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Universidad Tecnológica de Morelia

TSU Biotecnología

Integrantes:
Valencia Jaramillo Diana Karina
Farias Ruiz Claudia Paulina

2 Revisión Proyecto Integradora

Integradora 1 3B

Fecha de entrega: 26/07/18


Extracción del metabolito 6 pentil-α-pirona de Trichoderma spp., Sobre
Especie de Phytophthora cinnamomi
Introducción
En el mundo se conoce un grupo importante de hongos y bacterias que presentan
efecto antagónico sobre otros microorganismos. Este efecto es aprovechado por el
hombre para la regulación, tanto de patógenos cuyo hábitat es el suelo, como
aquellos que se desarrollan en la parte foliar de las plantas (Sandoval, 2002; Ruiz,
1996); los antagonistas contribuyen a la atenuación de los daños que causan las
enfermedades, en los agroecosistemas donde existan condiciones para su
desarrollo y conservación. Para lograr este objetivo los microorganismos
beneficiosos presentan diferentes modos de acción que les permitan ejercer su
efecto biorregulador. Estos atributos, de conjunto con la capacidad de multiplicarse
abundantemente, se encuentran entre los de mayor importancia para su selección
como agentes de control biológico (Fernández, 2001).
Hongo Trichoderma ha sido objeto de estudio para control biológico debido a su alta
capacidad reproductiva, habilidad para sobrevivir a condiciones ambientales
desfavorables, eficiencia en la utilización de nutrientes, capacidad para modificar la
rizosfeta, fuerte agresividad contra hongos fitopatógenos y eficiencia en la
promoción de crecimiento en plantas e inducción de mecanismos de defensa.
(Intagri, 2016)
La acción de Trichoderma como micoparásito natural se demostró por Weindling en
1932, y su utilización en experimentos de control biológico se implementó a partir
de 1970, cuando se incrementaron los estudios de campo para su uso en cultivos
de hortalizas y ornamentales (Chet,1990). No obstante, la información sobre su
empleo en la producción agrícola es insuficiente y dispersa.
La capacidad de producir diversos metabolitos y de adaptación a diversas
condiciones ambientales y sustratos, confiere a Trichoderma la posibilidad de ser
utilizado en la industria biotecnológica.(Infante, 2009).
Se han reportado diferentes metabolitos producidos por Trichoderma, entre ellos:
Gliotoxina, viridina, pacibasina, trichodermina,furanona, trichorziaminas, 6-pentil-α-
pirona, que tienen efectos antagónicos efectos antagónicos sobre los hongos
fitopatógenos: Pythiumultimum Trow, Sclerotium rolfsii Sacc., y Rhizoctonia
solaniKühn, entre otros (Horvath et al., 1995; Howell et al., 1993;Ordentlich et al.,
1992; Pavlovicova, 1998; Wilhite y Straney,1996). Entre los metabolitos volátiles
que produce Trichoderma spp., el 6PAP es el más conocido y estudiado(Collins y
Halim, 1972).La habilidad para producirloes muy variada entre las diferentes
especies, aún entre cepas de la misma especie (Cooney et al., 1997a). Su toxicidad
está relacionada con su habilidad hidrofóbica de adsorberse dentro de las
membranas celulares, formando una capa hidrorepelente sobre la pared celular,
que impide la absorción de agua por la célula del hongo (Scarselletti y Faull,
1994).El 6PAP mostró ser promisorio in vitro y también in vivo en el control de
muchos hongos en Nueva Zelanda, entre ellos Armillaria, Botritis (Cutler y Hill,
1994).
Debido a los efectos que ha tenido Trichoderma frente a otros hongos para control
biológico se realizará el estudio del 6PAP, debido a su potente actividad antifúngica
(Cutler y Hill, 1994) frente al hongo Phytophthora cinnamomi y observar el efecto
que tiene con la finalidad de que pequeños como grandes productores conozcan
una solución a la enfermedad que presenta los cultivos de aguacate en Michoacán,
tenga menores pérdidas y un mayor ingreso económico, así como dar a conocer el
efecto que puede tener este metabolito sobre la enfermedad que presenta abriendo
camino hacía la investigación de ambos hongos.

