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LABORATORIO DE BIOQUIMICA
2013
1
APUNTE
LABORATORIO DE BIOQUIMICA.
AÑO: 2013
Profesor: Manuel Andrés Gutiérrez-Hernández.
2 LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
INDICE.
PRESENTACION.................................................................................................................................... 4
NORMAS DE SEGURIDAD .................................................................................................................... 5
PAUTA DE ELABORACIÓN DE INFORME .............................................................................................. 7
LABORATORIO N° 1. “RECONOCIMIENTO DE GLÚCIDOS” .................................................................. 8
LABORATORIO N° 2. “RECONOCIMIENTO DE LÍPIDOS” .................................................................... 10
LABORATORIO N° 3. “AISLAMIENTO DE CASEÍNA Y LACTOSA”......................................................... 12
LABORATORIO Nº 4. “RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS” .............................................................. 14
LABORATORIO N° 5. “CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS” ................................................................. 16
LABORATORIO N°6. “ENZIMOLOGÍA” ............................................................................................... 18
CONCLUSIONES. ................................................................................................................................ 20
BIBLIOGRAFÍA. ................................................................................................................................... 21
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Facultad de Salud, Deporte y Recreación
Nutrición y Dietética
PRESENTACION
El presente apunte tiene como principal objetivo describir de manera ordenada los contenidos de
los trabajos experimentales a realizarse en los laboratorios de Bioquímica realizados para los
estudiantes de primer año de la carrera de Nutrición y Dietética
El apunte corresponde una recopilación de experiencias prácticas. Éste se organiza en tres partes:
b) Pautas de realización de informes: El estudiante al final del curso deberá ser capaz de
comunicar, analizar y discutir los resultados obtenidos en los trabajos prácticos a través de
un informe de laboratorio, el cual debe cumplir con las pautas analizadas en esta sección.
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NORMAS DE SEGURIDAD
2. Por ningún motivo deje solventes volátiles (acetona, benceno, alcohol, éter etílico,
sulfuro de carbono, etc.) cerca de mecheros encendidos.
4. Nunca caliente sistemas cerrados, si usted lo hace, con toda seguridad explotarán.
5. Los ácidos deben ser manejados con cuidado, sobre todos los concentrados, las
salpicaduras en la ropa se neutralizan con amoníaco diluido o carbonato de sodio.
En el caso de salpicaduras en la piel u ojos deben lavarse con abundante agua en
forma inmediata.
6. Los álcalis tienen igual precaución que los ácidos. Las manchas en la ropa se
neutralizan con ácido acético o ácido clorhídrico diluido y luego con amoníaco
diluido.
7. Siga las instrucciones de su guía de laboratorio; si se indica que añada una gota de
reactivo, agregue una y no dos. Si no entiende, pregunte; no se arriesgue.
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10. No se debe mirar por la boca de los tubos de ensayo o matraces cuando se está
realizando una reacción.
11. Observe atentamente las etiquetas de los reactivos antes de usarlos. Luego de
utilizarlos, déjelos en el lugar correspondiente.
12. Nunca vierta al desagüe del laboratorio: papeles filtros o toalla nova usada, trozos
de vidrio, cerillas apagadas y residuos insolubles (como parafina sólida, metales
etc.), ocupe los cubos de basura. En el caso de líquidos orgánicos viértalos en un
recipiente especialmente adecuado para ello. Los otros líquidos (soluciones ácidas
o básicas) se vierten directamente al desagüe mientras el agua está circulando.
OBLIGACIONES
4. Observar anotar todo lo que ocurra durante la realización del experimento sea lo
previsto o no.
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OBJETIVOS
Conocer un procedimiento clásico para caracterizar la presencia de azúcares
reductores.
PROCEDIMIENTO
Poner en los tubos de ensayo 3 ml de la solución de glucosa, maltosa, lactosa fructosa o
sacarosa (según indique el profesor).
Añadir 1ml de solución de Fehling A (contiene CuSO4) y 1 ml de Fehling B (lleva NaOH
para alcalinizar el medio y permitir la reacción).
Calentar los tubos a la llama del mechero hasta que hiervan.
La reacción será positiva si la muestra se vuelve de color rojo y será negativa si queda
azul o cambia a un tono azul -verdoso.
Observar y anotar los resultados de los diferentes grupos de prácticas con las distintas
muestras de glúcidos.
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OBJETIVOS
Determinar la presencia de sacarosa en una solución problema.
