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CELERA

ViroSeq™
HIV-1 Genotyping System v2.0
Para utilizar con los ABI PRISM ® 3100/3100-Avant Genetic Analyzers
(Analizadores genéticos ABI PRISM ® 3100/3100-Avant) y el
ViroSeq® HIV-1 Genotyping System Software v2.8

Instrucciones de uso

0197

4J94-36

CDx 5001504 Rev. A

Celera
1401 Harbor Bay Parkway DRAFT ABBOTT
Max-Planck-Ring 2
Alameda, CA 94502 August 21, 2008 3:56 pm, 5001504_cover_es.fm 65205 Wiesbaden
USA *+H3764J94360X* Germany
+ 49-6122-580
Contenido

Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1
Indicaciones de uso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Campo de aplicación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Resumen y explicación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Principios del procedimiento. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Para realizar pedidos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
Leyenda de los símbolos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

Preparación y procesamiento de las muestras . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2


Reactivos del Pack 1 (paquete 1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Advertencias y precauciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
Requisitos de conservación y manipulación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
Muestra extraída . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
Material necesario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
Preparación de la zona de trabajo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
Prevención de la degradación del ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
Flujo de trabajo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
Tamaño del análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
Controles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Protocolo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
Control de calidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
Limitaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

Secuenciación de series analíticas en los ABI PRISM ® 3100 y


3100-Avant Genetic Analyzers (Analizadores
genéticos ABI PRISM® 3100 y 3100-Avant) . . . . . . . . . . . .16
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
Material necesario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
Protocolo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 i


Análisis con el ViroSeq® HIV-1 Genotyping System Software v2.8 . . . .24
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
Material necesario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
Requisitos del sistema para ejecutar el programa ViroSeq® Software v2.8 . . . . . . . . . . . 24
Instalación, desinstalación y uso del software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
Ejemplos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
Edición de los datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
Informe sobre resistencia a antirretrovirales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
Tablas de mutaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
Mensajes de error del software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
Software ViroSeq® y resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

Eficacia diagnóstica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .47


Eficacia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

Mantenimiento y calibración de los analizadores ABI PRISM ® 3100 y


3100-Avant Genetic Analyzers (Analizadores
genéticos ABI PRISM® 3100 y 3100-Avant) . . . . . . . . . . . .53
Material necesario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
Cuidado de los analizadores 3100 y 3100-Avant Genetic Analyzers
(Analizadores genéticos 3100 y 3100-Avant) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
Matriz de capilares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
Jeringas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
Bloques de polímero . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
Inyector automático . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
Unidades de placa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
Mantenimiento del ordenador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
Calibración espacial y espectral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

Bibliografía . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .64
Referencias citadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

ii ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0


El ViroSeq™ HIV-1 Genotyping System detecta mutaciones en las regiones de la
Sección 1: Introducción TI y de la proteasa del gen pol, y proporciona un informe en el que se señalan los
indicios genéticos de resistencia viral. Es un sistema completo que incluye reactivos
para el aislamiento del ARN viral del plasma, la TI-PCR y la secuenciación.19,20 El
gen de la proteasa completo y dos terceras partes del gen de la TI se amplifican para
Contenido generar un amplicón de 1,8 kb. El amplicón se utiliza como patrón de secuenciación
para siete cebadores que generan una secuencia consensuada de 1,3 kb
Indicaciones de uso . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 aproximadamente. El programa ViroSeq® HIV-1 Genotyping System Software
Campo de aplicación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 ensambla, modifica e identifica las mutaciones en esta secuencia de 1,3 kb. El
Resumen y explicación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 software compara la secuencia consensuada con una referencia conocida, la
Principios del procedimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 secuencia HXB-2, para determinar las mutaciones presentes en la muestra. Por
Para realizar pedidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 último, el software ViroSeq utiliza un algoritmo patentado para analizar las
Leyenda de los símbolos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 mutaciones y generar un informe sobre resistencia farmacológica.

Indicaciones de uso Principios del procedimiento


El ViroSeq™ HIV-1 Genotyping System está indicado para utilizarse en la
La formación del usuario es esencial para realizar el ensayo ViroSeq HIV-1
detección de mutaciones genómicas del VIH que confieren resistencia a tipos Genotyping y para lograr resultados precisos.
específicos de fármacos antirretrovirales y como ayuda durante la vigilancia y el
tratamiento de las infecciones por el VIH. En particular, el ViroSeq HIV-1 El ViroSeq™ HIV-1 Genotyping System se basa en seis procesos principales:
Genotyping System puede utilizarse para: • Preparación de muestras
• Detectar la resistencia viral del subtipo B del VIH-1 en muestras de plasma • Transcripción inversa (TI)
recogidas en EDTA con una carga viral entre 2.000 y 750.000 copias/mL. • Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
• Genotipar el gen completo (desde el codón 1 hasta el 99) de la proteasa del • Secuenciación cíclica
VIH-1 y dos terceras partes del gen de la transcriptasa inversa (TI), desde el • Detección de secuencias automatizada
codón 1 hasta el 335. • Análisis del software
Para utilizar el ViroSeq HIV-1 Genotyping System:
• El usuario o el técnico deben haber recibido formación sobre su uso.
• Un médico cualificado debe interpretar y aplicar los resultados. Para realizar pedidos
El kit no debe utilizarse como prueba de cribado para el VIH ni como prueba
diagnóstica para confirmar la presencia de infección por el VIH.
4J94-36 ViroSeq™ HIV-1 Genotyping System v2.0
Para utilizar con los ABI PRISM® 3100/3100-Avant
Genetic Analyzers (Analizadores genéticos ABI PRISM®
Campo de aplicación 3100/3100-Avant) y el ViroSeq® HIV-1 Genotyping
System Software v2.8
Incluye las siguientes poblaciones:
Instrucciones de uso
• Personas infectadas con el VIH-1 con fracaso terapéutico (aumento de la carga
viral) antes del cambio de tratamiento
• Personas infectadas con el VIH-1 en la presentación inicial, antes del tratamiento
farmacológico inicial
Leyenda de los símbolos
Resumen y explicación
Número de catálogo de
El virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH-1) es el agente etiológico CDx = Celera = Riesgos biológicos
responsable de la pandemia del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA).1,2
El tratamiento de las infecciones por VIH-1 con un tratamiento antirretroviral
potente puede suprimir la replicación del VIH-1.3,4 Sin embargo, es complicado Número de catálogo de Limitación de la
erradicar el VIH-1, ya que las infecciones latentes constituyen un mecanismo que ABI = Applied Biosystems = temperatura
permite al virus reaparecer y perdurar durante toda la vida del paciente.5,6 Con
frecuencia, el fracaso terapéutico se debe a un cumplimiento inadecuado de los
regímenes de tratamiento y/o a la aparición de cepas del virus resistentes a los
fármacos.7 Estas cepas mutantes del VIH-1 pueden ser resistentes a uno o más Σ = Contiene 48 ensayos = Consultar las
fármacos de cada una de las seis clases de antirretrovirales: los inhibidores instrucciones de uso
nucleósidos de la transcriptasa inversa, los inhibidores no nucleósidos de la Σ48
= 48
transcriptasa inversa, los inhibidores de la proteasa, los inhibidores de la fusión, los
inhibidores de la entrada y los inhibidores de la transferencia de la cadena de Peligro de descarga Representante autorizado
integrasa del VIH.8,9,10 Además, la resistencia a un determinado fármaco puede = eléctrica/incendio = en la Comunidad Europea
generar resistencia cruzada a otros fármacos de la misma clase.7,11 Sin embargo, el
fracaso terapéutico no siempre produce resistencia a todos los fármacos de un
régimen.12 Por este motivo, la determinación del mejor tratamiento de rescate para = Nocivo = Producto sanitario para
pacientes en los que han fracasado varios regímenes terapéuticos puede ser un reto diagnóstico in vitro
considerable.
Uno de los factores clave para identificar nuevas estrategias de tratamiento es
conocer el genotipo de resistencia viral indicado por las mutaciones presentes en el = Tóxico = Fabricante
conjunto de virus existente en el plasma del paciente.13 Los resultados obtenidos en
estudios de intervención retrospectivos y prospectivos apoyan la utilidad clínica de
las pruebas de resistencia.14-16 Estos estudios indican que la presencia de resistencia
farmacológica es un factor de riesgo independiente de fracaso terapéutico. En la
actualidad, se recomienda realizar pruebas de resistencia en las personas infectadas = Peligro de láser = Riesgo de infección
con el VIH que solicitan atención médica, independientemente de si el tratamiento
va a iniciarse de inmediato. Se debe considerar la conveniencia de repetir estas
pruebas al inicio del tratamiento antirretroviral. Las pruebas de resistencia
farmacológica del VIH deben realizarse siempre que cambie de régimen
antirretroviral debido a un fracaso terapéutico. También se recomienda realizar = Sensible a la luz
pruebas de resistencia a las mujeres embarazadas antes de iniciar el tratamiento
antirretroviral y a las mujeres que se queden embarazadas durante el tratamiento.17,18

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 1 de 66


Sección 2: Preparación ViroSeq™ HIV-1 RT-PCR Module
Color del
tapón Cantidad

HIV RT Mix (mezcla de TI del VIH), tubo Azul 1 x 384 μL


y procesamiento de < 0,1% dATP, dCTP, dGTP, dTTP
< 0,1% de cebadores oligonucléotidos
sintéticos no infecciosos del VIH-1

las muestras RNase Inhibitor (inhibidor de la RNasa),


tubo
Blanco 1 x 48 μL

20 U/μL de RNase Inhibitor (inhibidor de


la RNasa)
Contenido: MuLV Reverse Transcriptase (transcriptasa Morado 1 x 48 μL
Reactivos del Pack 1 (paquete 1) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2 inversa del MuLV), tubo
Advertencias y precauciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 50 U/μL de transcriptasa inversa
recombinante del virus de la leucemia
Requisitos de conservación y manipulación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4 murina
Muestra extraída. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
Material necesario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 HIV PCR Mix (mezcla para PCR del VIH), Azul 1 x 1,42 mL
Preparación de la zona de trabajo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 tubo
Prevención de la degradación del ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 < 0,1% dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dUTP
Flujo de trabajo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 < 0,1% de cebadores oligonucléotidos
Tamaño del análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6 sintéticos no infecciosos del VIH-1
Controles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 AmpliTaq Gold® DNA Polymerase (ADN Dorado 1 x 24 μL
Protocolo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7 polimerasa AmpliTaq Gold®), tubo
Control de calidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 5 U/μL de AmpliTaq Gold® DNA
Limitaciones. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14 Polymerase (ADN polimerasa AmpliTaq
Gold®)
AmpErase® UNG, tubo Verde 1 x 48 μL
Reactivos del Pack 1 (paquete 1) 1 U/μL de uracil-N-glicosilasa
DTT (100 mM), tubo Amarillo 1 x 20 μL
1,4% de ditiotreitol
DNA Mass Ladder (marcador de peso Transparente 1 x 36 μL
Σ de ADN), tubo
< 0,1% de marcador de peso de ADN
Σ48
= 48
Agarose Gel Loading Buffer (solución Transparente 1 x 240 μL
tampón de carga de gel de agarosa), tubo
ViroSeq™ HIV-1 Sample Preparation Color del Cantidad RNA Diluent (diluyente de ARN), tubo Transparente 1 x 1,6 mL
Module tapón
HIV Viral Lysis Buffer (tampón de lisado Transparente 2 x 14,4 mL
viral del VIH), tubo
43% de tiocianato de guanidina
< 2% de ditiotreitol
< 1% de N-lauroilsarcosina

Contiene Libera gases


tiocianato de tóxicos en
guanidina. contacto con
ácidos o lejía.

R 20/21/22 Nocivo por inhalación, por


ingestión y en contacto con la piel.
R 32 Libera gases muy tóxicos en contacto con
ácidos.
R 36/38 Irrita los ojos y la piel.
S 26 En caso de contacto con los ojos, aclarar
de inmediato con abundante agua y solicitar
ayuda médica.
S 35 Elimínense los residuos del producto y
sus recipientes con todas las precauciones
posibles.
S 36/37/39 Úsense indumentaria y guantes
adecuados, y protección para los ojos/la cara.
S 46 En caso de ingestión, solicitar ayuda
médica de inmediato y mostrar el envase o la
etiqueta.
RNA Diluent (diluyente de ARN), tubo Transparente 3 x 1,6 mL

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Color del ViroSeq™ HIV-1 8E5 Control Module Color del tapón Cantidad
ViroSeq™ HIV-1 Sequencing Module Cantidad
tapón
POSIBLE PELIGRO
BIOLÓGICO. Material de
origen humano. Utilice las
precauciones universales.
HIV SEQ Mix A (mezcla A para secuenciación Blanco 1 x 576 μL
del VIH), tubo HIV-1 8E5 Positive Control (control Rojo 5 x 500 μL
positivo del VIH-1 de 8E5), tubo
BigDye® Terminator Ready Reaction Mix
< 0,1% de nucleótidos y cebadores El control positivo se preparó diluyendo
oligonucléotidos sintéticos no infecciosos VIH-1 tipo B (8E5) cultivado en plasma
del VIH-1 humano negativo para el ARN del VIH y no
< 0,1% de AmpliTaq® DNA Polymerase, FS reactivo en las pruebas de anticuerpos anti
VIH-1/2, anti VHC, anti VTLH-I y HbsAg
< 0,1% de cloruro de magnesio autorizadas por la FDA de EE.UU. El virus
HIV SEQ Mix B (mezcla B para secuenciación Blanco 1 x 576 μL de las células 8E5 contiene un genoma viral
del VIH), tubo intacto pero defectuoso, con una inserción
BigDye® Terminator Ready Reaction Mix de una sola base en el codón 219 del gen de
< 0,1% de nucleótidos y cebadores la TI.21 La carga viral es de 50.000 a
oligonucléotidos sintéticos no infecciosos 100.000 copias/mL.
del VIH-1 HIV-1 8E5 Negative Control (control Transparente 5 x 950 μL
< 0,1% de AmpliTaq® DNA Polymerase, FS negativo del VIH-1 de 8E5), tubo
< 0,1% de cloruro de magnesio El control negativo contiene plasma humano
HIV SEQ Mix C (mezcla C para secuenciación Blanco 1 x 576 μL normal analizado para demostrar que carece
del VIH), tubo de ARN del VIH, y no es reactivo en las
BigDye® Terminator Ready Reaction Mix pruebas de anticuerpos anti VIH-1/2, anti
< 0,1% de nucleótidos y cebadores VHC, anti VTLH-I y HbsAg autorizadas
oligonucléotidos sintéticos no infecciosos por la FDA de EE.UU.
del VIH-1
< 0,1% de AmpliTaq® DNA Polymerase, FS
< 0,1% de cloruro de magnesio
HIV SEQ Mix D (mezcla D para secuenciación Blanco 1 x 576 μL
del VIH), tubo
BigDye® Terminator Ready Reaction Mix
< 0,1% de nucleótidos y cebadores
oligonucléotidos sintéticos no infecciosos
del VIH-1
< 0,1% de AmpliTaq® DNA Polymerase, FS
< 0,1% de cloruro de magnesio
HIV SEQ Mix F (mezcla F para secuenciación Rojo 1 x 576 μL
del VIH), tubo
BigDye® Terminator Ready Reaction Mix
< 0,1% de nucleótidos y cebadores
oligonucléotidos sintéticos no infecciosos
del VIH-1
< 0,1% de AmpliTaq® DNA Polymerase, FS
< 0,1% de cloruro de magnesio
HIV SEQ Mix G (mezcla G para secuenciación Rojo 1 x 576 μL
del VIH), tubo
BigDye® Terminator Ready Reaction Mix
< 0,1% de nucleótidos y cebadores
oligonucléotidos sintéticos no infecciosos
del VIH-1
< 0,1% de AmpliTaq® DNA Polymerase, FS
< 0,1% de cloruro de magnesio
HIV SEQ Mix H (mezcla H para secuenciación Rojo 1 x 576 μL
del VIH), tubo
BigDye® Terminator Ready Reaction Mix
< 0,1% de nucleótidos y cebadores
oligonucléotidos sintéticos no infecciosos
del VIH-1
< 0,1% de AmpliTaq® DNA Polymerase, FS
< 0,1% de cloruro de magnesio

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 3 de 66


Advertencias y precauciones Requisitos de conservación
1. Esta prueba debe utilizarse con plasma humano recogido únicamente con
EDTA como anticoagulante. No utilice plasma recogido en heparina con este
y manipulación
procedimiento, ya que se ha demostrado que inhibe la PCR.
2. No pipetee con la boca. Nota. Si se siguen las recomendaciones de conservación de los
3. No beba, coma ni fume en las zonas de trabajo del laboratorio. Utilice equipo reactivos, los tubos de reactivo (tanto abiertos como sin abrir) son
de protección personal apropiado al manipular las muestras extraídas y los estables hasta la fecha de caducidad. No utilice este kit ni ninguno de
reactivos del kit (p. ej., gafas de seguridad, guantes y ropa protectora). Lávese sus componentes reactivos después de la fecha de caducidad.
las manos exhaustivamente después de manipular las muestras extraídas y los
reactivos del kit.
Pack 1 (paquete 1)
4. Evite la contaminación microbiana y con ribonucleasa de los reactivos
cuando extraiga cantidades iguales (alícuotas) de los frascos de reactivo.
Se recomienda utilizar pipetas y puntas de pipeta desechables y estériles. Módulo Condiciones de conservación Comentarios
5. No combine reactivos de lotes diferentes ni de distintos frascos del mismo
lote. ViroSeq™ HIV-1 Sample Conservar entre Una vez abiertos, los componentes
6. No utilice este kit después de la fecha de caducidad. Preparation Module • –15 °C y –25 °C siguientes deben transferirse y
• En un congelador de conservarse en el área de ADN
7. Minimice la exposición a productos químicos. La exposición incluye el ViroSeq™ HIV-1 RT-PCR descongelación manual amplificado a una temperatura de
contacto, la ingestión o la inhalación de los productos químicos. No deje los Module designado como «sin 2 °C a 8 °C:
envases de los productos químicos abiertos. Utilícelos solamente con una amplicones» • DNA Mass Ladder (marcador
ventilación adecuada. de peso de ADN)
• Agarose Gel Loading Buffer
8. Deseche los reactivos no utilizados y los residuos de acuerdo con las buenas (solución tampón de carga de
prácticas de laboratorio y las normativas medioambientales y de salud gel de agarosa)
nacionales, estatales o provinciales, y locales. Nota. Todos los demás
componentes deben conservarse a
una temperatura entre –15 °C y
–25 °C en la zona «sin amplicones».

9. PELIGRO DE LÁSER. La exposición a luz láser directa o ViroSeq™ HIV-1 8E5 Conservar entre • Cinco viales de cada control de
reflejada a 40 mW durante 0,1 segundos puede quemar la retina y dejar Control Module • –15 °C y –25 °C plasma (positivo y negativo).
• En un congelador de • Descongele un vial de control
escotomas permanentes. No mire nunca directamente al haz del láser ni descongelación manual de plasma positivo y otro de
permita que el reflejo del haz entre en los ojos. Siga las recomendaciones del designado como «sin control de plasma negativo.
fabricante sobre el uso de ropa y protección ocular apropiada cuando utilice amplicones» • Utilícelos en cada análisis de
el ABI PRISM ® 3100 o el ABI PRISM ® 3100-Avant Genetic Analyzers muestras.
• No los vuelva a congelar.
(Analizadores genéticos ABI PRISM® 3100/3100-Avant).
ViroSeq™ HIV-1 Conservar en la zona de Estos materiales son
Sequencing Module posamplificación entre: sensibles a la luz.
• entre –15 °C y –25 °C Evite la exposición
10. RIESGOS BIOLÓGICOS. Las muestras biológicas, como • En un congelador de prolongada a la luz.
los tejidos y la sangre, pueden transmitir enfermedades infecciosas. descongelación manual
Manipule todas las muestras extraídas como si fueran infecciosas. Utilice designado para ADN
amplificado únicamente
procedimientos de laboratorio seguros, como los que se describen en
el documento Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories22
(Seguridad biológica en laboratorios biomédicos y microbiológicos) y en
el documento M29-T del NCCLS.23 Pack 2 (paquete 2)

Reactivo Condiciones de conservación Comentarios



ViroSeq HIV-1 KCl Conservar en la zona de No lo congele.
11. PRECAUCIÓN: Los controles contienen componentes de posamplificación entre:
origen humano y/o potencialmente infecciosos. Los componentes derivados • 15 °C y 30 °C
de sangre humana se han analizado con pruebas autorizadas por la FDA para
demostrar que no son reactivos para HBsAg, anti-VHC, anti-VIH-1/VIH-2 ni
anti-VTLH-I. Ningún método de prueba conocido puede ofrecer una garantía
total de que los productos derivados de tejidos humanos no transmitan
infecciones. Por lo tanto, todos los materiales de procedencia humana deben Muestra extraída
considerarse potencialmente infecciosos. Las partículas de VIH-1 que
contiene el control positivo son defectuosas; no obstante, hay estudios que
demuestran una capacidad limitada para revertir a una forma infecciosa. Esto
debe tenerse en consideración en caso de una exposición accidental A. Recogida de muestras
importante.
12. Los componentes que contengan azida sódica pueden reaccionar con el plomo El ViroSeq HIV-1 Genotyping System está indicado para utilizarse únicamente con
y el cobre de las tuberías formando azidas metálicas muy explosivas. Cuando muestras de plasma. Recoja 5 mL de sangre entera en un tubo estéril con EDTA
vaya a verter soluciones que contengan azida sódica por el fregadero del como anticoagulante (tubos Vacutainer™ PPT™ de Becton-Dickinson,
laboratorio, deje correr gran cantidad de agua por las cañerías para impedir REF. 362788, o equivalentes) e invierta de inmediato el tubo de 8 a 10 veces para
la acumulación de azidas. mezclarla.
13. Limpie y desinfecte a fondo todas las superficies de trabajo con una solución ¡IMPORTANTE!
recién preparada de hipoclorito sódico al 0,5% en agua desionizada. NO • Este ensayo solo está validado para utilizarse con muestras de pacientes
utilice lejía (hipoclorito sódico al 0,5%) en el material de vidrio ni en las recogidas en EDTA.
superficies expuestas al HIV Viral Lysis Buffer (tampón de lisado viral • Las muestras recogidas con heparina no son adecuadas para este ensayo.
del VIH).
• Se ha demostrado que los siguientes componentes en las muestras de plasma
14. Información para los usuarios de Europa: para los productos no clasificados no interfieren con los resultados de la prueba:
como peligrosos según la Directiva Europea 1999/45/CE − existe una Ficha – Lípidos hasta 30 mg/mL
de datos de seguridad disponible para los usuarios profesionales que la – Bilirrubina hasta 0,6 mg/mL
soliciten. En el caso de los materiales no suministrados por Celera, consulte la
Ficha de datos de seguridad del fabricante para obtener más información. – Hemoglobina hasta 5 mg/mL

Página 4 de 66 ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0


Se recomienda separar el plasma de la sangre en los 30 minutos siguientes a la
recogida y, como máximo, 120 minutos después de la recogida si se utilizan tubos
PPT o equivalentes.
Artículo ABI
• Centrifugue los tubos a 1.000 a 2.000 x g a temperatura ambiente (entre 15 °C
y 25 °C) durante 15 minutos. ABI PRISM ® 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador 3100-AVANT
genético ABI PRISM® 3100-Avant) con: ¡IMPORTANTE! No debe
• Tan pronto como sea posible, transfiera el plasma de los tubos PPT (o • Data Collection Software v.1.0 (software de recogida de descargarse software de Internet
equivalentes) a tubos de polipropileno estériles de 1,5 mL y consérvelos a datos v.1.0) para este uso específico.
una temperatura de entre –65 °C y –80 °C hasta el momento de su utilización. • Versión del firmware 6278000-01 ó 6278050-01
• PC con:
– Microsoft® Windows NT® v.4.0, Service Pack 6 o 6a
– Procesador Intel® Pentium® IV a 2 GHz
B. Transporte de las muestras extraídas – 1 GB de RAM
– 2 x discos duros de 36 GB
• Kit de limpieza del bloque de polímero
El transporte de productos derivados de sangre humana, como el plasma, debe
cumplir las normativas locales y nacionales referentes al transporte de agentes
etiológicos. ABI PRISM ® Sequencing Analysis Software v.3.7 para un 4317380
ordenador con Windows NT® Si necesita licencias adicionales,
Los tubos con plasma pueden enviarse a una temperatura entre 2 °C y 8 °C por utilice 4310990 y especifique la
mensajería urgente (entrega antes de 24 horas) o bien, congelados a –70 °C o menos v.3.7
en hielo seco. ¡IMPORTANTE! No descargue
software de Internet para este uso
específico.