Antecedentes
En el año de 1794 Persoon hizo la primera descripción del género Trichoderma en
la que incluyo cuatro especies: T. viride, Xylohypha nigrescens, Sporotrichum
aureum, Trichothecium roseum. Actualmente, solo T. viride se reconoce como
especie de Trichoderma”. Años más tarde de 1984 a 1991 J. Bissett realizó una
revisión del género Trichoderma, reconociendo un total de 31 especies que fueron
divididas en cinco secciones: cuatro especies en la sección Longibrachiatum, veinte
especies en la sección Pachybasium, cuatro especies en la sección Trichoderma,
una especie en la sección Hypocreanum y dos especies en la sección
Saturnisporum. En 1998 Gams y Bissett, realizaron una nueva revisión de este
género y decidieron excluir la sección Saturnisporum transfiriendo sus dos especies
a la sección Longibrachiatum. En los últimos años se han realizado un sinnúmero
de estudios sobre este género logrando identificar 100 especies mediante análisis
de secuencia de ADN (Velasco N. C., 2013, pág. 3).
En la aplicación de T. harzianum para el control de la marchitez en mora. Genero
un incremento en el tamaño de los fruto tanto en diámetro como en longitud lo que
significa que la aplicación de T.harzianum ayudó al cultivo a elevar su potencial
genético brindando así una mejor cosecha, calidad de fruto y por ende mejor
beneficio neto. T. harzianum es un excelente estimulador del crecimiento de raíces
y raicias razón por la cual la planta de mora se ve beneficiada ya que se obtuvo
mayor peso por planta en aquellas que habían sido inoculadas por el hongo
(Moltalva, 2012).
Recientes investigaciones en la construcción y análisis de la función de Trichoderma
transformado con genes de Metarhizium contra insectos, han reportado un
incremento en la actividad de quitinasas y proteasas dando como resultado la
disminución de crecimiento del gusano de seda y larvas del barrenador de maíz en
un 23% (Chen y Li, 2010). Por otra parte varios aislamientos de Trichoderma revelan
actividad nematicida contra Meloidogyne spp. teniendo como modo de acción,
actividades enzimáticas, parasitismo directo, antibiosis y la resistencia inducida
(Spiegel y Sharon, 2010).
Existen varias especies de Trichoderma que son de gran importancia para la
agricultura, ya que han demostrado su eficacia como biocontrolador de
fitopatógenos en diversos cultivos, inclusive ya se están produciendo biofungicidas
cuyo ingrediente principal es Trichoderma. “Esto se debe a que posee varios
mecanismos de acción tales como: mico parasitismo, antibiosis, competencia,
promoción del crecimiento e inducción a la resistencia de la planta” (Harman,
Howell, Viterbo, & Chet, 2004).

