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UNIVERSIDAD NACIONAL

AUTONOMA DE MEXICO
FACULDAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA
QUIMICA FARMACEUTICO BIOLOGICA

MICROBIOLOGÍA GENERAL I

RECOMBINACIÓN GENÉTICA, MÉTODOS DE


CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS Y
PATOGENICIDAD Y VIRULENCIA

PROFESOR: ROMERO DÍAZ GABRIEL ALEJANDRO


SEMSTRE: 2019-1
GRUPO: 1601
ALUMNO: PARTIDA HERNÁNDEZ AMÉRICA
ESMERALDA
NO. DE LISTA: 24
FECHA: 13-11-2018
RECOMBINACIÓN GENÉTICA

La recombinación genética se refiere al intercambio de genes entre dos


moléculas de ADN para formar nuevas combinaciones en un cromosoma.

En eucariotas, la recombinación genética es un proceso ordenado que


generalmente ocurre como parte del acto sexual del organismo. La transferencia
vertical de genes ocurre cuando los genes pasan de un organismo a su
descendencia (plantas y animales). Las bacterias pueden transmitir sus genes
no solo a su descendencia, sino también a otros microbios del mismo género
(transferencia horizontal).

En todos los mecanismos, la transferencia involucra a una célula donante que


proporciona parte de su ADN a una célula receptora. Una vez transferido, parte
del ADN del donante se incorpora al ADN del receptor, el resto es degradado por
enzimas celulares. La célula receptora que incorpora el ADN del donante en su
propio ADN se denomina recombinante.

 Transformación en bacterias

El experimento lo realizo Frederick


Griffith en Inglaterra en 1928 con
dos cepas de Streptococcus
pneumoniae.

Durante el proceso de
transformación, os genes se
transfieren de una bacteria a otra
como ADN desnudo en solución. La
transformación no solo mostro que
el material genético podía
transferirse de una célula
bacteriana a otra, sino que el
estudio de este fenómeno llevo a la conclusión de que el ADN es el material
genético.

 Conjugación en bacterias

Esta medida por un tipo de plásmido (pieza de ADN que se replica


independientemente del cromosoma de la célula), la conjugación difiere de la
transformación por dos formas principales. Primero, la conjugación requiere
contacto directo de célula a célula, segundo, las células de conjugación deben
ser del tipo de emparejamiento opuesto; las células donadoras deben llevar el
plásmido, y las receptoras no.
 Transducción en bacterias

En este proceso, el ADN bacteriano se transfiere de una célula donante a una


célula receptora dentro de un virus que infecta bacterias, llamadas bacteriófagos
o fagos.

Ciclo de vida de un tipo de fago transductor de E. coli

 En el proceso de infección el fago se adhiere a la pared celular bacteriana


del donante e inyecta su ADN en la bacteria.
 El ADN del fago actúa como una plantilla para la síntesis del nuevo ADN
del fago y también dirige la síntesis de las capas de proteínas del fago.
Durante el desarrollo del fago dentro de la célula infectada, el cromosoma
bacteriano se rompe por las enzimas del fago y
 Algunas piezas del ADN bacteriano se empaquetan por error dentro de las
capas de proteínas del fago.
Las partículas de fago resultantes transportan ADN bacteriano en lugar de
ADN del fago
 Cuando se liberan partículas de fago a una nueva población de bacterias,
los genes bacterianos son transferidos a las células receptoras recién
infectadas a baja frecuencia
 La transducción del ADN celular por un virus puede conducir a la
recombinación entre el ADN de la célula huésped donante y el ADN de la
célula huésped receptora.
MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

Existen numerosos métodos que permiten establecer el número de


microorganismos en una muestra dada, algunos métodos cuantifican el número
de células otros cuantifican la masa total de la población. Debido a que las
poblaciones bacterianas son usualmente muy grandes, la mayoría de los
métodos de conteo se basan en conteos directos o indirectos de muestras muy
pequeña; posteriormente se hacen cálculos que determinan finalmente el
tamaño de la población total; así, los ensayos de cuantificación microbiana se
agrupan de manera general en métodos directos y métodos indirectos.

CUANTIFICACIONES DIRECTAS:

Cuenta microscópica

Para estos recuentos se utilizan generalmente cámaras de recuentos, aunque


también pueden realizarse a partir de muestras filtradas en membranas y
transparentadas o teñidas con colorantes fluorescentes (Naranja de acridina).