C. Conservación de las muestras extraídas GeneAmp® PCR System 9600 Thermal Cycler N801-0001
(Termociclador 9600 del sistema de PCR GeneAmp®) ó
Conserve las muestras de plasma a una temperatura entre –65 °C y –80 °C. No las o N805-0001
congele durante más de 6 meses. No congele y descongele el plasma más de dos GeneAmp® PCR System 9700 Thermal Cycler (Termociclador
veces. 9700 del sistema de PCR GeneAmp®)

MicroAmp® 96-Well Tray (Bandeja de 96 pocillos N801-0541


MicroAmp®) para los tubos de reacción con tapón incorporado
Material necesario MicroAmp® 96-Well Support Base (Base de soporte de N801-0531
96 pocillos MicroAmp®)
Artículo
Separadores de depósitos 4315932

ViroSeq™ HIV-1 Genotyping System v2.0, Pack 1 con: 4J94-20 Base de placa de 96 pocillos 4317237
• ViroSeq™ HIV-1 Sample Preparation Module
• ViroSeq™ HIV-1 RT-PCR Module
• ViroSeq™ HIV-1 Sequencing Module Retenedor de placa de 96 pocillos 4317241
• ViroSeq™ HIV-1 8E5 Control Module
Separadores de placa de 96 pocillos 4315933
ViroSeq™ HIV-1 Genotyping System v2.0, Pack 2 con: 4J94-21
• YM-100 Microconcentrators (microconcentradores YM-100)
• MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plates with Covers (placas MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate (placa óptica de 96 N801-0560
ópticas de 96 pocillos para reacción MicroAmp® con tapa) pocillos para reacción MicroAmp®)
• MicroAmp® Reaction Tubes with Caps (tubos de reacción
MicroAmp® con tapón) Jeringa de vidrio para llenado de la matriz, 250 μL 4304470
• KCl (200 mM)

Jeringa de vidrio con polímero de reserva, 5,0 mL 628-3731

Juntas tóricas de jeringa 221102


Artículo ABI
3100 Performance Optimized Polymer 6 (POP-6™) 4316357
ABI PRISM ® 3100 Capillary Array (matriz de capilares 4315930
ABI PRISM® 3100), 50 cm
Solución tampón 10X con EDTA del analizador genético 402824

ABI PRISM ®
3100-Avant Capillary Array (matriz de capilares 4333466
®
ABI PRISM 3100-Avant), 50 cm Formamida Hi-Di™, 25 mL 4311320

ABI PRISM ® 3100 Genetic ABI PRISM ® 3100 Genetic 3100-01 Contiene formamida.
Analyzer (Analizador genético Analyzer (Analizador genético ¡IMPORTANTE! No debe
ABI PRISM® 3100) con: ABI PRISM® 3100) con: descargarse software de Internet R 61 Riesgo durante el embarazo de efectos adversos para
• Data Collection Software • Data Collection Software para este uso específico. el feto.
v.1.0.1 (software de v.1.1 (software de
recogida de datos v.1.0.1) recogida de datos v.1.1) R 36/38 Irrita los ojos y la piel.
• Versión del firmware • Versión del firmware S 53 Evítese la exposición – recábense instrucciones especiales
6286100-04 6286150-01 antes del uso.
• PC con: • PC con: S 24/25 Evítese el contacto con los ojos y la piel.
– Microsoft® Windows – Microsoft® Windows S 35 Elimínense los residuos del producto y sus recipientes con
NT® v.4.0 NT® v.4.0, Service todas las precauciones posibles.
– Procesador Intel® Pack 5 o 6a S 36/37/39 Úsense indumentaria y guantes adecuados, y
Pentium® III a – Procesador Intel® protección para los ojos/la cara.
550 MHz Pentium® IV a 2 GHz S 45 En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente
– 256 MB de RAM – 1 GB de RAM al médico (si es posible, muéstresele la etiqueta).
– Disco duro de – 2 x discos duros de
18 GB 36 GB
• Kit de limpieza del bloque • Kit de limpieza del bloque BigDye® Terminator v1.1 Sequencing Standard (patrón de 4336791
de polímero de polímero secuenciación BigDye® Terminator v1.1)

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 5 de 66


Material no suministrado Siempre que sea posible, utilice un espacio dedicado, como una campana de
bioseguridad con lámpara de UV, para la preparación de los reactivos para los pasos
de la TI y la PCR. Las lámparas germicidas de UV de la mayoría de las campanas de
El usuario deberá suministrar los siguientes materiales, reactivos y equipo.
bioseguridad dañan el ADN que se deja en las superficies expuestas, lo que lo hace
(Utilícelos según las instrucciones del fabricante a menos que se especifique otra inadecuado para la posterior amplificación.
cosa).
Mantenga un aislamiento físico estricto entre el espacio de trabajo del ADN
a. Puntas resistentes a aerosoles, sin RNasa, de 10 a 1.000 μL amplificado (zona 3) y las otras dos zonas para impedir la transferencia de ADN
b. Gel de agarosa con bromuro de etidio amplificado fuera de la zona 3.
c. Sistema de electroforesis en gel de agarosa (caja de gel con alimentación Debido al tipo de equipo utilizado en el espacio de trabajo del ADN amplificado
eléctrica capaz de suministrar 10 V/cm de gel de agarosa) (zona 3), se necesita un espacio relativamente amplio. Este espacio suele ser mayor
d. Cinta adhesiva de aluminio que el necesario para las zonas 1 y 2.
e. Campana de flujo laminar (campana de bioseguridad) limpia
f. Lejía (para limpiar; prepare una solución al 10% antes de utilizarla)
g.
h.
Microtubos de centrífuga Quick-Spin (2.000 x g)
Centrífuga con refrigeración (21.000 a 25.000 x g) y rotor con cierre
Prevención de la degradación
i.
hermético para tubos de 1,5 mL
Centrífuga con rotor de microplacas
del ARN
j. Centrífuga con bomba de vacío (si se utilizan las placas de 96 pocillos Para llevar a cabo correctamente el genotipado, es fundamental que se evite
CENTRI•SEP 96™); debe tener: la degradación del ARN en las muestras problema.
– Capacidad para crear vacío Las RNasas degradan al ARN. Estas enzimas están presentes de forma natural en las
– Rotor con cabezal basculante células y se liberan durante la lisis celular. Si la purificación no es completa, pueden
quedar RNasas en las muestras derivadas de células. Asimismo, debido a que las
k. Placas de 96 pocillos CENTRI•SEP 96™ RNasas se excretan a través de la piel, es posible introducirlas en las muestras a
l. Etanol al 70% (para limpiar) través del contacto con superficies que el usuario haya tocado. Debe utilizar guantes
m. Etanol al 100%, no desnaturalizado (calidad para biología molecular) en todo momento cuando manipule muestras extraídas, reactivos, equipo y material
n. Bromuro de etidio desechable.
o. ExoSAP-IT® para la limpieza de productos de la PCR Las RNasas son muy estables y no necesitan cofactores, por lo que permanecen
funcionales en las superficies en condiciones medioambientales muy diversas.
p. Guantes sin talco Tienen una alta actividad, de forma que una pequeña contaminación con RNasa
q. Isopropanol al 100%, anhidro (calidad ACS) basta para causar una pérdida significativa en una muestra de ARN. Entre las fuentes
r. Batas de laboratorio de contaminación por RNasa están:
s. Pañuelos de papel que no suelten pelusa • El material de vidrio y de plástico de uso general en el laboratorio
t. Pipetas con capacidad de 0 a 1.000 μL • La piel y el pelo
u. Tubos con tapón de rosca, 1,5 mL (estériles, sin RNasa/DNasa), deben • Soluciones contaminadas
soportar entre 21.000 y 25.000 x g
v. Acetato sódico, 3,0 M, pH 5,2
w. Solución tampón de TBE, 10X
x. Pipetas de transferencia, punta fina Flujo de trabajo
y. Caja de luz ultravioleta (lámpara de UV de 300 nM)
Puede terminar el procedimiento durante un periodo de dos o más días. Si lo
z. Vórtex con plataforma en el cabezal (2.500 rpm) interrumpe en los puntos especificados, deberá conservar las muestras preparadas
aa. Agua estéril desionizada, sin RNasa/Dnasa tal y como se especifica en la tabla siguiente hasta que esté listo para continuar.
ab. Congelador de descongelación manual, capaz de alcanzar las condiciones de ¡IMPORTANTE! Mantenga todas las muestras, controles y reactivos en frío (entre
conservación indicadas en la documentación de los productos 2 °C y 8 °C) antes de realizar la mezcla maestra. Una vez hecha la mezcla maestra,
ac. Frigorífico capaz de alcanzar las condiciones de conservación indicadas en consérvela a temperatura ambiente, pero mantenga los reactivos originales en hielo.
la documentación de los productos .

Al finalizar… Conservar las muestras a… Durante un máximo de…

A. Preparación de muestras Entre –65 °C y –80 °C 2 semanas


Preparación de la zona de trabajo B. Transcripción inversa Entre –15 °C y –25 °C 2 semanas

Las diferentes partes del procedimiento del ViroSeq HIV-1 Genotyping System C. PCR Entre –15 °C y –25 °C 2 semanas
deben llevarse a cabo en distintas zonas de trabajo. Cada zona de trabajo debe tener D. Secuenciación cíclica Entre –15 °C y –25 °C 3 días
pipetas, equipos y suministros específicos para que el ensayo resulte satisfactorio
habitualmente. Se sugieren tres zonas de trabajo: E. Secuencias purificadas Entre –15 °C y –25 °C 1 semana

• Zona 1: Preparación de las muestras (preamplificación): se utiliza para preparar


las muestras y trabajar con muestras de VIH-1.
• Zona 2: Preamplificación: se utiliza para los pasos de configuración de la
transcripción inversa y la PCR. Tamaño del análisis
• Zona 3: Posamplificación (ADN amplificado): zona dedicada a la amplificación
por PCR, la secuenciación cíclica y la detección de secuencias automatizada, y El kit del ViroSeq HIV-1 Genotyping System contiene suficientes reactivos para
a otras actividades que conlleven la manipulación de ADN amplificado. 48 pruebas. Se recomienda procesar las series analíticas en lotes de 12 muestras,
En el caso ideal, las zonas 1 y 2 deben estar separadas entre sí para evitar la posible lo que permite procesar cuatro series por kit. El análisis de un número menor de
muestras aumenta el número de ciclos de congelación-descongelación y la
transferencia de ADN y ARN exógeno al área de trabajo de preparación de la TI y la manipulación de los reactivos, lo que puede reducir la eficacia u ocasionar
PCR. No obstante, si las zonas 1 y 2 están en la misma sala, deben estar claramente
delimitadas. Las campanas de bioseguridad en las superficies de trabajo pueden contaminación.
servir para aislar las zonas de esta sala. ¡IMPORTANTE! No congele y descongele los reactivos más de cinco (5) veces.
Las pipetas y el equipo utilizado en la zona 1 están expuestos de forma rutinaria a
patógenos humanos transportados por la sangre y no deben utilizarse en ningún otro
lugar fuera de la zona 1.

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Controles 8. Mientras se centrifugan las muestras:
• Descongele el Viral Lysis Buffer (tampón de lisado viral) hasta que
Nota. Se debe incluir un control positivo y uno negativo en cada análisis. alcance la temperatura ambiente.
El control positivo (8E5) es un VIH-1 no infeccioso24 en una concentración de Libera gases
Contiene
50.000 a 100.000 copias/mL. Para garantizar el rendimiento adecuado de los tiocianato de tóxicos en contacto
reactivos, debe utilizarse en cada análisis una dilución 1:10 del control positivo guanidina. con ácidos o lejía.
(de 5.000 a 10.000 copias/mL). Esto está diseñado de forma que simule las muestras
de pacientes en todos los aspectos del procedimiento de prueba del ViroSeq System, R 20/21/22 Nocivo por inhalación, por ingestión y en contacto con
desde «A. Preparación de las muestras» hasta la «Sección 4: Análisis con el la piel.
ViroSeq® HIV-1 Genotyping System Software v2.8».
R 32 Libera gases muy tóxicos en contacto con ácidos.
El control negativo es plasma humano normal analizado para demostrar que carece R 36/38 Irrita los ojos y la piel.
de ARN del VIH-1. Debe utilizarse desde «A. Preparación de las muestras» hasta
«D1. Purificación y cuantificación de los productos de la PCR» en la sección S 26 En caso de contacto con los ojos, aclarar de inmediato con
«D. Secuenciación cíclica» para asegurarse de que no hay contaminación. Debido abundante agua y solicitar ayuda médica.
a la naturaleza de la secuenciación automatizada del ADN, no se recomienda S 35 Elimínense los residuos del producto y sus recipientes con todas
analizar un control negativo. las precauciones posibles.
S 36/37/39 Úsense indumentaria y guantes adecuados, y protección
para los ojos/la cara.
S 46 En caso de ingestión, solicitar ayuda médica de inmediato
Protocolo y mostrar el envase o la etiqueta.
Nota. Si se observan precipitados, caliente el Viral Lysis Buffer (tampón
de lisado viral) a 37 °C para disolver el precipitado y, a continuación, déjelo
enfriar a temperatura ambiente antes de utilizarlo.
A. Preparación de muestras
• Descongele el RNA Diluent (diluyente de ARN) y consérvelo a una
(El tiempo total para procesar 12 muestras es de 2,5 a 3,0 horas; el tiempo dedicado temperatura entre 2 °C y 8 °C.
a los procedimientos manuales es de 1,5 horas.) • Prepare el etanol al 70% y consérvelo a una temperatura entre 2 °C y
8 °C para utilizarlo en el paso 20.
¡IMPORTANTE! Este procedimiento se lleva a cabo en la zona de
preamplificación 1. Nota. Utilice únicamente etanol al 100% de calidad para biología molecular
y agua sin RNasa/DNasa.

A1. Preparación
PELIGRO QUÍMICO. El etanol líquido y sus vapores son
inflamables. La exposición puede causar irritación en los ojos, la piel
1. Enfríe una centrífuga con refrigeración y el rotor entre 2 °C y 8 °C, siguiendo y las vías respiratorias altas. El contacto prolongado o reiterado puede
las instrucciones del fabricante. secar la piel. La exposición puede causar la depresión del sistema
nervioso central y lesiones hepáticas. Conservar alejado del calor,
2. Descongele las muestras de plasma y un tubo de cada control (positivo y chispas y llamas. Úsense gafas, indumentaria y guantes de protección
negativo) hasta que alcancen la temperatura ambiente (entre 15 °C y 25 °C). adecuados. Consulte la Ficha de datos de seguridad del fabricante
para obtener más información.
3. Mantenga únicamente un reactivo o tubo de muestra abierto a la vez.
9. Extraiga los tubos en cuanto se detenga el rotor.

A2. Aislamiento del ARN viral del VIH-1 10. Extraiga con cuidado el sobrenadante de los tubos, con ayuda de una pipeta
de transferencia de punta fina. No desprenda el sedimento (que en algunos
casos no está visible).
1. Agite las muestras de plasma en el vórtex durante 3 a 5 segundos para
mezclarlas. RECOMENDACIÓN: Al aspirar, empiece con la punta de la pipeta de
transferencia justo debajo de la línea del menisco y vaya bajando la punta
por la pared opuesta a la marca de orientación a medida que aspira. Extraiga
2. Centrifúguelas durante 1 ó 2 segundos a 2.000 x g para acumular el la mayor cantidad de sobrenadante posible sin desprender el sedimento.
contenido en el fondo del tubo.
11. Añada 600 μL de Viral Lysis Buffer (tampón de lisado viral) a cada
3. Etiquete los tubos de acuerdo con el protocolo del laboratorio y a sedimento.
continuación, añada 0,5 mL del plasma a un tubo con tapón de rosca nuevo
sin RNasa ni DNasa.
12. Agite en el vórtex durante 3 a 5 segundos para mezclar.
4. Prepare un control con un bajo contenido de ARN viral.
13. Centrifugue durante 1 ó 2 segundos a 2.000 x g para acumular el contenido
Combine en un tubo de microcentrífuga:
en el fondo del tubo.
– 50 μL de HIV-1 8E5 Positive Control (control positivo de VIH-1 de
8E5)
– 450 μL de HIV-1 8E5 Negative Control (control negativo de VIH-1 14. Deje reposar las muestras a temperatura ambiente (entre 15 °C y 25 °C)
de 8E5) (plasma negativo) durante 10 minutos para garantizar el lisado completo del virus.
y etiquételo según corresponda.
15. Añada 600 μL de isopropanol a temperatura ambiente (entre 15 °C y 25 °C)
a cada muestra.
5. Coloque una marca de orientación en un lateral del tubo y ciérrelo.

6. Introduzca las muestras en el rotor con las marcas de orientación dirigidas


hacia el borde exterior del rotor. PELIGRO QUÍMICO. El isopropanol líquido y sus vapores
son inflamables. La exposición puede causar irritación en los ojos, la
Nota. Utilice un rotor que cierre herméticamente con una junta tórica para piel y las vías respiratorias altas. El contacto prolongado o reiterado
evitar salpicaduras y pulverización. con la piel puede causar sequedad e irritación. La exposición puede
causar efectos sobre el sistema nervioso central como somnolencia,
7. Centrifugue de 21.000 a 25.000 x g durante 60 min entre 2 °C y 8 °C. mareos y cefaleas. Úsense gafas, indumentaria y guantes de
protección adecuados. Consulte la Ficha de datos de seguridad del
fabricante para obtener más información.

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 7 de 66


16. Agite cada tubo en el vórtex durante 3 a 5 segundos para mezclar. B. Transcripción inversa
¡IMPORTANTE! Este procedimiento se lleva a cabo en la zona de
17. Introduzca las muestras en el rotor con las marcas de orientación dirigidas preamplificación 2.
hacia el borde exterior del rotor.

18. Centrifugue las muestras a 12.500 a 15.000 x g a temperatura ambiente


B1. Preparación
durante 15 min.
1. Si es necesario, descongele las muestras de ARN. Asegúrese de descongelar
19. Extraiga con cuidado el sobrenadante con una pipeta de transferencia de también el ARN de los controles positivo y negativo.
punta fina. No desprenda el sedimento (que en algunos casos no está visible).
¡IMPORTANTE! No deseche el sobrenadante junto con los residuos con 2. Agite en el vórtex durante 3 a 5 segundos para mezclar.
lejía, ya que podrían formarse gases tóxicos.
3. Etiquete un MicroAmp® Reaction Tube (tubo de reacción MicroAmp®)
20. Añada a cada tubo 1 mL del etanol al 70% preparado en el paso 8, frío (entre de 0,2 mL para cada muestra de ARN.
2 °C y 8 °C).
4. Descongele la HIV RT Mix (mezcla de TI del VIH) y el DTT.
21. Agite cada tubo en el vórtex durante 3 a 5 segundos para mezclar. Agite en el vórtex durante 3 a 5 segundos para mezclar.

22. Introduzca los tubos en el rotor con las marcas de orientación dirigidas hacia 5. Extraiga el RNase Inhibitor (inhibidor de la RNasa) y la MuLV Reverse
el borde exterior del rotor. Transcriptase (transcriptasa inversa del MuLV) del kit.

23. Centrifugue a 12.500 a 15.000 x g a temperatura ambiente durante 5 min. 6. Centrifugue todos los tubos de reactivo y las muestras durante 1 a
2 segundos a 2.000 x g para acumular el contenido en el fondo.
24. Extraiga con cuidado el sobrenadante con una pipeta de transferencia de
punta fina. No desprenda el sedimento (que ahora debe ser visible). 7. Conserve todos los reactivos y las muestras a una temperatura entre 2 °C y
Elimine la mayor cantidad posible del etanol. 8 °C o en hielo hasta el momento de utilizarlos.

25. Centrifugue durante 1 ó 2 segundos a 2.000 x g para acumular el líquido


restante en el fondo del tubo. B2. Reacciones de TI
Nota. Utilice únicamente el termociclador GeneAmp® 9600 ó 9700 situado en la
26. Extraiga con cuidado cualquier resto de etanol con otra pipeta de zona de trabajo 2.
transferencia de punta fina. Seque los tubos con aire, destapados, durante 1 Nota. Programe el termociclador antes de preparar la reacción (consulte el paso 5).
a 5 min, hasta que no se observen restos de etanol. Consulte las instrucciones de programación detalladas en el manual de
¡IMPORTANTE! Es fundamental que se elimine todo el etanol visible. funcionamiento del termociclador.
El etanol residual inhibe la reacción de TI-PCR.
1. Prepare la mezcla maestra de TI de acuerdo con la tabla siguiente. Cuando
termine, devuelva las soluciones madre a una temperatura entre –15 °C y
27. Resuspenda cada sedimento en RNA Diluent (diluyente de ARN) frío (entre
2 °C y 8 °C), de acuerdo con las directrices siguientes. –25 °C.

Volumen para 1 Volumen para 5 Volumen para 15


Añada esta cantidad de RNA Reactivo
Si la carga viral es… reacción (µL) reacciones (µL) reacciones (µL)
Diluent (diluyente de ARN)…
HIV RT Mix (mezcla de 8 40 120
> 15.000 copias/mL 100 μL TI del VIH)
2.000 a 15.000 copias/mL 50 μL RNase Inhibitor 1 5 15
desconocida 50 μL (inhibidor de la RNasa)
Controles MuLV Reverse 1 5 15
Transcriptase
Positivo sin diluir 100 μL (transcriptasa inversa
Positivo bajo 50 μL del MuLV)
DTT, 100 mM 0,4 2,0 6,0
Negativo 50 μL
Volumen final 10,4 52,0 156,0

Nota. Prepare un volumen suficiente para 1 ó 2 reacciones más a fin de


28. Agite enérgicamente en el vórtex durante 10 segundos para resuspender el compensar las pérdidas debidas al pipeteo.
sedimento. Puede quedar algo de material insoluble.
2. Agite la mezcla maestra de TI en el vórtex durante 2 a 3 segundos para
29. Centrifugue durante 1 ó 2 segundos a 2.000 x g para acumular el contenido mezclarla.
en el fondo del tubo.
3. Centrifugue durante 1 ó 2 segundos a 2.000 x g para acumular el contenido
30. Cuando finalice el procedimiento: en el fondo del tubo.
• Continúe con los pasos de la transcripción inversa o ¡IMPORTANTE! La mezcla maestra de TI debe estar a temperatura
• Detenga el procedimiento y conserve las muestras en un congelador ambiente (entre 15 °C y 25 °C) en el momento de añadirla a los tubos de
a una temperatura entre –65 °C y –80 °C. reacción. No la deje a temperatura ambiente durante más de 30 min.
¡IMPORTANTE! No congele y descongele el ARN más de dos (2) veces.
No conserve el ARN durante más de dos semanas. 4. Añada 10 μL del ARN viral a los MicroAmp® Reaction Tubes (tubos de
reacción MicroAmp®) de 0,2 mL y devuelva la solución madre de ARN viral
al hielo.
¡IMPORTANTE! Utilice una punta limpia para cada adición.

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5. Tape inmediatamente los MicroAmp® Reaction Tubes (tubos de reacción
C2. Reacción de PCR
MicroAmp®), colóquelos en el termociclador preparado en las condiciones
siguientes e inicie el programa. Espere a que la temperatura de las muestras y 1. Prepare la mezcla maestra de PCR.
del instrumento aumente gradualmente hasta los 65 °C. Mientras se calienta Combine en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mL:
el ARN, deje la mezcla maestra de TI a temperatura ambiente.
Nota. Detenga el proceso una vez transcurridos 5 minutos a 42 °C y continúe Volumen para 1 Volumen para 5 Volumen para 15
de inmediato con el paso 6. Reactivo
reacción (µL) reacciones (µL) reacciones (µL)

Temperatura (°C) Tiempo Proceso HIV PCR Mix (mezcla para 29,5 147,5 442,5
PCR del VIH)
65 30 segundos Relaja la estructura secundaria del ARN AmpliTaq Gold DNA 0,5 2,5 7,5
42 5 minutos Se enfría a la temperatura óptima para la actividad Polymerase (ADN
enzimática polimerasa AmpliTaq Gold)
Realizar una pausa de forma manual, realizar el paso 6 y pulsar Resume (Reanudar) AmpErase UNG (uracil-N- 1 5 15
glicosilasa AmpErase)
42 60 minutos Transcripción inversa
Volumen final 31 155 465
99 5 minutos Inactiva la MuLV Reverse Transcriptase
(transcriptasa inversa del MuLV)
4 Mantener Detiene el proceso hasta que esté listo para Nota. Prepare un volumen suficiente para 1 reacción más a fin de compensar
(> 10 minutos) continuar las pérdidas debidas al pipeteo.
Nota. Cuando el sistema se lo indique, establezca el volumen del
termociclador en 20 μL. 2. Agite la mezcla maestra de PCR en el vórtex durante 3 a 5 segundos para
mezclarla.
¡IMPORTANTE! Los instrumentos GeneAmp® 9600 y 9700 solo se
mantienen en pausa durante 10 minutos. El paso 6 debe llevarse a cabo antes
de que transcurran 10 minutos. 3. Centrifugue durante 1 ó 2 segundos a 2.000 x g para acumular el contenido
en el fondo del tubo.
6. Mientras el instrumento está en pausa, realice lo siguiente:
4. Añada 30 μL de la mezcla maestra de PCR a cada tubo de reacción de TI que
a. Extraiga de inmediato las muestras de ARN del termociclador. contenga ADNc del VIH-1.
b. Añada 10 μL de la mezcla maestra de TI a temperatura ambiente a cada
tubo de reacción y tape los tubos. El volumen final es ahora igual a 50 μL.
c. Agite en el vórtex la bandeja con las muestras durante 3 a 5 segundos para
mezclarlas. 5. Lleve las muestras al termociclador en la zona 3.
d. Centrifugue la bandeja de muestras durante 1 a 2 segundos a 2.000 x g No vuelva a la zona 2 durante el resto del día.
para acumular el contenido en el fondo.
6. Nota. Utilice únicamente el termociclador GeneAmp® 9600 ó 9700 situado
7. Devuelva las muestras al termociclador y pulse Resume (Reanudar). en la zona de trabajo 3.
Nota. Consulte las instrucciones de programación detalladas en el manual de
8. Al finalizar el programa de la TI, deje las muestras en el termociclador funcionamiento del termociclador.
durante al menos 10 minutos a 4 °C, pero no más de 18 horas. Configure el programa del termociclador de la siguiente forma:

9. Cuando finalice el programa: Temperatura


Tiempo Ciclos
• Continúe con los pasos de la PCR o (°C)
• Detenga el procedimiento y conserve las muestras entre –15 °C y –25 °C 50 10 min 1
hasta que esté listo para llevar a cabo la PCR; no conserve las muestras
durante más de dos semanas. 93 12 min 1
93 20 s
64 45 s 40

C. PCR 66 3 min
72 10 min 1
4 Mantener —
C1. Preparación
¡IMPORTANTE! Este procedimiento se lleva a cabo en la zona de
preamplificación 2. Nota. Cuando el sistema se lo indique, establezca el volumen del
termociclador en 50 μL.
1. Si las muestras están congeladas, descongélelas a temperatura ambiente
(entre 15 °C y 25 °C). 7. Transfiera los tubos al termociclador e inicie el programa.

