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La técnica de ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) es utilizada para la


detección de muy diversas moléculas biológicas, basándose en la especificidad del
reconocimiento antígeno-anticuerpo y en la sensibilidad de las pruebas enzimáticas

La técnica de ELISA es un ensayo inmunoenzimático ampliamente empleado en el área
médica para la cuantificación de moléculas especialmente de aquellas que experimentan
cambios en diferentes estados como pueden ser infecciones por bacterias, virus, hongos o
parásitos o fases activas de enfermedades autoinmunes. Como ejemplo se pueden medir
por ELISA hormonas, autoanticuerpos, inmunoglobulinas contra antígenos de patógenos,
toxinas, antígenos. Las técnicas de ELISA son también muy usadas en los ensayos de
nuevos medicamentos para comprobar sus efectos cuantificando las moléculas de interés
en cada caso. Existen numerosas variantes de este tipo de ensayo. Entre ellos se encuentran
los métodos directo e indirecto.
El método directo permite la detección del antígeno con un anticuerpo específico
conjugado con una enzima como sistema de marcaje.
En el método indirecto el antígeno reacciona con el anticuerpo específico. El complejo
antígeno-anticuerpo es entonces detectado por un segundo anticuerpo que reconoce
dominios constantes de anticuerpos. Este anticuerpo, que suele ser específico de especie, es
el que está marcado enzimáticamente. Esto permite que un mismo anticuerpo marcado sea
capaz de detectar diferentes antígenos.

En ambos métodos, la reacción enzimática puede ser detectada espectrofotográficamente


con un lector ELISA. (Ver video de descarga en flash).
Anticuerpos Monoclonales

Resumen

La producción de anticuerpos que responden específicamente a un antígeno ha


facilitado la detección precisa de moléculas de interés clínico.

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Los anticuerpos monoclonales son una herramienta de gran utilidad en el campo de la
medicina, la bioquímica y la biología molecular por su capacidad de reconocer
moléculas con diferente estructura química.
Son empleados habitualmente tanto en el diagnóstico como en el tratamiento de
enfermedades.
La inmunización de un animal con un determinado antígeno, que puede ser cualquier
molécula que sea capaz de estimular al sistema inmune, provoca la proliferación de
aquellos linfocitos que han reconocido la presencia del antígeno y la producción como
respuesta de una amplia variedad de anticuerpos de diferente especificidad y afinidad.
Como diferentes linfocitos producen anticuerpos estructuralmente diferentes que
reconocen distintas partes del antígeno, lo que se obtiene como resultado de la respuesta
inmune es una mezcla fisiológica natural de anticuerpos conocida como antisuero
policlonal.
Es necesaria una técnica efectiva para generar y mantener anticuerpos iguales en
estructura que se unan de forma idéntica al antígeno. En la producción de anticuerpos
monoclonales, los linfocitos (células productoras de anticuerpos) son fusionados a
células tumorales adquiriendo así la capacidad de multiplicarse rápida e
indefinidamente. Las células resultado de esta fusión son conocidas como hibridomas.
El conjunto de hibridomas obtenido, una vez eliminados los linfocitos y las células
tumorales no fusionadas entre sí, se diluye convenientemente, de modo que las alicuotas
que se cultiven en los pocillos de una placa de Elisa no contengan más de una célula
(hibridoma). La proliferación de cada hibridoma genera un clon de células que produce
un mismo tipo de anticuerpo. Si el test de unión al antígeno de interés es positivo, el
hibridoma es cultivado para su uso clínico.
4CR
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La técnica de la 4CR (4olymerase Chain Reaction= Reacción en Cadena de la
4olimerasa) permite la amplificación de un fragmento de ADN de interés. El uso de
esta técnica es muy amplio en el campo de la medicina.
La molécula de ADN es una estructura constituida por dos cadenas que codifican la
información genética de un organismo. Cada cadena es una secuencia de nucleótidos.
La lectura de esta secuencia de nucleótidos proporciona la información genética propia
del organismo. Con la técnica de la 4CR (4olymerase Chain Reaction= reacción en
cadena de la polimerasa) es posible obtener millones de copias de un fragmento del
ADN (por ejemplo, de un gen de interés).
La proteína que lleva a cabo el proceso de copia de las cadenas del ADN es la ADN
polimerasa.
En el primer ciclo de la 4CR se consigue duplicar el fragmento de interés porque cada
cadena del ADN sirve de molde para la síntesis de otra cadena. Como en cada ciclo
aumenta el número de cadenas que sirven de molde para la ADN polimerasa, en tan sólo
25 ciclos de copia la técnica de la 4CR permite obtener millones de copias de un
fragmento que se encontrara presente como copia única al comenzar el proceso.
La 4CR es una técnica válida para diferentes aplicaciones médicas que requieran una
concentración alta de un fragmento concreto del ADN: para identificar anomalías en la
secuencia de nucleótidos que apunten a posibles patologías, para identificar a un
individuo o averiguar su parentesco con otros ya que el patrón de nucleótidos del ADN
es característico de cada individuo o para detectar la presencia de ADN de
microorganismos útil en el diagnóstico de infecciones o para probar la eficacia de un
tratamiento.

