Peptides et protéines

I. Introduction
 Les protéines sont des macromolécules : molécules longues avec de PM importants.
 Constituées de C, H, N O et parfois S et P.
 La protéine est un enchaînement d'acides aminés liés par liaison peptidique.
 Importance quantitative et fonctionnelle : catégorie de macromolécules ayant les rôles les plus importants
o Molécules les plus abondantes dans les C donc de l'organisme humain = représentent 50% du poids sec
o Classe de protéines importante (% élevé de :
 = enzymes !!! ce sont des protéines
 Aussi, pour agir, les médicaments doivent se fixer au niv de récepteurs (transmembranaires ou nucléaires)
qui sont également des protéines
 rôle de transporteur dans le sang comme l'albumine et globuline = pales protéines qui vont transporter
médoc et substances endogènes, anticorps…)
 interviennent également dans certaines maladies génétiques (anomalies des protéines à l'origine de certaines
pathologies)
 Propriétés fonctionnelles très différentes

On parle de :

Peptides Protéines
<100 aa >100 aa
Oligopeptides Ou Polypeptides de PM > 10.000
Polypeptides

Peptides et protéines se différencient par la taille !

Les peptides sont constitués d'oligopeptides : une dizaine d'acides aminés. Au-delà on parle de polypeptides.
Les protéines sont des polypeptides de haut PM.

 Composés de L-acides aminés (de la série L essentiellement)

 Polypeptide : fait référence à l’enchaînement des ac. aminés = structure primaire il existe différentes structure : primaire…
 Protéine : se réfère à la chaîne d'acides aminés après repliement (et modification) = à la structure biologique--ment active
(tertiaire , quaternaire  organisation en 3 dimensions, configuration espace, arrangement entre protéines)

Classification des protéines :

 Selon fonction (ex: lipoprotéines, glycoprotéines…)
 Par la composition chimique :
o Protéines simples ou holoprotéines
o Protéines complexes ou hétéroprotéines = 2 parties distinctes : partie protéique + gp prosthétique
 hémoprotéines (hème) – nucléoprotéines (acides nucléiques) – glycoprotéines (glucides) lipoprotéines
(lipides) – phosphoprotéines (P) – métalloprotéines (métallo)
 Par la forme :

Protéines fibreuses/fibrillaires Protéines globulaires = sphéroprotéines

Peu solubles, on parle de scléroprotéines Solubles, de forme arrondie
Protéines de structure Ou Fonctions biologiques
Ex: collagène, fibrinogène, kératine, etc. Ex : enzymes, [albumines, globulines (alpha)
= solubles, dans le sang = protéines sériques], histones

+ protéines membranaires

 Synthétisées dans le cytoplasme et dans le RE lors de la traduction des ARN messagers (cf biologie cellulaire)

1
Protide Acide aminé ; corps qui libère un tel acide (peptides, protéines…).
 Les composés protidiques sont constitués d'acides aminés (éléments de base).
 Sous le terme de protides, on regroupe à la fois les protéines, les peptides et les acides aminés.
 Les acides aminés sont au nombre de 20 et sont les constituants de base des protéines et des peptides.
 Les peptides sont constitués d'une dizaine d'acides aminés.
 Les protéines sont un assemblage complexe et ordonné d'acides aminés.

Les acides aminés essentiels (AAE)

RAPPEL : La structure chimique des protéines comprend des acides aminés dont huit sont appelés essentiels (AAE) car notre
organisme ne sachant pas les fabriquer, ils doivent être obligatoirement fournis par l'alimentation. Il s'agit de l'isoleucine, la
leucine, la lysine, la méthionine, la phénylalanine, la thréonine, le tryptophane et la valine. Dans l'alimentation, le déficit de l'un de
ces acides aminés essentiels empêche l'organisme d'utiliser les sept autres.

Les composés protidiques ou protides regroupent les acides aminés, peptides et protéines. L'élément de base est l'AA.
L'association d'AA ⟹ peptide ou polypeptides et leur sous classes. Holoprotéines (que des protéines) / hétéroprotéines.

L'hydrolyse coupe les liaisons peptidiques (entre 2 acides aminés) de la chaîne peptidique des peptides et des protéines qui sont
hydrolysables (l'hydrolyse libère les AA et dans le cas des hétéroprotéines le groupement prosthétique en plus), elle permet donc
de redonner les différents acides aminés constitutifs (qui eux ne seront pas sensible à l'hydrolyse car élément de base).

II. Liaison peptidique

Définition

 La liaison peptidique s'établit entre deux acides aminés. Elle est formée pendant l'étape de traduction
 La liaison peptidique est une liaison amide résultant d'une déshydratation entre le groupement carboxyle d'un AA et le
groupement amine d'un autre AA
o L'un des AA implique son groupement acide et l'autre son groupement aminé provoquant une déshydratation =
élimination de H2O, ici avec formation de la liaison amide COOH NH2)
 Un acide aminé est donc impliqué dans 2 liaisons peptidiques (d'une part avec son groupement aminé, de l'autre avec son
groupement acide). Dans une chaîne peptidique, il restera une fonction COOH : acide aminé C terminal et fonction NH2 libre :
acide aminé N terminal
o Liaison covalente, très stable (> ester) liaison ester. Ex: pour les acides gras de type triglycérides (liaison ester avec glycérol :
 AA N-terminal et AA C-terminal sensibles à hydrolyse pour libérer AG de la molécule) mais stable
 Par convention, lecture en partant de l’extrémité N-terminale (à gauche) vers l’extrémité C-terminale (à droite)
o on commence par lire en partant de l'extrémité N -terminale libre en citant les AA (de gauche à droite)

2
 COOH NH2

Les peptidases sont les enzymes qui vont venir couper la liaison peptidique.