2. Centrifugue la bandeja de muestras o los tubos durante 1 a 2 segundos a 8. Cuando finalice el programa:
2.000 x g para acumular el contenido en el fondo. • Continúe con los pasos de purificación o
• Detenga el procedimiento y conserve las muestras entre –15 °C y –25 °C.
3. Descongele la HIV PCR Mix (mezcla para PCR del VIH). ¡IMPORTANTE! No deje los tubos en el termociclador durante más de
24 horas. La actividad residual de la UNG podría destruir el ADN
4. Agite en el vórtex durante 3 a 5 segundos para mezclar. amplificado.

5. Extraiga la AmpliTaq Gold® DNA Polymerase (ADN polimerasa AmpliTaq


Gold®) y los reactivos de AmpErase® UNG (uracil-N-glicosilasa) del kit.
Descongele y agite en el vórtex durante 1 a 2 segundos.

6. Centrifugue todos los reactivos durante 1 a 2 segundos a 2.000 x g para


acumular el contenido en el fondo.

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D. Secuenciación cíclica Para utilizar el gel de agarosa con los productos de la PCR purificados del
YM-100 Microconcentrator (microconcentrador YM-100):
¡IMPORTANTE! Este procedimiento se lleva a cabo en la zona de
posamplificación 3. 1. Descongele el DNA Mass Ladder (marcador de peso de ADN) a temperatura
ambiente (entre 15 °C y 25 °C). Esto tardará al menos 30 minutos.
D1. Purificación y cuantificación de los productos de Antes de utilizarlo, agítelo en el vórtex durante 10 a 15 segundos para
mezclarlo.
la PCR
Hay dos métodos de purificación para los productos de la PCR. 2. Descongele el Agarose Gel Loading Buffer (solución tampón de carga
de gel de agarosa) hasta que alcance la temperatura ambiente. Esto tardará
Opción 1: Microconcentración al menos 30 minutos.
Nota. Si se forman cristales, caliente la solución a 65 °C durante 10 minutos.
Para concentrar y purificar los productos de la PCR con los YM-100 Antes de utilizarlo, agítelo en el vórtex durante 10 a 15 segundos para
Microconcentrators (microconcentradores YM-100): mezclarlo.

1. Monte el microconcentrador. 3. Prepare el gel de agarosa al 1% con TBE y 0,5 μg/mL de bromuro de etidio (o
a. Para cada muestra, etiquete bien, utilice un gel de agarosa al 1% comercial).
– Un tubo de recogida de 1,5 mL
– Una columna de centrifugación PELIGRO QUÍMICO. El bromuro de etidio causa irritación en los
b. Introduzca en cada tubo una columna de centrifugación etiquetada ojos, la piel y el aparato respiratorio, y es un mutágeno conocido (es decir,
adecuadamente, con la membrana blanca hacia arriba. puede provocar cambios en el material genético en las células vivas y puede
causar cáncer). Úsense gafas, indumentaria y guantes de protección
2. Pipetee con cuidado 300 μL de KCl (200 mM) en el depósito de cada adecuados. Consulte la Ficha de datos de seguridad del fabricante para
obtener más información.
microconcentrador. El KCl (200 mM) se suministra en el Pack 2 (paquete 2).
¡IMPORTANTE! No toque la membrana con la punta de la pipeta. 4. Prepare una solución tampón 1X de TBE en gel con 0,5 μg/mL de bromuro de
etidio.
3. Pipetee los 50 μL completos del producto para PCR de cada muestra en
el depósito del microconcentrador que contiene KCl y lleva la etiqueta
5. Coloque el gel preparado en la caja de gel.
correspondiente.
¡IMPORTANTE! No toque la membrana con la punta de la pipeta.
6. Añada suficiente solución tampón 1X de TBE en gel para cubrir el gel.

4. Tape firmemente cada tubo con el tapón correspondiente.


7. Para cada muestra, mezcle:
• 5 μL de Agarose Gel Loading Buffer (solución tampón de carga de gel
5. Centrifugue los microconcentradores preparados entre 800 y 900 x g durante de agarosa)
15 minutos. • 5 μL del producto de la PCR purificado

6. Destape los tubos y pipetee con cuidado 300 μL de agua desionizada estéril 8. Cargue la solución de DNA Mass Ladder (marcador de peso de ADN).
en el depósito de cada microconcentrador. a. 6 μL en la calle 1
¡IMPORTANTE! No toque la membrana con la punta de la pipeta. b. 3 μL en la calle 2

7. Tape firmemente cada tubo con el tapón correspondiente. Obtendrá los siguientes resultados:

8. Centrifugue los microconcentradores preparados entre 800 y 900 x g durante


15 minutos. Bandas
Calle de 6 μL Calle de 3 μL
(ng) (ng)
Posición Tamaño (kb)
9. Destape los tubos y pipetee con cuidado 35 µL de agua desionizada estéril
en el centro de cada microconcentrador. Superior 2,0 100 50

¡IMPORTANTE! No toque la membrana con la punta de la pipeta. Segundo 1,2 60 30

Tercero 0,8 40 20
10. Vuelque el contenido de los microconcentradores en tubos de recogida
nuevos y etiquetados.
a. Retire los microconcentradores del tubo que contiene el filtrado.
b. Invierta el microconcentrador de cada muestra sobre un tubo 9. Cargue el resto de las calles con 10 μL de cada muestra.
de 1,5 mL nuevo y etiquetado según corresponda.
c. Deseche el tubo usado junto con el filtrado. ¡IMPORTANTE! No olvide anotar qué muestra cargó en cada calle.

11. Centrifugue los microconcentradores preparados entre 800 y 900 x g durante 10. Realice la electroforesis a 10 V/cm hasta que el azul de bromofenol haya
5 minutos. migrado al menos 5 cm en el gel.

12. Retire y deseche los microconcentradores, conservando las muestras en los 11. Examine el gel con luz UV.
tubos.
12. Fotografíe el gel utilizando un tiempo de exposición que no sature la película
13. Tape firmemente cada tubo con el tapón correspondiente y: y permita ver las diferencias de intensidad de los fragmentos marcadores de
• Proceda a correr el gel de agarosa o bien, peso.
• Detenga el procedimiento y conserve las muestras entre –15 °C y –25 °C
durante dos semanas como máximo.

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13. Evalúe la cantidad de productos de la PCR que hay en cada muestra, 3. Prepare el gel de agarosa al 1% con TBE y 0,5 μg/mL de bromuro de etidio
comparando la intensidad de cada banda con la intensidad de las bandas (o bien, utilice un gel de agarosa al 1% comercial).
de los DNA Mass Ladder (marcadores de peso de ADN).
PELIGRO QUÍMICO. El bromuro de etidio causa irritación en
los ojos, la piel y el aparato respiratorio, y es un mutágeno conocido (es
decir, puede provocar cambios en el material genético en las células vivas y
puede causar cáncer). Úsense gafas, indumentaria y guantes de protección
adecuados. Consulte la Ficha de datos de seguridad del fabricante para
obtener más información.

4. Prepare una solución tampón 1X de TBE en gel con 0,5 μg/mL de bromuro
de etidio.

5. Coloque el gel preparado en la caja de gel.

6. Añada suficiente solución tampón 1X de TBE en gel para cubrir el gel.


Diluya el producto de la PCR restante de cada muestra con agua destilada
desionizada (H2Odd), de acuerdo con la siguiente tabla. 7. Para cada muestra, mezcle:
• 5 μL de Agarose Gel Loading Buffer (solución tampón de carga de gel
de agarosa)
Si la intensidad de la banda es… Haga lo siguiente… • 5 μL del producto de la PCR no purificado
Entre 20 y 40 ng ajuste el volumen de la muestra a 60 μL.
8. Cargue la solución de DNA Mass Ladder (marcador de peso de ADN).
Entre 40 y 60 ng diluya la muestra 1:2 con H2Odd
(1 parte de muestra y 1 parte de agua). a. 6 μL en la calle 1
Entre 60 y 100 ng diluya la muestra 1:4 con H2Odd b. 3 μL en la calle 2
(1 parte de muestra y 3 partes de agua).
> 100 ng diluya la muestra 1:10 con H2Odd Obtendrá los siguientes resultados:
(1 parte de muestra y 9 partes de agua).

Bandas
Calle de 6 μL Calle de 3 μL
Nota. La banda del producto de la TI-PCR debe tener una intensidad igual (ng) (ng)
o mayor a la de la banda del marcador de 20 ng para garantizar una Posición Tamaño (kb)
secuenciación de alta calidad. 2,0 100 50
Superior
14. Tape y agite en el vórtex cada muestra sin diluir durante 3 a 5 minutos para Segundo 1,2 60 30
mezclarla.
Tercero 0,8 40 20

15. Centrifugue durante 1 ó 2 segundos a 2.000 x g para acumular el contenido


en el fondo del tubo.
9. Cargue el resto de las calles con 10 μL de cada muestra.
16. Cuando finalice el procedimiento, continúe con la secuenciación cíclica.
¡IMPORTANTE! No olvide anotar qué muestra cargó en cada calle.

Opción 2: ExoSAP-IT® para la limpieza de productos de la PCR 10. Realice la electroforesis a 10 V/cm hasta que el azul de bromofenol haya
migrado al menos 5 cm en el gel.
Nota. La opción ExoSAP-IT requiere la cuantificación en gel de agarosa seguida
por el tratamiento con ExoSAP-IT y posteriormente, la dilución apropiada para la
secuenciación. 11. Examine el gel con luz UV.

Procesamiento del producto de PCR no purificado en el gel de agarosa para 12. Fotografíe el gel utilizando un tiempo de exposición que no sature la película
la opción ExoSAP-IT: y permita ver las diferencias de intensidad de los fragmentos marcadores de
peso.
1. Descongele el DNA Mass Ladder (marcador de peso de ADN) a
temperatura ambiente (entre 15 °C y 25 °C). Esto tardará al menos 30 13. Evalúe la cantidad de productos de la PCR que hay en cada muestra,
minutos. comparando la intensidad de cada banda con la intensidad de las bandas de
Antes de utilizarlo, agítelo en el vórtex durante 10 a 15 segundos para los DNA Mass Ladder (marcadores de peso de ADN).
mezclarlo. Nota. NO diluya en este paso.

2. Descongele el Agarose Gel Loading Buffer (solución tampón de carga de 14. Continúe con la purificación de los productos de la PCR con ExoSAP-IT en
gel de agarosa) hasta que alcance la temperatura ambiente. Esto tardará al las muestras que tengan una intensidad igual o mayor a la de la banda del
menos 30 minutos. marcador de peso de 20 ng.
Nota. Si se forman cristales, caliente la solución a 65 °C durante Nota. La banda del producto de la TI-PCR debe tener una intensidad igual
10 minutos. o mayor a la de la banda del marcador de 20 ng para garantizar una
Antes de utilizarlo, agítelo en el vórtex durante 10 a 15 segundos para secuenciación de alta calidad.
mezclarlo.

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Purificación de los productos de la PCR con ExoSAP-IT para la limpieza
de productos de la PCR: 3. Centrifugue durante 1 ó 2 segundos a 2.000 x g para acumular el contenido
en el fondo del tubo.
®
Nota. Utilice únicamente el termociclador GeneAmp 9700.
Nota. Programe el termociclador antes de preparar la reacción (consulte el paso 3). 4. Cuando finalice el procedimiento, continúe con la secuenciación cíclica.
Consulte las instrucciones de programación detalladas en el manual de
funcionamiento del termociclador.

1. Pipetee con cuidado 3 µL de ExoSAP-IT® en cada tubo con 45 µL de D2. Preparación de la secuenciación cíclica
producto de la PCR que tenga una intensidad de banda superior o igual Nota. Utilice únicamente el termociclador GeneAmp® 9600 ó 9700 situado en la
a la de la banda de 20 ng/5 µL. zona de trabajo 3.
Nota. Programe el termociclador antes de preparar la reacción (consulte el paso 7).
2. a. Tape los tubos. Consulte las instrucciones de programación detalladas en el manual de
b. Agite los tubos o la bandeja de muestras en el vórtex durante 3 a funcionamiento del termociclador.
5 segundos para mezclarlas. Nota. No prepare las reacciones de secuenciación para el control negativo.
c. Centrifugue los tubos o la bandeja de muestras durante 1 a 2 segundos ¡IMPORTANTE! Las mezclas para secuenciación son sensibles a la luz. No las
a 2.000 x g para acumular el contenido en el fondo.
exponga a la luz durante periodos prolongados.
El volumen final es ahora de 48 µL.
1. Descongele las mezclas de VIH-1 para secuenciación a temperatura
3. Programe el termociclador con el siguiente programa: ambiente (entre 15 °C y 25 °C).

2. Configure el formato de reacción. Puede utilizar una de las siguientes


Temperatura opciones.
(°C) Tiempo Ciclos
• Un MicroAmp® Reaction Tube (tubo de reacción MicroAmp®) para cada
37 15 min 1 HIV SEQ Mix (mezcla para secuenciación del VIH)
80 15 min 1 • MicroAmp® 8-Tube Strips (tiras de 8 tubos MicroAmp®) en una bandeja
MicroAmp®
4 Mantener —
• Una MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate (placa óptica de
96 pocillos para reacción MicroAmp®), incluida con el kit
Nota. Cuando el sistema se lo indique, establezca el volumen de reacción
en el termociclador en 48 μL. ¡IMPORTANTE! Si utiliza la MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate
(placa óptica de 96 pocillos para reacción MicroAmp®), deberá considerar
tanto la disposición de las muestras como la plataforma del instrumento que
4. Transfiera los tubos o la bandeja de muestras al termociclador e inicie utilice.
el programa.

5. Cuando finalice el programa, continúe con los pasos de dilución.

Dilución del producto purificado con ExoSAP-IT para la secuenciación cíclica:

1. Diluya el producto de la PCR purificado con ExoSAP-IT de cada muestra


con agua destilada desionizada (H2Odd), de acuerdo con la siguiente tabla.

Si la intensidad de la
Haga lo siguiente… Una placa de reacción de 96 pocillos cargada con la muestra 1 (S1)
banda es…
empezando en la columna 1 de la placa de 96 pocillos, S2 en la columna 2,
Entre 20 y 40 ng ajuste el volumen de la muestra a 60 μL. etc. La fila H no se utiliza, a menos que desee procesar 13 muestras en la
Entre 40 y 60 ng diluya la muestra 1:2 con H2Odd misma placa.
(1 parte de muestra y 1 parte de agua). Nota. Si utiliza un 3100-Avant Genetic Analyzer (analizador genético
Entre 60 y 100 ng diluya la muestra 1:4 con H2Odd 3100-Avant) para el paso de detección automatizada de la secuencia, solo
(1 parte de muestra y 3 partes de agua). podrá analizar 7 columnas de muestras a la vez. Las columnas de muestras
> 100 ng diluya la muestra 1:10 con H2Odd restantes y 10 µL de cada pocillo que contenga control positivo deberán
(1 parte de muestra y 9 partes de agua). transferirse a una segunda placa. Consulte Preparación de reacciones de
secuenciación purificadas para el análisis en el 3100-Avant Genetic
Analyzer (analizador genético 3100-Avant).
Ilustración:
3. En cada tubo o pocillo, combine lo siguiente:

Volumen para una


Componente
reacción (μL)
Añada una de las siguientes mezclas HIV-1 SEQ (mezclas de
VIH-1 para secuenciación) a cada tubo o pocillo de la placa:
HIV SEQ Mix A (Mezcla A para secuenciación del VIH)
HIV SEQ Mix B (Mezcla B para secuenciación del VIH) 12
HIV SEQ Mix C (Mezcla C para secuenciación del VIH)
HIV SEQ Mix D (Mezcla D para secuenciación del VIH)
HIV SEQ Mix F (Mezcla F para secuenciación del VIH)
HIV SEQ Mix G (Mezcla G para secuenciación del VIH)
HIV SEQ Mix H (Mezcla H para secuenciación del VIH)
Producto de la PCR purificado y diluido 8
2. Tape y agite en el vórtex cada muestra sin diluir durante 3 a 5 segundos para
mezclarla. Volumen final 20

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4. Tape los tubos o coloque una tapa de MicroAmp® Optical 96-Well Reaction 5. Incube las mezclas de muestras:
Plate (placa óptica de 96 pocillos para reacción MicroAmp®) sobre la placa. • A temperatura ambiente
• En la oscuridad
5. Centrifugue a temperatura ambiente entre 5 y 10 segundos. • Durante 15 minutos

6. Transfiera las muestras al termociclador. 6. Centrifugue la bandeja o la placa entre 1.500 y 2.000 x g durante 45 minutos.

7. Configure el programa del termociclador de la siguiente forma: 7. En cuanto se detenga la centrífuga, quite con cuidado los tapones o la cinta
adhesiva sin desprender los sedimentos.

Temperatura 8. Coloque de inmediato una servilleta de papel absorbente o un pañuelo de


Tiempo Ciclos
(°C)
papel que no suelte pelusa sobre la bandeja o placa, y déle la vuelta.
96 10 s
25
50 5s 9. Coloque la bandeja o la placa invertida en la centrífuga, sobre una servilleta
60 4 min o pañuelo de papel que no suelte pelusa, y centrifúguela a 700 x g durante
1 minuto.
4 Mantener —
¡IMPORTANTE! Debe centrifugar la bandeja o placa invertida
inmediatamente después de la centrifugación; de lo contrario, se perderá
la señal.
Nota. Cuando el sistema se lo indique, establezca el volumen de reacción
en el termociclador en 20 μL.
¡IMPORTANTE! No deje las muestras en el termociclador durante más de Si la bandeja o la placa… Haga lo siguiente…
24 horas. Conserve las muestras a una temperatura entre –15 °C y –25 °C.
permanecen más de 1 minuto antes de centrifúguelas de nuevo en la posición normal
centrifugarlas en posición invertida durante 5 minutos entre 1.500 y 2.000 x g antes
8. Ponga el termociclador en marcha. de centrifugarlas en la posición invertida.

9. Cuando finalice el programa:


• Continúe con los pasos de purificación o 10. Cuando se detenga la centrífuga y finalice el secado, extraiga la bandeja o la
placa, tápela con las tiras o con la cinta adhesiva de aluminio, y consérvela
• Detenga el procedimiento y conserve las muestras entre –15 °C y –25 °C. en la oscuridad a una temperatura entre –15 °C y –25 °C. Analice las
No conserve las muestras durante más de 3 días entre –15 °C y –25 °C. muestras antes de una semana.
¡IMPORTANTE! Utilice una caja oscura para la conservación. Los
productos de las reacciones de secuenciación son sensibles a la luz.
D3. Purificación de las secuencias
Hay tres métodos recomendados para la purificación de las reacciones de
secuenciación del BigDye® Terminator. D3.b Purificación con etanol/acetato sódico

D3.a Purificación de las secuencias con isopropanol 1. Prepare la solución de acetato sódico/etanol combinando lo siguiente para
cada reacción:
1. Extraiga la bandeja MicroAmp® del termociclador y destape los tubos o 2 μL de acetato sódico 3,0 M, pH 5,2
la placa. 50 μL de etanol al 100%

2. Añada a cada mezcla de muestra:


• 20 μL de agua desionizada PELIGRO QUÍMICO. El etanol líquido y sus vapores son
• 60 μL de isopropanol al 100% inflamables. La exposición puede causar irritación en los ojos, la piel y las
vías respiratorias altas. El contacto prolongado o reiterado puede secar la
piel. La exposición puede causar la depresión del sistema nervioso central
y lesiones hepáticas. Conservar alejado del calor, chispas y llamas. Úsense
PELIGRO QUÍMICO. El isopropanol líquido y sus vapores gafas, indumentaria y guantes de protección adecuados.
son inflamables. La exposición puede causar irritación en los ojos, la Prepare una cantidad suficiente para una reacción más de las necesarias.
piel y las vías respiratorias altas. El contacto prolongado o reiterado Consulte la Ficha de datos de seguridad del fabricante para obtener más
con la piel puede causar sequedad e irritación. La exposición puede información.
causar efectos sobre el sistema nervioso central como somnolencia,
mareos y cefaleas. Úsense gafas, indumentaria y guantes de ¡IMPORTANTE! Prepare una solución nueva para cada serie de
protección adecuados. Consulte la Ficha de datos de seguridad del precipitaciones.
fabricante para obtener más información.
2. Añada 52 μL de la solución de acetato sódico/etanol a cada reacción
También puede preparar una nueva solución madre combinando: de secuenciación.
• 1 parte de agua desionizada
• 3 partes de isopropanol al 100% 3. Tape los tubos con las tiras correspondientes o cubra la placa con cinta
Después, añada 80 μL a cada mezcla de muestra. adhesiva de aluminio.

3. Tape los tubos con las tiras correspondientes o cubra la placa con cinta 4. Mezcle por inversión (tres veces) o agite en el vórtex.
adhesiva de aluminio. ¡IMPORTANTE! Mezcle exhaustivamente en este paso. Esto es
fundamental para una precipitación eficaz.
4. Agite en el vórtex o invierta la bandeja varias veces para mezclar
el contenido. 5. Centrifugue a 2.000 x g durante 20 minutos.

6. En cuanto se detenga la centrífuga, quite los tapones o la cinta adhesiva sin


desprender los sedimentos.

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 13 de 66


7. Coloque de inmediato una servilleta de papel absorbente o un pañuelo de 10. Cuando se detenga la centrífuga y finalice el secado, extraiga la bandeja o la
papel que no suelte pelusa sobre la bandeja o placa, y déle la vuelta. placa, tápela con las tiras o con la cinta adhesiva de aluminio, y consérvela
en la oscuridad a una temperatura entre –15 °C y –25 °C. Analice las
8. Centrifugue a 150 x g durante 1 minuto. muestras antes de una semana.
¡IMPORTANTE! Utilice una caja oscura para la conservación. Los
productos de las reacciones de secuenciación son sensibles a la luz.
9. Añada 150 μL de etanol al 70% a cada pocillo.

10. Centrifugue a 2.000 x g durante 5 minutos.

11. Coloque de inmediato una servilleta de papel absorbente o un pañuelo de Control de calidad
papel que no suelte pelusa sobre la bandeja o placa, y déle la vuelta.
El ViroSeq™(8E5) Control Module, que contiene controles tanto positivos como
negativos, se incluye con el ViroSeq HIV-1 Genotyping System. Se debe utilizar
12. Centrifugue a 150 x g durante 1 minuto. un control positivo y uno negativo en cada análisis. Para controlar tanto el éxito de la
TI-PCR como el del genotipado se necesita el HIV-1 8E5 Positive Control (control
13. Cuando se detenga la centrífuga y finalice el secado, extraiga la bandeja o la positivo de VIH-1 de 8E5). El HIV-1 8E5 Negative Control (control negativo de
placa, tápela con las tiras o con la cinta adhesiva de aluminio, y consérvela VIH-1 de 8E5) solo se necesita para controlar el éxito de la TI-PCR.
en la oscuridad a una temperatura entre –15 °C y –25 °C. Analice las
muestras antes de una semana.
¡IMPORTANTE! Utilice una caja oscura para la conservación. Los Éxito de la TI-PCR
productos de las reacciones de secuenciación son sensibles a la luz.
El éxito de la TI-PCR se determina en la sección «D1. Purificación y cuantificación
de los productos de la PCR». Para garantizar una secuenciación de alta calidad, la
D3.c Purificación con placas de 96 pocillos CENTRI•SEP 96™ intensidad de la banda de TI-PCR debe ser igual o superior a la del marcador de
20 ng en el gel de agarosa. Las muestras de plasma con cargas virales superiores a
¡IMPORTANTE! Las placas CENTRI•SEP 96 son sensibles a la temperatura. No las 2.000 copias/mL deben proporcionar al menos 20 ng de producto de la TI-PCR
las conserve a temperaturas inferiores a 4 °C. Las placas deben estar a temperatura en este paso. A medida que la carga viral desciende por debajo de las 1.000
ambiente antes de utilizarlas. copias/mL, las probabilidades de éxito en la PCR disminuyen. Sin embargo,
cualquier muestra que tenga una cuantificación de ADN de 20 ng o más se puede
secuenciar para obtener un genotipo, independientemente de la concentración inicial
1. Asegúrese de que las placas CENTRI•SEP 96 estén a temperatura ambiente. en el plasma. El HIV-1 8E5 Positive Control (control positivo de VIH-1 de 8E5)
tiene una carga viral inicial de 50.000 a 100.000 copias/mL; el control positivo bajo
2. Desprenda la película adhesiva de aluminio de la parte inferior de la placa (dilución 1:10) tiene una carga viral de 5.000 a 10.000 copias/mL. El control
CENTRI•SEP 96 y a continuación, de la parte superior. negativo no tiene un nivel detectable de ARN del VIH-1.
Los resultados de TI/PCR esperados para los controles ViroSeq son:
3. Prepare la placa CENTRI•SEP 96.
a. Apile la placa CENTRI•SEP 96 sobre una MicroAmp® Optical 96-Well Control positivo/positivo bajo Control negativo
Reaction Plate (placa óptica de 96 pocillos para reacción MicroAmp®)
Valor esperado > 40 ng/5 μL (control Valor esperado 0 ng
y una las dos placas y una base con cinta adhesiva. positivo sin diluir)
b. Centrifugue la placa a 700 x g durante 2 minutos para empacar la > 20 ng/5 μL (control
columna. positivo bajo)
c. Retire la cinta adhesiva y separe las placas. Si… Haga lo siguiente… Si… Haga lo siguiente…
d. Deseche el líquido sobrante en la placa de lavado agitándola la intensidad de la el análisis no es válido. hay cualquier banda se ha producido
enérgicamente. banda es: Repita la prueba. presente en el gel de contaminación entre las
e. Lave la MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate (placa óptica de • Control positivo agarosa muestras.
96 pocillos para reacción MicroAmp®) y guárdela para utilizarla como sin diluir: • Ninguno de los
placa de lavado. < 40 ng resultados de las
• Control positivo muestras es válido
bajo: • Repita desde «A.
< 20 ng Preparación de las
4. Coloque una placa de recogida de 96 pocillos en una base de 96 pocillos muestras» hasta
y apile sobre ella la placa CENTRI•SEP 96. «D1. Purificación
y cuantificación
de los productos
5. Una las placas a la base de 96 pocillos con cinta adhesiva, asegurándose de de la PCR».
alinear los índices alfanuméricos de todas las placas. todas las demás se ha producido un fallo
reacciones de las del sistema.
muestras han fallado • Repita todas las
6. Cargue las reacciones de secuenciación. Con una pipeta multicanal, (menos de 20 ng/5 μL). muestras y los
transfiera los 20 μL de las reacciones de secuenciación a cada pocillo de la controles
placa CENTRI•SEP 96.
se ha repetido el fallo póngase en contacto con
• Coloque con cuidado todas las muestras en el centro de los lechos de gel. el servicio técnico de
No coloque las muestras en el lateral de los pocillos. Abbott Molecular
• No toque el lecho de gel con las puntas de la pipeta.

