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2 Alteraciones cromosómicas

Técnicas de diagnóstico molecular para la


detección de anomalías cromosómicas

Diagnóstico Molecular y Genético 2 Alteraciones cromosómicas


Citogenética molecular
Hibridación fluorescente in situ (FISH)
– FISH en metafase
– FISH en interfase

Cariotipo espectral (SKY)

Hibridación genómica comparada (CGH)

Otras técnicas:
– FISH en hebra (Fiber FISH)
– Mapeo óptico
– Microdisección de cromosomas
Diagnóstico Molecular y Genético 2 Alteraciones cromosómicas
Conceptos básicos

Compactación y estructura de la cromatina

Mutaciones y polimorfismos
– genómicas,
– cromosómicas y
– génicas

Cariotipos convencionales

Mapeo de cromosomas: nomenclatura

Diagnóstico Molecular y Genético 2 Alteraciones cromosómicas


Técnicas de diagnóstico molecular para la
detección de anomalías cromosómicas
Aplicaciones Tipo de muestra
! Evaluar a una pareja con
antecedentes de abortos o infertilidad

! Evaluar una apariencia anormal del Sangre (o células mucosa


cuerpo que sugiere una anomalía bucal)
genética

! Análisis en casos de leucemia y


Células de la médula ósea
linfomas (el cromosoma Filadelfia está
presente en el 85% de los casos de LMC)

! Diagnóstico prenatal para evaluar Células fetales en líquido


anomalías cromosómicas en un feto amniótico o vellosidades
en desarrollo coriónicas
! Diagnóstico genético preimplantatorio Células embrionarias
en técnicas de reproducción asistida
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Biopsia médula ósea

Toma de muestra

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Diagnóstico prenatal

Toma de muestras

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Diagnóstico preimplantatorio

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Genoma humano
Complemento haploide:
2,9 Gbases

250
Millones de pares de bases

200

150

100

50

0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 X Y
Cromosoma

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Organización
del ADN

Niveles de enrollamiento:

Doble hélice 2 nm

Nucleosomas 11 nm

Solenoides 30 nm

Bucles de cromatina 300 nm

Cromátide 700 nm

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El ADN de una célula “mide” 2 metros

Microfotografía de un cromosoma sin histonas

Lazo de ADN Esqueleto proteico

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Organización del ADN

Heterocromatina
– ADN compacto poco accesible a la transcripción

Eucromatina
– ADN más laxo que permite la transcripción

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Alteraciones en el ADN

Un cambio heredable en la secuencia de ADN es una


mutación o un polimorfismo.

Mutación: cambio presente en una pequeña proporción de


la población (variante) o del organismo.

Polimorfismo: cambio presente en al menos un 1% de la


población.

No tienen por qué producir efectos en el fenotipo.

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Mutaciones

Génicas
– Afectan a un único gen y frecuentemente son cambios
pequeños en el ADN

Cromosómicas
– Afectan a la estructura de uno o varios cromosomas

Genómicas
– Cambios en el número de cromosomas
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Anomalías cromosómicas

Estructurales: pérdida, ganancia o inversión de parte


del material genético

Numéricas: afectan al número de cromosomas.

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Alteraciones cromosómicas
estructurales
Deleción

Duplicación

Inversión

Translocación

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Alteraciones cromosómicas
estructurales

Fragmento sin
identificar

CROMOSOMA MARCADOR

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Ejemplo de translocación

Esquema de la translocación
(9;22) que da origen al
cromosoma Filadelfia en la
leucemia mieloide crónica

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Anomalías cromosómicas

Estructurales: pérdida, ganancia o inversión de parte


del material genético

Numéricas: afectan al número de cromosomas.

" Aneuploidías: trisomías (2n+1); monosomías (2n-1)


" Poliploidías: triploidía (3n); tetraploidía (4n)

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Anomalías cromosómicas
" Aneuploidías: trisomías (2n+1); monosomías (2n-1)

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Aneuploidías
Frequencia de trisomías
en abortos espontáneos

Down

Patau Edwards

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Aneuploidías
Riesgo de trisomía 21
con la edad materna

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Aneuploidías
Síndrome de Turner:
única monosomía viable

45,X
Falta de desarrollo de
características sexuales
secundarias.
Cuello ancho (doble tejido
conectivo a los lados del cuello)
Pecho ancho “Anormalidades
renales y cardiovasculares.
No afecta el IQ pero existe cierto
grado de inmadurez y
comportamiento infantil.