Justificación
Michoacán es el líder mundial en producción de aguacate con 120,000 hectáreas
de cultivo de aguacate certificadas para la exportación, siendo de gran aportación
económica para dicho estado. Aun con este liderato, la producción de este frutal
enfrenta grandes problemas, uno de los más importantes es la pudrición de la raíz
o marchitez del aguacate, misma que se asocia a distintos agentes patógenos,
destacando a Phytophthora Cinnamomi como la causa primaria de esta
enfermedad. También conocida como muerte ascendente por la sintomatología
aérea que presenta el hospedero. (El Economista, 2017)
Los plaguicidas son un foco de contaminación generado por las actividades
agrícolas. Su mal manejo y persistencia provoca la contaminación de mantos
acuíferos, suelo e incluso alimentos (Chiron et al. 2000, Sun y Chen 2008). Lo
anterior puede potencialmente causar alteraciones en el ambiente y la salud
humana, debido a que estas sustancias pueden ser bioacumuladas y
biomagnificadas en la cadena alimenticia (Binelli y Provini 2004, Li et al. 2008).
El control de esta enfermedad se basa generalmente en estudios epidemiológicos
y manejo integrado del cultivo. Este último se logra combinando labores culturales,
productos químicos, adición de materia orgánica al suelo, buen drenaje y
mejoramiento genético (injertos). Se utilizará un control biológico Trichoderma para
la inhibición de Phytophthora C, puesto que un control químico contamina el fruto
de aguacate además de del medio ambiente, por ello la selección de un medio
biológico que no dañaría al medio. (INTAGRI,2017)
El consumo nacional de aguacate es sensible a cambios en el precio, por lo que se
ha visto afectado por variaciones importantes. De la producción nacional, 69% se
destina al consumo en fresco, 19% para la industria y 12% a exportación. Se reporta
un consumo per capita anual de 10 kg, que lo ubica como el país donde se presenta
el mayor consumo de esta fruta (BANCOMEXT, 2010)
Aunado a la importancia económica que esta fruta representa actualmente, cabe
destacar el elevado valor nutritivo basado en su composición, donde 100 g de pulpa
contienen: calorías (150 a 300 cal), hidratos de carbono (2.9 a 7.6 g), proteínas (1.2
a 2.1 g), grasa (6.1 a 21.2 g), agua (68 a 86 g) y fibra (0.7 a 2.1 g). Lo que permite
afirmar que se ubica entre las frutas más completas, convirtiéndose en una
alternativa de importancia para contrarrestar problemas de nutrición que
actualmente se tienen, sobre todo, en zonas rurales (Guillen, H., M.E. 2007).

Objetivos
Objetivo General
Obtener metabolito 6 pentil-α-pirona con actividad antibiótica de Trichoderma para
control biológico sobre Phytophthora cinnamomi para cultivos de aguacate.
Objetivos específicos
 Extracción de metabolito 6 pentil-α-pirona de Trichoderma por metanol.
 Probar el metabolito de Trichoderma en Phytophthora C
 Definir las necesidades de inhibir el crecimiento de Phytophthora C.
 Analizar los resultados que se obtuvieron nivel laboratorio de Trichoderma
sobre Phytophthora C.

Materiales y Métodos

Extracción y Actividad Antibiótica del 6 pentil-α-pirona de Trichoderma spp.,obre