PROCEDIMIENTO
Tomar 3 ml de solución de sacarosa y añadir 10 gotas de HCl diluido.
Calentar a la llama del mechero durante unos 5 minutos.
Dejar enfriar. Neutralizar añadiendo 3 ml de solución alcalina.
Realizar la prueba de Fehling como se indica en el experimento 1.
Observar y anotar los resultados.
OBJETIVOS
Determinar la presencia de almidón, polisacárido con características no reductoras.
PROCEDIMIENTO
Colocar en un tubo de ensayo 3 ml de la solución de almidón.
Añadir 3 gotas de la solución de lugol.
Observar y anotar los resultados.
Calentar suavemente, sin que llegue a hervir, hasta que pierda el color.
Enfriar el tubo de ensayo al grifo y observar cómo, a los 2-3 minutos, reaparece el color
azul.
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2.1. SAPONIFICACIÓN
Las grasas reaccionan en caliente con el hidróxido sódico o potásico descomponiéndose
en los dos elementos que las integran: glicerina y ácidos grasos. Éstos se combinan con los
iones sodio o potasio del hidróxido para dar jabones, que son en consecuencia las sales
sódicas o potásicas de los ácidos grasos. En los seres vivos, la hidrólisis de los triglicéridos
se realiza mediante la acción de enzimas específicos (lipasas) que dan lugar a la formación
de ácidos grasos y glicerina (Adaptación de Universidad de Guanajuato, 2009 & Quesada,
2013).
OBJETIVOS
Elaborar la producción de un jabón.
PROCEDIMIENTO
Colocar en un tubo de ensayo 2 ml de aceite y 2 ml de NaOH al 20%.
Agitar enérgicamente y colocar el tubo al baño María de 20 a 30 minutos.
Pasado este tiempo, se pueden observar en el tubo 3 fases: una inferior clara que
contiene la solución de sosa sobrante junto con la glicerina formada, otra intermedia
semisólida que es el jabón formado y una superior lipídica de aceite inalterado.
2.2. TINCIÓN
Los lípidos se colorean selectivamente de rojo-anaranjado con el colorante Sudán III.
OBJETIVOS
Determinar la presencia de lípidos en una solución problema.
PROCEDIMIENTO
Disponer en una gradilla 2 tubos de ensayo colocando en ambos 2 ml de aceite.
Añadir a uno de los tubos 4-5 gotas de solución alcohólica de Sudán III.
Al otro tubo añadir 4 -5 gotas de tinta roja.
Agitar ambos tubos y dejar reposar.
Observar los resultados: en el tubo con Sudán III todo el aceite tiene que aparecer
teñido, mientras que en el tubo con tinta, ésta se irá al fondo y el aceite no estará
teñido.
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2.3. SOLUBILIDAD
Los lípidos son insolubles en agua. Cuando se agitan fuertemente en ella se dividen en
pequeñísimas gotas formando una emulsión de aspecto lechoso, que es transitoria, pues
desaparece en reposo por reagrupación de las gotitas de grasa en una capa que, por su
menor densidad, se sitúa sobre el agua. Por el contrario, las grasas son solubles en
disolventes orgánicos, como el éter, cloroformo, acetona, benceno, etc.
OBJETIVOS
Determinar la solubilidad de lípidos en una batería de solventes polares y apolares.
PROCEDIMIENTO
Poner 2 ml de aceite en dos tubos de ensayo.
Añadir a uno de ellos 2 ml de agua y al otro 2 ml de éter u otro disolvente orgánico.
Agitar fuertemente ambos tubos y dejar reposar.
Observar los resultados: Se verá cómo el aceite se ha disuelto en el éter y, en cambio
no lo hace en el agua y el aceite subirá debido a su menor densidad.
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OBJETIVOS
Caracterizar el aislamiento de la proteína caseína de la leche.
1. Introducir 200 ml de leche descremada en un vaso ancho de 600 ml. No se debe dejar la
leche en reposo durante mucho tiempo antes de utilizarla, ya que la lactosa puede
convertirse lentamente en ácido láctico, aunque se guarde en frío.
2. Calentar la leche hasta aproximadamente los 40° C y añadir gota a gota una disolución
de ácido acético diluido (1 volumen de ácido acético glacial en 10 volúmenes de agua), con
un cuentagotas (pipeta Pasteur).
3. Agitar continuamente la mezcla con una varilla de vidrio durante todo el proceso de
adición. Continuar añadiendo ácido acético diluido hasta que no precipite más caseína.