Exemple d’un tétra-peptide

Glycine = plus petit AA

Structure intermédiaire entre simple et double liaisons car

échanges entre les e- libres de la liaison carbonyle et le doublet
Structure de la liaison de l'azote = équilibre = rigidité de la liaison, ce qui en fait des
macromolécules solides
 Liaison plane, rigide et polaire
 Caractère de double liaison partielle
o Équilibre entre 2 formes mésomériques
→ Rigidité de la liaison
 CO et NN sont parallèles Ces 4 atomes et les 2 C α sont coplanaires
o Peu de mobilité / torsion au niv de cette double liaison.
 Conformation trans en général. Selon position des 2C α

3
 Hydrolyse : les protéines sont sensibles à l'hydrolyse

La liaison amide est plus stable que la liaison ester. Hydrolyse chimique (faite in vitro à la paillasse ou pour réaction de synthèse
de molécule ou pour couper la molécule pour déterminer les AA de la protéine : enchainement dans bon ordre des AA) méthode qui
enlève un par un les AA par hydrolyse = acide chlorhydrique 6N pendant 1h pour hydrolyser liaison. Hydrolyse chimique pas faite
dans organisme et plus complexe.

 Hydrolyse chimique
- Des acides minéraux fort comme HCl 6N hydrolysent la liaison peptidique
- Le bromure de cyanogène (BrCn) coupe liaisons à certains points spécifiques : carbonyle des méthionines. Il clive la méthionine
côté C-terminal. (identifier un AA pour mettre en évidence les méthionines)

Importance de la dénaturation : c'est en faisant agir des dénaturants (ils sont nombreux et peuvent être physiques ou chimiques)
sur des protéines que l'on va pouvoir les séquencer. On utilise certain de ces agents dénaturants pour obtenir une structure primaire,
utile au séquençage des protéines (détermination de l'ordre des acides aminés dans la chaine peptidique).

 Hydrolyse enzymatique par enzyme protéolytique ou protéase

Des enzymes protéolytiques (= qui hydrolyse des protéines) ou protéases (niveau du système digestif) sont des catalyseurs très
efficaces pour cliver la liaison peptidique.

Les peptidases (ou protéases ou enzymes protéolytiques) sont des enzymes qui coupent les liaisons peptidiques des protéines. On
parle alors de coupure protéolytique ou de protéolyse. Ce processus implique l'utilisation d'une molécule d'eau ce qui les classe
parmi les hydrolases.

4
III. Structure des protéines

Structure primaire :
 La structure primaire d'une protéine correspond à sa séquence en AA. Celle-ci est déterminée par les gènes.
 Commence du côté N-terminal (jusqu'à l'extrémité C-terminal)

La structure primaire c'est donc simplement l'enchainement des AA (les uns après autres, commence du côté N-terminal vers le C-
terminal). Cette succession est déterminée d'un point de vue génétique.
L'enchainement dans le bon ordre est important pour faire de la synthèse protéique. Ex : en thérapeutique, les médicaments sont
des peptides (polymères d'AA), des protéines) ! Pour le fonctionnement de la protéine, l'enchainement dans le bon ordre est
essentiel !

 Séquençage des AA : méthode d'Edman (pas à retenir)

 Couplage en milieu alcalin
o Action du PTC à pH 9
(PhénylisoThioCyanate)
→ Formation de PTC-peptide

 Clivage en milieu acide

o Formation de PTC-AA (absorbe dans UV)
et du peptide amputé de son AA terminal
⟹ Protéine de départ moins son AA.. etc jusqu'à ce que l'on
ait tout découpé) comme ça va dans l'ordre à chaque fois on
refait un cycle jusqu'à avoir identifié les AA composant la
protéine

 Identification par chromatographie de l'AA lié au

PTH

 Nouveau traitement du peptide amputé d'un AA

 Séquenceur automatique

5
 Interactions intervenant dans le repliement
des protéines
Ces différents interactions permettent l'arrangement dans l'espace de la protéine. Elles lui donnent sa configuration /structure et donc
permettent l'activité de celle-ci. Par exemple, dans le cas particulier des enzymes, c'est grâce au repliement des enzymes
qu'apparaissent le site de fixation et le site actif ou catalytique, tous deux relativement proches => permettant l'activité enzymatique
 repliements et maintien de la protéine dans une certaine structure
Interactions hydrophobes = effet hydrophobe
→ Entre acides aminés dont les radicaux sont hydrophobes
→ Se regroupent au centre par repliement de la chaîne pour échapper au milieu
naturellement hydrophile.
Les différentes parties hydrophobes s'associent entre elles au centre de la
protéine laissant les parties hydrophiles vers l'extérieur au contact des
parties aqueuses
Interactions ioniques
→ Entre radicaux s'ionisant positivement et négativement.
Certains radicaux chargés +/-, ils s'ionisent en fonction du pH ⇒
interactions ioniques entre eux
Liaisons hydrogènes
→ Entre un doublet non liant porté par un atome et un atome d'hydrogène
relié à un atome électronégatif
Ponts disulfures :
→ Entre deux cystéines (SH), entre deux acides aminés cystéines =>
formation de ponts disulfures (liaisons très fortes, difficilement rompues)

Structure secondaire (pas à retenir)

→ Organisation spatiale d'une section de la protéine

→ Structures répétitives
→ Déterminées par les angles de torsions de la liaison peptidique
o Φ Phi: entre le Cα et l'azote de la liaison peptidique en amont de l'AA (liaison NH-Cα)
o Ψ Psi entre le Cα et le carbone de la liaison peptidique en aval de l'AA (liaison Cα – CO)