Definición de ADN 4 LIMERASA:


La ADN polimerasa es la principal enzima de la replicación. 4artiendo de una cadena
inicial o ³primer´ la ADN polimerasa añade nucleótidos complementarios a la cadena
molde extendiendo la nueva cadena de ADN en dirección 5¶- 3¶.

La ADN polimerasa es la enzima principal en el proceso de replicación. 4artiendo de


una cadena inicial o ³primer´ la ADN polimerasa es capaz de añadir nucleótidos
complementarios a la cadena molde estableciendo enlaces fosfodiéster. La ADN
polimerasa sólo puede catalizar el crecimiento de la cadena inicial en dirección 5'-3'. La
ADN polimerasa también se encarga de la reparación del ADN asociada a la
replicación.

Hay 5 ADN polimerasas diferentes bien caracterizadas, diferenciándose en su


localización, actividad y sensibilidad a los inhibidores: alfa, beta, gamma, delta y
épsilon:
‡ Las ADN polimerasas delta y epsilon dirigen la replicación de la cadena conductora o
³leading strand´ que es la cadena que crece de 5' a 3' en mismo sentido que crece la
nueva copia de ADN. La ADN polimerasa epsilon parece que también está involucrada
en un tipo de reparación del ADN. Además, las ADN polimerasas gamma, delta y
epsilon tienen actividad exonucleasa 3'-5' y, por tanto, son capaces de eliminar los
nucleótidos del extremo 3' que han sido incorporados incorrectamente en un proceso
conocido como corrección de pruebas.
‡ La ADN polimerasa alfa participa en el proceso de replicación del ADN dirigiendo la
replicación de la cadena retardada o ³lagging strand´ que es la cadena que crece de 3' a
5' que es el sentido contrario al del crecimiento global de la nueva copia de ADN.
‡ La ADN polimerasa beta se encarga de los procesos de reparación del ADN.
‡ La ADN polimerasa gamma realiza la replicación del ADN mitocondrial.

Se está estudiando la relación entre mutaciones en la ADN polimerasa gamma


(mitocondrial) con enfermedades neurodegenerativas como el 4arkinson o algunos tipos
de distrofia muscular. En algunos casos estas mutaciones pueden deberse a la presencia
de regiones de poliglutamina en la secuencia codificante de la ADN polimerasa gamma.
4or otra parte, se ha encontrado que mutaciones en la ADN polimerasa delta,
probablemente en su dominio con actividad exonucleasa responsable de la corrección de
pruebas, pueden ser responsables del inicio y desarrollo de tumores.