Debe evitarse un exceso de ácido porque puede hidrolizarse parte de la lactosa. Agitar la
caseína hasta que se forma una gran masa amorfa.
4. Separar la caseína con ayuda de una varilla o espátula y colocarla en otro vaso.
5. Añadir, inmediatamente, 5 g de carbonato de calcio en polvo al primer vaso (que
contiene el líquido del que se ha separado la caseína).
6. Agitar esta mezcla durante unos minutos y guardarla para utilizarla luego en la siguiente
práctica. Debe utilizarse cuanto antes y durante el mismo período de trabajo. Esta mezcla
contiene lactosa.
7. Filtrar la masa de caseína al vacío durante aproximadamente 15 minutos para separar
todo el líquido que sea posible.
8. Presionar la caseína con una espátula durante la operación de filtrado.
9. Colocar el producto entre varias toallas de papel para ayudar a secar la caseína.
Cambiar el producto por lo menos en tres o cuatro ocasiones, poniendo nuevas toallas de
papel, hasta que la caseína esté completamente seca. Dejar que la caseína se seque
completamente al aire durante uno o dos días y finalmente pesarla.
10. La densidad de la leche es de 1,03 g/ml. Calcular el porcentaje de caseína aislada.
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OBJETIVOS
Caracterizar el aislamiento del azúcar de la leche, lactosa.
1. Calentar la mezcla que se guardaba del experimento anterior a ebullición suave durante
aproximadamente 10 minutos. Esto causará la precipitación casi completa de las
albúminas (proteínas del suero).
2. Filtrar la mezcla caliente al vacío para separar las albúminas precipitadas y el carbonato
de calcio que aún quede.
3. Concentrar el filtrado (transparente), en un vaso de boca ancha de 600 ml con un
mechero Bunsen, hasta aproximadamente 30 ml. Utilizar varias varillas para ayudar a
conseguir una ebullición homogénea y evitar las salpicaduras que se producirían al ir
aumentando el precipitado. También se puede formar espuma, si la mezcla entra en
ebullición con demasiada fuerza. Esto puede controlarse soplando suavemente sobre la
superficie de la disolución de lactosa.
4. Añadir 175 ml de etanol del 95% (lejos de cualquier llama) y 1 ó 2 g de carbón activo a la
disolución caliente.
5. Después de haberlo mezclado todo bien, filtrar la solución caliente al vacío. El filtrado
debe ser transparente. El filtrado puede enturbiarse debido a la cristalización rápida de la
lactosa, después de la filtración al vacío. Si la turbidez aumenta con relativa rapidez al
dejarla en reposo, debe evitarse otra filtración, pues se perdería producto.
6. Pasar la disolución a un matraz Erlenmeyer y dejarla reposar durante la noche o hasta
que se inicie el siguiente período de trabajo. En algunos casos, se requieren varios días
para que la cristalización haya finalizado. La lactosa cristaliza en la pared y en el fondo del
matraz.
7. Desalojar los cristales y filtrarlos al vacío.
8. Lavar el producto con unos pocos mililitros de etanol acuoso frío al 25 %. La lactosa
cristaliza con una molécula de agua, C12H22O11*H2O.
9. Pesar el producto cuando esté completamente seco. La densidad de la leche es de 1,03
g/ml. Con este valor, calcular el porcentaje de lactosa en la leche.
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Las proteínas son las biomoléculas más importantes de los seres vivos. Todas las
estructuras celulares están formadas por proteínas y prácticamente todas las funciones
celulares son realizadas por proteínas. Las enzimas, los transportadores, los anticuerpos,
los receptores, los microtúbulos y los microfilamentos del citoesqueleto, etc, son todas
proteínas. Aparte de sus funciones específicas, las proteínas participan en la regulación
del equilibrio osmótico y tienen capacidad tamponante o reguladora del pH (Adaptación
de Quesada, 2007).
OBJETIVOS
Una vez desarrollada esta actividad práctica los alumnos conocerán algunos métodos
de reconocimiento de las proteínas y sus fundamentos teóricos.
Tubos 1 2 3
NaCl 0,9% p/v ----- ----- 3 ml
SAB 5 mg/ml ----- 3 ml -----
Plasma diluído 3 ml ----- -----
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Leer en el espectrofotómetro a 280 nm (UV) en cubetas de cuarzo. (El vidrio detiene la luz
UV). Comparar resultados y discutir la utilización de tubos con SAB y con la solución de
NaCl.