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Poliploidías
" Poliploidías: triploidía (3n); tetraploidía
(4n)

Letal

Individuo triploide

Cariotipo 69,XXX

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Visualización
Tinciones convencionales tiñen específicamente el ADN
– T. de Feulgen
– T. de Wright
– Hematoxilina
– DAPI (fluorescente)

Existen tinciones que específicamente marcan distintas regiones de los


cromosomas
– bandeo Q
– bandeo G
– bandeo R
– bandeo C
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Requisitos para el estudio del cariotipo
Importante: máximas condiciones de esterilidad

! Las células deben estar en


división
! Deben pararse en metafase
! Deben someterse a choque
osmótico para conseguir
buena separación de los
cromosomas
! Hay que fijarlas
! Deben teñirse los
cromosomas para que sean
identificables
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Método de estudio del cariotipo
1) Toma de sangre periférica y separación de los glóbulos blancos
(linfocitos T)
2) Incubación en presencia de productos que inducen a la mitosis
(mitógenos) tales como la fitohemoaglutinina
3) Detención de la mitosis en la metafase (utilizando colchicina, que
interfiere en la polimerización de los microtúbulos del huso mitótico)
4) Paso por un medio hipotónico que hace que las células se hinchen
5) Depositar una gota de la preparación entre porta y cubre (sobre el cual
se hace presión para dispersar los cromosomas)
6) Fijar, teñir y fotografiar los núcleos estallados (10-15; 30 en mosaicos)
7) Antes había que ampliar la fotografía y recortar y ordenar los
cromosomas. Hoy en día existen aparatos de captación y programas de
análisis que elaboran el cariotipo automáticamente.

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Cariotipo

Representación ordenada de los cromosomas de un


individuo atendiendo a su número, forma y tamaño
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Métodos de tinción
Bandeo Método Características
Q Tinción con quinacrina Bandas fluorescentes brillantes

G Tinción con Giemsa, tras pre- Las bandas G oscuras


tratamiento del cromosoma corresponden a las Q brillantes
con tripsina
R Naranja de acridina, Giemsa Patrón inverso al Q y G, útil
modificado para definir los extremos de
los cromosomas
T Varias técnicas Resaltan las regiones
teloméricas
C Extracción de DNA/proteínas, Resaltan las regiones
tinción con Giemsa centroméricas

NOR Tinción con nitrato de plata Tiñe las regiones organizadoras


del nucléolo
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Ejemplos de bandeo

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Bandeo G
Más habitual

Se tratan previamente con


tripsina antes del Giemsa

400 bandas por genoma,


cada banda de 5 a 10 Mb

Heterocromatina en las
bandas oscuras.

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Cariotipo de alta resolución
Tinción de los cromosomas en profase o en metafase
temprana (más largos y finos).

Permite distinguir el doble de bandas (800).

Se añade metotrexato además de colchicina antes de la


tinción con Giemsa.

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Tipos de cromosomas

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Tipos de cromosomas
Ejemplos

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Ideograma

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Nomenclatura
ISCN: International System for Human
Cytogenetic Nomenclature
http://www.iscn1995.org/
P brazo corto (petite) + ganancia

q brazo largo - pérdida

del deleción I,iso isocromosoma

inv inversión r cromosoma en anillo

dup duplicación t translocación

ins inserción tel telómero

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Fórmulas cromosómicas
46,XX

46,XY

47,XXY Corrector de sintaxis:


47,XX,+21 http://www.mcndb.org/iscn/index.jsp
46,XY,19p+

46,XX,del(7)(q13)

46,XY,t(5;17)(p13.3;p13)

46,X,i(X)

48,XX,+15,+16 [8]/46,XX [27]

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Fluorescent In Situ
Hybridization: FISH
Hibridación in situ fluorescente

Es la detección de sondas fluorescentes


altamente específicas que se han
hibridado a cromosomas en interfase o
metafase.

Las sondas de ADN pueden marcarse


con moléculas fluorescentes (método
directo) o no fluorescentes que se
detectan con anticuerpos fluorescentes
(método indirecto).

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FISH

Primero, las sondas hibridan a regiones específicas.

Después se tiñen los núcleos con un color de


contraste inespecífico (generalmente DAPI).

Finalmente se visualiza en el microscopio.

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Protocolo básico

Los portaobjetos con los núcleos fijados:

1 Desnaturalización del ADN (70% en formamida).

2 Se añade la sonda, se cubre y se sella. Se incuba de 2 a


12 horas a 37º.