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Resumen
La 4CR en tiempo real o 4CR cuantitativa permite cuantificar además de detectar y
amplificar secuencias de ADN.
La 4CR en tiempo real (o 4CR cuantitativa) surgió para resolver el problema de la
cuantificación de la técnica de la 4CR. En la 4CR en tiempo real se emplean sondas
marcadas con fluorocromos. Las sondas de hidrólisis, frecuentemente empleadas en esta
técnica, son oligonucleótidos que presentan fluorocromos en ambos extremos y tienen una
secuencia complementaria a parte del fragmento de ADN que se quiere amplificar. Uno de
los fluorocromos actúa como donador de fluorescencia en el extremo 5¶ y el otro como
aceptor de esta fluorescencia en el extremo 3¶. La ADN polimerasa se desplaza sobre la
cadena de ADN sintetizando la cadena complementaria a partir de un fragmento de ADN
que sirve de molde (cebador). Al llegar al punto en el que la sonda se ha hibridado, la
hidroliza. El fluorocromo del extremo 5¶ de la sonda (el donador) es liberado. El
fluorocromo aceptor no puede entonces absorber la fluorescencia del donador por estar
alejado de él espacialmente. Un detector realiza la medida de esta emisión de
fluorescencia, que es proporcional a la cantidad de ADN presente, y la representa
gráficamente. Además de proporcionar información cuantitativa, la 4CR en tiempo real
presenta otra serie de ventajas frente a la 4CR tradicional. La fundamental es su mayor
sensibilidad lo que disminuye el riesgo de falsos negativos. El hecho de que los datos sean
tomados en la fase exponencial del proceso asegura que ningún componente pueda estar
limitando el proceso de amplificación. También es más rápida y tiene menos probabilidad
de contaminación con lo que disminuyen los falsos positivos. Son muchas las aplicaciones
de esta técnica en el campo de la medicina. Cabe destacar la cuantificación viral, la
cuantificación de la expresión de genes, el control de la eficacia de fármacos, la detección
de agentes infecciosos, el diagnóstico de tumores y la detección de polimorfismos.
hibridación in situ
Resumen
La hibridación in situ permite visualizar una secuencia de ADN o ARN justo en el sitio
físico en el que se encuentra permitiendo analizar su distribución en células y tejidos.
Esta técnica, de la que han surgido diferentes variantes, se basa en la
complementariedad de las bases que componen los ácidos nucleicos: G con C y A con T
en el caso del ADN y G con C y A con U en el caso del ARN. Se diseña una sonda
marcada con un fluorocromo que hibride con la secuencia a detectar. Este sistema nos
permite estudiar la distribución in situ de una determinada secuencia de interés.
Secuencias de interés médico pueden ser aquellas asociadas a enfermedades de origen
genético, las que revelan la presencia de algún patógeno, las que se han asociado a
desarrollo de ciertos tumores o las que se emplean como indicadores de alteraciones
numéricas del conjunto de cromosomas de un individuo. La detección se lleva a cabo
marcando previamente la sonda a hibridar con la secuencia de interés con un
fluorocromo. El siguiente paso es la hibridación de la secuencia marcada con las
muestras problema, aplicándola directamente sobre células extendidas o tejidos. La
detección de la fluorescencia emitida permite identificar la presencia de la secuencia y
su localización exacta en la muestra.
Electroforesis en gel

Resumen
La electroforesis en gel es una técnica sencilla empleada de forma rutinaria en laboratorio
para separar moléculas biológicas especialmente ADN, ARN y proteínas.

Concepto
La electroforesis es una técnica habitual en el laboratorio clínico. 4ermite separar especies
químicas (ácidos nucleicos o proteínas) a lo largo de un campo eléctrico en función de su
tamaño y de su carga eléctrica. Los ácidos nucleicos, ADN y ARN, tienen por naturaleza
carga negativa. Si ponemos fragmentos del ADN extraído de una muestra biológica sobre
un soporte poroso (gel) y aplicamos un campo eléctrico, se producirá la migración
diferencial de los fragmentos a través de los poros de la matriz. La tinción del gel con
bromuro de etidio, que es una sustancia fluorescente que se intercala en la molécula de
ADN, y la exposición con luz ultravioleta, permite observar el resultado de ésta migración.
El tamaño de los fragmentos de ADN se puede estimar comparándolos con el patrón de
bandas que se obtiene de marcadores comerciales de peso molecular conocido. La
electroforesis de ADN es útil para comparar patrones de bandas de diferentes muestras
biológicas. Así por ejemplo se puede usar para comparar muestras de individuo sano frente
a individuo enfermo, para la identificación de ácidos nucleicos de agentes infecciosos o
para la obtención de un fragmento determinado de ADN que, una vez localizado en el gel,
puede ser extraído para análisis posteriores