Pas beaucoup de torsion possible car qqch de rigide mais petite flexion possible => angle de torsions.
Si on considère un AA il est impliqué dans deux liaisons peptidiques : en aval et en amont => certaine
organisation peptidique à l'origine de la structure secondaire

 Hélices α (pas à retenir)

 Structure la plus fréquente
 Structure compacte
 Enroulement de la chaîne sous forme cylindrique (hélice)
 Pas d’hélice de 5,4 Å soit 3,6AA
 Stabilisée par liaisons H entre l'AA n et n+4 (hélice tous
les : entre 1 AA n et un autre à (n+4))
 Liaisons intra chaines
 Liaisons parallèle à l'axe de l’hélice
→ Hélice extensible et élastique (ex: tissus de collagène
extensible dû aux hélices)
Ce sont toutes les liaisons intra-chaines (au sein d'une même
chaîne) qui vont stabiliser l'hélice.
 AA favorables à formation d’hélice α
o AA volumineux, AA non ou peu polaires
→ stabilisation par liaisons hydrophobes
o Leu Phe, Ala, Trp
 AA déstabilisants
o AA basiques et acides dont les chaînes latérales
sont ionisés

6
 Chaîne latérales oriente vers l’extérieur o Val Ile, Thr : Chaîne latérale ramifiée sur le Cβ
 Hélice a un pas de droite → gène spatiale

 AA entraînant rupture de l’hélice

o Proline rotation Φ bloquée, empêche la
continuité de la structure

 Feuillet plissé β
 Structure étirée
 Liaisons inter-chaînes (entre deux chaînes différentes)
 Distance entre 2 AA : 3,5 Å
 Valeurs des angles Φ et Ψ identiques mais signes opposés → aspect plissé
 Feuillets parallèles ou antiparallèles (orientation des chaînes dans un sens ou dans l'autre)
 Coude β
Permet repliement au niveau de la protéine, permettant à la chaîne de se replier sur elle-même = changement de structure =
bifurcation (feuillet béta => hélice alpha)

 Séquences de 4 AA qui permettent à la chaîne de se replier sur elle-même (changement de direction)

 Structure stabilisée par une liaison hydrogène entre le 1er et 4e résidu d'AA
 Contiennent généralement 1 proline
 Pas d'AA apolaires (que des AA polaires)

Hélice 𝜶

Feuillet plissé 𝜷

7
C'est l'alternance entre ces 2 types de feuillets plissés (parallèle et antiparallèle) qui donne cet aspect plissé

Coude 𝜷

8
 Structure tertiaire

 Arrangement dans l'espace des structures secondaires (hélice alpha, feuillet béta) = structure en 3D
 Résulte du repliement de la chaîne sur elle-même (même type d'interactions que sur les repliements des AA)
 Pour une protéine, une seule structure tertiaire = forme native = forme biologiquement active (structure tertiaire
particulière)
 Interactions faibles (non covalentes) entre AA non contigus
 Ou ponts disulfures (liaison covalente)
 Caractérise les protéines globulaires
 N'est pas figée (car les liaisons sont faibles)

Bases moléculaires de la structure tertiaire Différentes représentations

de la structure tertiaire

Structure 3D de la ribonucléase A

9
 deux types de structure alpha et béta et coude béta permettant le repliement
par endroit !

 Notion de domaine (pas vu)

 Zone globulaire compacte d'une protéine

 Portion de structure commune à plusieurs protéines

 On distingue :
o Domaine articulés
o Domaines détachables
o Domaines fonctionnels

Exemples de domaines : les anticorps (pas vu)

Structure quaternaire

 Assemblage de 2 ou plusieurs chaînes polypeptidiques

 Chaque chaîne = sous unité
 Multimère (unité structurale = monomère*)
 Polypeptidiques identiques ou différents
o Polypeptide homomérique : si toutes les sous unités sont identiques
o Polypeptide hétéromérique : si sous unité différentes
 Sous unité associé par des liaisons non covalentes, parfois ponts disulfures

Ex: récepteurs membranaires permettant de fixer médicament = ce sont des structures quaternaires avec plusieurs sous-unités protéiques.
o Récepteur au GABA dans le système nerveux central : Les récepteurs GABA de type A (GABA A) sont des canaux ioniques des
membranes des neurones qui sont activés par fixation de l'acide γ-aminobutyrique (GABA). Ces récepteurs ionotropes ont une
grande importance en physiologie des mammifères, le GABA étant le principal neurotransmetteur inhibiteur dans le cerveau.
→ Les canaux GABAA sont la cible de plusieurs molécules pharmacologiques telles que les benzodiazépines utilisées pour diminuer
l'anxiété, elles se fixent sur les même récepteurs que GABA.