3 Se quita el cubre y se lava con detergente y sales.

4 Se añade colorante para el fondo.

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FISH en metafase

Tipos de sonda:

– Cósmidos

– Satélites alfa

– Sondas completas
(painting probes)

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Sondas específicas

Cósmidos:
– Secuencias únicas que
hibridan en segmentos
pequeños

– Se usan en estudios de
microdeleciones

Sonda de 1,4 kb cromosoma 11

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Sondas específicas

Sonda específica
para el síndrome
Williams-Beuren
(Elastina: 7q11.23)
y control

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Sondas específicas

Sonda específica
(22q11.2) para el
síndrome diGeorge:
microdeleción
cromosoma 22
Control (22q13)

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Sondas específicas

Sondas con
secuencia
centromérica y
telomérica del
cromosoma 12

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Sondas específicas

Sonda con
secuencia
telomérica del
cromosoma 4q

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Sondas específicas

FISH de banda
multicolor

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Sondas satélite

Satélites alfa:
– Sonda formada por secuencias altamente repetidas que se
encuentran cerca de los centrómeros.

– En la mayoría de los casos son específicos para cada cromosoma

– Se usan para determinar aneuploidías o para identificar el origen


de cromosomas marcadores.

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Sondas satélite

Sondas para
cromosomas 14 y 22:
se detecta un
cromosoma marcador
dicéntrico

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Sondas satélite

Sonda para secuencia Alu

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Sondas completas
Sonda para el cromosoma 1

Sonda para el cromosoma 19.


Marca el extremo de otro
cromosoma identificando el
material de un cromosoma
marcador.

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Sondas completas

Caso de una translocación


desequilibrada, una porción del
brazo 4 reemplaza el extremo
del cromosoma 1

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Sondas completas

sonda sonda
cromosoma 1 cromosoma 4
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FISH en interfase

No siempre es posible tener núcleos fijados en metafase para poder


realizar el FISH.

Normalmente cuando se fija una célula sin tratar el núcleo se encuentra


en interfase, con los cromosomas descondensados.

De todas maneras es posible realizar el FISH aunque los resultados no


sean tan específicos. Se utiliza sobretodo para detectar aneuploidías o
grandes deleciones, duplicaciones o translocaciones en células fetales
o tumorales

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FISH en interfase

18
18

DXZ1 DYZ3 D18Z1

Metafase Interfase

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FISH en interfase:
aneuploidías

2ª ronda:
Aneuploidías en células embrionarias
– sonda 18
1ª ronda – sonda X
– sonda 13 – sonda Y
– sonda 21
Feto varón normal*
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FISH en interfase:
aneuploidías

Aneuploidías en células embrionarias 2ª ronda:


– sonda 18
1ª ronda – sonda X

– sonda 13 – sonda Y

– sonda 21 Feto femenino con trisomía 21

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FISH en interfase:
traslocaciones recíprocas
46,XY 46,XX,t(12;17)(p13;p13)
sondas subteloméricas y centroméricas

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FISH en interfase:
traslocaciones recíprocas
Primero se prueban las sondas en linfocitos de ambos
progenitores para comprobar su correcta hibridación

tel 12
tel 17
ctr 17

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FISH en interfase:
traslocaciones recíprocas

tel 12
tel 17
ctr 17

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FISH en interfase:
traslocaciones recíproca

tel 12
tel 17
ctr 17

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FISH en interfase:
traslocaciones recíprocas

tel 12
tel 17
ctr 17

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FISH en linfocitos:

186 93%

7 3,5%

5 2,5%

1 0,5%

1 1,5%

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FISH en interfase:
traslocaciones robertsonianas
male female

miscarriage

chromosome 13

chromosome 21

Robertsonian translocation
der(13;21)(q10;q10)

Carrier Normal

Down syndrome Carrier Down syndrome Normal

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FISH multicolor: SKY

SKY (Spectral Karyotyping) es una técnica que permite


visualizar los 23 pares cromosomas a la vez teñidos con
diferentes sondas fluorescentes.

Se utiliza sobre todo en el estudio de células tumorales. Las


sondas para cada cromosoma es de un color (o
combinación; solo hay 5 colores) distinto.