7. Centrifugue la placa a 700 x g durante 2 minutos.


Limitaciones
8. Deseche únicamente la placa CENTRI•SEP (debe haber cerca de 20 μL
en cada pocillo de la placa de recogida).
Reactivos y bioquímica
9. Seque las muestras en una centrífuga con bomba de vacío, utilizando un rotor
apropiado. No seque excesivamente las muestras. • El ensayo ViroSeq solo pueden realizarlo usuarios capacitados.
• La obtención de resultados exactos y fiables depende de una recogida
y conservación adecuadas de las muestras antes de realizar la prueba.
• La sangre recogida en tubos con heparina no es adecuada para utilizarse en PCR
ni con este ensayo.

Página 14 de 66 ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0


• Las pruebas de resistencia a antirretrovirales solo se han validado en muestras de
pacientes con cargas virales entre 2.000 y 750.000 copias/mL. En EE. UU., en
una población típica de pacientes positivos para el VIH tratados con HAART
(tratamiento antirretroviral sumamente activo), es previsible que el 25% de los
pacientes muestren supresión de la carga viral. Es posible que estas muestras
no siempre generen resultados interpretables con el ViroSeq HIV-1 Genotyping
System si la carga viral es inferior a 1.000 copias/mL. Los usuarios deben
analizar las muestras problema con una carga viral igual o superior a
2.000 copias/mL.
• Independientemente de la carga viral, la intensidad de la banda del producto de
la TI-PCR en el gel de agarosa debe ser igual o superior a la del marcador de
20 ng para producir una secuencia de alta calidad.
• La presencia de AmpErase® UNG (uracil-N-glicosilasa AmpErase®) en el
ViroSeq HIV-1 Genotyping System solo reduce el riesgo de contaminación con
el producto previamente amplificado. La contaminación entre las muestras o a
partir del control positivo podría seguir produciéndose. El seguimiento riguroso
de las instrucciones sobre la preparación de la zona de trabajo y del protocolo
reduce la posibilidad de contaminación.
• Con este ensayo, solo se pueden utilizar secuenciadores de ADN automatizados
y termocicladores de Applied Biosystems.

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 15 de 66


Sección 3: Secuenciación COLUMNAS
COLUMNS

de series analíticas A
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

en los ABI PRISM ® 3100 y


B

C
F
RI
D
O
L

3100-Avant Genetic
W
A
S E
S
F

Analyzers (Analizadores
G

: Una serie
Runanalítica en el 3100-Avant Genetic Analyzer

genéticos ABI PRISM®


Single on 3100-Avant Genetic Analyzer (4 capillary array)
(Analizador genético 3100-Avant ) con matriz de 4 capilares

: Una serie
Single Runanalítica
on 3100enGenetic
el 3100Analyzer
Genetic Analyzer
(16 capillary array)
(Analizador genético 3100) con matriz de 16 capilares

3100 y 3100-Avant) • Asegúrese de que el instrumento esté calibrado antes de proceder con
el análisis. Consulte la sección 6: Mantenimiento y calibración de los
analizadores ABI PRISM ® 3100 y 3100-Avant Genetic Analyzers
Contenido: (Analizadores genéticos ABI PRISM® 3100 y 3100-Avant).
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 • Si desea ver las ilustraciones y diagramas que explican cómo llevar a cabo una
tarea específica en el ABI PRISM ® 3100 Genetic Analyzer (Analizador genético
Material necesario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16 ABI PRISM® 3100), consulte el ABI PRISM ® 3100 Genetic Analyzer User Guide
Protocolo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 (Guía del usuario del analizador genético ABI PRISM® 3100), (PN 4334785).
• Si desea ver las ilustraciones y diagramas que explican cómo llevar a cabo una
tarea específica en el ABI PRISM ® 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador
genético ABI PRISM® 3100-Avant), consulte el ABI PRISM ® 3100-Avant Genetic
Introducción Analyzer User Guide (Guía del usuario del analizador genético ABI PRISM®
3100-Avant), (PN 4333549).
El ViroSeq™ HIV-1 Genotyping System v2.0 está aprobado para uso diagnóstico
in vitro con el programa ViroSeq® HIV-1 Genotyping System Software v2.8
en los analizadores ABI PRISM ® 3100 Genetic Analyzer (Analizador genético
ABI PRISM® 3100) y ABI PRISM ® 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador Material necesario
genético ABI PRISM® 3100-Avant). Ambos instrumentos son plataformas de
electroforesis capilar con fluorescencia, totalmente automatizadas, que analizan
simultáneamente las muestras de un mismo análisis. Tal como se resume a Artículo ABI
continuación, las diferencias principales entre las dos plataformas son el número
de placas de 96 pocillos que es posible cargar en el instrumento y el número de ®
ABI PRISM 3100 Genetic ®
ABI PRISM 3100 Genetic 3100-01
capilares de la matriz de capilares. Analyzer (Analizador genético Analyzer (Analizador genético ¡IMPORTANTE! No debe
ABI PRISM® 3100) con: ABI PRISM® 3100) con: descargarse software de Internet
Nota. El número de capilares en la matriz de capilares del instrumento determina • Data Collection Software • Data Collection Software para este uso específico.
el tamaño del análisis. v.1.0.1 (software de v.1.1 (software de recogida
recogida de datos v.1.0.1) de datos v.1.1)
3100-Avant Genetic Analyzer 3100 Genetic Analyzer • Versión del firmware • Versión del firmware
Parámetro (Analizador genético (Analizador genético 6286100-04 6286150-01
3100-Avant) 3100) • PC con: • PC con:
– Microsoft® Windows – Microsoft® Windows
Número de placas de 96 pocillos 1 2 NT® v.4.0 NT® v.4.0, Service
– Procesador Intel® Pack 5 o 6a
Número de capilares en la matriz 4 16 Pentium® III a – Procesador Intel®
550 MHz Pentium® IV a 2 GHz
Número de series analíticas por placa 24 6 – 256 MB de RAM – 1 GB de RAM
de 96 pocillos – Disco duro de 18 GB – 2 x discos duros de
• Kit de limpieza del bloque 36 GB
de polímero • Kit de limpieza del bloque
de polímero
Juntos, estos parámetros definen el rendimiento del instrumento y permiten a cada
centro determinar la configuración del sistema más adecuada para el volumen de ABI PRISM ® 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético 3100-AVANT
secuenciación actual y futuro. ABI PRISM® 3100-Avant) con: ¡IMPORTANTE! No debe
• Data Collection Software v.1.0 (software de recogida de descargarse software de Internet
datos v.1.0) para este uso específico.
Mapa de la placa de 96 pocillos •

Versión del firmware 6278000-01 ó 6278050-01
PC con:
– Microsoft® Windows NT® v.4.0, Service Pack 6 o 6a
En el 3100 Genetic Analyzer (Analizador genético 3100), cada serie analítica está – Procesador Intel® Pentium® IV a 2 GHz
compuesta por las inyecciones de los 16 pocillos de dos columnas consecutivas de – 1 GB de RAM
la placa, empezando con la columna que contiene el pocillo A1 (es decir, del pocillo – 2 x discos duros de 36 GB
A1 hasta el H2, del pocillo A3 hasta el H4, etc.). Esto significa que para una placa • Kit de limpieza del bloque de polímero
completa, se necesitan seis series analíticas para inyectar los 96 pocillos. ABI PRISM ® Sequencing Analysis Software v.3.7 para el 4317380
En el 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético 3100-Avant), cada serie ordenador con Windows NT® Si necesita licencias adicionales,
utilice 4310990 y especifique la
analítica está compuesta por las inyecciones de 4 pocillos consecutivos de una v.3.7
columna de la placa, comenzando por la columna que contiene el pocillo A1 (es ¡IMPORTANTE! No descargue
decir, del pocillo A1 hasta el D1, del E1 hasta el H1, del A2 hasta el D2, etc.). Es software de Internet para este uso
decir, se necesitan cuatro series analíticas para inyectar 16 pocillos y 24 series para específico.
inyectar una placa completa de 96 pocillos.

Página 16 de 66 ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0


3. Pulse Ctrl+Alt+Delete (Ctrl+Alt+Supr) y escriba lo que corresponda en los
Artículo ABI campos user name (Nombre de usuario) y password (Contraseña).
GeneAmp® PCR System 9600 Thermal Cycler N801-0001 • Si el ordenador está conectado a una red, no tendrá que iniciar sesión en
(Termociclador 9600 del sistema de PCR GeneAmp®) o ó la red antes de poner en marcha el instrumento.
GeneAmp® PCR System 9700 Thermal Cycler (Termociclador N805-0001 • OrbixWeb™ Daemon se iniciará automáticamente. Si no es así, haga
9700 del sistema de PCR GeneAmp®) doble clic en el acceso directo a OrbixWeb Daemon en el escritorio o
MicroAmp® 96-Well Support Base (Base de soporte de 96 N801-0531 seleccione Start > Applied Biosystems > OrbixWeb Daemon (Inicio >
pocillos MicroAmp®) Applied Biosystems > OrbixWeb Daemon).
Separadores de depósitos 4315932 Nota. OrbixWeb Daemon debe estar ejecutándose para que pueda
ejecutarse el programa 3100 o 3100-Avant Data Collection Software
Base de placa de 96 pocillos 4317237 (software de recogida de datos del analizador 3100 o 3100-Avant).
Retenedor de placa de 96 pocillos 4317241
Separadores de placa de 96 pocillos 4315933
4. ¡IMPORTANTE! En el caso del 3100 Data Collection software v.1.1
(software de recogida de datos del analizador 3100 v.1.1) y del 3100-Avant
®
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (placa óptica de N801-0560 Data Collection software v.1.0 (software de recogida de datos del analizador
96 pocillos para reacción MicroAmp®) 3100-Avant v.1.0), debe estar ejecutándose AE Server además de
Jeringa de vidrio para llenado de la matriz, 250 μL 4304470 OrbixWeb Daemon para poder llevar a cabo la extracción y el análisis de
los datos.
Jeringa de vidrio con polímero de reserva, 5,0 mL 628-3731
Si el AE Server no se inicia automáticamente, haga doble clic en el acceso
Juntas tóricas de jeringa 221102 directo a AE Server o seleccione Start > Applied Biosystems > 3100
Utilities > AE Server (Inicio > Applied Biosystems > Utilidades del 3100 >
3100 Performance Optimized Polymer 6 (POP-6™) 4316357
Servidor AE).
Solución tampón 10X con EDTA del analizador genético 402824
Formamida Hi-Di™, 25 mL 4311320
Encendido del instrumento

1. En el ordenador, compruebe que:


Contiene formamida. • El ordenador esté encendido.
R 61 Riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el • El sistema operativo Microsoft® Windows NT® esté cargado.
feto.
R 36/38 Irrita los ojos y la piel. Nota. El ordenador debe estar encendido y el sistema operativo Windows
S 53 Evítese la exposición – recábense instrucciones especiales NT debe estar ejecutándose antes de utilizar el instrumento.
antes del uso.
S 24/25 Evítese el contacto con los ojos y la piel.
S 35 Elimínense los residuos del producto y sus recipientes con
2. Asegúrese de que en el instrumento:
todas las precauciones posibles. • La puerta de la estufa esté cerrada y bloqueada
S 36/37/39 Úsense indumentaria y guantes adecuados, y • Las puertas del instrumento estén cerradas
protección para los ojos/la cara.
S 45 En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al Nota. Si las puertas están abiertas al encender el instrumento, se encenderá
médico (si es posible, muéstresele la etiqueta). una luz de advertencia.
ABI PRISM ® 3100 Capillary Array (matriz de capilares 4315930
ABI PRISM® 3100), 50 cm 3. Pulse el botón de encendido/apagado situado en la parte frontal del
instrumento.
ABI PRISM ®
3100-Avant Capillary Array (matriz de capilares 4333466
®
ABI PRISM 3100-Avant), 50 cm Nota. Mientras el instrumento se inicializa y realiza autocomprobaciones,
la luz amarilla de estado parpadeará.

4. Asegúrese de que la luz verde de estado esté encendida y sin parpadear antes
Protocolo de continuar.
Nota. Si no se enciende la luz verde, inicie el software de recogida de datos
y consulte el registro de sucesos. La ruta de acceso al registro de sucesos es:
Preparación para la detección de secuencias D:\AppliedBio\3100\Data Collection
o
automatizada D:\AppliedBio\3100-Avant\Data Collection

Inicio de la estación de trabajo


Nota. Debe encender el ordenador de la estación de trabajo antes de encender
Software de recogida de datos
el instrumento.
Para determinar las versiones del firmware de los analizadores 3100 o 3100-Avant
y del Data Collection software (software de recogida de datos) instalado en
el sistema, haga clic en el botón
1. Encienda el monitor.
About Data Collection (Acerca de la recogida de datos) en la barra
2. Encienda el ordenador. de herramientas.
Cuando el ordenador arranca, se abre el cuadro de diálogo Begin Logon ¡IMPORTANTE! Utilice únicamente las siguientes versiones del software:
(Comenzar inicio de sesión).
ABI 3100 Data Collection software v.1.0.1 (software de recogida de datos
del ABI 3100 v.1.0.1) con el Firmware v.6286100-04
o
ABI 3100 Data Collection software v.1.1 (software de recogida de datos
del ABI 3100 v.1.1) con el Firmware v.6286150-01
o
ABI 3100-Avant Data Collection software v.1.0 (software de recogida de datos
del ABI 3100-Avant v.1.0) con el Firmware v.6278000-01 o v.6278050-01

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 17 de 66


No cambie de lugar ni elimine archivos ni carpetas a menos que se lo indique
un representante de Applied Biosystems o el ABI PRISM ® 3100 o ABI PRISM ® 5. Compruebe:
3100-Avant Genetic Analyzer User Guide (Guía del usuario del analizador genético • Que el bloque de polímero esté firmemente encajado en el instrumento.
ABI PRISM® 3100 o ABI PRISM® 3100-Avant). De lo contrario, el software podría • Si hay polímero seco alrededor del bloque de polímero y límpielo si es
quedar inutilizable. necesario.
• Si hay fugas alrededor de la jeringa y las tuercas de los tornillos.
Inicio del software de recogida de datos • Que las puntas de los capilares no estén aplastadas ni dañadas.

6. Si acaba de instalar una matriz de capilares nueva o usada en el instrumento,


1. Compruebe que el instrumento esté encendido y que la luz de estado verde realice una calibración espacial.
esté encendida de forma continua (que no parpadee).
7. Realice una calibración espectral si es necesario. Consulte Realización de
2. Asegúrese de que se esté ejecutando OrbixWeb Daemon (el botón una calibración espectral.
correspondiente debe aparecer en la barra de tareas de Windows NT).
Si OrbixWeb Daemon no se está ejecutando, seleccione Start > Applied
Biosystems > OrbixWeb Daemon (Inicio > Applied Biosystems >
OrbixWeb Daemon). Uso del software de recogida de datos
¡IMPORTANTE! Debe iniciar OrbixWeb Daemon antes de ejecutar
el software de recogida de datos. Para el 3100 Data Collection
Para el 3100 Data Collection Software v.1.1 (software de
recogida de datos del analizador
3. ¡IMPORTANTE! En el caso del 3100 Data Collection software v.1.1 Software v.1.0.1 (software de 3100 v.1.1) y el 3100-Avant Data
(software de recogida de datos del analizador 3100 v.1.1) y del 3100-Avant recogida de datos del analizador
3100 v.1.0.1) Collection Software v.1.0 (software
Data Collection software v.1.0 (software de recogida de datos del analizador de recogida de datos del analizador
3100-Avant v.1.0), debe estar ejecutándose AE Server además 3100-Avant v.1.0)
de OrbixWeb Daemon.
Si AE Server no se está ejecutando, seleccione Start > Applied Biosystems 1. Seleccione View > Preferences Seleccione View > Preferences
> 3100 Utilities > AE Server (Inicio > Applied Biosystems > Utilidades del (Ver > Preferencias). (Ver > Preferencias).
3100 > Servidor AE).
2. En la ventana Setting Preferences En la ventana Setting Preferences
4. Seleccione Start > Applied Biosystems > 3100 Data Collection o (Preferencias de configuración), haga (Preferencias de configuración), haga
3100-Avant Data Collection (Inicio > Applied Biosystems > recogida de clic en la ficha Data Analysis clic en la ficha Data Analysis and
datos del 3100 o recogida de datos del 3100-Avant). (Análisis de datos) y seleccione las Extraction (Extracción y análisis de
siguientes opciones: datos) y seleccione las siguientes
• Seleccione AutoAnalysis On opciones:
(Análisis automático activado) • Seleccione Enable AutoAnalysis
Preparación para el análisis • Desactive Enable BioLIMS (Activar análisis automático)
Nota. Después de abrir la puerta del instrumento, y antes de ejecutar cualquier otro (Activar BioLIMS) • Desactive Extract to Sequence
comando, debe esperar a que finalice la secuencia de vuelta a la posición inicial del • Especifique el formato en Collector (Extraer en el
inyector automático. Sample File Name Prefix recopilador de secuencias)
Format (Formato del prefijo del • Seleccione By run (Por serie
nombre del archivo de muestras): analítica) para los archivos de
1. Prepare y tenga a mano los siguientes reactivos y consumibles: – Sample Name (Nombre de la muestras agrupadas
• 3100 Performance Optimized Polymer 6 (POP-6™) muestra) • Especifique el formato en
• Una matriz de 50 cm, de 16 o de 4 capilares – Well Position (Posición del Sample File Name Format
pocillo) (Formato del nombre de los
• Solución tampón 10X con EDTA del analizador genético archivos de muestras)
– <none> (ninguno)
Nota. Para preparar la solución tampón 1X con EDTA del analizador – Sample Name (Nombre de la
genético, diluya la solución tampón 10X con EDTA del analizador genético muestra)
con agua desionizada. – Well Position (Posición del
pocillo)
– <none> (ninguno)

PELIGRO QUÍMICO. El polímero POP-6 causa irritación en los 3. Haga clic en OK (Aceptar). Haga clic en OK (Aceptar).
ojos, la piel y el aparato respiratorio. Utilice protección ocular, guantes y
ropa protectora apropiados. 4. Seleccione la ficha Plate View (Vista Seleccione la ficha Plate View (Vista
de la placa) y haga clic en New de la placa) y haga clic en New
2. Asegúrese de que hay suficiente polímero POP-6 para el análisis (1,5 mL (Nuevo), o seleccione Tools > Plate (Nuevo), o seleccione Tools > Plate
para una placa de 96 pocillos) y añada polímero si es necesario. Editor (Herramientas > Editor de Editor (Herramientas > Editor de
placas). placas).
Nota. Cambie el polímero si lleva en el instrumento más de 7 días. No
utilice un polímero que haya caducado o que contenga precipitaciones.
5. En el cuadro de diálogo Plate Editor En el cuadro de diálogo Plate Editor
(Editor de placas) que se abre: (Editor de placas) que se abre:
3. Rellene o cambie los depósitos de tampón y de agua antes de cada análisis. • Escriba el nombre de la placa • Escriba el nombre de la placa
• Depósito del ánodo. Llene hasta la línea de llenado con una nueva • Especifique la aplicación • Especifique la aplicación
solución tampón 1X con EDTA del analizador genético (9 mL). Sequencing (Secuenciación) Sequencing (Secuenciación)
• Depósito del cátodo. Llene hasta la línea de llenado con una nueva • Especifique el tipo de placa de • Especifique el tipo de placa
solución tampón 1X con EDTA del analizador genético (16 mL). 96-Well (96 pocillos) 96-Well (96 pocillos)
• Depósitos de agua. Llene hasta la línea de llenado con agua fresca
desionizada (16 mL cada uno). ¡IMPORTANTE! Utilice ¡IMPORTANTE! Utilice
únicamente letras y números, o los únicamente letras y números, o los
símbolos que se indican a símbolos que se indican a
4. Compruebe que no haya burbujas en los canales del bloque de polímero. continuación. No utilice espacios. continuación. No utilice espacios.
Si hay burbujas, presione la jeringa hasta eliminarlas. -_(){}#.+ -_(){}#.+

6. Haga clic en Finish (Finalizar). Haga clic en Finish (Finalizar).


Se abrirá la hoja de cálculo Plate Se abrirá la hoja de cálculo Plate
Editor (Editor de placas). Editor (Editor de placas).

Página 18 de 66 ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0


Uso del Editor de placas
1. Si las muestras están congeladas, espere a que se equilibren a temperatura
ambiente.
1. En la columna Sample Name (Nombre de la muestra), escriba los nombres
de las muestras. ¡IMPORTANTE! Esto debe hacerse inmediatamente antes de cargar las
muestras.
¡IMPORTANTE! Asegúrese de utilizar la convención de nombres de muestras
que se indica a continuación. Para que el programa ViroSeq® HIV-1
Genotyping System Software v2.8 compile correctamente los proyectos de 2. Resuspenda las muestras añadiendo 20 μL de formamida Hi-Di a cada
muestras, el nombre de la muestra debe seguir esta convención de pocillo de muestra; utilice una alícuota nueva de formamida Hi-Di para cada
nomenclatura. experimento.
• El nombre de la muestra tiene un límite de 32 caracteres como máximo.
• Para los nombres de las muestras se pueden utilizar únicamente letras,
números y los siguientes símbolos: -_(){}#.+. NO UTILICE ESPACIOS. Contiene formamida.
• El nombre de la muestra debe ser idéntico para las siete secuencias de R 61 Riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto.
cebadores de una muestra. R 36/38 Irrita los ojos y la piel.
• El nombre de la muestra y la identificación del cebador deben separarse S 53 Evítese la exposición – recábense instrucciones especiales antes del uso.
con dos subrayados consecutivos (doble subrayado).
S 24/25 Evítese el contacto con los ojos y la piel.
• La identificación del cebador contiene el nombre del cebador y cualquier
otra información específica de esa secuencia. S 35 Elimínense los residuos del producto y sus recipientes con todas las
precauciones posibles.
Por ejemplo:
S 36/37/39 Úsense indumentaria y guantes adecuados, y protección para los
• Patient196__A
ojos/la cara.
• Patient196__B
S 45 En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico
• Patient196__C
(si es posible, muéstresele la etiqueta).
Nota. Las muestras resuspendidas en formamida Hi-Di son estables a
2. Seleccione la siguiente configuración para cada muestra de la hoja de temperatura ambiente durante un máximo de 35 horas. No deje estas
cálculo. muestras a temperatura ambiente durante más tiempo.
3100 Data
Collection 3100 Data
Collection 3100-Avant Data 3. Agite en el vórtex durante 10 a 15 segundos.
Software v.1.0.1 Collection Software
(software de Software v.1.1
(software de v.1.0 (software de
recogida de recogida de datos 4. Centrifugue la placa entre 30 y 40 segundos a 2.000 x g para que el líquido se
datos del recogida de datos
del analizador
analizador 3100 del analizador
3100-Avant v.1.0) acumule en el fondo de la placa.
v.1.0.1) 3100 v.1.1)
Nota. No es necesario desnaturalizar las muestras con calor.
Dye Set (Conjunto de E E E
colorantes) 5. Prepare e instale la unidad de placa.
Mobility File DT3100POP6 DT3100POP6 DT3100POP6{BD}
(Archivo de {BD}v2.mob {BD}v2.mob v2.mob
movilidad)
Preparación de reacciones de secuenciación
escriba escriba escriba comentarios,
Comments
(Comentarios)
comentarios, si comentarios, si si procede purificadas para el análisis en el 3100-Avant
procede procede
Genetic Analyzer (Analizador genético
BioLIMS Project 3100-Project1 — —
(Proyecto BioLIMS) 3100-Avant)
Project Name — 3100-Project1 3100Avant-Project1
(Nombre del
proyecto) 1. Si las muestras están congeladas, espere a que se equilibren a temperatura
ambiente.
Run Module 1 StdSeq50_POP6 StdSeq50_POP6 StdSeq50_POP6 ¡IMPORTANTE! Esto debe hacerse inmediatamente antes de cargar las
(Módulo de análisis 1) DefaultModule DefaultModule DefaultModule
muestras.
BC- — —
Analysis Mode 1
3100SR_SeqOff 2. Resuspenda las muestras añadiendo 20 μL de formamida Hi-Di a cada
(Modo de análisis 1)
FtOff.saz
pocillo de muestra; utilice una alícuota nueva de formamida Hi-Di para cada
— BC- BC- experimento.
Analysis Module 1
3100POP6SR_Seq 3100APOP6SR_Seq
(Módulo de análisis 1)
OffFtOff.saz OffFtOff.saz

Contiene formamida.
Nota. Para facilitar la introducción de texto, seleccione la configuración
apropiada para la primera muestra y, a continuación, haga clic en el R 61 Riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto.
encabezado de la columna para seleccionar toda la columna. Después, en R 36/38 Irrita los ojos y la piel.
el menú Edit (Edición), utilice el comando Fill Down (Rellenar) o pulse S 53 Evítese la exposición – recábense instrucciones especiales antes del uso.
Ctrl + D. S 24/25 Evítese el contacto con los ojos y la piel.
S 35 Elimínense los residuos del producto y sus recipientes con todas las
3. Compruebe que el registro de la placa sea correcto y haga clic en OK precauciones posibles.
(Aceptar) para volver al menú principal. S 36/37/39 Úsense indumentaria y guantes adecuados, y protección para los
ojos/la cara.
S 45 En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico
Preparación de reacciones de secuenciación (si es posible, muéstresele la etiqueta).
Nota. Las muestras resuspendidas en formamida Hi-Di son estables a
purificadas para el análisis en el 3100 Genetic temperatura ambiente durante un máximo de 35 horas. No deje estas
Analyzer (Analizador genético 3100) muestras a temperatura ambiente durante más tiempo.

