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APUNTE

LABORATORIO DE BIOQUIMICA

Facultad de Salud, Deporte y Recreación


Escuela de Nutrición y Dietética
Profesor: Manuel A. Gutiérrez-Hernández

2013

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APUNTE
LABORATORIO DE BIOQUIMICA.

Facultad de Salud, Deporte y Recreación


Escuela de Nutrición y Dietética.

CÁTEDRA: LABORATORIO DE BIOQUIMICA

AÑO: 2013
Profesor: Manuel Andrés Gutiérrez-Hernández.

Licenciado en Bioquímica de la Universidad de Chile


©Doctor en Ciencias Biomédicas de la Universidad de
Chile.
Atiende las cátedras de Química, Bioquímica y
Farmacología en la Facultad de Salud, Deportes y
Recreación de la Universidad Bernardo O´Higgins.

2 LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
INDICE.

PRESENTACION.................................................................................................................................... 4
NORMAS DE SEGURIDAD .................................................................................................................... 5
PAUTA DE ELABORACIÓN DE INFORME .............................................................................................. 7
LABORATORIO N° 1. “RECONOCIMIENTO DE GLÚCIDOS” .................................................................. 8
LABORATORIO N° 2. “RECONOCIMIENTO DE LÍPIDOS” .................................................................... 10
LABORATORIO N° 3. “AISLAMIENTO DE CASEÍNA Y LACTOSA”......................................................... 12
LABORATORIO Nº 4. “RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS” .............................................................. 14
LABORATORIO N° 5. “CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS” ................................................................. 16
LABORATORIO N°6. “ENZIMOLOGÍA” ............................................................................................... 18
CONCLUSIONES. ................................................................................................................................ 20
BIBLIOGRAFÍA. ................................................................................................................................... 21

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Facultad de Salud, Deporte y Recreación
Nutrición y Dietética

PRESENTACION

El presente apunte tiene como principal objetivo describir de manera ordenada los contenidos de
los trabajos experimentales a realizarse en los laboratorios de Bioquímica realizados para los
estudiantes de primer año de la carrera de Nutrición y Dietética

La relevancia de este apunte es consolidar los conocimientos adquiridos en el aula de clases


mediante prácticas experimentales, las cuales han sido planificadas acorde a los contenidos
desarrollados durante la cátedra. Paralelamente, se espera que los estudiantes de Nutrición y
Dietética se familiaricen con el trabajo de laboratorio desarrollando habilidades como son la
observación y análisis de fenómenos biológicos, claves en el entendimiento de asignaturas más
complejas en su perfil académico. Además, es de suma importancia que los alumnos desarrollen la
rigurosidad en las actividades experimentales y la capacidad de trabajar en equipo.

El apunte corresponde una recopilación de experiencias prácticas. Éste se organiza en tres partes:

a) Normas de seguridad de laboratorio. Esta sección es de vital importancia a fin de asegurar


la seguridad de los estudiantes dentro del laboratorio.

b) Pautas de realización de informes: El estudiante al final del curso deberá ser capaz de
comunicar, analizar y discutir los resultados obtenidos en los trabajos prácticos a través de
un informe de laboratorio, el cual debe cumplir con las pautas analizadas en esta sección.

c) Trabajos prácticos: Es fundamental que el estudiante al momento de iniciar cada trabajo


práctico sea capaz de responder qué va a hacer, por qué lo va a hacer y cómo lo va a
hacer y qué resultado espera. Con este efecto se presenta un breve marco teórico
relacionado al experimento, junto con la metodología experimental a desarrollar. La
responsabilidad del estudiante consiste en profundizar los contenidos de cada
laboratorio práctico.

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Nutrición y Dietética

NORMAS DE SEGURIDAD

El laboratorio de bioquímica es, potencialmente, un lugar peligroso, en el que se puede


encontrar material de vidrio frágil, instrumental eléctrico, líquidos inflamables sustancias
tóxicas, etc. Sin embargo, no se debe ser temeroso. El conocimiento de lo que se realiza,
junto al respeto de las normas de seguridad y la adecuada supervisión, hacen del
laboratorio un lugar seguro en el que se puede aprender mucho acerca del mundo
químico-biológico de los organismos vivos.

