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Resumen
Los polifenoles son un grupo heterogéneo de moléculas que comparten la característica de poseer
en su estructura varios grupos bencénicos sustituidos con funciones hidroxílicas. Existe un gran
interés en el poder antioxidante de estas moléculas naturales, debido a que tienen efectos positivos
sobre enfermedades degenerativas crónicas, enfermedades vasculares y cáncer. Por otro lado, los
beneficios en la salud que actualmente se le adjudican al vino, se relacionan tanto con su consumo
moderado, como por su contenido en polifenoles, que además le otorgan sus propiedades
organolépticas características. Los compuestos fenólicos del vino incluyen, entre otros, a los ácidos
fenólicos (cumarínico, cinámico, cafeico, gentísico, ferúlico y vanílico) y flavonoides (catequinas,
quercetina) y estilbenos (resveratrol). El presente trabajo se dirige al desarrollo de una nueva
estrategia de determinación de polifenoles basados en biosensores enzimáticos de lacasa, como
alternativa a los métodos analíticos actuales basados en el HPLC o en los métodos colorimétricos,
que requieren instrumentación sofisticada y largos tiempos de análisis. En este trabajo se
desarrollaron biosensores enzimáticos de lacasa de "trametes versicolor", mediante la integración de
esta enzima a la formulación de compósitos de grafito-epoxi, obteniéndose un biocompósito lacasa-
GEB. En este trabajo se muestran los principales resultados obtenidos en la determinación de
polifenoles en vino usando biosensores enzimáticos basados en un biocompósito lacasa-GEB.
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vino, en especial el vino tinto, contiene un alto electroquímica de los transductores realizada
número de compuestos tales como ácidos por voltamperometría cíclica se llevó a cabo con
fenólicos (cumarínico, cinámico, cafeico, un sistema electroquímico de CH Instruments.
gentísico, ferúlico y vanílico), trihidroxi El sistema de tres electrodos usado fue, en
estilbenos (resveratrol y polidatina), y todos los casos, el electrodo de trabajo o
flavonoides (antocianinas, catequina, indicador (electrodo de compósito de grafito-
epicatequina, miricetina, kaempferol, y epoxy (GEC) y electrodos de biocómposito de
quercetina). De entre todos los compuestos, los grafito-epoxy modificados con enzima lacasa
polifenoles de la uva se encuentran en la piel, (lacasa-GEB)), el electrodo de referencia
especialmente en las células epidérmicas, y en ORION de Ag/AgCl/KCl (3M) de doble unión y el
las pepas, siendo su concentración más baja en electrodo auxiliar de platino CRISON 52 67 1.
la pulpa.
Actualmente, se dispone de varios métodos
para el análisis de compuestos polifenólicos. 2.2 Reactivos
Entre ellos cabe destacar la cromatografçía
líquida o los métodos colorimétricos (métodos
de Folin-Ciocalteau, vainillina-HCl y n-butanol-
Para la preparación de los electrodos
HCl). Las desventajas de estos métodos es el enzimáticos se ha utilizado: Grafito en polvo de
largo tiempo de análisis o su alto coste. tamaño de la partícula < 20 μm (Merck,
En el presente trabajo se plantea el diseño de
Alemania) y Resina epoxi EPO-TEK H77 (Epoxy
un biosensor enzimático basado en Technology, USA). Enzima lacasa de trametes
biocompósitos rígidos para la determinación del versicolor (Fluka) > 20 unidades/mg.
índice polifenólico en matrices alimentarias, y se
Los reactivos usados para la preparación de las
demuestra su utilidad en vinos. Para tal fin, se soluciones han sido de calidad proanálisis o
escogió como enzima la lacasa (EC 1.10.3.2), similar.
glicoproteína producida por algunos hongos y
Como sustratos se ha empleado soluciones 1
bacterias y capaz, mediante sus centros de mM en agua bidestilada de: ácido gálico, ácido
cobre, de catalizar la oxidación de diversos cafeico, trans-resveratrol, catequina hidratada.
compuestos fenólicos [3]. Sus propiedades
La solución reguladora ABS a pH 3,5 fue
catalíticas la cualifican para oxidar compuestos preparada con acetato potásico 0,1 M y cloruro
fenólicos de forma natural usando como aceptor sódico 0,1 M. La solución reguladora CBS a pH
natural el O2 (Figura 1), mientras que mediante
5,0 fue preparada en concentraciones de citrato
mediadores redox pueden oxidar también
sódico tribásico dihidratado 0,1 M y cloruro
compuestos no fenólicos, en presencia de O2 y
sódico 0,1 M.
H2O de forma simultánea.