Nota. Las instrucciones para preparar reacciones de secuenciación purificadas para 3. Agite en el vórtex durante 10 a 15 segundos.
el análisis en el 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético 3100-Avant) se
describen en la siguiente sección.

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 19 de 66


4. Centrifugue la placa entre 30 y 40 segundos a 2.000 x g para que el líquido se 5. Seleccione el indicador de posición de la placa que desea vincular al registro
acumule en el fondo de la placa. que acaba de seleccionar.
Nota. No es necesario desnaturalizar las muestras con calor. • El color del indicador de posición de la placa cambiará a verde.
• El registro de la placa se pasa de la tabla Pending Plate Records
(Registros de placa pendientes) a la tabla Linked Plate Records
5. ¡IMPORTANTE! La señal se puede degradar si se dejan las muestras en el (Registros de placa vinculados).
3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético 3100-Avant) durante más
de 14 series analíticas (1 serie analítica = aproximadamente 2,5 horas). Nota. La duración de este proceso es variable y depende del número de
muestras.
Si la placa contiene 7 o menos columnas de muestras (incluido el control),
prepare e instale la placa en la unidad de placa tal como se describe en
«Carga de muestras y vinculación de una placa al registro de la placa». 6. Haga clic en la ficha Run View (Vista del análisis) para ver el plan de
análisis.
O bien,
• Seleccione cada serie analítica para comprobar que se resaltan los
Si la placa contiene más de 7 columnas de muestras, continúe con el paso 6 pocillos apropiados.
que se describe a continuación.
¡IMPORTANTE! Si el pocillo no está resaltado, no se analizará.
6. Transfiera las columnas de muestras sobrantes de la placa 1 a una nueva
placa MicroAmp® Optical 96-Well Reaction Plate (placa óptica de 7. Para añadir información a un registro de placa vinculado:
96 pocillos para reacción MicroAmp®) (placa 2). a. Desvincule el registro de la placa y devuélvalo a la tabla Pending Plate
Nota. Se pueden adquirir placas adicionales de Applied Biosystems. Records (Registros de placa pendientes).
Consulte Material necesario en la página 5. b. Haga doble clic en el nombre del registro de la placa para abrirlo.
c. Actualice el registro de la placa y haga clic en OK (Aceptar).
7. Transfiera 10 µL de control positivo (la mitad del volumen de la d. Vincule de nuevo el registro de la placa a la placa.
configuración de secuenciación) de la placa 1 a la placa 2. Realice este paso
en los 7 pocillos que contienen el control positivo. 8. Compruebe que la placa esté vinculada.

8. Prepare e instale la placa 1 en la unidad de placa tal como se describe en


«Carga de muestras y vinculación de una placa al registro de la placa». Desvinculación del registro de una placa
9. Selle la placa 2 con cinta adhesiva de aluminio y consérvela en la oscuridad, 1. En la tabla Linked Plate Records (Registros de placa vinculados) de la
a una temperatura entre –15 °C y –25 °C. Analice las muestras antes de una página Plate View (Vista de la placa), seleccione el registro de la placa que
semana. desee desvincular.
Nota. Cargue la placa 2 cuando finalice la placa 1. Siga los pasos 10 a 13
que se describen a continuación. 2. Haga clic en Unlink (Desvincular).

10. Espere a que la placa 2 se equilibre a la temperatura ambiente.


Si el registro de
¡IMPORTANTE! Esto debe hacerse inmediatamente antes de cargar las El registro de la placa…
la placa está…
muestras.
Finalizado Pasará a la tabla Processed Plate Records (Registros de placa
11. Agite en el vórtex durante 10 a 15 segundos. procesados) y el color del indicador de posición de la placa
cambiará de nuevo a amarillo.

12. Centrifugue la placa entre 30 y 40 segundos a 2.000 x g para que el líquido se No finalizado Volverá a la tabla Pending Plate Records (Registros de placa
acumule en el fondo de la placa. pendientes) y el color del indicador de posición de la placa
cambiará de nuevo a amarillo.
Nota. No es necesario desnaturalizar las muestras con calor.

13. Prepare e instale la placa 2 en la unidad de placa tal como se describe a


continuación en «Carga de muestras y vinculación de una placa al registro de
la placa». Inicio del análisis

1. ¡IMPORTANTE! No interrumpa un análisis.


Carga de muestras y vinculación de una placa Haga clic en el botón Run Instrument (Accionar el instrumento) de color
al registro de la placa verde para iniciar el análisis.
¡IMPORTANTE! No realice simultáneamente un análisis de datos ni
1. Acople un separador de 96 pocillos a la placa, y encaje la placa en el ejecute ningún otro programa de software durante la secuenciación. Si la
retenedor y la base del analizador. estación de trabajo está ocupada con la recogida de datos, los datos de
secuenciación deben transferirse a otro ordenador para analizarlos.
2. Coloque la placa con las reacciones de secuenciación en el instrumento.
2. El software comprueba automáticamente el espacio disponible en la base de
• Coloque el pocillo A1 en la esquina superior derecha. datos y en la unidad D.

3. Haga clic en la ficha Plate View (Vista de la placa). Si la base de datos


Entonces…
o la unidad D…
• Compruebe que el indicador de posición de la placa está de color
amarillo.
Está llena Si la unidad D está llena, copie los archivos de las muestras a un
CD-RW o elimine la muestra original de la unidad. Después, haga
4. En la tabla Pending Plate Records (Registros de placa pendientes), clic en Run Instrument (Accionar el instrumento).
seleccione el Plate Record (Registro de la placa) correspondiente a la placa Si la base de datos está llena, emplee la utilidad CleanUp DB
(Limpiar base de datos) para limpiar la base de datos. Después,
que va a cargar. haga clic en Run Instrument (Accionar el instrumento).

No está llena Se inicia el análisis.

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Si los datos se han vuelto a extraer, se encontrarán en la ubicación definida en las
3. Cuando finalice el preanálisis, compruebe lo siguiente: preferencias o en la siguiente ubicación predeterminada:
• Starting Electrophoresis (Iniciando electroforesis) aparece en
la esquina inferior izquierda de la pantalla D:\AppliedBio\3100\DataExtractor\Extracted Runs
• EP está en On (Activado) o
• Oven Temp (Temperatura de la estufa) está en 50,0 °C D:\AppliedBio\3100-Avant\DataExtractor\Extracted Runs
Nota. Si no hay corriente eléctrica, habrá una burbuja en el bloque de
polímero y deberá:
Uso del programa ABI PRISM ® Sequencing
a. Cancelar el análisis.
b. Eliminar la burbuja del bloque de polímero. Analysis Software v3.7 y análisis de los datos
c. Reinicie el análisis.
ABI PRISM Sequencing Analysis Software
4. Para supervisar el progreso del análisis, seleccione View >
Instrument Status Monitor (Ver > Monitor de estado del instrumento). El programa ABI PRISM Sequencing Analysis Software v3.7 se instalará en el disco
duro de la estación de trabajo. Este programa se utiliza para:
• Revisar las secuencias de bases identificadas
• Reanalizar los datos
No utilice datos que estén en proceso de recopilarse si se produce un corte
de corriente en medio de un análisis.
Módulo de análisis del analizador genético para utilizar
con el ViroSeq HIV-1 Genotyping System v2.0
Para ver los datos sin analizar Para el programa 3100 Data Collection software v.1.0.1 (software de recogida
de datos del analizador 3100 v.1.0.1), utilice: BC-3100SR_SeqOffFtOff.saz
¡IMPORTANTE! Cierre siempre las ventanas Array View (Vista de la matriz) o
y Capillary View (Vista de los capilares). Durante un análisis, no deje abiertas estas
páginas durante períodos prolongados. Esto podría provocar problemas de Para el programa 3100 Data Collection software v.1.1 (software de recogida de datos
actualización de la pantalla irrecuperables. Deje abierta la ventana Status View del analizador 3100 v.1.1), utilice: BC-3100POP6SR_SeqOffFtOff.saz
(Vista del estado).
o
Para el programa 3100-Avant Data Collection software v.1.0 (software de recogida
Vista de los datos sin procesar de un análisis finalizado de datos del analizador 3100-Avant v.1.0), utilice:
BC-3100APOP6SR_SeqOffFtOff.saz
1. En el Data Collection Software (software de recogida de datos),
seleccione la ficha Array View (Vista de la matriz).
Parámetros de procesamiento
2. Seleccione Instrument > Data Acquisition > Display Run Data Un parámetro de procesamiento es una palabra, una frase o una casilla de verificación
(Instrumento > Adquisición de datos > Mostrar datos del análisis). que indica al programa Sequencing Analysis (Análisis de la secuenciación) qué hay
que hacer en un determinado punto del procesamiento del archivo.
3. En la lista desplegable, seleccione el análisis que desee ver y haga clic en
OK (Aceptar). Creación de Basecaller Settings (Configuración
Nota. Puede ver cualquier análisis finalizado que esté en la base de datos del del identificador de bases)
instrumento. Pueden pasar unos instantes hasta que se recuperen los datos,
sobre todo si la base de datos está bastante llena. Basecaller Settings (Configuración del identificador de bases) establece las
funciones del programa Basecaller (Identificador de bases) que permiten definir
el número de bases de los archivos de datos que se desea analizar.
4. Utilice las funciones de desplazamiento de la página Array View (Vista de la
matriz) para ver los datos. Durante la identificación de las bases, Basecaller (Identificador de bases) tiene en
cuenta tanto lo establecido en Basecaller Settings (Configuración del identificador
de bases) como el valor de Stop Point (Punto de parada) en la ventana Sample
5. O bien, si desea ver los datos del electroferograma de varios capilares a la Manager (Administrador de muestras), y se detiene en cuanto encuentra uno de los
vez, seleccione la ficha Capillary View (Vista de los capilares) para abrir la criterios de interrupción o el valor del Stop Point (Punto de parada), lo que ocurra
página Capillary View (Vista de los capilares). primero.

1. En el programa Sequencing Analysis (Análisis de la secuenciación),


Para ver los datos analizados seleccione Edit > Preferences > Basecaller Settings (Edición > Preferencias
> Configuración del identificador de bases).
Cuando finaliza un análisis, los archivos de las muestras analizadas se extraen en
una carpeta para el análisis, junto con un registro del análisis, en la ubicación
definida en las preferencias o bien, en la siguiente ubicación predeterminada: 2. En la ventana Preferences (Preferencias), haga clic en Create a set (Crear un
conjunto).
D:\AppliedBio\3100\DataExtractor
o
D:\AppliedBio\3100-Avant\DataExtractor 3. Seleccione la casilla de verificación Set the endpoint (Establecer el punto
de interrupción) y escriba 580 en el cuadro de texto.

4. Guarde estos ajustes como configuración predefinida con el nombre HIV580.

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 21 de 66


Establecimiento del parámetro del identificador de bases 5. Borre las columnas P (Imprimir) y F (Factura).

1. Seleccione Edit > Preferences > Sample Manager Defaults (Edición > 6. Haga clic en Start (Inicio).
Preferencias > Configuración predeterminada del administrador de muestras).
7. Después del análisis, compruebe si aparece un cuadro verde para cada
2. Seleccione el Basecaller (Identificador de bases) apropiado en la lista muestra en la columna A.
desplegable Basecaller (Identificador de bases):
¡IMPORTANTE! Si alguna muestra tiene un cuadro rojo, revise la
Para el programa 3100 Data Collection software v.1.0.1 (software de recogida configuración y analice de nuevo los datos.
de datos del analizador 3100 v.1.0.1), seleccione: 3100SR
Para el programa 3100 Data Collection software v.1.1 (software de recogida de
datos del analizador 3100 v.1.1), seleccione: 3100POP6SR Adición de los archivos de muestras
Para el programa 3100-Avant Data Collection software v.1.0 (software
de recogida de datos del analizador 3100-Avant v.1.0), seleccione:
3100APOP6SR 1. Haga clic en Add files (Añadir archivos) en la ventana Sample Manager
(Administrador de muestras) o seleccione Manager > Add Files
(Administrador > Añadir archivos).
La parte superior del cuadro de diálogo que se abre es similar a un cuadro
Nota. El analizador 3100 o 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético de diálogo de directorio típico, pero solo muestra los nombres de las
3100 o 3100-Avant) está listo para iniciar el análisis de la secuencia.
carpetas y los archivos de muestras.

Uso de la ventana Sample Manager (Administrador 2. En el cuadro de lista superior, localice y abra la carpeta que contiene los
de muestras) archivos que desea añadir a Sample Manager (Administrador de
muestras).
La ventana Sample Manager (Administrador de muestras) permite seleccionar una
lista de los archivos de muestras que procesará el programa Sequencing Analysis
(Análisis de la secuenciación) y elegir los valores de varios parámetros del análisis. 3. Añada los archivos que desee de Sample Manager (Administrador de
muestras) a la lista Sample Files (Archivos de muestras) de la parte
inferior del cuadro de diálogo.
1. Para abrir la ventana, seleccione Window > Show Sample Manager
(Ventana > Mostrar administrador de muestras). Para añadir… Entonces…

2. Para cerrar la ventana, seleccione Window > Hide Sample Manager Un solo archivo a la lista Seleccione el archivo y haga clic en Add (Añadir),
(Ventana > Ocultar administrador de muestras). o haga doble clic en el nombre del archivo.

Todos los archivos a la lista Haga clic en Add All (Añadir todos).
Uso del programa Sequencing Analysis (Análisis de
la secuenciación) Algunos archivos a la lista Añádalos individualmente o bien, haga clic en
Add All (Añadir todos) y utilice después el botón
Remove (Eliminar) para quitar los archivos que no
desee añadir a la lista.
1. Cuando finalice el análisis, inicie el programa Sequencing Analysis
(Análisis de la secuenciación).

2. Añada todos los archivos de las carpetas Run (Análisis) a Sample Manager 4. Cuando todos los archivos deseados estén en las listas de la parte inferior,
(Administrador de muestras). haga clic en Finish (Finalizar) para cerrar el cuadro de diálogo y añadir
los archivos a Sample Manager (Administrador de muestras).
3. Seleccione la configuración siguiente para cada muestra:
Puede eliminar un archivo de muestras de la ventana Sample Manager
Para el programa 3100 Data Collection
software v.1.0.1 (software de recogida de (Administrador de muestras) en cualquier momento, excepto cuando el programa
datos del analizador 3100 v.1.0.1): esté procesando ese archivo. También puede cambiar el orden en el que aparecen los
Basecaller-3100SR archivos de muestras en la ventana Sample Manager (Administrador de muestras).
Para el programa 3100 Data Collection
Basecaller (Identificador de bases) software v.1.1 (software de recogida de datos
del analizador 3100 v.1.1): Eliminación de un archivo
Basecaller-3100POP6SR
Para el programa 3100-Avant Data Collection
software v.1.0 (software de recogida de datos 1. Haga clic en el nombre del archivo en la columna Sample File Name
del analizador 3100-Avant v.1.0):
Basecaller-3100APOP6SR (Nombre del archivo de muestras).
Aparecerá resaltada la fila completa.
Spacing (Separación) Definido por el instrumento
Basecaller Setting (Configuración del HIV580 2. Pulse la tecla Supr o bien, haga clic en Remove (Eliminar) en la parte
identificador de bases)
superior de la ventana o seleccione Manager > Remove Files
Peak 1 Location (Ubicación del pico 1) Establecido por el software (Administrador > Eliminar archivos).
Start Point (Punto de inicio) Establecido por el software
El programa Sequencing Analysis (Análisis de la secuenciación) eliminará
el archivo de la lista.
Stop Point (Punto de parada) Establecido por el software
DyeSet/Primer (Conjunto de DT3100POP6{BD}v2
colorantes/Cebador)
Factura settings (Configuración de Esta función no se utiliza con el ensayo
factura) ViroSeq

4. Seleccione la casilla de verificación A (analizar) para cada muestra.

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Eliminación de varios archivos Antes de utilizar el programa ViroSeq® HIV-1
Genotyping System Software
1. Para eliminar todos los archivos.
a. Seleccione Edit > Select All (Edición > Seleccionar todos).
b. Haga clic en Remove (Eliminar) o pulse la tecla Supr.
Lista de comprobación para los datos de análisis
de la secuenciación del ADN
2. Para eliminar varios archivos adyacentes. Antes de analizar los datos de Sequencing Analysis (Análisis de la secuenciación)
a. Haga clic en el nombre del primer archivo del grupo en Sample File del ADN con el programa ViroSeq® HIV-1 Genotyping System Software, revise lo
Name (Nombre del archivo de muestras). siguiente en los archivos:
b. Mientras mantiene pulsada la tecla Mayús, haga clic en el nombre del
último archivo del grupo en Sample File Name (Nombre del archivo Artículo Compruebe/Acción
de muestras).
c. Haga clic en Remove (Eliminar) o pulse la tecla Supr. Revise o corrija los Start Inspeccione un subconjunto de muestras para comprobar que
Points (Puntos de inicio) los Start Points (Puntos de inicio) se han establecido
correctamente.
3. Para eliminar varios archivos no adyacentes. • Establezca Start Points (Puntos de inicio) después del
a. Mientras mantiene pulsada la tecla Ctrl, haga clic en el nombre de cada blob de terminación del colorante inicial.
o
archivo que desea eliminar en Sample File Name (Nombre del archivo • Determine el Start Point (Punto de inicio) medio para un
de muestras). subconjunto de muestras, introduzca este valor en Start
b. Haga clic en Remove (Eliminar) o pulse la tecla Supr. Point (Punto de inicio) y Peak 1 Location (Ubicación del
pico 1) de la primera muestra, y a continuación, seleccione
Fill Down (Rellenar) para todas las muestras.

Reordenación de archivos Revise o corrija los Stop Compruebe que los Stop Points (Puntos de parada) para un
Points (Puntos de parada) subconjunto de muestras estén en el punto de 580 bases.
En caso contrario, asegúrese de seleccionar HIV580.
1. Haga clic en el nombre del archivo en la columna Sample File Name
(Nombre del archivo de muestras). Nombres de las muestras Compruebe que los nombres de los archivos de muestras sean
correctos. Utilice el mismo nombre de muestra para todas las
Aparecerá resaltada la fila completa. muestras de un proyecto. El nombre de los archivos de
muestras:
• Debe tener menos de 59 caracteres
2. Mientras mantiene pulsada la tecla Alt, arrastre el nombre del archivo a una • Debe incluir toda la información necesaria para identificar
nueva ubicación en la columna Sample File Name (Nombre del archivo de una muestra.
muestras). • Debe tener dos subrayados consecutivos para separar el
nombre de la muestra y el cebador de la secuencia.
El software ViroSeq necesita este doble subrayado para
compilar y crear proyectos.
Impresión de los datos de un análisis ¡IMPORTANTE! La información que aparece a la izquierda
del doble subrayado debe ser idéntica para las seis o siete
secuencias de una muestra. La información que aparece a la
derecha del doble subrayado es exclusiva de cada secuencia y
1. Si desea cambiar temporalmente la orientación de la página, el tipo de papel, debe incluir la letra del cebador.
el número de paneles/página, etc., seleccione File > Print Setup (Archivo >
Configuración de impresión) para abrir un cuadro de diálogo Print Setup Archivo DyeSet/Primer El archivo DyeSet/Primer (Conjunto de colorantes/Cebador)
(Configuración de impresión) especial. (Conjunto de correcto para el análisis.
colorantes/Cebador)

2. Ajuste la configuración según sea necesario. Después, haga clic en OK Intensidad suficiente de Revise las cifras de intensidad de la señal para cada base.
(Aceptar) para cerrar el cuadro de diálogo. la señal Si el valor total de intensidad de la señal del A, C, G y T es
inferior a 400, inspeccione los datos sin procesar y los datos
analizados, y deseche los datos con ruido.
3. Abra el archivo que desee imprimir.
¡IMPORTANTE! Es necesario que se hayan secuenciado correctamente seis de los
4. Seleccione File > Print (Archivo > Imprimir) para abrir el cuadro de diálogo siete segmentos para poder continuar con el análisis en el software ViroSeq. Uno de
Printing Options (Opciones de impresión). los segmentos faltantes puede ser A o D.

5. Si desea dejar un margen izquierdo más ancho para realizar perforaciones,


seleccione Allow for 3-hole punch (Dejar espacio para 3 perforaciones).

6. Haga clic en OK (Aceptar) para cerrar el cuadro de diálogo Printing


Options (Opciones de impresión) y abrir el cuadro de diálogo Printer
(Impresora) estándar de la impresora.

7. Realice los cambios necesarios en el cuadro de diálogo Printer (Impresora)


y haga clic en Print (Imprimir) para empezar a imprimir.

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 23 de 66


Sección 4: Análisis Término
Archivo de proyecto
Definición
El archivo principal que crea y que utiliza el software ViroSeq. Contiene
todos los datos necesarios para producir un análisis de genotipos.

con el ViroSeq® HIV-1 Secuencia de referencia La secuencia fija que se utiliza para todas las comparaciones. La
secuencia de referencia del ViroSeq se basa en el HXB-2 (GenBank
K03455).
Archivo de la muestra Un archivo que contiene todos los datos de secuencia de una muestra,

Genotyping System Secuencia


generado por el programa ABI PRISM® DNA Sequencing Analysis
Software.
Una cadena de bases nucleotídicas.

Software v2.8 Segmento de secuencia


Recortado
Los datos de secuencia obtenidos de un cebador.
Marcaje de datos para excluirlos del proceso de obtención de la
secuencia consensuada.
VM Virtual Machine. El intérprete de Windows Java™ que permite que
el ordenador comprenda el lenguaje Java.
Contenido: XML Extensible Markup Language (Lenguaje de marcado extensible). Un
formato flexible de texto que se utiliza para el intercambio de datos
Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24 en Internet y en otros lugares.
Material necesario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
Requisitos del sistema para ejecutar el programa ViroSeq® Software v2.8. . . . . 24
Instalación, desinstalación y uso del software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
Ejemplos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 Material necesario
Edición de los datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
Informe sobre resistencia a antirretrovirales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
Descripción
Tablas de mutaciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
Mensajes de error del software. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
ViroSeq® HIV-1 Genotyping System Software v2.8 4J94-22
Software ViroSeq® y resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

Introducción Requisitos del sistema para ejecutar


Para generar un proyecto el software ViroSeq®
procesa los seis o siete archivos de
secuencia de cebador correspondientes a una misma muestra de plasma. Un
el programa ViroSeq® Software v2.8
proyecto es un conjunto de los archivos de muestras que contienen toda la
información de secuenciación necesaria para producir un genotipo. El formato del Para ejecutar el software ViroSeq sin conexión en un ordenador independiente
proyecto permite la revisión y la edición manual de los datos del electroferograma se deben cumplir los siguientes requisitos. El software no puede instalarse en
para generar una secuencia consensuada final para los genes de la proteasa y de Windows NT.:
la transcriptasa inversa (TI) del VIH-1. • Java™ Runtime Environment (JRE)
¡IMPORTANTE! Para obtener información acerca de las limitaciones y anomalías Microsoft® Windows® 2000 - JRE versión 1.4.2_10,
conocidas del ViroSeq® HIV-1 Genotyping System Software v2.8, consulte las o
Release Notes (Notas de la versión) incluidas en el ViroSeq Software v2.8 CD
(CD del software ViroSeq v.2.8). Microsoft® Windows® XP - JRE versión 1.4.2_10.
Nota. JRE se incluy en el CD de instalación del software ViroSeq y se instala
automáticamente junto con el software ViroSeq.
Terminología empleada en esta sección
Término Definición
Configuración 1 Configuración 2 Configuración 3

ASCII Acrónimo de American Standard Code for Information Interchange Requisitos del sistema Requisitos del sistema Requisitos del sistema
(código normalizado estadounidense para el intercambio de operativo: operativo: operativo:
información). Un formato de texto simple que muchas plataformas
y ordenadores reconocen. • Microsoft® Windows® • Microsoft® Windows® XP, • Microsoft® Windows® XP,
Identificación de bases La identidad del nucleótido asignado a un pico de señal de un 2000, Service Pack 4 Service Pack 2 Service Pack 2
electroferograma.
Plataforma: Plataforma: Plataforma:
Secuencia consensuada Una secuencia obtenida a partir de varias secuencias ya alineadas.
• Procesador Intel® • Procesador Intel® • Procesador Intel® Core™
Cursor de edición Un elemento gráfico que resalta un solo nucleótido de la secuencia Pentium® IV (un solo Pentium® M (un solo 2 Duo (doble núcleo)
consensuada y que se convierte en la diana de la operación de edición. núcleo) núcleo)
Electroferograma Las señales procesadas de la fluorescencia de los colorantes de
secuenciación, calculadas por el software de recogida y análisis de datos • 2,0 GHz o más • 1,86 GHz o más • 2,4 GHz o más
suministrado con el instrumento de secuenciación. • 1 GB de RAM o más • 512 MB de RAM o más • 2 GB de RAM o más
FASTA Un archivo de texto con formato ASCII que contiene información del
nombre del archivo y una secuencia. • Disco duro de 40 GB o más • Disco duro de 40 GB o más • Disco duro de 40 GB o más
IUB International Union of Biochemists (Unión internacional de • Teclado, ratón • Teclado, ratón • Teclado, ratón
bioquímicos)
• Monitor que admita una • Monitor que admita una • Monitor que admita una
Java Un lenguaje de programación diseñado para generar aplicaciones que resolución de pantalla de resolución de pantalla de resolución de pantalla de
puedan ejecutarse en sistemas operativos distintos sin necesidad de 1.280 x 1.024 1.280 x 1.024 1.440 x 900
modificaciones.
Barra de navegación Elemento gráfico que muestra las posiciones de interés (POI) y permite
desplazarse a los datos correspondientes.
POI Acrónimo de Position of Interest (posición de interés). La posición de un
nucleótido que debe ser investigado por el usuario.
Identificación del cebador La correspondencia de una secuencia con un cebador conocido.
Proyecto La entidad de software que comprende los datos, el historial de
ediciones, las posiciones de recorte, las secuencias ensambladas, etc.,
asociadas al procesamiento de los segmentos de secuencias de una sola
muestra de VIH-1.