Los accidentes más frecuentes en los laboratorios de Bioquímica son quemaduras,


lesiones con material corto punzante, explosiones e intoxicaciones y sus causas pueden
deberse a la adquisición de hábitos incorrectos o a la ignorancia de la peligrosidad del
trabajo que se realiza. Entonces, su seguridad e integridad y la de los que lo rodean
dependen de usted (Mutual de seguridad, AChS. 2013).

1. Los experimentos no autorizados pueden tener peligros desconocidos y están


estrictamente prohibidos. Presuma que todos los reactivos químicos son tóxicos,
por lo tanto, no los pruebe, toque o huela a menos que reciba instrucciones
específicas para hacerlo.

2. Por ningún motivo deje solventes volátiles (acetona, benceno, alcohol, éter etílico,
sulfuro de carbono, etc.) cerca de mecheros encendidos.

3. Todas aquellas operaciones que requieren trabajar con líquidos o vapores


corrosivos, tóxicos o molestos (H2S04 fumante, Br2, NH3 concentrado, etc.) se
realizarán en la campana extractora de gases.

4. Nunca caliente sistemas cerrados, si usted lo hace, con toda seguridad explotarán.

5. Los ácidos deben ser manejados con cuidado, sobre todos los concentrados, las
salpicaduras en la ropa se neutralizan con amoníaco diluido o carbonato de sodio.
En el caso de salpicaduras en la piel u ojos deben lavarse con abundante agua en
forma inmediata.

6. Los álcalis tienen igual precaución que los ácidos. Las manchas en la ropa se
neutralizan con ácido acético o ácido clorhídrico diluido y luego con amoníaco
diluido.

7. Siga las instrucciones de su guía de laboratorio; si se indica que añada una gota de
reactivo, agregue una y no dos. Si no entiende, pregunte; no se arriesgue.

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8. Preste atención a su trabajo, no bromee y distraiga a sus compañeros. No se pasee


por el laboratorio, ni haga movimientos bruscos. EVITE ACCIDENTES.
9. Las personas de pelo largo, deben atarlo detrás de la nuca durante la sesión de
laboratorio.

10. No se debe mirar por la boca de los tubos de ensayo o matraces cuando se está
realizando una reacción.

11. Observe atentamente las etiquetas de los reactivos antes de usarlos. Luego de
utilizarlos, déjelos en el lugar correspondiente.

12. Nunca vierta al desagüe del laboratorio: papeles filtros o toalla nova usada, trozos
de vidrio, cerillas apagadas y residuos insolubles (como parafina sólida, metales
etc.), ocupe los cubos de basura. En el caso de líquidos orgánicos viértalos en un
recipiente especialmente adecuado para ello. Los otros líquidos (soluciones ácidas
o básicas) se vierten directamente al desagüe mientras el agua está circulando.

OBLIGACIONES

1. Cumplir con todas las normas establecidas en el Reglamento específico de


laboratorio.

2. Conocer el fundamento teórico del trabajo de Laboratorio.

3. Esquematizar o planificar el desarrollo del trabajo práctico.

4. Observar anotar todo lo que ocurra durante la realización del experimento sea lo
previsto o no.

5. Asear y ordenar todo el material que haya usado en la sesión de Laboratorio. La


limpieza del material es indispensable para el desarrollo correcto del trabajo
práctico. El material de vidrio puede ser lavado con agua, detergente o mezcla
sulfocrómica según corresponda; enjuague con abundante agua potable y luego
con agua destilada. El material limpio debe dejarse sobre papel filtro u otro
material absorbente (toalla nova). Nunca seque el material de vidrio con paños de
género.

6. Traer a cada sesión de Laboratorio la guía de trabajos prácticos, delantal blanco,


fósforos y cuaderno de anotaciones.

7. Llegar puntualmente al laboratorio. No se admiten alumnos atrasados.

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PAUTA DE ELABORACIÓN DE INFORME

El objeto de la creación de informes es instruir a los alumnos en la capacidad de


comunicar ideas y resultados a través de un medio escrito. Un informe es el reflejo del
trabajo en laboratorio; un laboratorio bien realizado se traducirá en un informe claro.
Además un buen informe puede ser entendido y utilizado por cualquier persona. En
orden a alcanzar una comunicación efectiva, es recomendable seguir el siguiente formato:

1. Portada. Debe incluir el Nombre de la Institución (Universidad Bernardo O´Higgins), el


Título del Laboratorio, Nombre de Integrantes y Fecha de la Experiencia.