Especies de Phytophthora

1.Aislamiento de Trichoderma y Phytophthora C. según la metodología de (Jung


Bae, 2016)
Será aislado Trichoderma haciéndolo crecer en medio Agar Dextrosa Papa, durante
10 días en condiciones de oscuridad y Phytophthora en Jugo Agar V8 (20% V8
Jugo, 8% CaCO3, 1.5% Bacto Agar), a una temperatura de 20 a 28°C de 5 a 13 días
en condiciones de oscuridad.
2.Extracción del 6PAP por Trichoderma spp, según la metodología de Aceve et al.
(2004)
Se va a preparar un medio sólido, para lo cual se utilizarán matraces de 250ml a los
cuales se les agregará 10 g de maíz molido (el grano entero se pasará por un molino
Wiley con una malla de 1mm) ,3ml de agua destilada y 5ml de un suplemento
formado por 1g de extracto de levadura, 2.0 g de caseína hidrolizada,1.5 g de
KH2PO4, 1g de MgSO4.7H2O, y 15g de glucosa/L. El medio se esteriliza a 121°C por
20min y posteriormente se deja enfriar; se inocularán grupos de cuatro matraces
con 1ml de una suspensión de conidios (1 x 103/ml) de 10 días de edad de
Trichoderma spp. Y se incubara a 20°C, con 24 h de luz y 50% de humedad relativa
durante 18 días. Para extraer el metabolito, una vez pasado el período de
incubación, a cada matraz se le adicionará 50 ml de la mezcla metanol-agua, en
una proporción 85:15 (v/v), se mezclará en un homogenizador durante 2 min para
deshacer los agregados y así se mantendrá homogenizando por 4h.;
posteriormente, el contenido de cada matraz se filtrará con papel Whatman GF/A
de 9cm de diámetro con una bomba de vacío. Luego, se vertirá en embudo de
separación en alícuotas de 4ml y se le adicionará 2ml de ciclohexano (Aldrich) y
10ml de una solución salina al 10% (pH 6.5); se mezclará y se dejará en separación
durante 12h. La capa de ciclohexano, con el 6PAP se separa de la solución y se
pasa a través de 1.5g de sulfato de sodio anhidro (Na2SO4), para eliminar el agua
y secarlo. La cuantificación del 6PAP se realiza en un cromatógrafo de gases con
detector de ionización de flama y una columna capilar no polar SPB-5, fase
aglomerada de poli (5% difenil/95% dimetilsiloxanos) de 25 m de longitud, 0.2 mm
de diámetro interior y una película de 0.33μm. Las condiciones de operación del
cromatógrafo deben ser flujos de 45ml/min de helio; 450ml/min de aire y 40ml/min
de hidrógeno, con 250°C de temperatura del inyector y del detector y 180°C de la
columna, durante 6min; posteriormente, la temperatura se fue eleva a 30°C por min
hasta alcanzar 230°C, con un flujo de 0.8ml/min de helio como gas de arrastre, 1μL
será el volumen de inyección y 8.67min el tiempo de cada corrida. La producción de
6PAP se expresa en mg/kg de sustrato. Generando así su tratamiento.
3.Antibiosis del 6PAP de Trichoderma spp. sobre Phytophthora C. según la
metodología de Aceve et al. (2004)
Para evaluar el efecto antibiótico del 6PAP de Trichoderma spp., se llevará a cabo
la producción del metabolito a través del medio de cultivo líquido. En matraces
Erlenmeyer de 250ml de capacidad se adicionará 50ml de medio con 3.5% de
Czapek Dox Broth, 4.0% de glucosa y 0.5% de extracto de levadura; el medio se
ajustará a un pH de 5.5 para luego esterilizarlo a 121°C por 20min (la glucosa se
esterilizó por separado). Posteriormente, se dejará enfriar y se adicionará la glucosa
antes de inocular con 1 ml de una suspensión de 1x106 conidios/ml, incubándose a
25°C en oscuridad, con 40% de humedad relativa, en un agitador rotatorio a 180
rpm durante 5 días. Después de la fermentación, la biomasa se pasará a través de
papel filtro Whatman no. 2 y posteriormente el filtrado se centrifuga a 10 000rpm por
30 min. El sobrenadante obtenido se esteriliza con filtro millipore 0.22 μm,y 10ml de
este filtrado de Trichoderma spp. se mezcla en proporción 1:1 (v/v) en PDA (5.9%)
antes de solidificar. La caja Petri se inocula con un disco de 5mm de diámetro de
PDA (3.9%) con micelio de colonias de 10 días en crecimiento activo de la especie
de Phytophthora C. a 25°C, con un fotoperíodo de 12h y 40% de humedad relativa
durante 12 días. Como testigos se utilizarán cajas Petri con PDA y agua destilada
estéril en lugar de filtrado. Se tendrán 4 repeticiones del tratamiento de la especie
de Phytophthora, el diámetro de las colonias, expresado en mm se registrará cada
2 días hasta 12 días después de la inoculación, tiempo en el cual el testigo llena la
superficie de la caja Petri. Los datos se expresaron en porcentaje de inhibición. El
número de conidios se determinó en la cámara hematométrica de Neubauer,
colocando 10 discos de 0.5cm de diámetro de la colonia en crecimiento de 12 días
de edad en 10ml de agua destilada estéril, y se calcularán los resultados a número
de conidios/caja. Para determinar el porcentaje de germinación de las unidades
formadoras de colonias (UFC), se siembran 100 conidios en cajas Petri de 9cm de
diámetro con PDA con 4 repeticiones y contabilizando el número de UFC
germinadas a las 48h. posteriores a la siembra. El efecto antibiótico del 6PAP en
las variables porcentaje de inhibición del micelio, número de conidios y porcentaje
de germinación de las UFC en Phytophthora C.