Exemple de structure quaternaire : acide gras synthétase et hémoglobine

10
IV. Principale fonctions des protéines (classées par fonctions)

Protéines de structures

→ Molécules très importantes en quantité, et ayant de nombreuses fonctions

→ Protéines fibreuses, mécaniquement très solides
→ Insolubles
→ Les principales sont :
o collagène, Protéine très solide. Ex : peuvent être utilisées pour faire des textiles comme la
o kératine, fibroïne sécrétée par le ver à soie utilisée pour faire des tissus.
o élastine
o fibroïne

11
  Collagène

 C'est le constituant majeur du tissu conjonctif (avec possibilité de déformation)

 Rôle de soutien (on en trouve au niveau de la peau, du cartilage et des tendons)
 Unité de base = tropocollagène
o Structure de base qui s'associe pour former des structures plus complexes. Le tropocollagène est une association d'acides
aminées, il résulte de l'association de trois hélices qui s'associent entre elles ⇒ microfibrilles, elles-mêmes s'associent pour
⇒ fibrilles ⇒ fibres : c'est cette association (structures qui établissent des liaisons entre elles ) qui confère cette grand
résistance au collagène
o C'est un enroulement avec pas à droite de 3 hélices très étirées (pas à gauche)
o Superhélice longue et fine (300nm sur 1,5nm)
o S’associe en microfibrille puis fibrille puis fibre (de collagène qui s'associent aussi pour former un faisceau)
 Glycoprotéine (prédominance de la protéine à 90%)
o Contient en majorité glycine et proline (acides aminés constitutifs de la protéine)
o mais aussi hydroxyproline et hydroxylysine → liaisons covalentes entre les fibres → forte résistance à la traction
(acides aminés hydroxylés, avec groupement OH) ⇒ permettent de faire des liaisons suffisamment fortes

 Kératine

 Constituant des phanères : cheveux, ongles (composant que l'on trouve surtout au niv des cheveux/ongles)
 Riches en cystéine → ponts disulfures → stabilité
AA avec un groupement SH formation de ponts disulfures liaisons très solides
entre deux groupements SH
à proximité qui se lient en S – S
Pour qu'il y ait de la résistance il faut qu'il y ait des liaisons fortes (= résistance mécanique) permise par les groupements SH
 Aussi méthionine, alanine, phénylalanine
 Hélice α : 2 hélices ⟹ super hélice ⟹ protofilaments ⟹ microfibrilles ⟹ microfibrilles ⟹ cheveu

 Elastine

 Important au niveau de nos tissus, présent notamment aux niveau de :

o Constituant des ligaments, parois artérielles, peau (derme), alvéoles pulmonaires
 Structure comparable au collagène
 Propriétés élastiques (peut s'étirer fortement jusqu'à limite d'élasticité, peut se déformer et reprendre sa forme initiale)
o Ex: Vasoconstriction-vasodilatation : mécanisme physiologique qui permet la contraction/dilatation des vaisseaux,
intervenant pour réguler la tension artérielle avec le système parasympathique).

 Fibroïne

 Protéine de la soie (produite par vers à soie)

 Feuillet β (antiparallèle) avec liaisons importantes entre les chaînes (fortes ⇒ résistance ⇒ soie)
 Riche en glycine et alanine

 Collagène

Tropocollagène
Il s'agit d'une glycoprotéine formée par l'enroulement de trois hélices gauches α, porteuses de glucide (glucose, galactose),
superenroulées en hélice droite. Le tropocollagène est un assemblage de trois protéines de collagène alpha (alpha1 - alpha1 -
alpha2) en une hélice droite. Les fibres de tropocollagène s'assemblent en une structure appelée fibrille de collagène. L'assemblage
de plusieurs fibrilles de collagène forme la fibre de collagène. Les fibrilles présentent une alternance de phase sombre et claire due
a l'espacement et au décalage des fibres de procollagène.

12
 Organisation des fibres de collagène

1: Faisceau 4: Microfibrille
2: Fibre 5:
Tropocollagène
3: Fibrille 6: 𝛼 hélice
On voit bien les trois hélices enroulées sur elles-mêmes, et
ce sont les groupements (glycine : petits acides aminés) qui
vont permettre la liaison

 Kératine

Organisation de fibres de kératine

 Fibroïne

Les fibroïnes de soie sont des protéines de structure, aussi appelées protéines de soie. Elles appartiennent à la famille des protéines
fibreuses. Leur structure de base est en feuillet bêta. Ces protéines sont formées de trois acides aminés : l'alanine (A), la glycine
(G) et la sérine (S).

13
  Elastine
Structure

Protéines de transport

14
  Hémoglobine et Myoglobine : les 2 protéines qui vont permettre de transporter l'oxygène

 Transport et stockage de l'oxygène (tissu ; hémo / muscle : myo)

o Hémoglobine : protéine transportant l'oxygène jusqu'aux tissus périphériques
o Myoglobine : protéine qui amène l'oxygène au niveau des muscles
 Protéines globulaires et solubles
 Groupement prosthétique : hème (hydrophobe) (4 noyaux pyrole associé entre eux et fer pour liaison)
 Dans les muscles

La myoglobine est une protéine qui transporte l’oxygène dans le cytoplasme des cellules. L’hémoglobine est une protéine qui
transporte l’oxygène dans les globules rouges.

 Albumine
 Principale protéine du plasma (plasma = phases aqueuses du sang et éléments figurés/solubilisés dedans : globules rouges/blancs et
plaquettes). Protéines du plasma sanguin : Albumine / Alpha-globuline / Lipoprotéines
 Protéine globulaire, riche en hélice α, peu de feuillets β
 Transporte surtout des substances hydrophobes (substances endogènes, mais aussi principe actif des médocs qui doit ê transporté
jusqu'aux récepteurs du tissu cible  transport du principe actif jusqu'aux tissus cibles par l'albumine : médocs peu solubles
/!\ insuffisance rénale, défaut de synthèse de protéines ⇒ problème transport
 Maintien de la pression osmotique du plasma (sans, l'eau contenue dans le plasma se diffuserait dans les tissus  œdèmes)

Les parois des vaisseaux sont perméables : œdème/réaction inflammatoire (dû au fait que, sur effet de la réaction inflammatoire,
modification de la perméabilité des vaisseaux)

 Lipoprotéine

 Récepteurs membranaires
 Ils vont permettre la fixation du médicament dessus ⟹ réactions chimiques ⟹ effet thérapeutique
 Forment un pore pour laisser passer par exemple des ions quand la substance endogène s'y fixe
Autres fonctions