2. Tabla de Contenidos (Índice).

3. Introducción. Presenta antecedentes relacionados directamente con el trabajo


práctico, y una breve descripción del experimento a realizar. Esta sección no debe
exceder de una página.

4. Objetivos. Definición clara de la motivación de la experiencia.

5. Procedimiento Experimental. Esta sección debe incluir una descripción de materiales


y reactivos, junto con las metodologías empleadas en el práctico.

6. Resultados. Presentación de los resultados obtenidos, en la forma de Tablas y/o


Gráficos. Tablas y Gráficos deben ser numerados secuencialmente, con un número de
Figura en el caso de Gráficos. Deben identificarse claramente las variables contenidas
en el Gráfico o Tabla, con las unidades correspondientes. Los gráficos además deben
exponer claramente variables asignadas a cada eje, escalas, puntos experimentales e
identificación de curvas.

7. Discusión. Sección dedicada a un análisis profundo de los resultados obtenidos.

8. Conclusiones. ¿El trabajo práctico cumplió los objetivos propuestos? En caso


contrario, plantear observaciones o sugerencias orientadas a alcanzar los objetivos
propuestos.

9. Referencias. Autor(es) (Apellido, Nombre). Nombre de Texto. Edición. Lugar de


Edición, Editorial, Año de Edición. Ejemplo: Chang, Raymond. Química. Séptima
Edición. México. McGraw-Hill. 2002.

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LABORATORIO N° 1. “RECONOCIMIENTO DE GLÚCIDOS”

1.1. ESTUDIO DE AZÚCARES REDUCTORES


Los monosacáridos y la mayoría de los disacáridos poseen poder reductor, que deben al
grupo carbonilo que tienen en su molécula. Este carácter reductor puede ponerse de
manifiesto por medio de una reacción redox llevada a cabo entre ellos y el sulfato de
Cobre (II). Las soluciones de esta sal tienen color azul. Tras la reacción con el glúcido
reductor se forma óxido de Cobre (I) de color rojo. De este modo, el cambio de color
indica que se ha producido la citada reacción y que, por lo tanto, el glúcido presente es
reductor (Adaptación de Quesada, 2013).

OBJETIVOS
 Conocer un procedimiento clásico para caracterizar la presencia de azúcares
reductores.

PROCEDIMIENTO
 Poner en los tubos de ensayo 3 ml de la solución de glucosa, maltosa, lactosa fructosa o
sacarosa (según indique el profesor).
 Añadir 1ml de solución de Fehling A (contiene CuSO4) y 1 ml de Fehling B (lleva NaOH
para alcalinizar el medio y permitir la reacción).
 Calentar los tubos a la llama del mechero hasta que hiervan.
 La reacción será positiva si la muestra se vuelve de color rojo y será negativa si queda
azul o cambia a un tono azul -verdoso.
 Observar y anotar los resultados de los diferentes grupos de prácticas con las distintas
muestras de glúcidos.

1.2. HIDRÓLISIS DE LA SACAROSA


La sacarosa es un disacárido que no posee carbonos anoméricos libres por lo que carece
de poder reductor y la reacción con el licor de Fehling es negativa, tal y como ha quedado
demostrado en el experimento 1. Sin embargo, en presencia de HCl y en caliente, la
sacarosa se hidroliza, es decir, incorpora una molécula de agua y se descompone en los
monosacáridos que la forman, glucosa y fructosa, que sí son reductores. La prueba de que
se ha verificado la hidrólisis se realiza con el licor de Fehling y, si el resultado es positivo,
aparecerá un precipitado rojo. Si el resultado es negativo, la hidrólisis no se ha realizado

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correctamente y si en el resultado final aparece una coloración verde en el tubo de ensayo


se debe a una hidrólisis parcial de la sacarosa.

OBJETIVOS
 Determinar la presencia de sacarosa en una solución problema.

PROCEDIMIENTO
 Tomar 3 ml de solución de sacarosa y añadir 10 gotas de HCl diluido.
 Calentar a la llama del mechero durante unos 5 minutos.
 Dejar enfriar. Neutralizar añadiendo 3 ml de solución alcalina.
 Realizar la prueba de Fehling como se indica en el experimento 1.
 Observar y anotar los resultados.