Resultados esperados y metas


Los metabolitos extraídos de hongo Trichoderma spp. podrían inhibir el crecimiento
de Phytophthora C. para así ser aplicados en campo, disminuyendo las pérdidas en
los cultivos de aguacate.
Que se logre el efecto inhibitorio que presenta Trichoderma spp. en Phytophthora
C. para así demostrar la eficacia del hongo, con la meta de que nuestro extracto
pueda ser un producto seguro y con una pureza que pueda disminuir el crecimiento
del hongo.

Impacto esperado
Con ésta investigación experimental, así como documental se pretende reducir el
impacto ambiental que tienen los agentes químicos empleados como controlador de
enfermedades en medios de cultivo agrícola aunado a ello que pequeños como
grandes productores conozcan una solución a la enfermedad que presenta los
cultivos de aguacate en Michoacán, tenga menores pérdidas y un mayor ingreso
económico, además no se verá a afectado el uso constante de dicho hongo puesto
que es un recurso sustentable y no afectará a generaciones futuras.

Literatura citada
 Michel Aceve, Alejandro Casimiro, Otero Sánchez, Marco Antonio, Rebolledo
Domínguez, Oscar, Lezama Gutiérrez, Roberto, Producción y Actividad
Antibiótica del 6 pentil-a-pirona de Trichoderma spp., Sobre Especies de
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Cartografía agroecológica del cultivo del aguacate en Michoacán.
Universidad Michoacana en San Nicolás de Hidalgo, Morelia, México. 141 p.
Plan de trabajo cuatrimestral
 Actividades a realizar
Actividad Duración (Semanas)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Adquirir el
equipo y
reactivos con
el que se
realizará la
extracción
Obtener hongo
Trichoderma y
Phytophthora
Extracción de
metabolito 6
pentil-α-pirona
de hongo
Trichoderma
Probar
metabolito 6
pentil-α-pirona
de hongo
Trichoderma
sobre
Phytophthora
(nivel
laboratorio)
Evaluar la
inhibición que
se obtuvo del
hongo
Dar a conocer
la eficacia que
se obtuvo en la
inhibición
Producción del
producto de
interés
Presupuesto del proyecto

Materiales y Suministros
Concepto Monto
Materiales y suministros de oficina $8,526.72
Materiales y suministros de producción $2,464
Materiales y suministros de laboratorio $72,642
Totales $83,632.72

Aportación. UTM

Concepto Monto

Laboratorio de Microbiología $57,623

Material de papelería $4263

Aportación de colaboradores

Concepto Monto

Sin patrocinadores 0$

Universidad Tecnológica de Morelia $57,623

Aportación de alumno

Concepto Monto

Adquirir hongo Trichoderma y $950


Phytophthora C.
Material de papelería $8526.72
Materiales y suministros de oficina

Concepto Monto
Caja lapiceros $55.92
Paquete de hojas blancas $82
2 Calculadoras $668.8
Caja Clips $69
Folder carta paquete $149
Plumones $32
Impresiones $100
Computadora $7000
2 Reglas $30
Tabla de Madera con clip $32
Lápices $10
Gomas $24
Sacapuntas $6
Marcadores $28
Engrapadora $191.50
Caja grapas $48.50

Materiales y suministros de producción


Concepto Monto
Hongo Trichoderma $100
Cajas Petri $260
Medios de cultivo $287
Mecheros $72
Matraces 5 $575
Vasos de precipitado 5 $500
Acetato de etilo $100
Varillas de vidrio $14
Rotavapor $23,000
Papel filtro $50
Hongo Phytophthora $50
Azas de inoculo $250
2 batas de laboratorio $500
Guantes de nitrilo $184
Garrafa de alcohol $600
Atomizadores $20
Molino $4,750
papel Whatman GF/A $420
Bomba de vacío $4229
detector de ionización de flama (FID) $7730
Centrifuga $1800
Autoclave $13,500
Garrafa agua destilada $285
Agitador orbital (Shaker) $12,000
2 Papel secante $60
Balanza analítica $7,620
Incubadora $3,790