Página 24 de 66 ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0


Instalación, desinstalación y uso Inicio del software
del software Hay tres formas de iniciar el software:

Antes de instalar o desinstalar el ViroSeq® software v2.8, debe iniciar una sesión en 1. Haga doble clic en el icono de ViroSeq v2.8 en el escritorio.
Windows utilizando una cuenta con privilegios de administrador. No intente instalar
o desinstalar el software ViroSeq desde una cuenta de usuario estándar o restringido. ADVERTENCIA: No abra más de una copia de la aplicación ViroSeq
software v2.8 a la vez.

Para instalar el software en un ordenador con 2. Inicie el software ViroSeq desde el menú Start (Inicio).
Windows 2000 o XP a. Haga clic en el menú Start (Inicio).
b. Seleccione Programs > ViroSeq v2.8 > ViroSeq v2.8 (Programas >
ViroSeq v2.8 > ViroSeq v2.8).
Se necesitan privilegios de administrador para que la instalación se ejecute
correctamente.
3. Inicie el software desde C:\ViroSeq v2.8.
1. Cierre todas las demás aplicaciones del escritorio. a. Haga clic en el directorio C:\ViroSeq v2.8.
b. Haga doble clic en el icono de ViroSeq.
2. Introduzca el ViroSeq software v2.8 CD (CD del software ViroSeq v.2.8) en
la unidad de CD.
Inicio de una sesión en el software
3. El instalador debe iniciarse automáticamente. Si no lo hace, haga lo
siguiente: Por motivos de seguridad, el programa requiere que cada usuario inicie una sesión.
a. Haga doble clic en My Computer (Mi PC) en el escritorio. Al arrancar el programa aparece la ventana de diálogo User Login (Inicio de sesión
b. Con el botón derecho del ratón, seleccione la unidad que contenga el CD. de usuario). Introduzca un nombre de usuario y una contraseña válidos y a
c. Seleccione Explore (Explorar). continuación haga clic en OK (Aceptar). El nombre de usuario, al igual que la fecha
d. En Windows Explorer (Explorador de Windows), abra la carpeta del y la hora del sistema, se registran en la ventana History (Historial). Consulte
Software Error Messages (Mensajes de error del software).
software ViroSeq. Haga doble clic en Setup.exe.
Si va a iniciar una sesión por primera vez, el nombre de usuario predeterminado
es Admin y la contraseña es hiv1.
4. Acepte las condiciones del License Agreement (Contrato de licencia).

5. Siga las instrucciones de la pantalla del instalador.


Nota. El software se instalará en el directorio C:. Puede seleccionarse un
directorio diferente si se desea. El icono de ViroSeq v2.8 se instalará
automáticamente en el escritorio.

Para desinstalar el software en un ordenador con


Windows 2000 o XP
El software se puede eliminar fácilmente del ordenador utilizando el programa
Uninstall (Desinstalar). El desinstalador eliminará todos los archivos del programa
y el icono del escritorio, pero dejará en el sistema los archivos modificados por
el usuario.

1. En el menú Start (Inicio) de Windows, seleccione Start > Programs >


ViroSeq v2.8 > Uninstall (Inicio > Programas > ViroSeq v2.8 >
Desinstalar).

2. Se abrirá el cuadro de diálogo InstallShield Wizard (Asistente para la


instalación).

3. Haga clic en Remove (Eliminar).

4. Haga clic en Next (Siguiente).

5. Aparecerá un cuadro de diálogo de confirmación.

6. Haga clic en Yes (Sí) para desinstalar la aplicación.

7. El proceso de desinstalación se llevará a cabo automáticamente y luego se


mostrará la ventana de diálogo Maintenance Complete (Mantenimiento
finalizado).

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 25 de 66


Cambio de la contraseña de administrador (Edición > Cambiar contraseñas). Cuando aparezca el cuadro de diálogo User
Access (Acceso de usuario), escriba la información adecuada en los campos Current
Password (Contraseña actual), New Password (Contraseña nueva) y Re-Enter
1. Escriba el nombre del centro en el cuadro Installation Site (Centro de Password (Reintroducir contraseña), y después haga clic en OK (Aceptar).
instalación). Las siguientes reglas se aplican a los nombres de usuario y a las contraseñas:
Nota. Se admiten abreviaturas e identificaciones numéricas. • Los nombres de usuario deben ser únicos. No distinguen entre mayúsculas
y minúsculas.
• Se permiten espacios en el nombre de usuario y la contraseña.
2. En Default Password (Contraseña predeterminada), escriba hiv1. • Las contraseñas distinguen entre mayúsculas y minúsculas.
• El campo de la contraseña no puede quedarse en blanco.
3. Escriba su propia contraseña en el cuadro New Password (Contraseña • Las contraseñas deben tener 6 caracteres como mínimo y 14 como máximo.
nueva) y en el cuadro Re-Enter Password (Reintroducir contraseña). • Las contraseñas aparecen en la pantalla como asteriscos.
Nota. La contraseña distingue entre mayúsculas y minúsculas, y debe tener • Las contraseñas pueden contener letras, números y caracteres especiales
un mínimo de seis y un máximo de 14 caracteres. (imprimibles).
• No se puede utilizar la contraseña predeterminada hiv1 al añadir un usuario
4. Haga clic en OK (Aceptar). nuevo.

Verificación de la instalación del software


Adición de usuarios nuevos
Compruebe que el programa ViroSeq HIV-1 Genotyping System Software v2.8 se
haya instalado correctamente, mediante el análisis de los archivos de muestras de
El software ViroSeq solo puede ser utilizado por usuarios capacitados. demostración QA10 (.ab1), ubicados en el directorio C:\ViroSeq v2.8.

1. Haga clic en New (Nuevo) en la ventana Project Status (Estado del


1. En la ventana Navigation (Navegación), seleccione Edit > Change proyecto). Se abrirá el cuadro de diálogo Open (Abrir).
Passwords (Edición > Cambiar contraseñas).
Nota. Es necesario abrir un proyecto de ViroSeq para que aparezca 2. Vaya a la carpeta C:\ViroSeq v2.8 > Projects > Demo > QA10 (C:\ViroSeq
la ventana Navigation (Navegación). v2.8 > Proyectos > Demo > QA10).

2. En el panel User Information (Información del usuario), escriba el nuevo 3. Seleccione un archivo de datos de secuencia y haga clic en Open (Abrir).
nombre de usuario que desee añadir en el cuadro User Name (Nombre de El software ensambla y alinea los datos para generar una secuencia
usuario). consensuada a partir de los archivos .ab1 encontrados en la carpeta QA10.
Se abrirán las ventanas Navigation (Navegación) y View*Edit
3. En el cuadro Employee ID (ID del empleado), escriba el nombre o el (Ver*Edición), que muestran el proyecto compilado final para QA10.
número de identificación del empleado.
4. Seleccione File > Generate Resistance Report (Archivo > Generar informe
4. Escriba una contraseña en el cuadro New Password (Contraseña nueva) sobre resistencia) para obtener una vista preliminar de las mutaciones de
y en el cuadro Re-Enter Password (Reintroducir contraseña). resistencia farmacológica detalladas en la página 1 del informe Antiretroviral
Drug Resistance Report (Informe sobre resistencia a antirretrovirales).
5. Haga clic en Add User (Añadir usuario).
El nuevo usuario aparecerá en el panel Registered Users (Usuarios Compruebe que las mutaciones de resistencia farmacológica resultantes coincidan
registrados). con la información de la tabla siguiente:

6. Puede seguir añadiendo usuarios si es necesario; cuando termine, haga clic


en OK (Aceptar). QA10 RT Proteasa
Resistencia M41L L10I
Mutaciones A62V L24I
Eliminación de un usuario T69ins
V118I
M46I
F53L
M184V I54V
T215Y A71V
1. En la ventana Navigation (Navegación), seleccione Edit > Change V82A
Passwords (Edición > Cambiar contraseñas).
Se abrirá el cuadro de diálogo Administrator Access (Acceso de
administrador).
Descripción general del proyecto
2. En el panel Registered Users (Usuarios registrados), seleccione el nombre
que desea eliminar. Pasos principales de un proyecto
Se habilitará el botón Remove (Eliminar).
Archivos de datos de Compruebe lo siguiente:
3. Haga clic en Remove (Eliminar) para quitar al usuario seleccionado secuenciación del ADN • Calidad correcta de la secuencia
y después, haga clic en OK (Aceptar). • Presencia de límites definidos
• Nombres correctos de las muestras
• Archivo DyeSet/Primer (Conjunto de colorantes/Cebador)
apropiado
Cambio de las contraseñas de usuario
Creación de un proyecto nuevo • Busque y seleccione los archivos de secuenciación
El administrador puede cambiar las contraseñas de usuario en la ventana de diálogo • Compile el proyecto
Administrator Access (Acceso de administrador), después de seleccionar Edit >
Change Passwords (Edición > Cambiar contraseñas). Los usuarios que no sean
administradores pueden cambiar las contraseñas de usuario en el cuadro de diálogo
User Access (Acceso de usuario), después de seleccionar Edit > Change Passwords

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Revisión de los datos del Verifique que:
Apertura de un proyecto existente
proyecto • Se haya compilado un número suficiente de archivos
de secuenciación 1. En la ventana Project Status (Estado del proyecto), seleccione el proyecto
• Los nombres de las muestras sean correctos que desee.
• Los archivos de secuenciación estén alineados en el
orden y en la orientación correctos Si el proyecto deseado no aparece en la ventana Project Status (Estado
del proyecto):
Edición de los datos • Escriba la información específica del paciente, del a. Haga clic en Find (Buscar) para abrir el cuadro de diálogo Open
laboratorio y de las muestras (Abrir).
• Distinga entre los picos y el ruido b. Vaya a la carpeta en la que está guardado el proyecto.
• Recorte los extremos de los segmentos c. Seleccione el proyecto que desee.
• Verifique y concilie las identificaciones de bases mixtas
y las bases que no se correspondan
• Compare con la secuencia de referencia 2. Haga clic en Open (Abrir). Se abrirán las ventanas Navigation
(Navegación) y View*Edit (Ver*Edición) del proyecto.
Preparación del informe sobre • Imprímalo o guárdelo en formato XML
resistencia • Guarde el archivo FASTA
¡IMPORTANTE! No abra y edite el mismo archivo de proyecto en más de una
copia del software ViroSeq. Si edita los mismos segmentos de datos a la vez en
varias instancias de ViroSeq, ocasionará un comportamiento inesperado del
Creación de un proyecto nuevo software.

1. Inicie el software ViroSeq y haga clic en New (Nuevo), en la ventana


Project Status (Estado del proyecto). La ventana Navigation (Navegación)
Se abrirá el cuadro de diálogo Open (Abrir).
Después de compilar un proyecto, el software ViroSeq muestra gráficamente
Si el software ViroSeq ya está abierto, seleccione File > New Project la secuencia consensuada en la ventana Navigation (Navegación). La ventana
(Archivo > Proyecto nuevo). Navigation (Navegación) tiene dos partes:
• La barra de navegación
2. Vaya a la carpeta que contiene los archivos del software Sequencing
Analysis (Análisis de la secuenciación) y ábrala. • La sección de alineación de segmentos

3. Seleccione un archivo de datos de secuencia y haga clic en Open (Abrir).


El software ensamblará y alineará los archivos de secuencia de cebador de
una muestra para generar una secuencia consensuada, y creará un proyecto.
Mientras el software compila el proyecto, aparecerá la ventana Progress
(Progreso).
Nota. El software crea proyectos independientes para cada nombre de
muestra único asignado a los datos en el programa Sequencing Analysis
(Análisis de la secuenciación). Existe una limitación en el número de
proyectos que es posible compilar a la vez. Un límite conservador serían Acerca de la barra de navegación
14 proyectos. La barra de navegación aparece en la parte superior de la ventana Navigation
Al terminar, la ventana Progress (Progreso) se cierra y se abren las ventanas (Navegación). Esta barra muestra el número y la ubicación de las posiciones de
Navigation (Navegación) y View*Edit (Ver*Edición), que muestran uno de interés (POI). Estas posiciones aparecen como líneas verticales en la barra de grises.
los proyectos compilados.

El software ViroSeq muestra los proyectos compilados ya existentes en la ventana


Project Status (Estado del proyecto). Para ver la ventana Project Status (Estado del
proyecto), vaya a la ventana Navigation (Navegación) y seleccione File > Open
Project (Archivo > Abrir proyecto). La columna Status (Estado) indica si el Los números de la escala horizontal representan las posiciones de los codones de
software encontró todos los segmentos introducidos. cada gen. Las POI están codificadas con colores, tal como se indica en la tabla
siguiente.
Codificación por color de las posiciones de interés (POI)
Si el estado es… Entonces…
Color Significado
OK (Correcto) Se encontraron todos los segmentos esperados y el proyecto se compiló
correctamente. Gris = color de fondo Sin diferencias respecto a la referencia
Rojo POI seleccionadas
? El software ViroSeq tuvo problemas al compilar el proyecto.
Las causas posibles pueden ser: Negro Falta de correspondencia entre segmentos
• No fue posible identificar uno o más segmentos Verde Diferencia conocida o desconocida entre la secuencia de referencia y la
• Se ensamblaron menos de 6 segmentos secuencia consensuada
Nota. No continúe si el proyecto tiene menos de seis segmentos ensamblados.
Uno de los segmentos faltantes puede ser A o D. Azul Posición de varias bases
Amarillo Muestra las zonas cubiertas por un solo segmento durante el
ensamblado
Blanco Identificación de base confirmada por el usuario
Nota. Primero es necesario guardar el proyecto.

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 27 de 66


Acerca de la sección de alineación de segmentos Partes y descripciones de la ventana View*Edit (Ver*Edición)
La sección de alineación de segmentos aparece en la parte inferior de la ventana
Navigation (Navegación). Esta parte muestra gráficamente cómo se superponen los Artículo Nombre Descripción
segmentos de secuencia.
1 Botón saltar al extremo Va a la POI situada en el extremo izquierdo.
izquierdo

2 Botón retroceder Pasa a la POI situada a la izquierda de la POI activa.

3 Botón Trim (Recortar) Recorta o deshace el recortado del extremo seleccionado


La etiqueta de cada segmento está formada por el nombre del proyecto y el cebador de un segmento en el electroferograma.
utilizado. Los segmentos apuntan en la dirección de la polimerización.
Compruebe que las secuencias están colocadas de la forma esperada. 4 Botón Revert Restablece la asignación de bases original de la POI actual.
(Restablecer)
• Hacia adelante - cebadores A, D, B, C
• Hacia atrás - cebadores F, G, H 5 Paleta de edición Edita la POI activa.
Los botones representan los códigos de letras de las bases
y las combinaciones de bases.

En raras ocasiones, el segmento D puede estar alineado en una 6 Casilla de verificación Si está seleccionada, hace que se pase automáticamente
Auto jump on edits a la siguiente POI después de cada edición.
posición incorrecta. Después de compilar el proyecto, compruebe la posición del (Saltar automáticamente
segmento D. Debe cubrir por completo el gen de la proteasa y el principio del después de la edición)
gen de la TI. Si el segmento D no está colocado de la forma especificada, vuelva
a compilar el proyecto sin el segmento D. 7 Casilla de verificación Se utiliza después de editar la posición actual; pasa a la
Reverse jump siguiente POI hacia la izquierda.
(Retroceder) Esta casilla solo está activa cuando se selecciona la casilla
Acerca de la ventana View*Edit (Ver*Edición) de verificación Auto jump on edits (Saltar
automáticamente después de la edición).

La ventana View*Edit (Ver*Edición) muestra la secuencia consensuada generada


8 Botón Navigation Abre el cuadro de diálogo Navigation Options (Opciones
por el software. También contiene las herramientas de navegación y de edición. Options (Opciones de de navegación). En este cuadro de diálogo se seleccionan
navegación) las POI activas.
Las POI activas son aquéllas a las que se ha llegado con los
botones de navegación.

9 Botón avanzar Pasa a la POI situada a la derecha de la POI activa.

10 Botón saltar al extremo Va a la POI situada en el extremo derecho.


derecho

11 Panel de etiquetas Etiqueta cada línea del panel de secuencias. También indica
el nombre del cebador y la dirección de la polimerización
para cada secuencia.

12 Número de codón Indica el número de codón de la secuencia de referencia.

13 Reference Translation Indica el código de una letra para la traducción a


(Traducción de referencia) aminoácidos del código en la secuencia de referencia.

14 Consensus Translation Indica el código de una letra para la traducción a


(Traducción consensuada) aminoácidos del código en la secuencia consensuada.

15 Reference Sequence Bases de la secuencia de referencia.


(Secuencia de referencia)

16 Consensus Sequence Bases de la secuencia consensuada.


(Secuencia consensuada)

17 Recuadro alrededor de POI actual.


la base

18 Picos de la secuencia Electroferograma de un segmento de secuencia. El software


ViroSeq muestra todos los segmentos de secuencia que se
superponen en una posición.

19 Barra de desplazamiento La barra de desplazamiento horizontal del panel de


secuencias.

20 Cuadro de información de Explica por qué se ha identificado una posición como POI.
posición

21 Close View Edit Cierra la ventana View Edit (Ver Edición).


(Cerrar Ver Edición)

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Paleta Editing (Edición) Menú File (Archivo)

Códigos IUB

Códigos IUB

A = adenosina S = G o C (Fuerte - 3 puentes de H)


Opciones del menú File (Archivo)
C = citidina W = A o T (Débil - 2 puentes de H)
G = guanosina Y = C o T (pYrimidine [pirimidina])
Método abreviado
Elemento de menú Descripción
T = timidina B = C, G o T de teclado
U = uracilo D = A, G o T
New Project (Proyecto Ctrl+N Abre el cuadro de diálogo Open (Abrir).
K = G o T (Keto [ceto]) H = A, C o T nuevo)
Al hacer clic en el botón New (Nuevo) se puede
M = A o C (aMino) V = A, C o G seleccionar y abrir un archivo Sequencing
Analysis (Análisis de la secuenciación) de una
R = A o G (puRine [purina]) N = aNy (cualquier) base carpeta y el software ensambla todas las
secuencias de esa carpeta en proyectos nuevos.

Códigos de los aminoácidos Open Project (Abrir Ctrl+O Abre la ventana Project Status (Estado del
proyecto) proyecto).
Seleccione un proyecto de la lista o bien, haciendo
Aminoácido Código de tres letras Código de una letra clic en el botón Find (Buscar), puede seleccionar
y abrir un proyecto ViroSeq ya compilado.
Alanina Ala A
Save (Guardar) Ctrl+S Guarda el proyecto abierto con todas las ediciones
realizadas.
Arginina Arg R

Save consensus (Guardar Ctrl+F Guarda la secuencia consensuada en un archivo


Asparagina Asn N consenso) [FASTA] de texto ASCII con la extensión .fasta.

Aspartato o ácido aspártico Asp D Generate Resistance Ctrl+G Permite ver e imprimir el informe sobre
Report (Generar informe resistencia.
sobre resistencia)
Cisteína Cys C

Export Resistance Report Ctrl+X Permite exportar el informe sobre resistencia.


Glutamina Gln Q (Exportar informe sobre
resistencia)
Glutamato o ácido glutámico Glu E
Quit (Salir) Ctrl+Q Cierra el software ViroSeq.
Glicina Gly G

Histidina His H Menú Edit (Edición)


Isoleucina Ile I

Leucina Leu L

Lisina Lys K

Metionina Met M
Opciones del menú Edit (Edición)
Fenilalanina Phe F
Método abreviado
Prolina Pro P Elemento de menú Descripción
de teclado

Serina Ser S Toggle Position Cursor Ctrl+T Activa o desactiva la línea de posición del cursor.
(Alternar cursor de
Treonina Thr T posición)

Triptófano Trp W Edit Report Information Ctrl+E Abre el cuadro de diálogo Edit Report
(Editar la información Information (Editar la información del informe)
del informe) donde se puede introducir la información del
Tirosina Tyr Y paciente, el laboratorio y el técnico para el
encabezado del informe final.

Valina Val V

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 29 de 66


Opciones del menú Edit (Edición) Revisión del proyecto compilado

Método abreviado
Elemento de menú Descripción
de teclado
Una vez que el software ViroSeq ha compilado un proyecto, es necesario
Change Passwords — Al iniciar una sesión como administrador, abre revisar y verificar las identificaciones de bases de las POI en la secuencia
(Cambiar contraseñas) el cuadro de diálogo Administrator Access consensuada. Se pueden aceptar o cambiar las identificaciones de bases en los
(Acceso de administrador) donde puede cambiar puntos en los que el software detecta diferencias entre la secuencia consensuada y la
las contraseñas y realizar otras funciones secuencia de referencia. El usuario decide si la identificación de bases propuesta está
administrativas.
justificada, analizando los electroferogramas. Por ejemplo, los blobs de colorante al
Al iniciar una sesión como usuario, abre el inicio de una secuencia o la repetición reiterada de la misma base pueden hacer que
cuadro de diálogo User Access (Acceso de el software interprete incorrectamente la secuencia y sugiera una variación cuando
usuario) donde el usuario puede cambiar su
contraseña. en realidad no existe ninguna.

Login As New User — Abre la ventana User Login (Inicio de sesión


(Iniciar sesión como de usuario). POI
usuario nuevo)
Una POI es una base de la secuencia consensuada con una o más de las siguientes
características:
Menú Window (Ventana) • Distinta de la cepa de VIH-1 de referencia
• Se encuentra en la tabla interna de posiciones de resistencia conocidas
• Se identifica como una base mixta en al menos un segmento en esa posición
• Muestra una inserción respecto a la secuencia de referencia
• Difiere de un segmento a otro
Nota. Se pueden aplicar uno o más criterios de POI a una misma posición
Opciones del menú Window (Ventana) de consenso.

Elemento de menú
Método abreviado
Descripción Códigos de color de las bases
de teclado

Base Color
History (Historial) — Abre el registro History (Historial).

Adenina Verde
Menú Help (Ayuda)
Citosina Azul

Guanina Negro

Timina Rojo
Opciones del menú Help (Ayuda)
Bases mixtas Rosa

Método abreviado
Elemento de menú Descripción
de teclado
Establecimiento de las opciones de navegación
About ViroSeq (Acerca — Muestra la información del producto.
de ViroSeq) La ventana Navigation Options (Opciones de navegación) se abre al hacer clic en el
botón Navigation Options en la ventana View*Edit (Ver*Edición).

Partes de un proyecto compilado


Un proyecto compilado consta de:
• Electroferogramas de los segmentos de secuencia
El software ViroSeq representa las bases como picos, con un color diferente para
cada una de las cuatro bases.
• Secuencia consensuada de los segmentos de secuencia
Con siete cebadores diferentes, los segmentos de secuencia se superponen
y cubren cada sección del gen diana al menos dos veces en ambos sentidos
(la excepción son los codones de la TI en las posiciones 315-335
aproximadamente).
• Secuencia de referencia
El software ViroSeq compara la secuencia consensuada con una secuencia
de referencia, HXB-2. Explicación de las opciones de navegación
• Traducción consensuada y de referencia
El software ViroSeq muestra la secuencia de aminoácidos de la cepa de virus Opción Descripción
de referencia y todas las posibles traducciones de aminoácidos de la secuencia
consensuada.
• Número de codón Configuración global
El software ViroSeq numera los codones basándose en la secuencia de
referencia. Additional variants from reference Localiza las mutaciones que no se utilizan en el algoritmo
(Variaciones adicionales respecto a la del software ViroSeq.
referencia)

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Opción Descripción
Secuencia de los sucesos de edición
• Recorte los extremos del segmento para eliminar los segmentos de secuencia
Multibase positions (Posiciones de Permite ir a posiciones de la secuencia consensuada de mala calidad.
varias bases) derivadas de segmentos con mezclas o con más de un • Verifique y concilie las identificaciones de bases mixtas y las bases que no
nucleótido en una posición.
correspondan.
• Compare las áreas con problemas de movilidad con otros segmentos de
Mismatches between segments (Falta de Localiza diferencias en una posición de la secuencia secuencia y con la secuencia de referencia para determinar la posición correcta
correspondencia entre segmentos) consensuada debidas a segmentos de cebador anterógrados
o retrógrados que no coinciden con dicha posición. de los picos.

Show saved edits (Mostrar ediciones Localiza las bases editadas manualmente y guardadas Edición de un proyecto
guardadas) en el proyecto.

Insertions (Inserciones) Localiza las bases adicionales que no forman parte de 1. Haga clic en Navigation Options (Opciones de navegación) para abrir la
la secuencia de referencia. ventana Navigation Options (Opciones de navegación).
Nota. Si desea obtener información sobre la forma en que
el software maneja las inserciones, consulte Mutaciones 2. Asegúrese de que estén seleccionadas todas las casillas de verificación de las
por inserción.
opciones de la ventana Navigation Options (Opciones de navegación).