1.3. INVESTIGACIÓN DE POLISACÁRIDOS (ALMIDÓN)


El almidón es un polisacárido vegetal formado por dos componentes: la amilosa y la
amilopectina. La primera se colorea de azul en presencia de yodo debido no a una
reacción química sino a la adsorción o fijación de yodo en la superficie de la molécula de
amilosa, lo cual sólo ocurre en frío. Como reactivo se usa una solución denominada lugol
que contiene yodo y yoduro potásico. Como los polisacáridos no tienen poder reductor, la
reacción de Fehling da negativa.

OBJETIVOS
 Determinar la presencia de almidón, polisacárido con características no reductoras.

PROCEDIMIENTO
 Colocar en un tubo de ensayo 3 ml de la solución de almidón.
 Añadir 3 gotas de la solución de lugol.
 Observar y anotar los resultados.
 Calentar suavemente, sin que llegue a hervir, hasta que pierda el color.
 Enfriar el tubo de ensayo al grifo y observar cómo, a los 2-3 minutos, reaparece el color
azul.

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LABORATORIO N° 2. “RECONOCIMIENTO DE LÍPIDOS”

2.1. SAPONIFICACIÓN
Las grasas reaccionan en caliente con el hidróxido sódico o potásico descomponiéndose
en los dos elementos que las integran: glicerina y ácidos grasos. Éstos se combinan con los
iones sodio o potasio del hidróxido para dar jabones, que son en consecuencia las sales
sódicas o potásicas de los ácidos grasos. En los seres vivos, la hidrólisis de los triglicéridos
se realiza mediante la acción de enzimas específicos (lipasas) que dan lugar a la formación
de ácidos grasos y glicerina (Adaptación de Universidad de Guanajuato, 2009 & Quesada,
2013).

OBJETIVOS
 Elaborar la producción de un jabón.

PROCEDIMIENTO
 Colocar en un tubo de ensayo 2 ml de aceite y 2 ml de NaOH al 20%.
 Agitar enérgicamente y colocar el tubo al baño María de 20 a 30 minutos.
 Pasado este tiempo, se pueden observar en el tubo 3 fases: una inferior clara que
contiene la solución de sosa sobrante junto con la glicerina formada, otra intermedia
semisólida que es el jabón formado y una superior lipídica de aceite inalterado.

2.2. TINCIÓN
Los lípidos se colorean selectivamente de rojo-anaranjado con el colorante Sudán III.

OBJETIVOS
 Determinar la presencia de lípidos en una solución problema.

PROCEDIMIENTO
 Disponer en una gradilla 2 tubos de ensayo colocando en ambos 2 ml de aceite.
 Añadir a uno de los tubos 4-5 gotas de solución alcohólica de Sudán III.
 Al otro tubo añadir 4 -5 gotas de tinta roja.
 Agitar ambos tubos y dejar reposar.
 Observar los resultados: en el tubo con Sudán III todo el aceite tiene que aparecer
teñido, mientras que en el tubo con tinta, ésta se irá al fondo y el aceite no estará
teñido.

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2.3. SOLUBILIDAD
Los lípidos son insolubles en agua. Cuando se agitan fuertemente en ella se dividen en
pequeñísimas gotas formando una emulsión de aspecto lechoso, que es transitoria, pues
desaparece en reposo por reagrupación de las gotitas de grasa en una capa que, por su
menor densidad, se sitúa sobre el agua. Por el contrario, las grasas son solubles en
disolventes orgánicos, como el éter, cloroformo, acetona, benceno, etc.

OBJETIVOS
 Determinar la solubilidad de lípidos en una batería de solventes polares y apolares.

PROCEDIMIENTO
 Poner 2 ml de aceite en dos tubos de ensayo.
 Añadir a uno de ellos 2 ml de agua y al otro 2 ml de éter u otro disolvente orgánico.
 Agitar fuertemente ambos tubos y dejar reposar.
 Observar los resultados: Se verá cómo el aceite se ha disuelto en el éter y, en cambio
no lo hace en el agua y el aceite subirá debido a su menor densidad.

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LABORATORIO N° 3. “AISLAMIENTO DE CASEÍNA Y LACTOSA”

OBJETIVOS
 Caracterizar el aislamiento de la proteína caseína de la leche.

