 °C.
7. Lavar con agua desionizada e inmediatamente poner una laminilla de 20x40 sobre
la laminilla.
8. Leer al microscopio óptico de fluorescencia a 100x usando filtro de excitación de
490 nm y filtro de barrera de 530 nm
9. …… 40 segundos por campo.
Interpretación
Cabezas con fluorescencia verde indican doble cadena de ADN intacta.
Cabezas con fluorescencia amarillenta o roja indican ruptura de las cadenas de ADN,
quedando cadenas simples en las nucleoproteínas que conllevan a la fragmentación e
inmadurez del núcleo espermático.
Valor de referencia: ≥ 75% de espermatozoides con ADN intacto.
BIBLIOGRAFÍA
Evenson, D. P., Jost, L. K., Baer, R. K., Turner, T. W., & Schrader, S. M. (1991). Individuality
of DNA denaturation patterns in human sperm as measured by the sperm chromatin
structure assay. Reproductive toxicology, 5(2), 115-125.
Royere, D., Hamamah, S., Nicolle, J. C., Barthelemy, C., & Lansac, J. (1988). Freezing and
thawing alter chromatin stability of ejaculated human spermatozoa: Fluorescence
acridine orange staining and Feulgen‐DNA cytophotometric studies. Molecular
Reproduction and Development, 21(1), 51-57.