 Enzymes
 Catalysent réactions du métabolisme
 Importance des enzymes au niveau du métabolisme (catalyse les réactions, accélère leur vitesse)
 Protéines contractiles ou motrices
 Actine et myosine du muscle lisse
 Tubuline du cytosquelette cellulaire
 Protéines de défense
 Les éléments intervenant au niveau des mécanismes de défense de l'organisme sont essentiellement des protéines
 Immunoglobulines (Ac sécrétés…)
 Complément (= ensemble de protéines au niv du syst immunitaire ⇒ dès qu'il y a une "attaque" : infection/virus/bactéries, de
l'organisme : ces protéines sont sécrétées et libérées dans circulation ⟹ lieu de l'inflammation / signal d'agression au niv de
l'organisme : que ce soit infectieux ou inflammatoire = réaction due défense en mobilisant les protéines du complément (lutte
contre agression)
 Fibrinogène (réparation)
 Thrombine (coagulation du sang) (hémostase, coagulation : avec fibrogène, protéines libérés lors d'une coupure : s'associe
pour former un bouchon = coagulation pour empêcher le sang de couler)
 Protéines régulatrices
 Hormone comme l'insuline (libérés pars les ilots de langerhans du pancréas, favorise le stockage du glucose sous forme de
glycogène pour diminuer glycémie) ou l'hormone de croissance
 Répresseur/activation de l'expression des gènes
 Protéines nutritive et de réserve
 Ovalbumine (oeuf),
 Caséine (lait),
 Ferritine (stock le fer)

APERCU DE TOUTES LES FONCTIONS QU'ON LES PROTEINES DANS ORGANISME

V. Propriétés des protéines

15
 Solubilité

⟶ Protéines fibreuses peu solubles dans eau

⟶ Protéines globulaires solubles (dans le sang, sont solubilisés dans le plasma)

⟶ Influence du pH sur ionisation (sur la solubilité)

o Grande influence du pH sur l'ionisation donc sur la solubilisation si ionisé, se solubilise plus facilement.
Ex: lipides/AG sous forme de sels/savons sont ionisés ⇒ solubilisés ⇒ grande influence du pH sur la solubilisation

⟶ Solubilité minimale au pHi

⟶ Influence de la force ionique (présence de sel dans milieu) sur la solubilité de la protéine

pas à retenir
LogS/S0 = solubiltié

Propriétés optiques

⟶ Absorption dans UV lointain (env 190nm) due à liaison peptidique (liaison chromophore) et à 280 nm si AA aromatique
⟶ Pouvoir rotatoire (dosage possible)
⟶ Diffusion de la lumière (méthode de dosages, mesure taille particule …)

Propriétés osmotiques

(Utilisées pour dialyse = utilisation d'une membrane perméable qui sépare deux milieux de concentration différentes en éléments
différents : mouvement d'eau et des éléments dissous (sels) qui vont se diffuser du milieu le moins concentré vers le plus concentré
pour équilibrer les concentrations. Méthode de séparation pour purifier substance / milieu et séparer composants : avec milieu
tampon).
 Les protéines ne sont pas dialysables
o Ne peuvent pas passer à travers les membranes.
o Si mélangées à d'autres substances celles-ci peuvent passer mais pas les protéines car la plupart sont trop grosses

 Les protéines permettent le maintien de la pression osmotique qui intervient dans échanges cellulaires (maintiennent l'eau
dans le milieu pour qu'elle ne soit pas diffusée à travers les membranes)
La pression osmotique se définit comme la pression minimum qu’il faut exercer pour empêcher le passage d’un solvant d’une
solution moins concentrée à une solution plus concentrée au travers d’une membrane semi-perméable (membrane
hémiperméable). En biophysique, on distingue la pression oncotique = part de la pression osmotique due aux protéines.

Le phénomène d'osmose considère uniquement les échanges entre deux solutions liquides de concentrations différentes en
phases liquides séparés par une paroi semi-perméable. L'osmose est un phénomène de diffusion de la matière, mis en évidence
lorsque des molécules de solvant traversent une membrane semi-perméable séparant deux solutions dont les concentrations en
soluté sont différentes ; le transfert global de solvant se fait alors de la solution
la moins concentrée (milieu hypotonique) vers la solution la plus concentrée
(milieu hypertonique) jusqu'à l'équilibre (milieux isotoniques).

L'osmose est un phénomène physique passif qui a lieu seulement si les solutions
sont séparées par une membrane à perméabilité sélective. Seules les molécules
d'eau traversent la membrane de la solution hypotonique (la plus diluée)
vers la solution hypertonique (solution la plus concentrée) jusqu'à ce que les
solutions soient isotoniques (de même concentrations). On rencontre l'osmose
aussi bien pour la cellule vivante que pour la cellule morte. Si les deux milieux
sont de même concentrations, aucun mouvement d'eau n'est observé : la cellule
est en équilibre osmotique.

16
 Dénaturation (en présence d'agent dénaturant)

 Principe
⟶ Modification de la structure tridimensionnelle sans modification de la structure primaire (enchainement AA)
⟶ Protéines fibreuses plus stables que les protéines globulaires

Ex : peuvent être dénaturées par des médocs inhibiteurs

⟶ La dénaturation (perte de la structure tridimensionnelle) se fait en 2 étapes :

= Perte de la forme spécifique active (réversible) ⟹ état déployé réversible = structure primaire inactive.
o Il y a modification des liaisons pouvant exister entre les différentes parties ⟹ déploiement ⟹ structure primaire,
enchainement des acides aminés = perte de l'activité.
o Etape réversible si on supprime l'agent dénaturant et qu'on remet la protéine dans son milieu.