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a cabo antes de cada determinación electroquímicas de las reacciones catalizadas
amperométrica o voltamperométrica. respecto a cuando no lo están.
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observarse en la Figura, es importante destacar (Ipc), ya que se incrementa linealmente con la
que a medida que aumenta la proporción de velocidad de barrido, al menos hasta 0.4 V s-1.
enzima, desde 0 a 10 %, se observa un
aumento evidente de la señal debido al centro
catalítico de cobre de la enzima, pero para
cantidades superiores, esta señal decae, debido
al empeoramiento de la conducción del material
biocompósito. Por lo tanto, se tomó como
material para subsecuentes estudios el
biosensor de lacasa(10%)-GEB.
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Fig.5. voltamperometría cíclica de los electrodos GEC y los biosensores de lacasa(10%)-GEB en ABS pH 3,5 (izquierda) y en
CBS pH 5,0 (derecha) v= 200 mVs-1. En todos los casos antes y después de la adición de a) catequina; b) ácido cafeico; c)
ácido gálico; y d) trans-resveratrol todos a concentración 90,9 μM.
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Teniendo en cuenta la dirección del barrido, efecto electrocatalítico del biosensor enzimático
(potencial inicial 0,0 V, yendo en sentido de lacasa(10%)-GEB a diferentes potenciales, y
negativo hasta -0.4 y revirtiendo el sentido del frente a diferentes vinos, comparando con elñ
barrido hasta 1,0 V), se observa en todos los sensor GEC sn enzima. En la Figura se muestra
casos un aumento de la Ipc (señal de el resultado para Vino tinto Cermeño (2006)
reducción) como consecuencia de la acción D.O. Ribera de Duero (utilizando CBS pH 5,0).
enzimática de la lacasa del biosensor, que oxida
los polifenoles, excepto para los compuestos
irreversibles. En este caso, no es posible
observar la reducción de los compuestos
previamente oxidados por la enzima. En
general, se observa que el efecto
electrocatalítico para los compuestos
reversibles es más marcado cuando se usa
CBS, pH=5, mientras que la señal debida a la
enzima lacasa aparece solapada por las
señales de los polifenoles. Para el caso de los
compuestos irreversibles, sin embargo, se
observa un incremento más marcado cuando se
usa ABS, pH 3,5. En este caso, debido a que no Fig.6: Representación de la señal amperométrica del
existe solapamiento con la señal de reducción biosensor lacasa(10%)-GEB a diferentes potenciales de
de los compuestos debido a su irreversibilidad, vino tinto Cermeño (2006) con una dilución 1/40 en 20,0 mL
de buffer CBS pH 5,0.
se puede suponer que la señal que se
incrementa es la correspondiente al sitio
catalítico de la enzima, teniendo además en Se puede concluir que para cuantificar
cuenta que los potenciales se corresponden a polifenoles en vino con el biosensor enzimático,
los observados en la Figura 2. Con el objeto de puede aplicarse un potencial de 0,1 V (vs
seleccionar un potencial capaz de detectar los Ag/AgCl), tanto en ABS (resultados no
diferentes polifenoles, se realizó la mostrados) como en CBS, aunque la respuesta
amperometría (resultados no mostrados). En amperométrica es mayor en CBS.
este caso, se espera observar la reducción de Luego de la selección del potencial idóneo
los polifenoles reversibles previamente oxidados de trabajo para ABS a pH 3,5 o CBS a pH 5,0,
por la acción de la enzima lacasa del biosensor. es de 0,1 V, se realizaron adiciones crecientes
El biosensor es capaz de detectar tanto en ABS, de vino en la misma celda, y los resultados se
pH=3,5 como en CBS, pH=5,0, la señal de muestran en la Figura 7.
reducción de los polifenoles reversibles
(catequina y ácido cafeico), mientras que para
el caso de los compuestos irreversibles se
obtiene una escasa señal de reducción. Cabe
destacar también que el biosensor es más
sensible para ácido cafeico cuando se usa CBS,
obteniéndose las señales de reducción más
altas, respecto al resto de polifenoles, mientras
que para el ABS, tanto ácido cafeico como
catequina son observados con casi la misma
sensibilidad. Como resultado del estudio
amperométrico, se puede concluir que para
cuantificar ácido cafeico o catequina, puede
aplicarse un potencial de 0,0 o de 0,1 V (vs Fig. 7. Representación de la señal de Intensidad obtenida
frente al volumen adicionado de vino tinto Cermeño (2006)
Ag/AgCl), y que la mejor solución para la (adiciones de 100 μL hasta un volumen de 1000μL) con los
determinación es CBS, pH=5,0. electrodos GEC y Lacasa(10%)-GEB CBS pH 5,0.
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4. Conclusiones
Bibliografía
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