Se utilizan programas informáticos para analizar las


imágenes y formar el cariotipo.
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FISH multicolor: SKY

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FISH multicolor: SKY

Multicolor Spectral Karyotyping of Human Chromosomes


Schröck et al. SCIENCE 1996; 273 (5274):494
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FISH multicolor: SKY

Multicolor Spectral Karyotyping of Human Chromosomes


Schröck et al. SCIENCE 1996; 273 (5274):494
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FISH multicolor: SKY

Traslocación entre el 1 y el 11

Traslocación entre el 4 y el 12
Trisomía parcial del extremo 4q
(derivativo)

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FISH multicolor: SKY

Traslocación entre el 2 y el 22

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FISH multicolor: SKY

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FISH en hebra

Fiber FISH o Halo FISH

Es un FISH en el que se extiende linealmente en un porta el


fragmento de cromosoma que nos interesa estudiar.

Permite distinguir pequeñas reorganizaciones sin tener que


clonar y secuenciar (habitualmente hasta 20 pb).

Se forman rosarios debido a las roturas de las hebras de


cromatina y el enrollamiento de los extremos.

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FISH en hebra

Al extenderse se consigue un 130% de su tamaño teórico


34 µm / 1 kb

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FISH en hebra

Se usa bastante para detectar deleciones en


clones o para estimar huecos en los proyectos
genoma
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Microdisección de
cromosomas y FISH inverso
Se puede recortar un fragmento de cromosoma por
micromanipulación (láser y micropipetas) teñido con
Giemsa o con una sonda.

Esto sirve para marcar ese ADN y convertirlo en una nueva


sonda.

Se utiliza para detectar el origen de un ADN marcador o


fabricar sondas inespecíficas que hibriden con
determinada región.
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Microdisección de
cromosomas y FISH inverso

1 aislamiento del cromosoma marcador y marcaje


2 hibridación con linfocito de donante sano: es un
fragmento del cromosoma 16 (16)(p13.1!q12.2)
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Microdisección de
cromosomas y FISH inverso

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Búsquedas bibliográficas: Pubmed/ISI Web of knowledge

Artículos / revisiones

Índice de impacto

Obtener artículos de la biblioteca

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CGH

Comparative genomic hybridization

Detecta pérdida o duplicación de regiones genómicas.

Es un FISH de dos colores.

Se utiliza sobretodo para determinar las reorganizaciones


cromosómicas de las células tumorales y predecir la
severidad del cáncer. No requiere cultivo de las células.

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CGH
1 El ADN-M del tejido a estudiar se marca con un
fluorescente (usualmente verde; Cy3 550 nm).

2 ADN-C de un tejido con un cariotipo normal se marca con


otro fluorescente (rojo; Cy5 660 nm).

El marcaje se realiza por desplazamiento de mella (nick-


translation )

3 Una misma cantidad de ADN de cada muestra se hibrida


con metafases de células normales (linfocitos).
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CGH
1 Si no existe reorganización de la zona la
relación entre ambas sondas será 1:1

2 Si el ADN-M presenta una duplicación habrá


proporcionalmente más sonda marcada y el
cromosoma fijado teñirá de verde.

3 Si el ADN-M presenta una deleción habrá


proporcionalmente menos sonda y el
cromosoma fijado teñirá de rojo

Requiere de software específico y experiencia


del operador.

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CGH

DAPI

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CGH

Cy3

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CGH

Cy5

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CGH

Superposición

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CGH

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CGH

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CGH

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CGH: una metafase

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CGH: 8 metafases

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CGH: 8 metafases

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CGH: limitaciones

Detecta bien deleciones y duplicaciones.

Es ineficaz para detectar traslocaciones o inversiones.

Depende de la población de células originales, si hay


mosaicismo la detección se verá contaminada por
contaminación (>50%).

La sensibilidad es de alrededor de las 2-20 Mb

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Array CGH

La resolución es mucho mayor hasta 150 kb o incluso genes.

Celdillas de fragmentos genómicos conocidos (BAC, cDNA,


oligonucleótidos) inmobilizados sobre una superficie
sustituyen la metafase del CGH. Aumenta por tanto el
número de copias diana.

Puede distinguir con precisión los puntos de corte de las


alteraciones cromosómicas.

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Array CGH

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Array CGH

Se suele añadir ADN Cot-1

Es ADN de origen placentario de 50


a 300 pb enriquecido en
secuencias repetitivas (Alu o
Kpn).

Se usa para bloquear hibridación


no específica en los microarrays.

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Array CGH

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Array CGH

Se analizan 120 x 60 = 7200 fragmentos

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Array CGH

Los microarrays se
preparan a partir
de clones
genómicos:
BACs o YACs

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Array CGH

El tipo de clon nos


va a limitar la
sensibilidad y el
tipo de
resultados

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Array CGH

Se suele representar la señal en forma de perfil lineal.