La mayor dificultad del recuento en cámara es obtener reproducibilidad en el


llenado de la cámara con líquido. Otra dificultad es la adsorción de las células en
las superficies del vidrio, incluyendo pipetas. Esta adsorción es crítica en el
proceso de dilución de la muestra y se minimiza al realizar las diluciones en
medios de alta fuerza iónica.

Cámara de recuento de Petroff-Hausser Cámara de Neubauer

Cámaras de conteo

Las cámaras más utilizadas son las de Hawksley y la de Petroff-Hausser. La


primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersión,
aunque la mayoría de los recuentos se realizan con objetivos secos. Una de las
mayores ventajas del recuento microscópico es brindar información adicional
sobre el tamaño y la morfología de los objetos contados.
Desventajas:

 No es práctico para un gran número de muestras.


 No es muy sensible, se necesitan al menos 106 bacterias/mL para que
sean observadas al microscopio.
 No distinguen células vivas de muertas.

Recuento de Breed

Los portaobjetos de Breed tiene marcadas áreas de 1 cm2. Dentro del cuadrado
se ponen 0.01 mL del líquido que se va a contar. Se deja secar. Se tiñe con azul
de metileno. Se examina bajo el objetivo de inmersión, un diámetro de campo
conocido, generalmente de unos 0.16 mm.
𝑁 𝑥 4 𝑥 104
𝑅𝑒𝑐𝑢𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑝𝑜𝑟 𝑚𝐿 =
𝜋𝑑 2

En la que N es el número de microorganismos por campo y d el diámetro del


campo.

Método del recuento de gota o método Miles y Misra

Involucra la preparación de diluciones seriadas de una suspensión bacteriana.


Las placas son divididas en sectores separados. Se inocula cada sector una gota
empleando una Pipeta Pasteur calibrada o bien micropipetas inoculando 0.02mL
(50 gotas por mL).

Las placas se incuban de 18 a 24 horas a la temperatura adecuada (37ºC).


Después de incubarlas, se escogen las placas que tengan colonias aisladas en el
área en la que se agregaron las gotas, de preferencia las que hayan dado menos
de 40 colonias por gota (el ideal es de 10 a 20). El número de bacterias viables
se obtiene dividiendo el número total de colonias contadas por el número de
gotas determinado, y se multiplica por 50 (para convertir la cifra a colonias por
mL) y por la dilución empleada.

Filtración

Utilizado cuando el número de bacterias es bajo, son filtros con poro de 0.45
micrómetros que retiene las bacterias, se filtra un volumen dado y se coloca el
filtro sobre una placa de medio de cultivo apropiado, donde crecerán tantas
colonias como bacterias hayan quedado adheridas al filtro.

Ventajas:

Nos permite poder separar las bacterias del medio acuoso

Desventajas:

Hay la posibilidad de que no todas las bacterias se queden en el filtro o sean


transferida.
Contadores electrónicos

Los contadores electrónicos permiten realizar recuentos de bacterias, levaduras


no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y microorganismos
filamentosos o micelares.

Estos instrumentos constan básicamente de dos compartimientos comunicados


a través de un pequeño conducto. En ambos compartimientos hay electrodos
que miden la resistencia eléctrica del sistema, y como el orificio del conducto es
muy pequeño y su resistencia es muy alta, la resistencia eléctrica de cada
compartimiento es independiente. El principio de funcionamiento de estos
instrumentos es el que se explica a continuación. Un volumen fijo de una
suspensión bacteriana es forzada a pasar desde un compartimiento al otro a
través del pequeño conducto, en un muy breve intervalo de tiempo. Cuando un
microorganismo pasa al nuevo compartimiento, la resistencia de éste se
incrementa debido a que la conductividad de la célula es menor que la del medio.
Estos cambios en la resistencia son convertidos en pulsos o voltaje y contados.

No pueden medirse células que formen filamentos o agregados o soluciones muy


concentradas de microorganismos, debido a que el pasaje de más de una célula
en un breve período de tiempo va a ser tomado como una célula más grande.
Es común la obstrucción del orificio por microorganismos muy grandes.

