Protocolo para extração de DNA genômico de fungos

1. Adicionar cerca de 50-100 mg de biomassa ao microtubo de 1,5 mL;

2. Adicionar três (03) pérolas de vidro com diâmetro de 3 mm (0,3 cm);
3. Adicionar 500 uL de tampão de extração;
4. Vortexar à 3.000 rpm por 1 minuto;
5. Aquecer à 80 ºC por 20 minutos;
6. Resfriar à -20ºC por 20 minutos;
7. Descongelar e vortexar (spin);
8. Centrifugar à 4.000 rpm por 10 minutos, 4ºC;
9. Recuperar o sobrenadante (podem ser aspirados debris em suspensão ainda) e
transferi-lo para novo microtubo de 1,5 mL;
10. Adicionar 1 volume de clorofórmio-álcool isoamílico (24:1);
11. Vortexar a 3.000 rpm por 10s;
12. Centrifugar à 10.000 rpm por 10 minutos, 4ºC;
13. Recuperar a fase aquosa (fase superior apenas, sem aspirar a interfase) e transferir
para novo microtubo de 1,5 mL;
14. Adicionar 0,7 volume de isopropanol puro gelado;
15. Misturar por inversão de 6-10 vezes*
*se após misturado formar debris/grumos, centrifugar à 4.000 rpm, 5 minutos,
4 ºC;
* recuperar o sobrenadante e transferir para novo tubo de 1,5 mL.
16. Centrifugar à 10.000 rpm, 30 minutos, 4ºC;
17. Desprezar o sobrenadante por única inversão e adicionar 1.000 uL de etanol 70% para
lavar o sedimento;
18. Centrifugar à 10.000 rpm, 10 minutos, 4ºC;
19. Desprezar o sobrenadante por única inversão (absorver excesso de etanol com papel
toalha sobre bancada encostando a boca do tubo ainda invertido) e secar o sedimento
à temperatura ambiente ou estufa à 37 ºC (tubo deitado);

* Verificar se o sedimento está seco a cada 10 minutos. Não secar completamente

pode prejudicar a qualidade do DNA;

* Secagem prolongada (> 1h) pode dificultar a dissolução do DNA.

20. Ressuspender o sedimento em 40uL de água ultra pura autoclavada (ou tampão TE);
21. Aquecer à 65 ºC, 15 minutos (dissolução do DNA)
22. Vortexar e estocar a -20 ºC.
* preferível quantificar o DNA por absorbância/fluorescência antes da estocagem.

Soluções

1. Tampão de extração (100 mL, pH 8,0)

* 250 mM Tris-HCl;
 * 25 mM EDTA
* 0,5% (p/v) SDS (dodecilsulfato de sódio) – pesar com máscara, pó muito tóxico!
* 250 mM NaCl
* Completar o volume com água ultrapura

2. Tampão Tris-EDTA (TE - 500 mL, pH 8,0)

* 10mM Tris  m = 0,6057g
* 1mM EDTA  m = 0,18612g
* 450 mL de água ultrapura
* ajustar o pH para 8,0
* Completar o volume com água ultrapura
* autoclavar

3. Clorofórmio-álcool isoamílico (24:1)

Em Tubo Falcon de 50 mL
* 48 mL de clorofórmio P.A.
* 2 mL de álcool isoamílico P.A.

4. Isopropanol 100% (gelado)

Em Tubo Falcon de 50 mL

5. Etanol 70% (v/v)

Em Tubo Falcon de 50 mL
* 37 mL etanol 96%
* 13 mL água ultrapura