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Purificação de Proteínas
Finalidades
Estrutura tridimensional
Desafio de uma purificação de proteínas:
• Eficiência razoável
• Rendimento
• Rapidez
• Pureza
• Atividade biológica
• Integridade estrutural
1º passo: Obtenção do extrato bruto
Centrifugação
diferencial
(fracionamento)
Baseiam na diferença de
velocidades que as
partículas sedimentam no
fundo do tubo.
Centrifugação isopícnica – Organelas / membranas
Agregação e
precipitação
Centrifugação
Diferentes proteínas precipitam em
diferentes faixas de [(NH4)2SO4]
A
-1
B
-2
50 60 70
[(NH4)2SO4] (% saturação)
Retirada de sal - diálise
3º passo: Fracionamento das Proteínas
Cromatografia em Coluna
•Carga
•Tamanho
•Afinidade de ligação
Cromatografia de Troca iônica
D.R. Marshak, J.T. Kadonaga, R.R. Bugess, M.W. Knuth, W.A. Brennan Jr, S.H. Lin. Strategies for
protein purification and characterization – A laboratory course manual. 1996. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, USA.
14
Grande carga líquida +
Carga líquida +
Carga líquida -
Grande carga líquida -
Matriz sólida
grupos negativos
• Efeito do pH
• Efeito da concentração salina
• Gradientes
Cromatografia por Exclusão Molecular
ou Filtração em Gel
• Atividade biológica
• Atividade enzimática
• Absorbância 280
• Pureza
Acompanhamento de um processo de purificação
• Absorbância 280
Cromatograma
Tirosina Triptofano
Atividade
9 Proteína 0,35
8
0,30
0,25
6
5 0,20
4
0,15
3
0,10
2
1 0,05
I0 I
Absorção de luz
Lei de Lambert-Beer
- A absorbância é diretamente proporcional à concentração de uma espécie absorvente c e
do caminho óptico b do meio absorvente.
- ε = L/mol cm
Espectofotômetro
(aula de hoje)
Análise de pureza - Eletroforese
Aparato experimental
Todas as proteínas
tem carga -?
SDS – revestem
proteínas com carga
negativa
• Princípio
= mobilidade eletroforética
Eletroforese em condições desnaturantes (SDS-PAGE)
1 SDS / 2 resíduos aa
• Géis
• agarose
• amido
• poliacrilamida
• Efeito de peneira molecular
• relação carga/massa
• tamanho
• forma
• pH
Vantagens do gel de poliacrilamida
• reprodutibilidade
• tamanho dos poros
• reatividade química
• pH
• T
• cor
Visualização das proteínas no gel
• PM
• No. de subunidades
• pI
Determinação do P.I. de uma proteína
Focalização isoelétrica
Focalização isoelétrica
Mistura de
proteínas
Solução de anfólitos
incorporada no gel Coloração: proteínas
distribuídas de acordo
com o seu pI
Gradiente
estável de
pH
Eletroforese Bidimensional
2
1 3
Focalização
SDS-PAGE
isoelétrica
Proteoma
Medida da concentração de proteínas