Características del perfil génico


3. Seleccione y recorte las áreas con una baja calidad de la secuencia para
mejorar la identificación de las bases.
Show Resistance positions (Mostrar Convierte cada mutación utilizada en el algoritmo de En la barra de navegación, los grupos densos de barras verticales
posiciones de resistencia) resistencia farmacológica en una POI, independientemente representan áreas en las que puede haber uno o más cebadores con una
de si la secuencia consensuada difiere de la secuencia de
referencia. secuencia de baja calidad.
Nota. Esto solo puede ocurrir si se desactiva la casilla
Only show if variant (Mostrar solo si varía). 4. Confirme o edite las identificaciones de bases.
a. Comience con la POI situada más a la izquierda en el gen de la proteasa,
Only show if variant (Mostrar solo Si se selecciona esta casilla junto con la casilla Show haciendo clic en el botón para editar o confirmar la identificación
si varía) Resistance positions (Mostrar posiciones de resistencia), de las bases.
solo se seleccionarán los codones de resistencia
farmacológica de la secuencia consensuada para los que se b. Use la barra espaciadora para confirmar la selección.
detecten mutaciones que tengan una función en la c. Pulse para continuar con la siguiente POI y editar o confirmar la
determinación de la resistencia farmacológica.
Esta función puede utilizarse al crear proyectos nuevos. No
identificación de bases. Repita este proceso hasta que haya confirmado
se recomienda su uso con proyectos guardados o o editado todas las POI de la secuencia consensuada.
modificados. Nota. Si las secuencias que se superponen no coinciden en la mayoría de las
posiciones, investigue si existe la posibilidad de que se hayan confundido las
muestras o de que se hayan producido errores en la designación de las
Confirmación o edición de una POI muestras.
Debe confirmar o editar manualmente cada posición de interés (POI) seleccionada
en Navigation Options (Opciones de navegación). 5. En la ventana Navigation Options (Opciones de navegación), desactive
todas las casillas de verificación con excepción de Show Resistance
El cursor de la ventana View*Edit (Ver*Edición) es un recuadro alrededor del positions (Mostrar posiciones de resistencia) y haga clic en OK (Aceptar).
código de letras de una base o una POI en la secuencia consensuada. Puede
confirmar o editar cualquier falta de correspondencia entre los segmentos
superpuestos o las mutaciones identificadas por el software. 6. Repita el procedimiento de edición/confirmación, comenzando en el extremo
izquierdo y avanzando hacia la derecha.
Nota. Puede utilizar la directriz de edición 1 del siguiente resumen para
Diferenciación entre picos y ruido identificar mezclas que el software pueda haber pasado por alto.

Un pico es una señal electroforética que tiene un máximo definible y pendientes


claramente resueltas a cada lado. Los picos representan la intensidad de la señal del Motivos para utilizar las directrices de edición
colorante fluorescente unido a cada fragmento de secuencia de ADN. Los programas
Data Collection (Recogida de datos) y Sequencing Analysis (Análisis de la ¡IMPORTANTE! La coherencia en la forma de identificar las bases entre un
secuenciación) leen y analizan los picos. usuario y otro es fundamental. Las directrices de edición de secuencias proporcionan
un método para lograr esa coherencia.
En la mayoría de los casos, el software ViroSeq identifica de forma precisa las
mezclas. En los casos en los que necesite tomar una decisión, utilice estas directrices
para distinguir las mezclas reales.
¡IMPORTANTE! La calidad de los datos de secuencia determina la exactitud de
las identificaciones de bases. Mientras menor sea el fondo o el ruido, menor será
el número de ediciones necesarias.
Picos bien resueltos Picos mal resueltos
Resumen de las directrices de edición para identificar
Nota. Las mesetas de los picos solo se definen como picos si tienen también mezclas
un máximo definible.
Puede identificar una mezcla si:
El ruido es la señal de fondo presente en un electroferograma. Puede deberse
al instrumento o a la calidad de la matriz de capilares, el polímero, la muestra, 1. Dos segmentos de secuencia de sentido opuesto contienen picos secundarios
la solución tampón o la formamida Hi-Di. que estén claramente por encima del ruido local (aproximadamente dos veces
el nivel de ruido).
Se deben distinguir los picos de mezclas de los picos de ruido. Sin embargo, cuando
existen niveles elevados de ruido continuo en una secuencia, los datos reales pueden 2. Un segmento de secuencia contiene un pico secundario de al menos un 30%
quedar ocultos y puede ser difícil distinguir los picos pequeños del ruido. del pico principal y tres veces el nivel de ruido local.
Tome nota de las mutaciones de resistencia en las regiones con una sola
cobertura; solo se puede utilizar la directriz de edición n.º 2 para identificar
una mutación de resistencia.
3. Un segmento de secuencia contiene un pico secundario de al menos un 30%
del pico principal y el segmento en sentido opuesto confirma la mezcla.
ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 31 de 66
Jerarquía de la edición de proyectos Ejemplos de la directriz 1
1. Para el primer análisis de los datos, seleccione todas las funciones de
navegación. Esto le permite detenerse en todas las posiciones en las que se ha Aceptable
identificado una mezcla. Esto ocurre porque al menos una de las secuencias
muestra una mezcla del 30%. Directriz 1: Dos segmentos de secuencia de sentido opuesto contienen picos
secundarios que estén claramente por encima del ruido local (aproximadamente dos
2. Evalúe si la mezcla del 30% es real (es decir, está por encima del nivel de veces el nivel de ruido).
ruido).
El software ViroSeq® identifica automáticamente las mezclas con un nivel del 30%
3. Si se cumplen los criterios del 30%, compruebe si la secuencia opuesta respecto al pico principal (el de mayor tamaño). En algunos casos, se observan
muestra un pico de confirmación (directriz 3). Si el pico de confirmación está mezclas que el software no detecta porque tienen menos del 30%.
presente, designe la mezcla.
4. Si la cadena opuesta no muestra un pico de confirmación, determine si el pico
del 30% en la secuencia original es 3 x el fondo. Si se cumple el criterio de
3 x el fondo, designe la mezcla (directriz 2). Esa es la regla para una mezcla
en un solo sentido.
5. Después del primer análisis de los datos, debe cambiar las opciones de
navegación para detenerse únicamente en las posiciones de resistencia.
Recuerde: debe desactivar la función Only show if variant (Mostrar solo
si varía).
6. Realice un segundo análisis de todos los datos, buscando mezclas que
cumplan la directriz 1 (2 x el fondo en ambos sentidos). En esta ocasión,
revise también las ediciones y las identificaciones automáticas realizadas en
las otras posiciones de resistencia.

Ejemplos
Ejemplo de datos de secuencia adecuados
El siguiente ejemplo muestra un nivel muy bajo de fondo y de picos secundarios. Para editar una identificación de bases en esta situación (la segunda posición del
codón 20), siga la directriz 1 para identificar la base de forma correcta, exacta y
coherente. La identificación correcta de la base en este ejemplo es W.

Inaceptable
A continuación se muestra un ejemplo de un pico de mezcla que está presente en
ambos sentidos, pero no se puede identificar porque es del mismo tamaño que los
picos del ruido de fondo próximos. Los propios picos son ruido.

Ejemplo de datos de secuencia inadecuados


El siguiente ejemplo muestra un nivel de fondo muy alto y picos secundarios que no
pueden identificarse de forma fiable. Es posible que se identifiquen mezclas falsas
debido al ruido de fondo. Esta muestra debe repetirse.

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Ejemplos de la directriz 2 Ejemplos de la directriz 3
Aceptable Aceptable
Directriz 2: Un segmento de secuencia contiene un pico secundario de al menos Directriz 3: Un segmento de secuencia contiene un pico secundario de al menos
un 30% del pico principal y tres veces el nivel de ruido local. un 30% del pico principal y el segmento en sentido opuesto confirma la mezcla.
En raras ocasiones, se observa una secuencia mezclada en un solo sentido. Para Los cebadores de secuencia del ViroSeq™ HIV-1 Genotyping System proporcionan
identificar esta mezcla, el pico de la mezcla de un solo segmento debe estar bien una cobertura doble para toda la longitud de la proteasa y hasta aproximadamente el
definido sin ambigüedades. El software ViroSeq identifica este tipo de mezclas codón 315 del gen de la TI, y una cobertura simple desde el codón 315 hasta el 335,
como «...Mismatch, ...Mixture» (...Falta de correspondencia, ...Mezcla). aproximadamente. La mezcla se observa tanto en sentido anterógrado como
retrógrado, lo que hace que la identificación de las mezclas sea más fiable.
En muchos casos, la mezcla constituye más de un 30% del pico principal en un
sentido y menos del 30% en el otro. La secuencia inferior (el segmento en sentido
opuesto) se utiliza para confirmar la presencia de la mezcla.

El ejemplo anterior muestra una mezcla en la que un segmento de secuencia contiene


un pico secundario de más del 30% y el otro segmento de secuencia no muestra
ninguna mezcla (no permite resolver un máximo). La mezcla presente en la
secuencia superior tiene al menos un 30% del pico principal y es significativamente
mayor que el fondo.

Inaceptable
Inaceptable
A continuación se muestra un ejemplo de una mezcla (la primera posición del
codón 32) que no se puede identificar. Se trata de una mezcla falsa debida a un blob A continuación se muestra un ejemplo de una mezcla falsa (la tercera posición
del colorante al inicio del cebador B. del codón 254) debida al alto nivel de ruido de fondo continuo. La identificación
correcta de la base es C.

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 33 de 66


Excepciones a las directrices Edición de los datos
Los ejemplos siguientes muestran posiciones anómalas en RT151 y RT215 que no
siguen las directrices de edición. Cuando hay mezclas en estas posiciones, suelen
mostrar un patrón como el que aparece a continuación.
Compare estos ejemplos con su muestra. Si los patrones coinciden, se puede
Acerca del recortado con el software ViroSeq®
identificar una mezcla para estas posiciones. Las secuencias situadas al inicio o al final de un segmento suelen ser de baja calidad.
El software ViroSeq recorta automáticamente estas secuencias. El software también
permite recortar manualmente.
La parte recortada de una secuencia sigue estando visible como parte de un
electroferograma, pero aparece en la pantalla sobre un fondo gris. El software
ViroSeq pasa por alto las diferencias entre las secuencias recortadas y la secuencia
de referencia a la hora de determinar la secuencia consensuada. Sin embargo, esta
información (en la zona gris) se puede utilizar para la identificación de las bases.

Secuencia
recortada

Ejemplo de recortado

Antes del recortado

Página 34 de 66 ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0


Después del recortado Edición de una identificación de bases
Edición de una mutación

1. Realice la modificación.
a. Haga clic en el botón de la paleta Editing (Edición) que corresponda
al tipo de mutación que desea editar o bien, introduzca la letra de
identificación de la base apropiada (código IUB) para la POI utilizando
el teclado.
b. Use la barra espaciadora para confirmar la edición.

2. Siga las directrices de edición para las mezclas.


1. Dos segmentos de secuencia de sentido opuesto contienen picos
Recortado manual de los extremos de un segmento secundarios que estén claramente por encima del ruido local
(aproximadamente dos veces el nivel de ruido).
2. Un segmento de secuencia contiene un pico secundario de un 30% del
1. En la ventana View*Edit (Ver*Edición), seleccione la región de baja calidad pico principal y tres veces el nivel de ruido local.
haciendo doble clic en esa parte del electroferograma. Tome nota de las mutaciones de resistencia en las regiones con una
La región desde el punto en el que hace doble clic hasta el extremo más sola cobertura; solo se puede utilizar la directriz de edición n.º 2 para
próximo aparecerá resaltada en negro. identificar una mutación de resistencia.
3. Un segmento de secuencia contiene un pico secundario de un 30% del
2. Haga clic en Trim (Recortar). pico principal y el segmento en sentido opuesto confirma la mezcla.
La secuencia seleccionada se recortará y aparecerá sobre un fondo gris. ¡IMPORTANTE! No utilice secuencias que tengan un alto nivel de ruido
Nota. El recortado simplemente excluye el uso de los datos recortados a continuo.
la hora de identificar las bases de la secuencia consensuada. El software
no excluye el uso de los datos recortados a la hora de ensamblar los datos.
Por lo tanto, si hay datos con ruido que ocasionan que los resultados del Confirmación de una identificación de bases
ensamblado o la alineación sean deficientes, será necesario recortarlos con
el programa Sequence Analysis (Análisis de la secuenciación).
1. Para confirmar una identificación de bases, use la barra espaciadora del
teclado.
3. Para deshacer el recortado de un segmento:
a. Seleccione una región de datos más pequeña y haga doble clic para 2. Para eliminar la confirmación, pulse de nuevo la barra espaciadora.
resaltarla en negro.
b. Haga clic en Trim (Recortar).
Restablecimiento de la identificación de bases original

1. Seleccione la identificación de bases que desea cambiar.


Revise con cuidado las áreas con inserciones. Estas interpretaciones afectan
a los resultados que aparecen en el Antiretroviral Drug Resistance Report (Informe 2. Haga clic en Revert (Restablecer).
sobre resistencia a antirretrovirales). La edición volverá a la identificación de bases original realizada por el
software.
Búsqueda de POI
Hay cuatro métodos para mover el cursor de edición a una nueva posición: Almacenamiento de las ediciones
• Haga clic en los botones de desplazamiento Avanzar ( ) o Retroceder
( ) para ir a la siguiente POI tal como se especifica en las Navigation Para guardar las ediciones, vaya al menú File (Archivo) y seleccione Save
Options (Opciones de navegación). (Guardar).
• Utilice la barra de desplazamiento de la parte inferior de la ventana View*Edit La ventana Progress (Progreso) se abre e indica cuándo se ha guardado el archivo.
(Ver*Edición) para moverse por la secuencia. El cursor de edición permanece Se registra una entrada en la ventana History (Historial) y el archivo se guarda en la
en el centro de la ventana. carpeta Projects\Completed en el directorio del software ViroSeq.
• Utilice las teclas de flecha derecha o izquierda del teclado. • La secuencia consensuada se puede guardar en formato de texto ASCII (formato
• Haga clic una vez del lado derecho o izquierdo de la secuencia consensuada para FASTA) seleccionando File > Save consensus [FASTA] (Archivo > Guardar
mover el marco de la ventana Edit (Edición). La base en la que se hace clic se consenso [FASTA]).
convierte en la POI central. El archivo se guarda en el directorio C:\ViroSeq v2.8\Projects\Completed\
Reports.
• El Antiretroviral Drug Resistance Report (Informe sobre resistencia a
antirretrovirales) se puede guardar en formato XML, seleccionando File >
Export Resistance Report (Archivo > Exportar informe sobre resistencia).
El archivo se guarda en el directorio C:\ViroSeq v2.8\Projects\Completed\
Export.
Nota. No edite ni modifique los resultados después de guardar una versión XML
del informe sobre resistencia.

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 35 de 66


Revisión del proyecto en la ventana History (Historial) Ejemplo 1
La ventana History (Historial) muestra un registro permanente de los segmentos
añadidos, rechazados y recortados, así como de las identificaciones de bases editadas.
N.º de codón 67 68 69 70 — — 71

Acceso a la ventana History (Historial)


Reference Translation D S T K W
(Traducción de referencia)
1. En el menú Window (Ventana), seleccione History (Historial).
Se abrirá la ventana History (Historial).
Consensus Translation N S S T S R W
(Traducción consensuada)
2. Desplácese por el registro con la barra de desplazamiento vertical del lado
derecho para ver las actividades.
Reference Sequence GAC AGT ACT AAA ––– ––– TGG
(Secuencia de referencia)
Nota. Si edita una base y la guarda varias veces, la edición final se registrará
correctamente en el historial. Consensus Sequence AAC AGT TCT ACA TCT AGA TGG
(Secuencia consensuada)

Mutaciones por inserción


El ejemplo 1 muestra un caso en el que la colocación de la inserción da como
resultado K70T.
En raras ocasiones, las inserciones pueden dar lugar a un informe
sobre resistencia farmacológico inexacto.
Ejemplo 2
1. El software ViroSeq no está diseñado para resolver casos en los que hay
dos especies dominantes de virus, una con inserciones y la otra sin ellas. N.º de codón 67 68 69 — — 70 71
Esta situación es fácil de detectar con el sistema ViroSeq y se describe a
continuación.
Reference Translation D S T K W
2. El uso de la secuenciación génica para genotipar virus con inserciones (Traducción de referencia)
puede dar lugar a soluciones que no son únicas en cuanto a la posición
de las inserciones y la existencia de mutaciones en las posiciones más
próximas a una inserción. Esta limitación se ilustra y se comenta a Consensus Translation N S S T S R W
continuación. (Traducción consensuada)
3. En las muestras en las que hay una inserción presente se necesitan al
menos dos secuencias de cebadores para la identificación correcta de las Reference Sequence GAC AGT ACT ––– ––– AAA TGG
bases de la inserción. Asegúrese de que el área con la inserción tiene al menos (Secuencia de referencia)
dos secuencias de cebador sin recortar. Si solo hay una secuencia de cebador
disponible en el área de la inserción, se generarán resultados inexactos.
Consensus Sequence AAC AGT TCT ACA TCT AGA TGG
El software ViroSeq puede detectar las mutaciones por inserción cuando la (Secuencia consensuada)
mutación está presente en una población homogénea. Sin embargo, el software
ViroSeq no puede interpretar una muestra que contenga una mezcla de dos o más
poblaciones de virus en la que una población contenga una inserción y la otra no.
Esta limitación existe con todas las metodologías de secuenciación. Las mutaciones El ejemplo 2 muestra un caso en el que la colocación de la inserción da como
por inserción en una mezcla ocasionan desplazamientos en la secuencia que son resultado K70R.
diferentes en cada virus; esto hace que las identificaciones de bases a partir de Ambas colocaciones son igual de probables y ambas son válidas, porque tienen el
la inserción se vean como mezclas. mismo número de diferencias entre las secuencias consensuada y de referencia.
Este fenómeno puede observarse claramente en el software ViroSeq como una serie La inserción en el codón 69 se produce con una frecuencia muy baja (inferior al 1%)
de mezclas importantes que comienza al final de la inserción y continúa hasta el final en los pacientes que se han sometido a un tratamiento prolongado.25 Un informe
de la secuencia de la muestra para ese cebador. reciente indica que los investigadores no fueron capaces de detectar mezclas (tipo
En el ejemplo siguiente, el virus 2 tiene una inserción de tres bases que desplaza natural y mutante) en pacientes con virus que contenían la inserción en el codón
la alineación de las dos secuencias mezcladas. 69.26 Este resultado sugiere que la mutación por inserción sustituyó rápidamente al
tipo natural y que las mezclas, en caso de haberlas, estarían presentes con una
frecuencia sumamente baja.
Consenso: GAC AGT rsk Amw wrr wGr ArA

Virus 1:
(sin inserción)
GAC AGT ACT AAA TGG AGA AAA Informe sobre resistencia
a antirretrovirales
Virus 2: GAC AGT GGG ACT AAA TGG AGA
(con inserción)

Creación de un Antiretroviral Drug Resistance


La elevada incidencia de mutaciones en el genoma del VIH-1 crea ambigüedad a la
hora de determinar la posición de las inserciones. Esta ambigüedad puede dificultar
Report (Informe sobre resistencia a
la determinación de si existe o no una determinada mutación de resistencia. Un antirretrovirales)
ejemplo es la inserción que se produce cerca del codón 69. En esta zona hay tres
mutaciones de resistencia importantes: Se puede incluir información específica del laboratorio o de la muestra en un
• D67N proyecto mediante el elemento de menú Edit Report Information (Editar la
• T69D información del informe). La información específica del laboratorio se puede
guardar como predeterminada e imprimirse en cada Antiretroviral Drug Resistance
• K70R Report (Informe sobre resistencia a antirretrovirales). Esta información es igual para
Considere los siguientes ejemplos, que muestran dos posibles interpretaciones de todos los usuarios del laboratorio.
la inserción.

Página 36 de 66 ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0


La información del técnico, del paciente y de la muestra que sea exclusiva para cada Impresión
muestra se puede introducir en cada proyecto a través del elemento de menú Edit
Report Information (Editar la información del informe).
1. Seleccione File > Generate Resistance Report (Archivo > Generar informe
• No se puede utilizar el carácter especial comillas dobles (“) en el encabezado del sobre resistencia) si aún no está abierto el informe. En la parte superior de la
Informe sobre resistencia. No lo utilice en ninguno de los campos de Edit ventana de informe ViroSeq, haga clic en el icono Print (Imprimir).
Report Information (Editar la información del informe).
• En el campo Comments (Comentarios) se pueden escribir hasta cinco líneas y un
máximo de 256 caracteres (espacios incluidos). Si escribe texto que supere esta 2. Cuando se abra el cuadro de diálogo Print (Imprimir), seleccione la
limitación, es posible que no aparezca en el informe. impresora y haga clic en OK (Aceptar).
• No utilice la tecla Intro en el campo Comments (Comentarios), ya que perdería
información.
• Si modifica los campos del informe de un proyecto existente, se recomienda que
genere y guarde el informe sobre resistencia completo antes de abrir otro
Interpretación del Antiretroviral Drug Resistance
proyecto en el software ViroSeq®. Report (Informe sobre resistencia a
antirretrovirales)
Creación de un encabezado predeterminado

1. Seleccione Edit > Edit Report Information (Edición > Editar la Información del laboratorio y de la muestra
información del informe). Esta parte del informe está definida por el usuario. En el menú Edit (Edición),
la opción Edit Report Information (Editar la información del informe) abre un
2. En la ventana Edit Report Information (Editar la información del cuadro de diálogo en el que se puede introducir información.
informe), escriba la información que desea que aparezca como
predeterminada en todos los informes de resistencia.
Acerca de las mutaciones y la resistencia
3. Haga clic en Set As Default (Establecer como predeterminado) y Se sabe que la aparición de resistencia a un fármaco es un proceso continuo en el que
después, en OK (Aceptar) para cerrar el cuadro de diálogo. algunas mutaciones confieren resistencia de bajo nivel, otras confieren resistencia
Nota. Para modificar la información predeterminada, escriba los cambios de alto nivel y las combinaciones de las mismas producen efectos aditivos o
y haga clic en Set As Default (Establecer como predeterminado) y en OK sinérgicos.27,29
(Aceptar). La interacción entre las mutaciones que confieren resistencia a un fármaco está bien
definida para algunos fármacos, pero no para todos. Se necesitan más estudios para
dilucidar la aportación exacta de cada combinación de mutaciones en la aparición de
Introducción de la información específica de la muestra una resistencia de alto nivel. En los casos en los que los datos no indican claramente
una resistencia de alto nivel, las mutaciones detectadas pueden indicar una
resistencia potencial. Estas mutaciones se incluyen en el informe como marcadores
1. En el menú Edit (Edición), seleccione Edit Report Information (Editar la de Possible Resistance (Posible resistencia).
información del informe). En algunos casos, las mutaciones pueden causar una hipersensibilidad a un fármaco
determinado.
2. En la ventana Edit Report Information (Editar la información del informe),
escriba la información del técnico que realizó el ensayo, del paciente y de la
muestra, así como los comentarios pertinentes. Resistencia a antirretrovirales contra el VIH-1
Nota. Las entradas predeterminadas en la ventana Edit Report Information Se indica la resistencia a tres clases de fármacos antirretrovirales:
(Editar la información del informe) son una serie de cinco guiones. Si el
usuario no personaliza la ventana, se incluirá automáticamente esta serie de • Inhibidores nucleósidos de la transcriptasa inversa
guiones en el informe de resistencia farmacológica, el archivo FASTA y el • Inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa inversa
archivo XML. • Inhibidores de la proteasa
Evidence of Resistance (las pruebas de la resistencia) se indican en la columna del
3. Haga clic en OK (Aceptar) para cerrar el cuadro de diálogo. extremo derecho de la página 1 del informe. Se indican las pruebas para cada
fármaco de una misma clase en función de las mutaciones encontradas en la muestra.
4. Haga clic en Save (Guardar) para guardar los cambios. La presencia de una mutación o combinación de mutaciones específica da lugar a
uno de los siguientes resultados:
• Resistance (Resistencia) indica que existen pruebas claras de resistencia.
Nota. Al modificar la información del informe, los cambios deben guardarse para • Possible Resistance (Posible resistencia) indica que existen indicios de que
que surtan efecto. podría existir resistencia. Se trata de mutaciones o combinaciones que no
cumplen los criterios necesarios para clasificarse como Resistance (Resistencia),
pero que podrían indicar resistencia.
Acceso al informe • None (Ninguna) indica que no hay pruebas suficientes que indiquen resistencia.
.

1. Seleccione File > Generate Resistance Report (Archivo > Generar Informe Grados de limitación de la responsabilidad
sobre resistencia).
Utilice los botones de la parte superior de la ventana para reducir o ampliar la Los niveles de Evidence of Resistance (Pruebas de la resistencia) se etiquetan con
vista, o para cambiar de página en un informe con varias páginas. ninguno, uno, dos o tres asteriscos. Los significados de estos asteriscos se describen
en la tabla siguiente:
2. Seleccione el icono Save (Guardar) para guardar el informe generado como
un archivo PDF (Portable Document Format). Etiqueta de Significado en términos
Limitación de la
limitación de la responsabilidad de los estudios analíticos
responsabilidad y clínicos
3. Se abrirá el cuadro de diálogo Save Report (Guardar informe). Seleccione el
directorio en el que se guardará el archivo PDF del informe resultante y haga
clic en Save (Guardar). (sin etiqueta) ninguna Todas las mutaciones presentes se
han verificado en estudios clínicos
y analíticos.