Dilución y vaciado en placa

Se determina el número de microorganismos en una muestra en relación a las


colonias que forman, las UFC (Unidades Formadoras de Colonias). Se emplean
soluciones diluidas o diluciones de una muestra concentrada para que cada
colonia formada provenga de un solo microorganismo, aunque algunas
agrupaciones no pueden ser separadas por las diluciones. Se utilizan
principalmente para la cuantificación de bacterias, levaduras y hongos
filamentosos.
Se reporta como: •UFC ****/unidad de volumen o peso.

Número Más Probable (NMP)

También llamada técnica de dilución en tubo proporciona una estimación


estadística de la densidad microbiana presente con base a que la probabilidad
de obtener tubos con crecimiento positivo disminuye conforme es menor el
volumen de muestra inoculado.

o Ventajas:

Técnica fácil

Ideal general de la población


bacteriana

También se usa para determinar


el número de células de un
cultivo mixto que puede crecer
en un medio liquido

Proporciona un 95% de
posibilidades de que la población
bacteriana este dentro de un
determinado margen

o Desventajas: Método
popular pero poco exacto
CUANTIFICACIONES INDIRECTAS:

Turbidimetría
 Fotómetro o espectrofotómetro: Mide la luz transmitida = “La
disminución de esta luz es proporcional a la concentración de
microorganismos”.
 Nefelómetro: Mide la luz dispersa = “A mayor dispersión mayor
concentración microbiana”.

La turbidez se determina por la densidad óptica (OD) que puede ser


expresada como Absorbancia, % de transmitancia o Unidades Klett (UK).

Ventajas: Es más exacta y precisa, ya que se basa de aspectos físicos y


químicos de las bacterias.

Es un recuento automatizado que da resultados con cálculos matemáticos

Desventajas: La presencia de precipitados u otras sustancias producidas


por las bacterias puede aumentar la turbidez

El método presenta el problema de que no puede medir bacterias móviles

No distingue células vivas de muertas

Es impreciso si el número de microorganismos es escaso

Es lento y subjetivo.

Longitud de onda para algunos microorganismos:

Bacterias: 540 nm

Protozoarios: 580 nm

Levaduras: 600 nm
Masa celular
 Peso seco: Liofilización. Se debe emplear balanzas muy exactas; un
miligramo supone una desviación en el número de bacterias.

El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se


encuentran en una suspensión se obtiene por el secado de un volumen
en un horno a 105°C hasta peso constante. Esta técnica es útil para
grandes volúmenes de muestra, debido a que diferencias del orden
de los miligramos representan el peso de un gran número de
bacterias.

La desventaja de este método es que componentes volátiles de la


célula pueden perderse por el secado y puede existir alguna
degradación. También la muestra seca puede recobrar humedad
durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene una humedad
relativa alta.

 Peso húmedo: Utiliza una alícuota del medio, se centrifuga y se pesa


el sedimento. Es un método inexacto.

Se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es pesada luego


de la separación de las células por filtración o centrifugación. Es una
técnica útil para grandes volúmenes de muestra.

La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el


espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad
de líquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de
células bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio
intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma
y deformación celular. Para corregir el peso húmedo se determina la
cantidad de líquido que queda retenida en el espacio intercelular luego
de una centrifugación, para ello se utilizan soluciones de polímeros no
iónicos (como el Dextran) que pueden ingresar en el espacio
intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas.
PATOGENICIDAD Y VIRULENCIA

Cuando se reúnen un microorganismo patógeno y un huésped susceptible y las


condiciones son favorables, se produce una enfermedad. Por lo tanto, la
patogenicidad no es una característica absoluta del parásito, sino más bien de
las circunstancias que definen cada interacción hospedero-parásito específica.

Lo mismo ocurre con la virulencia, como lo ha expresado Dubos: La virulencia


no es una propiedad permanente, intrínseca de una especie determinada,
expresa únicamente la propiedad de una cepa específica del agente infeccioso,
en cierta fase de crecimiento de producir un estado patológico en un huésped
particular, en condiciones bien definidas.