= Formation de liaisons non spécifiques ⟹ état dénaturé irréversible ⟹ perte définitive de l'activité
= Liaisons fortes maintiennent la protéines avec un arrangement différent = site actif au mauvais endroit donc perte
d'activité par formations de liaisons non spécifiques

 Conséquences de la dénaturation

 Pertes des propriétés biologiques spécifiques : propriétés enzymatiques, hormonales, de transports, immunologiques (not
avec les Ac, si leur structure est dénaturée ⟹ perte propriété de reconnaissance et de fixation)

 Diminution de la solubilité
⟶ Résulte de la modification de répartition des groupements polaires et apolaires
= inversion de la position de ces groupement ⇒ dénaturation
⟶ S'accompagne d'une augmentation de la sensibilité aux attaques enzymatiques

 Agents dénaturants

Agents physiques
- UV, ultrason, température (froid et chaud) Ex: la dénaturation froide (peut dénaturer la protéine également) : protéines
conservés sous forme lyophilisée (pour réinjection)
- Rupture des liaisons H et hydrophobes sous effet de la chaleur

Agents chimiques

- Variation de pH → Rupture des liaisons ioniques

- Détergents (tensioactifs) anioniques et cationiques → Rupture des liaisons hydrophobes

o Tensioactifs : partie hydrophile et lipophile
o Certains sont anioniques ou cationiques donc portent des charges
o Si protéines en contact avec ces détergents, ils peuvent interagir avec liaisons hydrophobes ⇒ rupture

- Solvants organiques → Rupture des liaisons hydrophobes

- Agents réducteurs ou oxydants → Rupture des ponts disulfures

17
 VI. Purification des protéines
Pourquoi purifier ? Difficultés (problème) Solution

→ Étudier les propriétés d'une protéine
→ Déterminer sa séquence en AA (leur
enchaînement au sein de la protéine)
→ Déterminer sa structure tridimensionnelle
(son organisation, dénaturée ou pas ?)
→ Les cellules contiennent souvent
plus de 1000 types de protéines ≠
→ Compliquer d'identifier cette
protéine, de la séparer et de la
purifier parmi toutes les autres
→ Tirer profit des différences de propriétés
physicochimiques et biochimiques des
protéines.

Les différentes propriétés physicochimiques et biochimiques mises à profit

→ Principales caractéristiques des protéines utilisées (déjà décrites) et technique correspondante

Pour isoler certaines protéines on peut le faire en fonction du pHi (isoélectrique) = solubilité minimale
On met le prélèvement à différent pH ⟹ solubilisation/précipitation saline
Focalisation isoélectrique (sur le pHi de la protéine voulue) : la protéine d'intérêt va précipiter (à son pHi)

⟶ La purification comprend 3 étapes :

Extraction de la molécule d’intérêt ⟹ Enrichissement intermédiaire ⟹ Purification finale

(prélèvement, tout en enlevant ce qui (concentration la plus élevée possible (pour la débarrasser de toutes les
n'intéresse pas…) de la protéine d'intérêt = sensibilité impuretés : sels restant dans le milieu
suffisante = augmentation du taux de not.)
protéine voulu)

⟶ Protéine extracellulaire : purification directe

⟶ Protéine intracellulaire : nécessité de libérer le contenu cellulaire en casant les membranes et parois (lyse cellulaire)

⟶ La purification se fait dans tampon (pH adapté dans lequel protéine soluble) ou dans détergent (protéine hydrophobe).

Extraction

 A partir de tissus, cellules, liquides physiologiques

 Lyse osmotique
→ La lyse osmotique est une rupture de la mp provoquée par la pénétration d'eau dans la cellule lorsque celle-ci est plongée dans
une solution hypotonique, solution dans laquelle le solvant (tel qu'un plasma dilué) a une plus faible concentration de soluté (sels,
etc.) que celle dans le milieu cellulaire interne (ou cytoplasme). Dans les conditions hypotoniques, la cellule augmentera son volume.
En d'autres termes, un milieu liquide hypotonique présente une concentration en substance dissoute plus faible: sa
pression osmotique est plus faible, s'opposant en cela à une solution hypertonique. L'état intermédiaire, en équilibre, est
dit isotonique.

18
 o Cellules dans le milieu hypotonique (milieu – concentré que le nôtre = l'eau rentre donc dans les cellules pour
équilibrer les [C] et les fait éclater)
o Addition de détergents non ioniques (isotoniques au plasma : les éléments solubilisés dedans sont aux mêmes
concentrations) ⟹ les cellules n'ont pas de réaction particulière
Si le milieu est hypotonique (- concentré), l'eau rentre dans les cellules pour équilibrer les concentration ⟹ éclatement
des cellules, libération du contenu
/!\ Injections par voie intraveineuse : jamais injecter qqch d'hypotonique par rapport au plasma ⇒ éclatement des
globules rouges

 Utilisation du lysozyme (pour bactéries : dégrade les parois des bactéries)

= protéine globulaire impliquée dans la défense contre les infections bactériennes. Il s'agit d'une glycoside hydrolase (ou
glycosidase) acide sécrétée par les granulocytes et les monocytes. Elle détruit la paroi bactérienne des bactéries à Gram positif
en catalysant l'hydrolyse des peptidoglycanes la constituant. Le lysozyme est un des constituants de l'immunité innée.