3.1. AISLAMIENTO DE LA CASEINA

1. Introducir 200 ml de leche descremada en un vaso ancho de 600 ml. No se debe dejar la
leche en reposo durante mucho tiempo antes de utilizarla, ya que la lactosa puede
convertirse lentamente en ácido láctico, aunque se guarde en frío.
2. Calentar la leche hasta aproximadamente los 40° C y añadir gota a gota una disolución
de ácido acético diluido (1 volumen de ácido acético glacial en 10 volúmenes de agua), con
un cuentagotas (pipeta Pasteur).
3. Agitar continuamente la mezcla con una varilla de vidrio durante todo el proceso de
adición. Continuar añadiendo ácido acético diluido hasta que no precipite más caseína.
Debe evitarse un exceso de ácido porque puede hidrolizarse parte de la lactosa. Agitar la
caseína hasta que se forma una gran masa amorfa.
4. Separar la caseína con ayuda de una varilla o espátula y colocarla en otro vaso.
5. Añadir, inmediatamente, 5 g de carbonato de calcio en polvo al primer vaso (que
contiene el líquido del que se ha separado la caseína).
6. Agitar esta mezcla durante unos minutos y guardarla para utilizarla luego en la siguiente
práctica. Debe utilizarse cuanto antes y durante el mismo período de trabajo. Esta mezcla
contiene lactosa.
7. Filtrar la masa de caseína al vacío durante aproximadamente 15 minutos para separar
todo el líquido que sea posible.
8. Presionar la caseína con una espátula durante la operación de filtrado.
9. Colocar el producto entre varias toallas de papel para ayudar a secar la caseína.
Cambiar el producto por lo menos en tres o cuatro ocasiones, poniendo nuevas toallas de
papel, hasta que la caseína esté completamente seca. Dejar que la caseína se seque
completamente al aire durante uno o dos días y finalmente pesarla.
10. La densidad de la leche es de 1,03 g/ml. Calcular el porcentaje de caseína aislada.

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OBJETIVOS
 Caracterizar el aislamiento del azúcar de la leche, lactosa.

3.2. AISLAMIENTO DE LA LACTOSA

1. Calentar la mezcla que se guardaba del experimento anterior a ebullición suave durante
aproximadamente 10 minutos. Esto causará la precipitación casi completa de las
albúminas (proteínas del suero).
2. Filtrar la mezcla caliente al vacío para separar las albúminas precipitadas y el carbonato
de calcio que aún quede.
3. Concentrar el filtrado (transparente), en un vaso de boca ancha de 600 ml con un
mechero Bunsen, hasta aproximadamente 30 ml. Utilizar varias varillas para ayudar a
conseguir una ebullición homogénea y evitar las salpicaduras que se producirían al ir
aumentando el precipitado. También se puede formar espuma, si la mezcla entra en
ebullición con demasiada fuerza. Esto puede controlarse soplando suavemente sobre la
superficie de la disolución de lactosa.
4. Añadir 175 ml de etanol del 95% (lejos de cualquier llama) y 1 ó 2 g de carbón activo a la
disolución caliente.
5. Después de haberlo mezclado todo bien, filtrar la solución caliente al vacío. El filtrado
debe ser transparente. El filtrado puede enturbiarse debido a la cristalización rápida de la
lactosa, después de la filtración al vacío. Si la turbidez aumenta con relativa rapidez al
dejarla en reposo, debe evitarse otra filtración, pues se perdería producto.
6. Pasar la disolución a un matraz Erlenmeyer y dejarla reposar durante la noche o hasta
que se inicie el siguiente período de trabajo. En algunos casos, se requieren varios días
para que la cristalización haya finalizado. La lactosa cristaliza en la pared y en el fondo del
matraz.
7. Desalojar los cristales y filtrarlos al vacío.
8. Lavar el producto con unos pocos mililitros de etanol acuoso frío al 25 %. La lactosa
cristaliza con una molécula de agua, C12H22O11*H2O.
9. Pesar el producto cuando esté completamente seco. La densidad de la leche es de 1,03
g/ml. Con este valor, calcular el porcentaje de lactosa en la leche.