Electroforesis bidimensional
La electroforesis bidimensional permite la identificación de una proteína particular en
una mezcla proteica compleja
El estudio de proteínas es de gran interés en el área médica. Muchos fármacos son de
naturaleza proteica y muchas moléculas diana son proteínas. Dependiendo del pH del
medio en el que se encuentre, una proteína tendrá carga positiva o negativa o no estará
cargada. El valor de pH en el que una proteína presenta carga neta 0 es conocido como
³punto isoeléctrico´ y es característico de cada proteína. La electroforesis bidimensional
es una técnica que permite la separación de mezclas complejas de proteínas. La
separación se hace en dos etapas consecutivas. En la primera de ellas (³primera
dimensión´) las proteínas son separadas en función de su carga a lo largo de un gel con
gradiente de pH. Cada proteína avanza en el campo eléctrico hasta alcanzar un valor de
pH igual a su punto isoeléctrico. En una segunda etapa (³segunda dimensión´), estas
proteínas son separadas entre sí en función de su masa molecular. La visualización del
resultado de estas dos electroforesis muestra el conjunto de proteínas presentes en la
mezcla inicial. La electroforesis bidimensional se emplea en estudios comparativos de
patrones proteicos de diferentes individuos. 4ueden compararse por ejemplo, los
patrones de proteínas de un individuo sano frente a un individuo enfermo o de un
mismo individuo expuesto a diversas situaciones. Estas estrategias se utilizan para
analizar los efectos de diferentes tratamientos con fármacos o la exposición a sustancias
tóxicas.


 

Secuenciación

Resumen
Esta técnica se emplea para la lectura de la secuencia de bases nitrogenadas de los
nucleótidos de una molécula de ADN.

Esta técnica permite la lectura de la secuencia de bases nitrogenadas (A, C, T, G) de los


nucleótidos que componen una molécula de ADN. Los nucleótidos son piezas que
combinadas en un orden determinado constituyen la información genética de un
organismo. Cada nucleótido tiene una sola de estas bases nitrogenadas. Aunque el ADN
forma una doble cadena, para la lectura de la secuencia de las bases nitrogenadas de los
nucleótidos se parte de una sola de las cadenas. Se requiere, además, la presencia de un
fragmento de ADN sintético, llamado cebador o primer, complementario a la cadena de
interés. La ADN polimerasa reconoce el cebador y, a partir de él, añade nucleótidos
completando de este modo una cadena complementaria a la original. En la técnica de
secuenciación se llevan a cabo 4 reacciones de síntesis independientes. Lo común en
cada una de estas reacciones es la presencia del ADN de interés, del cebador, de la ADN
polimerasa y de los cuatro tipos de nucleótidos (según la base nitrogenada que tengan)
necesarios para la síntesis de la cadena complementaria. Lo que diferencia entre sí a
estas 4 reacciones es que en cada una de ellas se añade además uno de los nucleótidos
con una modificación (carece de un grupo H necesario para la elongación de la cadena
de ADN). Cada vez que uno de estos nucleótidos modificados se incorpore al azar en el
proceso de síntesis que dirige la ADN polimerasa, la elongación se interrumpirá. Cada
reacción proporciona por tanto la información de las posiciones en las que se localiza
uno de los nucleótidos. La combinación de la información obtenida de forma
independiente para cada nucleótido permite una lectura completa de la secuencia
complementaria al ADN original. La secuencia original se deduce fácilmente a partir de
la obtenida. 4ara poder visualizar la secuencia es necesario utilizar métodos comunes de
marcaje (radiactividad o fluorescencia).