 Traitement mécanique souvent nécessaire

o Broyage en présence de billes de verre
o Homogénéiseur à lames
o Presse de French
o Ultrasons

Presse de French Broyeur à billes de verre

Enrichissement

Pour avoir la concentration la plus importante possible de notre protéine : revient à éliminer les protéines qui ne nous intéressent
pas par :

 Centrifugation du lysat
→ Élimination des débris cellulaires
o Les débris ne sont pas solubilisés ⇒ dans le fond
o On récupère le surnageant

Ensuite on sépare la protéine d'intérêt des autres par :

 Précipitation des protéines

o Isoélectrique : se placer au pHi de la Protéine à purifier (celle-ci précipite mais pas les autres)

Rappels :
- Toutes les protéines ont un pHi différent ; on modifie le pH du milieu de sorte à avoir le pHi pour que la protéine voulue
précipite.
- La solubilité dépend du pH (moindre au pHi) mais aussi de la force ionique (soit soluble ou moins soluble = précipitation
de la protéine) donc aussi par :

o Par modification force ionique : utilisation de sels

Ex : sulfate d'ammonium (NH4)2 SO4

Purification et séparation (pas à savoir)

 Dialyse

Les protéines ne sont pas dialysables = pas diffuses à travers membrane semi-perméable pour les plus grosses qui restent dans le
milieu au niveau de la membrane, mais les petites peuvent tout de même dialyser :

 Séparation selon taille moléculaire

19
  Solution de protéine (et de sels) séparée par une membrane poreuse d'une solution de sels à une concentration différente
 Diffusion et équilibre
 Utile pour enlever les sels d'une solution de protéines

 Permet aussi d'éliminer les petites molécules présentes dans les extraits cellulaires :
o composants du milieu de culture
o composés cellulaires

SCHEMA DIALYSE
Ne reste que les grosses protéines
à l’intérieur du sac car ils ne
savent pas traverser travers les
pores.

 Ultrafiltration, semblable à filtration (pas à savoir)

Principe :
 membrane tubulaire avec pores calibrés
 maintien d'une pression avec la pompe pour forcer les petites molécules à passer à travers
les pores
 circulation permanente de liquide en boucle fermé pour réduire le colmatage

Utilisation :
 Concentration des solutions de protéines
 Purification par élimination des protéines de petite masse moléculaire
 Dialyse rapide (1-2h) pour éliminer des sels
 Microfiltration avec des suspensions cellulaires → permet de séparer des cellules microbiennes du milieu de culture

SCHEMA ULTRAFILTRATION

20
  Chromatographie par filtration sur gel
= chromatographie d'exclusion sur gel

On utilise une colonne dans laquelle on va avoir des billes de polymère de certaine porosité : →
les plus petites particules vont les traverser et mettre plus de temps à sortir de la colonne

Principe : les protéines sont séparées selon leur masse moléculaire :

– les plus petites sont plus retenues car peuvent pénétrer à l’intérieur des pores
– les plus grosses passent à travers les billes de support sans pénétrer dans les pores et
migrent plus vite

 Chromatographie par échange d’ions

 Séparation en fonction de la charge de la protéine au pH de la chromatographie : lavage puis élution

 Chromatographie d’affinité

 Utilisation d'affinité spécifique :

o Substrat – Enzyme
o Antigène – Anticorps
o Métal – Métalloprotéine
o Sucre – Lectine
o Hormone – Récepteurs

 Chromatographie par interactions hydrophobes

On va jouer sur le support. Puis sur la concentration en sel afin de stabiliser les interactions, ensuite on va les déstabiliser de plus
en plus et enfin, diminuer la concentration pour que les interactions ne tiennent plus et que toutes les protéines soient séparées.

 Electrophorèse

21
  Séparation par migration dans un champ électrique
 Migration dépend de :
o La charge et la taille de la protéine
o Du support (gel papier, acétate de cellulose, …)
 Les protéines les + chargées au pH du tampon migrent le +
 Les protéines de faible masse moléculaire migrent le +
 Puis fixation par un colorant.

 Cas de l’électrophorèse SDS-PAGE

Principe :
 On dénature les protéines avec un détergent : le dodécyl sulfate de sodium (SDS)
→ Toutes les protéines sont charges négativement
→ La migration se fait uniquement selon la masse moléculaire (les petites molécules migrent beaucoup)
 Étalonnage avec protéines de MM connues permet de déterminer la masse moléculaire

 Focalisation isoélectrique

22
Migration sous l'effet d'un champ électrique mais dans un gradient de pH.

Electrophorèse 2D

VII. Modifications post traductionnelles

23
 Définition

 Modifications chimiques ou biologiques intervenant après l’étape de polymérisation des AA par le ribosome
 Permettent des modifications d'activité
 Sont le plus souvent catalysées par des enzymes
 Étapes :
o Repliement correct pour adopter la structure secondaire ou tertiaire
o Ajouts covalents à la chaîne polypeptidique si nécessaire

Repliement des Protéines

 Nécessite l'intervention de protéines chaperonnes

o Se lient à la protéine à la sortie du ribosome

→ permettent conformation rapide
→ évitent interactions et agrégation entre les protéines
→ évitent dénaturation en cas de stress cellulaire
⟹ permettent passage dans mitochondries

o La plupart sont des protéines de choc thermique = protéines HSP (Heat Choc Protein)
o HSP 60 ou chaperonines
o HSP 70

o Aussi enzymes :
o Isomérase des disulfures protéiques (PDI) → Rupture et reformation des ponts disulfures
o Peptidyl Proline cis trans Isomérase (PPI) → Isomérisation de liaison peptidique au niveau proline