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LABORATORIO Nº 4. “RECONOCIMIENTO DE PROTEÍNAS”

Las proteínas son las biomoléculas más importantes de los seres vivos. Todas las
estructuras celulares están formadas por proteínas y prácticamente todas las funciones
celulares son realizadas por proteínas. Las enzimas, los transportadores, los anticuerpos,
los receptores, los microtúbulos y los microfilamentos del citoesqueleto, etc, son todas
proteínas. Aparte de sus funciones específicas, las proteínas participan en la regulación
del equilibrio osmótico y tienen capacidad tamponante o reguladora del pH (Adaptación
de Quesada, 2007).

OBJETIVOS
 Una vez desarrollada esta actividad práctica los alumnos conocerán algunos métodos
de reconocimiento de las proteínas y sus fundamentos teóricos.

4.1. Reconocimiento de proteínas plasmáticas


El plasma sanguíneo tiene un contenido de proteínas de aproximadamente 7 g/100 ml
(g/dl), de los cuales aproximadamente 4 g corresponden a albúmina y el resto está
constituido por anticuerpos, factores de coagulación, apoproteínas de las lipoproteínas,
enzimas proteicas, etc. Este contenido de proteínas puede variar de acuerdo a las
condiciones nutricionales o el estado de salud del individuo.

a) Reconocimiento por absorbancia a 280 nm de luz ultravioleta (UV).


Las proteínas absorben luz ultravioleta a 280 nm, longitud de onda a la que absorben los
aminoácidos aromáticos (triptófano, tirosina y fenilalanina) de las proteínas,
especialmente el grupo indol de triptófano. Esta propiedad se puede aprovechar para
reconocer la presencia de proteínas. En esta actividad se utilizará plasma (u ovoalbúmina)
diluido 1: 20 con suero fisiológico (NaCl 0.9 % p/v), una solución de seroalbúmina de
bovino (SAB) 5 mg/ml y una solución de NaCl 0.9 % p/v, según el cuadro siguiente:

Tubos 1 2 3
NaCl 0,9% p/v ----- ----- 3 ml
SAB 5 mg/ml ----- 3 ml -----
Plasma diluído 3 ml ----- -----

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Leer en el espectrofotómetro a 280 nm (UV) en cubetas de cuarzo. (El vidrio detiene la luz
UV). Comparar resultados y discutir la utilización de tubos con SAB y con la solución de
NaCl.

b) Reconocimiento de proteínas con el reactivo de Biuret (método colorimétrico)


Este método se basa en la formación de un complejo coloreado entre el ión Cu +2 del
reactivo y los nitrógenos del grupo funcional amida del enlace peptídico. Por lo tanto este
reactivo reconoce específicamente la presencia de enlaces peptídicos. Se utiliza como
blanco el reactivo de Biuret a la misma concentración de los tubos muestra y estándar.
Preparar los siguientes tubos:

Tubos 1 2 3
NaCl 0,9% p/v 1 ml 1 ml 2 ml
SAB 5 mg/ml ----- 1 ml -----
Plasma diluído 1 ml ----- -----
Reactivo de
Biuret 4 ml 4 ml 4 ml

Mezclar bien, sin agitar, y leer después de 30 minutos a 540 nm (luz visible) en cubetas de
vidrio. Como alternativa se puede calentar a 50°C en baño de agua por 5 minutos para
desarrollar color y leer después de enfriar en corriente de agua.
Discuta sus resultados e identifique en el procedimiento los tubos con muestra y
estándar. Compare y discuta los resultados obtenidos con ambos métodos (UV y
colorimétrico).

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LABORATORIO N° 5. “CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS”

La determinación colorimétrica cuantitativa de una sustancia se basa en la capacidad de