Tubos 1 2 3
NaCl 0,9% p/v 1 ml 1 ml 2 ml
SAB 5 mg/ml ----- 1 ml -----
Plasma diluído 1 ml ----- -----
Reactivo de
Biuret 4 ml 4 ml 4 ml
Mezclar bien, sin agitar, y leer después de 30 minutos a 540 nm (luz visible) en cubetas de
vidrio. Como alternativa se puede calentar a 50°C en baño de agua por 5 minutos para
desarrollar color y leer después de enfriar en corriente de agua.
Discuta sus resultados e identifique en el procedimiento los tubos con muestra y
estándar. Compare y discuta los resultados obtenidos con ambos métodos (UV y
colorimétrico).
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OBJETIVOS
Una vez desarrollada esta actividad práctica los alumnos conocerán algunos métodos o
procedimientos para determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica.
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PROCEDIMIENTO
Determinación de la concentración total de proteínas plasmáticas de una muestra de
sangre por el método de Biuret utilizando seroalbúmina de bovino (SAB, PM = 66.500)
como estándar. En esta actividad se utilizará plasma diluido 1:20 con NaCl 0.9 % p/v y
solución de SAB 100 ug / mL (ug = microgramo) de acuerdo al siguiente cuadro:
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8
Reactivo de Biuret 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0
Mezclar bien, sin agitar y leer después de 30 minutos a 540 nm en cubetas de vidrio. Se
puede calentar en baño a 50ºC por 5 minutos y leer después de enfriar en agua corriente.
Determinar el contenido de proteínas de la muestra a partir de la curva estándar y a partir
de la Absorbancia promedio calculada por mg de estándar. Compare y discuta sus
resultados. Calcule la concentración total de proteínas del plasma en mg/dl. ¿Cómo
determinaría usted la concentración de hemoglobina de una muestra de sangre?
Infórmese al respecto.
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Las enzimas son biocatalizadores proteicos esenciales para mantener los procesos
metabólicos a velocidades compatibles con la vida, contribuyendo además a su
regulación. Debido a su naturaleza proteica las enzimas pueden modificar su actividad por
cambios de temperatura y pH, factores que pueden alterar la estructura molecular de la
enzima, provocando su desnaturalización. En general una reacción química aumenta su
velocidad de reacción al aumentar la temperatura, pero en el caso de las reacciones
catalizadas por enzimas, este efecto se observa sólo entre 0 y 40 ºC, ya que a
temperaturas mayores la enzima se desnaturaliza debido a la ruptura de enlaces débiles,
principalmente puentes de hidrógeno y la pérdida de su conformación nativa.
Debido también a su naturaleza proteica la enzima presenta numerosos grupos ionizables,
los que derivan de los radicales de sus aminoácidos constituyentes. Las alteraciones del
pH pueden cambiar el grado de ionización de los grupos químicos involucrados en el sitio
activo de la enzima, afectando su actividad catalítica.
Las enzimas son activas en un rango estrecho de pH, con una actividad máxima a un valor
de pH denominado pH óptimo. Por tal motivo la actividad enzimática se mide en presencia
de tampones o amortiguadores de pH (Adaptación de Universidad de Guanajuato, 2009,
Quesada, 2007 & 2013).
OBJETIVOS
Estas actividades prácticas tienen como objetivo que los alumnos:
1. Se familiaricen con los procedimientos de laboratorio para manipular muestras
biológicas
2. Conozcan algunos procedimientos para determinar la actividad de una enzima en
muestras biológicas
3. Comprueben el efecto que tiene en la actividad de una enzima las variaciones de pH y
temperatura
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PROCEDIMIENTO
La amilasa salival es una enzima que rompe específicamente los enlaces glicosídicos α 1-4
de los polisacáridos. La hidrólisis del almidón por amilasa salival da como producto una
mezcla de maltosa, maltotriosa (dextrinas) y glucosa. El almidón es un polisacárido
formado por 2 tipos de cadena: amilasa (lineal), que presenta sólo enlaces α 1-4 y
amilopectina (ramificada), con enlaces α 1-4 y α 1-6. El almidón se reconoce
químicamente por el color azul intenso que desarrolla en presencia de yodo, por lo que la
hidrólisis enzimática del almidón se puede determinar por la pérdida del color azul de una
mezcla de reacción.
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CONCLUSIONES.
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BIBLIOGRAFÍA.
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