= protéines qui par leur liaison avec d'autres protéines permettent d'imposer à ces
dernières une structure secondaire, tertiaire ou quaternaire spécifique. Certaines
sont induites par la chaleur (choc thermique)
Conformation des protéines naissantes (HSP60)
Transport transmembranaire des protéines, Démantèlement des vésicules →
endosomes (HSP 70), Inhibition des récepteurs nucléaires (HSP90)…

Une protéine chaperon ou chaperons moléculaires est une protéine dont la fonction
est d'assister d'autres protéines dans leur maturation, en évitant la formation
d'agrégats protéiques via les domaines hydrophobes présents sur leur surface lors de leur repliement tridimensionnel = elles aident
au repliement moléculaire correct d'autres protéines. Ces agrégats, dus à des interactions hydrophobes, peuvent être accentués par
le stress. Les protéines chaperons peuvent aussi défaire les agrégats.
Protéines chaperons : les protéines du choc thermique : Les protéines chaperons sont aussi les « protéines de choc thermique »
qui protègent les cellules de l'effet d'un stress, d'où le nom de Hsp (heat shock protein). De manière générale, ces protéines sont
produites dans des conditions stressantes, comme en cas de chaleur, et elles évitent des interactions indésirables entre protéines. Les
protéines de choc thermique ou HSP (Heat shock proteins) sont des protéines synthétisées par l'organisme en réponse à un stress
(température, exposition à des métaux lourds, infections...). Elles ont été regroupées en familles en fonction de leur masse
moléculaire : HSP60, HSP70, HSP 90, HSP110... Les protéines de choc thermique font partie de la famille des chaperons
moléculaires. Elles s'associent à des peptides ou des protéines qui ne sont pas correctement repliés. Les protéines HSP servent à
éviter l'accumulation de protéines incorrectement repliées. En effet, un stress thermique peut avoir comme conséquence de dénaturer
des protéines.

Les protéines HSP peuvent être associées à des maladies chroniques. Par exemple, les tumeurs humaines ont tendance à surexprimer
les protéines de la famille de HSP70.

Chez les eucaryotes, Hsp70 (de masse 70 kDa) est un chaperon moléculaire du cytosol qui se lie à de nombreux polypeptides en
cours de formation. Dans le RE des eucaryotes, la protéine BiP permet le repliement des protéines.

24
 Figure 7.17 : Rôle des chaperons pendant la
traduction. En s'attachant au bout aminé de la chaîné
polypeptidique naissante, des chaperons la
maintiennent dans une conformation déployée jusqu'à
ce que la synthèse de la chaîné s'achève. Une fois
complétée, la chaîné quitte le ribosome et peut se
reployer dans la conformation tridimensionnelle
correcte.

Figure 7.18 : Rôle des chaperons lors du transfert

d'une protéine. Un polypeptide reployé à demi passe
du cytosol à la mitochondrie ; des chaperons du cytosol
stabilisent sa conformation déployée. Les chaperons
mitochondriaux facilitent son transfert dans l'organite,
puis son reploiement définitif.

Figure 7.21 : Réaction catalysée par

l'isomérase des disulfures protéiques
(PDI)
L'isomérase des disulfures protéiques (PDI)
catalyse la rupture des liaisons disulfure,
échangeant ainsi diverses liaisons disulfure
proches dans une chaîne polypeptidique.
L'enzyme forme une liaison disulfure avec
un résidu cystéine du polypeptide puis échange ce groupe disulfure avec un autre résidu cystéine. Dans cet exemple, PDI catalyse
la conversion de liaisons disulfure inappropriées (1-2 et 3-4) en une paire de liaisons disulfure.

Principales modifications post-traductionnelles des protéines (tableau pas à savoir)

 Clivage de la chaine polypeptidique (pro-enzyme)

 Elimination d’acides aminés
 Glycosylation
 Acétylation, hydroxylation, biotinylation, sulfonation
 Glutamylation et glycylation
 Ubiquitinylation
 Ancrage lipidique
 Phosphorylation
 Formation de ponts covalents

25
26
VIII. Propriétés des protéines
Solubilité

 Protéines fibreuse peu solubles dans l'eau

 Protéines globulaires solubles
 Influence du pH sur ionisation
 Solubilité minimale au pHi

 Influence de la force ionique :

Concentration des ions dans le milieu

Propriétés optiques

 Absorption dans UV lointain (≈190nm) due à liaison peptidique et à 280nm si AA aromatique

o On fait un spectre d’absorption
 Pouvoir rotatoire
 Diffusion de la lumière : diffuse a des angles différents

Propriétés osmotiques

 Ne sont pas dialysables

 Développent pression osmotique qui intervient dans les échanges cellulaires

Dénaturation

 Modification de la structure tridimensionnelle sans modification de structure primaire

 Protéines fibreuses plus stables que globulaires

 Dénaturation en 2 étapes

 Perte de forme spécifique (état éployé, réversible)

 Formation de liaisons non spécifiques (état dénaturé irréversible)

 Conséquences de la dénaturation

 Pertes des propriétés biologiques spécifiques

o Enzymatiques, hormonales, de transport, et immunologiques
 Diminution de la solubilité
o Résulte de la modification de répartition des groupements polaires et apolaires
o S'accompagne d'une ↑ de sensibilité aux attaques enzymatiques
 Agents dénaturants

 Agents physiques
o UV, ultrason, température (froid et chaud)
o Rupture des liaisons H et hydrophobes sous effet de la chaleur

27
 Agents chimiques
o Variation de pH : rupture des liaisons ioniques.
o Détergents anioniques et cationiques : rupture des liaisons hydrophobes.
o Solvants organiques : rupture des liaisons hydrophobes.
o Agents réducteurs ou oxydants : rupture des ponts disulfures.

28