Para que un agente biológico pueda funcionar como parasito es decir como
patógeno deber ser capaz de lleva a cabo las siguientes acciones:

 Adherencia al huésped
 Penetración en el huésped
 Condiciones adecuadas en el huésped
 Escape de os mecanismos de defensa del huésped
 Escape de la acción iatrogénica
 Producir daño en el huésped

Factores de virulencia

Los factores de virulencia son moléculas producidas por un patógeno, que influye
específicamente en las funciones del huésped, para permitir al patógeno crecer,
eso aumenta su efectividad y les permite lograr lo siguiente:

 Colonización de un nicho en el huésped (esto incluye el archivo adjunto


a las células)
 Inmunoevasión, evasión de la respuesta inmune del huésped
 Inmunosupresión, inhibición de la respuesta inmune de huésped
 Entrada y salida de las células (si el patógeno es intracelular)
 Obtener nutrición del anfitrión
Toxinas

Existen básicamente dos tipos de toxinas bacterianas:

 Endotoxinas, las cuales son componentes estructurales de la célula


bacteriana que posee actividad tóxica sobre células y organismos
eucariotas. El lipopolisacárido (LPS) de bacterias Gramnegativas es el
ejemplo clásico de endotoxinas. Aunque las endotoxinas forman parte
integral de la célula bacteriana, pequeñas cantidades pueden ser liberadas
en el transcurso del ciclo de crecimiento bacteriano.

 Exotoxinas, las cuales son de naturaleza proteica. Las exotoxinas se


pueden clasificar a su vez en dos grandes grupos, de acuerdo con su sitio
de acción. Un primer grupo incluye aquellas toxinas que actúan
intracelularmente, ya sea sobre componentes celulares que se encuentran
en la cara interna de la membrana citoplasmática, o sobre estructuras
dispersas en el citoplasma, como el citoesqueleto y los ribosomas. Un
segundo grupo está constituido por aquellas exotoxinas que actúan
directamente sobre la membrana de la célula blanco. Dicha acción puede
causar lisis de la célula, por lo que a este grupo de toxinas se les denomina
citolisinas.

Enzimas

Muchas bacterias producen enzimas hidrolíticas, tales como hialuronidasa, que


degrada componentes de la matriz extracelular y de esta forma lesiona la
estructura de los tejidos del hospedero. Otra enzima es la DNasa la cual reduce
la viscosidad de los residuos de células muertas del hospedero (pus) y por lo
tanto, ayuda a la propagación de la bacteria a una área más extensa de daño en
el hospedero. Las enzimas hidrolíticas también proveen a la bacteria de fuentes
de carbono y energía rompiendo los polímeros del hospedero en azúcares y
aminoácidos de bajo peso molecular. A pesar del hecho de que las enzimas
hidrolíticas producidas por bacterias causan daño a los tejidos, dichas enzimas
no son clasificadas como toxinas porque generalmente no matan a las células
del hospedero o no causan un daño metabólico identificable como el producido
por la toxina colérica. La virulencia de algunos microorganismos es debido en
parte a la producción de enzimas u otros factores metabólicos. Entre las
principales enzimas metabólicas relacionadas con la virulencia de las bacterias
patógenas se encuentran:

 Colagenasa, enzima que desintegra el colágeno,


encontrada en músculo, hueso y cartílago, favoreciendo
la diseminación.
 Coagulasa, enzima capaz de coagular el plasma, lo que
facilita el depósito de fibrina, impidiendo una fagocitosis
adecuada.
 Hialuronidasa, enzima inducible en presencia de su
substrato específico, que hidroliza el ácido hialurónico
(cemento intercelular). Esto facilita la diseminación de
los microorganismos en el hospedero y se le llama
también "factor de diseminación".
 Leucocidinas, substancias producidas por algunas
bacterias, son capaces de lisar a leucocitos
polimorfonucleares
 Hemolisinas, producidas por diversas bacterias, que lisan
los eritrocitos. Se les relaciona con la virulencia debido a
que las cepas hemolíticas de un patógeno en general son
más virulentas que las no hemolíticas.
 Lecitinasa, también conocida con el nombre de alfa-
toxina, destruye varios tipos de células, en particular
eritrocitos.
 Fibrinolisina, disuelve la fibrina humana pero no la de
otras especies animales. Como ejemplo se puede citar la
estreptocinasa producida por los grupos A, B, y C
del Streptococcus ß-hemolítico.

REFERENCIAS
 Rodríguez, José Ángel García; Picazo, Juan J. (1999). Compendio de
microbiología médica. Elsevier España.
 Collins C. H., Lyne M. Patricia. Métodos microbiológicos. Editorial
ACRIBIA, S.A. ZARAGOZA, España.
 Vullo. Microbiología en la práctica. Editorial Atlante. Buenos Aires,
Aregentina. 2000.