ésta para absorber selectivamente ciertas longitudes de onda de la luz incidente. La
cantidad de luz absorbida es directamente proporcional al espesor del medio y a la
concentración de la sustancia presente. De esta manera, si se mantiene constante el
espesor del medio, la absorción de luz por una sustancia disuelta en un medio
transparente (Ej. agua) será proporcional a su concentración molar.
Estos principios están contenidos en las leyes de Lambert – Beer y están expresadas en la
siguiente ecuación: log Io/ I = E*c*l o DO = E*c*l, donde DO es la Densidad Óptica o
Absorbancia de la sustancia, E es el coeficiente de extinción molar, c es la concentración e
l es el espesor, siendo éste último igual a 1 cm. El coeficiente E se expresa en litros/M cm y
es numéricamente igual a la DO de una solución 1M (1 Molar) de concentración.
Si las sustancias siguen la ley de Lambert-Beer, presentan una relación lineal entre DO y
concentración. Por otro lado si la relación entre DO y concentración es lineal para dos
soluciones de la misma sustancia a igual espesor y longitud de onda, entonces se puede
usar una de ellas de concentración conocida (estándar) para determinar la concentración
de la otra solución. En la práctica para determinar espectrofotométricamente la
concentración de una sustancia se requiere: a) una serie estándar de concentración
conocida, en un rango de concentración que muestre absorción lineal y que permita
expresar la concentración en DO por unidad de masa o concentración. b) un blanco que
contiene todos los componentes del ensayo con excepción de la sustancia a medir y c) la
muestra con la sustancia problema a una dilución tal que su lectura de DO este en el rango
lineal de la curva de calibración (Adaptación de Universidad de Guanajuato, 2009 &
Quesada, 2007).

OBJETIVOS
Una vez desarrollada esta actividad práctica los alumnos conocerán algunos métodos o
procedimientos para determinar la concentración de proteínas en una muestra biológica.

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PROCEDIMIENTO
Determinación de la concentración total de proteínas plasmáticas de una muestra de
sangre por el método de Biuret utilizando seroalbúmina de bovino (SAB, PM = 66.500)
como estándar. En esta actividad se utilizará plasma diluido 1:20 con NaCl 0.9 % p/v y
solución de SAB 100 ug / mL (ug = microgramo) de acuerdo al siguiente cuadro:

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8

NaCl 0.9% p/v - - 1,8 1,5 1,0 0,5 - 2,0

SAB 100ug/mL - - 0,2 0,5 1,0 1,5 2,0 -

Plasma diluido 2,0 2,0 - - - - - -

Reactivo de Biuret 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0 4,0

Mezclar bien, sin agitar y leer después de 30 minutos a 540 nm en cubetas de vidrio. Se
puede calentar en baño a 50ºC por 5 minutos y leer después de enfriar en agua corriente.
Determinar el contenido de proteínas de la muestra a partir de la curva estándar y a partir
de la Absorbancia promedio calculada por mg de estándar. Compare y discuta sus
resultados. Calcule la concentración total de proteínas del plasma en mg/dl. ¿Cómo
determinaría usted la concentración de hemoglobina de una muestra de sangre?
Infórmese al respecto.

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LABORATORIO N°6. “ENZIMOLOGÍA”

Las enzimas son biocatalizadores proteicos esenciales para mantener los procesos
metabólicos a velocidades compatibles con la vida, contribuyendo además a su
regulación. Debido a su naturaleza proteica las enzimas pueden modificar su actividad por
cambios de temperatura y pH, factores que pueden alterar la estructura molecular de la
enzima, provocando su desnaturalización. En general una reacción química aumenta su
velocidad de reacción al aumentar la temperatura, pero en el caso de las reacciones
catalizadas por enzimas, este efecto se observa sólo entre 0 y 40 ºC, ya que a
temperaturas mayores la enzima se desnaturaliza debido a la ruptura de enlaces débiles,
principalmente puentes de hidrógeno y la pérdida de su conformación nativa.
Debido también a su naturaleza proteica la enzima presenta numerosos grupos ionizables,
los que derivan de los radicales de sus aminoácidos constituyentes. Las alteraciones del
pH pueden cambiar el grado de ionización de los grupos químicos involucrados en el sitio
activo de la enzima, afectando su actividad catalítica.
Las enzimas son activas en un rango estrecho de pH, con una actividad máxima a un valor
de pH denominado pH óptimo. Por tal motivo la actividad enzimática se mide en presencia
de tampones o amortiguadores de pH (Adaptación de Universidad de Guanajuato, 2009,
Quesada, 2007 & 2013).