Control normal 46XX

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Array CGH

El marcaje de XX sobre XY permite distinguir el doble


cromosoma X

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Array CGH

Deleción en 7q11.23 heterocigoto


Flecha indica fluorescencia reducida en 3 BACs
Zona gris indica el centrómero
FISH de confirmación:
sonda verde BAC gen LIMK1,
sonda roja BAC 7q11.21
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Aplicaciones clínicas FISH
Preparación del tejido diana FISH SKY CGH CGHa

Metafase + + + +

Interfase + - + +

Cultivo previo -/+ + - -

Anomalías cromosómicas

Aneuploidías + + + +

Traslocaciones eq, inversiones + +/- - -

Microdeleciones/duplicaciones + - - +

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Cáncer

Suele haber alteraciones cromosómicas en las células


somáticas. Algunas son heredables entre generaciones y
pueden causar predisposición al cáncer.

Las alteraciones cromosómicasa son marcadores diagnósticos


y de valor pronóstico.

La evaluación citogenética molecular de los cánceres es de


gran importancia.

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Cáncer

el cáncer surge tras una acumulación de mutaciones que


confieren a la célula una ventaja selectiva puntual

Muchos tumores exhiben altos niveles de inestabilidad


genómica.

¿Son estas mutaciones cromosómicas causas o efectos del


cáncer?

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Cáncer

Existen determinadas traslocaciones asociados a cánceres


específicos
– Sobreexpresión o desregulación de un protooncogen porque se une
a un fuerte promotor o enhancer.

– Generación de una gen quimera que codifica una proteína de


fusión desregulada

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Cáncer
Sobreexpresión de BCL2 debido al enchancer IG en un
linfoma folicular

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Cáncer

Linfoma de Burkitt

- non Hodgkins

- Cancer agresivo de células B

- también aparece en el
mieloma múltiple

Traslocación IG-MYC

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Cáncer

Un FISH con dos sondas específicas es suficiente


para distinguir la traslocación IG-MYC

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Cáncer

Esquema de la translocación
(9;22) que da origen al
cromosoma Filadelfia en la
leucemia mieloide crónica

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Cáncer

Normal 2+2

Proteína de fusión BCR-ABL

Fusíon 1+1+2

2+2+1

1+1+1

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Cáncer
Proliferación
Apoptosis
Estabilidad genómica
Angiogénesis
Invasión
Metastasis

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Cáncer

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Cáncer

Origen de los cromosomas marcadores de una línea tumoral


de cáncer de mama.
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Cáncer

Dos zonas de Traslocación 17;22


amplificación

Perdida del der(17)

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Cáncer

Amplificación. Células de un cáncer de mama.


– sonda verde cromosoma 17 (centrómero)
– sonda roja gen HER2/ERBB2 (17q11.2-q12)
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Cáncer

Amplificación.
– De 100 a 1000 kb pocas veces incluyen un único gen

– Sobreexpresión y se asocia con mala prognosis o estadío final

– Dos formas:

• Partículas pequeñas (double minutes DMs)

• Regiones de tinción homogénea (homogeneously staining


regions HSR

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Cáncer

Amplificación. Glioblastoma (DMs)


– sonda verde cromosoma 17
– sonda roja gen EGFR (17q25)
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Cáncer

Amplificación. Leucemia linfoide/mieloide (HSRs)


– sonda amarilla gen MLL (11q23)
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Cáncer

Amplificación. Leucemia linfoide/mieloide (HSRs)


– sonda amarilla gen MLL (11q23)
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IL6R,MCL1, SKI REL MYC
Cáncer

ABL,TAN1 CDK2,GLI,SAS,CDK4,MDM2

IL4R BCL2 SIS,YES2

Las reorganizaciones suelen implicar a genes relacionados con el cáncer.


Linfoma de células B alargadas/difusas
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Cáncer

En los estadíos avanzados y de mal pronóstico se acumulan las anomalías


cromosómicas.
GGH de linfoma de Hodgkin
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Cáncer

Combinación
restricción
PCR y
array de CGH
para detectar
patrones de
metilación en células
de cáncer de pulmón

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Cáncer

El gen
MINT26 está
metilado en
las células de
este tumor

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FISH bases de datos
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sky/

Base de datos de resultados de SKY y CGH

Diagnóstico Molecular y Genético 2 Alteraciones cromosómicas


FISH bases de datos

Diagnóstico Molecular y Genético 2 Alteraciones cromosómicas