OBJETIVOS
Estas actividades prácticas tienen como objetivo que los alumnos:
1. Se familiaricen con los procedimientos de laboratorio para manipular muestras
biológicas
2. Conozcan algunos procedimientos para determinar la actividad de una enzima en
muestras biológicas
3. Comprueben el efecto que tiene en la actividad de una enzima las variaciones de pH y
temperatura

18 LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
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PROCEDIMIENTO
La amilasa salival es una enzima que rompe específicamente los enlaces glicosídicos α 1-4
de los polisacáridos. La hidrólisis del almidón por amilasa salival da como producto una
mezcla de maltosa, maltotriosa (dextrinas) y glucosa. El almidón es un polisacárido
formado por 2 tipos de cadena: amilasa (lineal), que presenta sólo enlaces α 1-4 y
amilopectina (ramificada), con enlaces α 1-4 y α 1-6. El almidón se reconoce
químicamente por el color azul intenso que desarrolla en presencia de yodo, por lo que la
hidrólisis enzimática del almidón se puede determinar por la pérdida del color azul de una
mezcla de reacción.

A.- Efecto de la temperatura sobre la hidrólisis enzimática del almidón


Numere 4 tubos de ensayo y agregue a cada uno 2 mL de la preparación enzimática, 1 mL
de la solución de cloruro de sodio, 1 mL de la solución tampón fosfato pH 7.0 y 2 mL de
solución de almidón. Mezcle suavemente sin agitar e incube durante 15 minutos en las
siguientes condiciones: tubo 1 a 0ºC (sobre hielo), el tubo 2 a 37ºC en un baño
termorregulado, el tubo 3 a 100ºC (baño maría) y el tubo 4 a temperatura ambiente.
Incluya un quinto tubo sin cloruro de sodio en la mezcla de reacción a temperatura
ambiente. Al cabo de los 15 minutos agregue 1 gota de lugol, mezcle y observe. Anote y
discuta sus resultados.

B.- Efecto del pH sobre la actividad de la amilasa salival


Numere 4 tubos de ensayo y agregue a cada uno 2 mL de preparación enzimática, 1 mL de
solución de cloruro de sodio y 2 mL de solución de almidón. Posteriormente adicione 1 mL
de tampón fosfato pH 4.0 al tubo 1, 1 mL buffer pH 5.0 al tubo 2 , 1 mL buffer pH 6.0 al
tubo 3 y 1 mL buffer pH 8.0 al tubo 4. Mezcle y deje incubando a temperatura ambiente
por 15 minutos. Al cabo de ese tiempo agregue una gota de lugol, mezcle y observe.
Anote y discuta sus resultados.

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Facultad de Salud, Deporte y Recreación
Nutrición y Dietética

CONCLUSIONES.

Los estudiantes de Nutrición y Dietética durante el semestre dilucidarán en las


experiencias prácticas desarrolladas en la asignatura de Bioquímica el vínculo y la
integración con los contenidos teóricos enseñados en el aula. Adicionalmente, los
distintos prácticos permitirán a los estudiantes gradualmente ir asimilando las normativas
y las buenas prácticas de laboratorio, la determinación e identificación de las distintas
macromoléculas como son: hidratos de carbono, lípidos y proteínas con vital importancia
en la nutrición por sus efectos bioquímicos y fisiopatológicos. Además, podrán cuantificar
y medir la función catalítica de la enzima amilasa salival. Las actividades descritas
permitirán a los estudiantes una sólida formación química que será apreciada en
asignaturas relacionadas en años venideros y en su formación integral de futuro
profesional del área de salud.

20 LABORATORIO DE BIOQUÍMICA
Facultad de Salud, Deporte y Recreación
Nutrición y Dietética

BIBLIOGRAFÍA.

- Quesada Mora, S. (2007) Manual de experimentos de laboratorio de bioquímica.


Editorial Universidad Estatal a Distancia. Ed. N° 1.

- Normas de seguridad en el laboratorio de bioquímica avanzada. Mutual de


Seguridad (CChC). Consultado el 25012013 y disponible en:
http://www.mutual.cl/LinkClick.aspx?fileticket=r6T9wBc4W_k%3D&tabid=524&mi
d=1571

- Manual de prácticas de bioquímica. Universidad de Guanajuato. Consultado el


25012013 y disponible en:
http://www.diciva.ugto.mx/directorio/josebar/documentos/Practicas%20de%20Bi
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- Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica. Silvia Quesada Mora.


Consultado 25012013 y disponible en:
http://books.google.cl/books/about/Manual_de_experimentos_de_laboratorio_p
a.html?id=8SAtkthrFEkC

21 LABORATORIO DE BIOQUÍMICA