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 37 de 66


• Mutaciones clasificadas como primarias y secundarias en las recomendaciones
Etiqueta de Significado en términos de la International AIDS Society de EE.UU. (IAS-USA).13,30
limitación de la Limitación de la de los estudios analíticos
responsabilidad – Esta lista se actualiza periódicamente y puede consultarse en el sitio web de
responsabilidad y clínicos la IAS-USA (http://www.iasusa.org/).
• Mutaciones descritas en los estudios GART14 y VIRADAPT15 como predictivas
* NOTA: Al menos una de las Todas las mutaciones presentes han de resistencia farmacológica.
mutaciones utilizadas para sido validadas en estudios clínicos, • Recomendaciones del Resistance Collaborative Group (Grupo de colaboración
determinar la existencia de pruebas pero no se han verificado para la definición de resistencia) basadas en el análisis de varios estudios
de la resistencia a este fármaco no necesariamente en estudios analíticos. prospectivos y retrospectivos.31
está plenamente validada.
• Se incluyeron como factores en el algoritmo otras mutaciones basadas en
informes más recientes y consultas con especialistas en este campo con el fin de
** NOTA: Al menos una de las Todas las mutaciones presentes han ofrecer una interpretación coherente con la literatura actual.8,16,32-50 El informe
mutaciones utilizadas para sido verificadas en estudios analíticos,
determinar la existencia de pruebas pero no se han verificado tiene secciones independientes para los inhibidores nucleósidos de la
de la resistencia a este fármaco no necesariamente en estudios clínicos. transcriptasa inversa (INTI), los inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa
está clinicamente validada. inversa (INNTI) y para los inhibidores de la proteasa (IP). Las mutaciones
utilizadas para determinar la resistencia se indican de forma esquemática en
*** NOTA: En al menos una de las Al menos una de las mutaciones no el informe, junto con el nombre del fármaco.
mutaciones utilizadas para evaluar se ha verificado mediante estudios
la existencia de pruebas de la clínicos ni analíticos. Se desarrolló un algoritmo para considerar todas las combinaciones posibles de
resistencia para este fármaco son las mutaciones que confieren resistencia a un determinado fármaco. Se utilizó un
válidas las dos notas anteriores. sistema de puntuación numérica estructurado que asignara un «grado de certeza de
resistencia» a las combinaciones de mutaciones que se sabe que generan resistencia
en caso de detectarlas en el ensayo. Para determinar el grado de certeza de
La clase de fármacos del inhibidor de la proteasa se marca con un signo +, que indica resistencia a un determinado fármaco, se suman las puntuaciones de las mutaciones
una etiqueta de limitación de la responsabilidad. presentes y pertinentes para ese fármaco, y se obtiene una puntuación total para ese
fármaco. La posición específica de un codón se cuenta solo una vez para cada
fármaco, utilizando la puntuación de mutación más alta de todas las mutaciones
presentes en esa posición del codón.
Etiqueta de limitación
Interpretación Una puntuación total baja (inferior a 0,5) se interpreta como insuficiente para indicar
de la responsabilidad
resistencia. Una puntuación total intermedia (entre 0,5 y 1) se interpreta como
posible resistencia. Una puntuación total alta (de 1,0 o más) se interpreta como
Las interpretaciones de las pruebas de resistencia al inhibidor de resistencia. La tabla siguiente muestra la relación entre la puntuación total y el grado
la proteasa (IP) se desarrollaron con el fin de calcular la respuesta de certeza de resistencia.
virológica esperada a dosis estándar de inhibidores de la proteasa
reforzadas farmacocinéticamente con ritonavir. Este método se ha
+
convertido en la forma más común de administrar inhibidores de la Relación entre la puntuación total y el grado de certeza de resistencia
proteasa, con la excepción de nelfinavir para garantizar una
concentración adecuada del fármaco en todos los pacientes. Los IP
reforzados son más activos en presencia de resistencia que los IP Puntuación total Grado de certeza de resistencia
no reforzados.

≥ 1,0 Resistencia
Notación de las mutaciones en las posiciones de
0,5 a < 1,0 Posible resistencia
esistencia
Las mutaciones se representan mediante convenciones de estilo, color y puntuación < 0,5 Ninguna
que indican su relevancia en la aparición de resistencia farmacológica.
• {llaves rojas en negrita}: mutaciones que confieren, por si mismas, resistencia
viral y dan lugar a un resultado de Resistance (Resistencia). Se utilizaron los siguientes criterios para asignar puntuaciones a mutaciones
• [corchetes azules en cursiva y negrita]: mutaciones que confieren, por si específicas:
mismas, la posibilidad de resistencia viral y dan lugar a un resultado de Possible • Se asignó la puntuación más alta (1,0) a las mutaciones que más contribuyen
Resistance (Posible resistencia). a la aparición de resistencia (por lo general, aquellas que confieren resistencia
• (paréntesis negros): mutaciones que menos contribuyen a la aparición de cuando están presentes como mutaciones únicas). De la misma forma, estas
resistencia. Se necesita más de una de estas mutaciones para un resultado de mutaciones se asociaron también a los mayores aumentos en la IC50
Possible Resistance (Posible resistencia). Esta mutación debe aparecer con (concentración que produce el 50% de inhibición) al introducirlas en cepas
al menos otra mutación para indicar la posibilidad de resistencia viral. naturales (WT) del VIH-1 y se asociaron claramente a la resistencia en varios
• <antilambdas verdes>: esta mutación contrarresta la resistencia. ensayos clínicos.
• Se asignó una puntuación intermedia a las mutaciones con efectos menos
pronunciados, que requieren la presencia de dos o más mutaciones para conferir
Mutaciones adicionales resistencia. Por ejemplo, al considerar la resistencia a la AZT, se asignó una
La sección Additional Mutations (Mutaciones adicionales) del informe identifica los puntuación de 0,625 a la mutación T215F/Y, una puntuación de 0,375 a la
aminoácidos que difieren respecto a la secuencia de referencia (HXB-2, número de mutación M41L y una puntuación de 0,25 a la mutación K70R. La sustitución
acceso K03455) en las posiciones de codón indicadas y que pueden ser útiles como T215F/Y aumenta de 12 a 16 veces la IC50 para la AZT, mientras que las
una determinación inicial del genotipo viral. No se ha establecido la actividad de mutaciones M41L o K70R producen un aumento de 3 a 5 veces. La combinación
estas mutaciones adicionales. Las mutaciones adicionales se especifican para el gen de M41L y K70R da como un resultado un aumento de 9 veces en la IC50.
de la proteasa o para el gen de la transcriptasa inversa. • Se asignaron puntuaciones bajas a las mutaciones con menor efecto en la
aparición de resistencia, pero que se han observado en pacientes tratados con
el fármaco y que tienen un efecto reducido sobre los valores de IC50 en cultivo.
Clave de notación Algunas de estas mutaciones pueden potenciar los efectos de las mutaciones
principales. En algunos casos, la presencia de varias mutaciones en esta
Las páginas tres y cuatro del informe contienen la clave para los colores y la lista de
mutaciones de resistencia del VIH-1 que se utilizan en el algoritmo para determinar categoría, en combinación con mutaciones cuya puntuación es intermedia,
podría producir resistencia.
la resistencia farmacológica.
• Se asignó una puntuación negativa a las mutaciones que aumentan la
sensibilidad a fármacos en función del grado de sensibilidad.
Algoritmo Las tablas de las páginas siguientes muestran, para cada fármaco, las mutaciones
La interpretación se basa en un algoritmo patentado que determina el impacto relevantes para la resistencia al fármaco y la puntuación asignada a cada mutación.
relativo de las mutaciones en los marcos de lectura abiertos de la transcriptasa
inversa y de la proteasa en la aparición de resistencia a antirretrovirales. Las
mutaciones incluidas en el algoritmo se basaron en:
• Mutaciones definidas por la FDA como de utilidad clínica establecida.28

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Tablas de mutaciones
A2. Estavudina, d4T, ZERIT® A3. Didanosina, ddI, VIDEX®
A. Resistencia a INTI
d4T ddI
A1. Zidovudina, AZT, RETROVIR®
Mutación Puntuación Mutación Puntuación
AZT
T69ins 1,2 T69ins 1,0

Mutación Puntuación Q151M 1,2 L74I/V 1,0

T69ins 1,2 V75A/M/S/T 1,0 Q151M 1,0

Q151M 1,2 Q151L 0,7 K65R 0,75

Q151L 0,7 T215F/Y 0,625 Q151L 0,5

T215F/Y 0,625 T215C/D/E/I/S/V 0,5 M41L 0,25

T215C/D/E/I/S/V 0,5 M41L 0,375 K65N 0,25

M41L 0,375 K65R 0,25 T69D/N 0,25

D67E/G/N 0,25 D67E/G/N 0,25 V75A/M/T 0,25

K70R 0,25 K70R 0,25 V75S 0,25

L210W 0,25 L210W 0,25 L210W 0,25

K219E/N/Q/R 0,25 K219E/N/Q/R 0,25 T215C/D/E/F/I/S/Y/V 0,25

V75I 0,125 V75I 0,125 D67E/G/N 0,125

F77L 0,125 F77L 0,125 K70E 0,125

F116Y 0,125 F116Y 0,125 V75I 0,125

E44D 0,0625 E44D 0,0625 F77L 0,125

A62V 0,0625 A62V 0,0625 F116Y 0,125

V118I 0,0625 V118I 0,0625 K219E/N/Q/R 0,125

K65N −0,125 M184I/V −0,2 E44D 0,0625

M184I/V −0,2 A62V 0,0625

K65R −0,25 V118I 0,0625

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 39 de 66


A4. Lamivudina, 3TC, EPIVIR®, A5. Abacavir, ABC, ZIAGEN® A6. Tenofovir, TDF, VIREAD®
Emtricitabina, FTC, EMTRIVA®

ABC TDF
3TC y FTC

Mutación Puntuación Mutación Puntuación


Mutación Puntuación
T69ins 1,0 T69ins 1,2
M184I/V 1,0
Q151M 1,0 K65R 1,0
K65R 0,5
K65R 0,75 Q151M 0,375
T69ins 0,5
L74I/V 0,75 M41L 0,35
K65N 0,25
Y115F 0,5 T215Y 0,35
Q151M 0,25
Q151L 0,5 L210W 0,3
T215F/Y 0,25
T215F/Y 0,3 K65N 0,25
E44D 0,125
M41L 0,25 K70E 0,25
K70E 0,125
K65N 0,25 Y115F 0,2
V75I 0,125
M184I/V 0,25 T215C/D/E/I/S/V 0,15
F77L 0,125
T215C/D/E/I/S/V 0,25 D67E/G/N 0,125
F116Y 0,125
L210W 0,2 K70R 0,125
V118I 0,125
K70E 0,125 V75I 0,125
Q151L 0,125
V75I 0,125 F77L 0,125
A62V 0,0625
F77L 0,125 F116Y 0,125
M41L 0,05
F116Y 0,125 Q151L 0,125
D67E/G/N 0,05
D67E/G/N 0,1 T215F 0,125
K70R 0,05
E44D 0,0625 K219E/N/Q/R 0,125
L210W 0,05
A62V 0,0625 E44D 0,0625
K219E/N/Q/R 0,05
V118I 0,0625 A62V 0,0625

V118I 0,0625

M184I/V −0,2

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B. Resistencia a INNTI B2. Delavirdina, DLV, RESCRIPTOR® B3. Efavirenz, EFV, SUSTIVA®
B1. Nevirapina, NVP, VIRAMUNE®
DLV EFV
NVP
Mutación Puntuación Mutación Puntuación
Mutación Puntuación
K103H/N/S/T 1,0 K103H/N/S/T 1,0

K103H/N/S/T 1,0 V106M 1,0 V106M 1,0

V106A/M 1,0 Y181C/I/V 1,0 Y188L 1,0

Y181C/I/V 1,0 Y188L 1,0 G190C/E/Q/S/T/V 1,0

Y188C/H/L 1,0 P236L 1,0 L100I 0,5

G190A/C/E/Q/S/T/V 1,0 Y318F 1,0 K101P/E 0,5

A98G 0,5 A98G 0,5 V106A 0,5

L100I 0,5 L100I 0,5 Y181C/I/V 0,5

K101E/P 0,5 K101E/P 0,5 Y188C/H 0,5

V108I 0,5 V106A 0,5 G190A 0,5

E138K 0,5 V108I 0,5 P225H 0,5

V179D/E/F 0,5 E138K 0,5 M230L 0,5

P225H 0,5 V179D/E/F 0,5 A98G 0,25

F227C/L 0,5 Y188C/H 0,5 K101Q 0,25

M230L 0,5 G190E/Q 0,5 K103R 0,25

K238T 0,5 P225H 0,5 V108I 0,25

Y318F 0,5 F227C 0,5 E138K 0,25

K101Q 0,25 M230L 0,5 V179D/E/F 0,25

K103R 0,25 K238T 0,5 F227C 0,25

K101Q 0,25 K238T 0,25

K103R 0,25 Y318F 0,25

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 41 de 66


B4. Etravirina, ETR, INTELENCE™ C. Resistencia a los inhibidores C2. Saquinavir, SQV, FORTOVASE®, INVIRASE®
de la proteasa
ETR SQV
C1. Indinavir, IDV, CRIXIVAN®

Mutación Puntuación Mutación Puntuación


IDV

V179F 0,5
G48V 1,0
Mutación Puntuación
Y181C/I/V 0,5
I84A/C/V 0,5
V82A/F/M/S/T 0,5
L100I 0,25
L90M 0,5
I84A/C/V 0,5
K101E/P 0,25
I54A/L/M/S/T/V 0,25
L90M 0,5
E138K 0,25
G73A/C/S/T 0,25
V32I 0,25
Y188L 0,25
V82A/F/S/T 0,25
M46I/L 0,25
G190C/E/Q/S/T/V 0,25
L10F/I/R/V 0,125
I47A 0,25
M230L 0,25
L24I 0,125
G48V 0,25
A98G 0,125
M46I/L/V 0,125
I54A/L/M/S/T/V 0,25
K103H/N/S/T 0,125
F53L 0,125
N88S 0,25
V106A/M 0,125
A71I/T/V 0,125
L24I 0,125
V179D/E 0,125
I50L −0,125
M46V 0,125
Y188C/H 0,125
L76V −0,125
I47V 0,125
G190A 0,125
F53L 0,125
P225H 0,125
G73A/C/S/T 0,125
F227C/L 0,125
L76V 0,125

N88D/T 0,125

L10F/I/R/V 0,0625

A71I/T/V 0,0625

I50L −0,125

Página 42 de 66 ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0


C3. Nelfinavir, NFV, VIRACEPT® C4. Amprenavir, APV, AGENERASE®, C5. Lopinavir/Ritonavir, LPV/r, KALETRA®
Fosamprenavir, FOS, LEXIVA®

NFV LPV/r
APV/FOS

Mutación Puntuación Mutación Puntuación


Mutación Puntuación
D30N 1,0 I47A 1,0
I50V 1,0
N88D/S/T 1,0 I50V 0,5
I47A 0,5
L90M 1,0 V32I 0,25
I54L/M 0,5
L23I 0,5 M46I/L 0,25
I84A/C/V 0,5
M46I/L/V 0,5 I54A/L/M/S/T/V 0,25
V32I 0,25
G48V 0,5 V82A/F/S/T 0,25
L33F 0,25
I54A/L/M/S/T/V 0,5 I84A/C/V 0,25
M46I/L 0,25
V82A/F/S/T 0,5 L24I 0,125
I47V 0,25
I84A/C/V 0,5 L33F 0,125
L76V 0,25
I47A 0,25 M46V 0,125
V82A/F/S/T 0,25
L10F/I/R/V 0,125 I47V 0,125
L90M 0,25
L24I 0,125 G48V 0,125
L10F/I/R/V 0,125
A71I/T/V 0,125 F53L 0,125
M46V 0,125
G73A/C/S/T 0,125 G73A/C/S/T 0,125
I54A/S/T/V 0,125
I50L −0,125 L76V 0,125
A71I/T/V 0,125
L90M 0,125
G73A/C/S/T 0,125
L10F/I/R/V 0,0625
I50L −0,125
A71I/T/V 0,0625
N88S −0,125
I50L −0,125

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 43 de 66


C6. Atazanavir, ATV, REYATAZ® C7. Tipranavir, TPV, APTIVUS® C8. Darunavir, DRV, PREZISTA®

ATV TPV DRV

Mutación Puntuación Mutación Puntuación Mutación Puntuación

I50L 1,0 V82L 0,5 I50V 0,375

N88S 1,0 V82T 0,375 V32I 0,25

I84A/C/V 0,5 I84A/C/V 0,375 I47A/V 0,25

V32I 0,25 L33F 0,25 I54L/M 0,25

M46I/L 0,25 M46I/L 0,25 L76V 0,25

I47A 0,25 I47A/V 0,25 I84A/V 0,25

I54A/L/M/S/T/V 0,25 I54A/V 0,25 V11I 0,125

V82A/F/S/T 0,25 V82F/S 0,25 L33F 0,125

N88D/T 0,25 V32I 0,125 G73A/C/S/T 0,125

L90M 0,25 E35G 0,125 I84C 0,125

L10F/I/R/V 0,125 K43T 0,125 L89V 0,125

M46V 0,125 M46V 0,125 M46I/L/V 0,0625

G48V 0,125 I54L/M/S/T 0,125 I54A/S/T/V 0,0625

A71I/T/V 0,125 Q58E 0,125 V82A/F/L/M/S/T 0,0625

G73A/C/S/T 0,125 G73A/C/S/T 0,125 L90M 0,0625

L24I 0,0625 T74P 0,125 I50L -0,125

L33F 0,0625 N83D 0,125

F53L 0,0625 L90M 0,125

L76V −0,125 L10F/I/R/V 0,0625

A71I/T/V 0,0625

V82A 0,0625

I50L/V −0,125

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Mensajes de error del software Mensaje Explicación

Selected file is invalid (El Se seleccionó un archivo de muestras (ab1) cuando el software
Mensaje Explicación archivo seleccionado no es esperaba un archivo de proyecto (vpr). [File > Open Project +
válido). Find (Archivo > Abrir proyecto + Buscar)]
O bien,
A unique non-blank user name Se hizo clic en el botón Add User (Añadir usuario) de la
must be used. Please select a ventana Administrator Access (Acceso de administrador) y se Se seleccionó un archivo de proyecto (vpr) cuando el software
different user name and try again. intentó crear un usuario que ya existía. esperaba un archivo de muestras (ab1). [File > New
(Debe utilizarse un nombre de Project/File > Open Project + New (Archivo >
Seleccione OK (Aceptar) y escriba un nombre de usuario único. Proyecto/Archivo nuevo > Abrir proyecto + Nuevo)]
usuario exclusivo sin dejar el
campo en blanco. Seleccione un O bien,
usuario diferente e inténtelo de
nuevo.) El tipo de archivo seleccionado en el cuadro de diálogo Open
(Abrir) es incorrecto.
Haga clic en OK (Aceptar) y seleccione el archivo correcto
Current Password incorrect. Se introdujo una contraseña incorrecta o se dejó en blanco el previsto.
Check ‘Caps Lock’ and try again. campo Current Password (Contraseña actual) en la ventana
(Contraseña actual incorrecta. User Access (Acceso de usuario).
Compruebe ‘Bloq mayús’ e Seleccione OK (Aceptar) y escriba correctamente la contraseña Sequence data does not cover Se intentó generar un informe de fármacos, un archivo FASTA
inténtelo de nuevo.) actual. critical portions of the reference y/o un informe XML con una secuencia de referencia que no
sequence. ViroSeq will not cubre la región situada entre el codón 9 de la proteasa y el
generate output. (Los datos de la codón 320 de la transcriptasa inversa. No se puede generar el
Default Password incorrect. La contraseña predeterminada que aparece en el cuadro de secuencia no cubren las partes informe si no se cubre la región situada entre el codón 9 de la
Check ‘Caps Lock’ and try again. diálogo Change Administrator Password (Cambiar cruciales de la secuencia de proteasa y el codón 320 de la transcriptasa inversa.
(Contraseña predeterminada contraseña del administrador) al iniciar el software por primera referencia. ViroSeq no generará
incorrecta. Compruebe ‘Bloq vez es incorrecta. un resultado.)
mayús’ e inténtelo de nuevo.) Seleccione «OK» (Aceptar) y escriba correctamente la
contraseña predeterminada (hiv1). The file is in use by another Se intentó guardar un informe nuevo con el nombre de un
application. You must close the archivo existente que está abierto en MS Word (o en cualquier
file in that application before otro programa que bloquee el archivo).
New passwords must be the Se introdujo una contraseña nueva válida en el cuadro de ViroSeq can output into that file.
same. Try entering the passwords dialogo Change Administrator Password (Cambiar Seleccione OK (Aceptar), cierre el archivo y después guárdelo
(El archivo está siendo utilizado de nuevo.
again. (Las contraseñas nuevas contraseña del administrador) o User Access (Acceso de por otra aplicación. Cierre el
deben ser iguales. Pruebe a usuario), pero la contraseña de confirmación no coincide. archivo en la otra aplicación para
introducirlas de nuevo.) Seleccione OK (Aceptar) y escriba como contraseña de que ViroSeq pueda guardar datos
confirmación la misma contraseña que introdujo en el campo en él.)
New password (Contraseña nueva).
Unable to assemble files in (No Se intentó crear un proyecto con menos de dos archivos de
Password length should be 6 to La contraseña nueva introducida en el cuadro de diálogo se pueden ensamblar los archivos segmentos con la misma ID de la muestra.
14 characters. Please choose a Change Administrator Password (Cambiar contraseña del de la carpeta): <carpeta> O bien,
longer password and try again. administrador), Administrator Access (Acceso de
(La contraseña debe tener una administrador) o User Access (Acceso de usuario) no tiene una Los archivos de muestras seleccionados en el cuadro de diálogo
longitud de entre 6 y 14 longitud suficiente. Open (Abrir) para ensamblarlos están dañados.
caracteres. Elija una contraseña Seleccione OK (Aceptar) y escriba una contraseña que tenga Seleccione OK (Aceptar) y compruebe que haya dos o más
más larga e inténtelo de nuevo.) entre 6 y 14 caracteres. archivos ab1 no dañados con la misma ID de la muestra en la
carpeta de trabajo.

The passwords entered were not Se introdujo una contraseña nueva válida en el cuadro de
the same. Please enter the exact diálogo Administrator Access (Acceso de administrador), pero Unable to load project (No se El sistema operativo de la plataforma no puede abrir el archivo
same password twice. (Las la contraseña de confirmación no coincide. puede cargar el proyecto): de proyecto (vpr) porque no tiene suficiente memoria o el disco
contraseñas introducidas no son <nombre del archivo> está dañado.
O bien,
iguales. Introduzca la misma O bien,
contraseña exacta dos veces.) Se hizo clic en el botón Add User (Añadir usuario) del cuadro
de diálogo Administrator Access (Acceso de administrador) Se intentó abrir un archivo de proyecto dañado o incompleto.
con un nuevo nombre de usuario válido y una contraseña de Seleccione OK (Aceptar) y compruebe que el archivo vpr no
confirmación que no coincide. esté dañado ni sea de solo lectura.
Seleccione OK (Aceptar) y escriba como contraseña de
confirmación la misma contraseña que introdujo en el campo
New password (Contraseña nueva). ViroSeq detected a deletion, Se intentó generar un informe de fármacos, un archivo FASTA
frame shifting insertion, and/or y/o un informe XML en una secuencia consensuada que tenía
multiple insertions. The software una eliminación, una inserción que desplazaba el marco de
User Name or password El nombre de usuario o la contraseña introducidos en el cuadro has not been validated for such lectura o varias inserciones.
incorrect. Check ‘Caps Lock’ de diálogo User Login (Inicio de sesión de usuario) no son mutations. Output will not be No se puede generar un informe de resistencia farmacológica,
and try again. (Nombre de válidos. created. (ViroSeq detectó una un archivo FASTA ni un informe XML cuando se detecta una
usuario o contraseña incorrectos. Seleccione OK (Aceptar) y escriba correctamente el nombre de eliminación, una inserción que eliminación, una inserción que desplaza el marco de lectura o
Compruebe ‘Bloq mayús’ e usuario y la contraseña. desplaza el marco de lectura y/o varias inserciones en la secuencia.
inténtelo de nuevo.) varias inserciones. El software no
está validado para esas
mutaciones. No se generará
Launch failed. A file is missing Falta un archivo o una carpeta del sistema ViroSeq, o está ningún resultado.)
or damaged. Please re-install the dañado.
software. If the problem persists, Seleccione OK (Aceptar) y vuelva a instalar el software
please contact technical support. ViroSeq. ViroSeq detected that an Se instaló una versión incorrecta de JRE.
(Error al iniciar. Falta un archivo incorrect version of Java Seleccione OK (Aceptar) y copie la carpeta correcta de JRE
o está dañado. Vuelva a instalar Runtime Environment [JRE] is del CD. Inicie el software ViroSeq.
el programa. Si el problema being used. Please refer to
persiste, póngase en contacto installation instructions for Plataforma Windows/versión de JRE
con el servicio de asistencia installing the appropriate JRE. Windows XP y 2000/JRE 1.4.2_10
técnica.) (ViroSeq detectó que se está
utilizando una versión incorrecta
de Java Runtime Environment
One or more “q” or “?”s were Se intentó generar un informe de fármacos, un archivo FASTA [JRE]. Consulte las instrucciones
detected in the consensus y/o un informe XML después de editar bases con «?» (con el de instalación para instalar la
sequence. ViroSeq will not teclado) o «q» (haciendo clic en la paleta Editing [Edición]). versión correcta de JRE.)
generate output. (Se detectó una No se puede generar el informe de resistencia farmacológica, el
o más «q» o «?» en la secuencia archivo FASTA ni el informe XML si se detecta una o más «q»
consensuada. ViroSeq no o «?» en la secuencia. ViroSeq software is not Se intentó instalar ViroSeq v2.8 en un sistema operativo
generará un resultado.) supported on Microsoft NT Windows NT.
operating system. (El sistema
operativo NT de Microsoft no
admite el software ViroSeq).

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 45 de 66


Software ViroSeq® y resultados El HIV-1 8E5 Positive Control (control positivo de VIH-1 de 8E5) es un VIH-1 no
infeccioso y debería producir poco fondo o ninguno. Cualquier mutación detectada,
aparte de las indicadas anteriormente, puede significar un error de edición o
• El software ViroSeq solo puede ser utilizado por usuarios cualificados. problemas con la calidad de la secuencia. Para determinar la causa del fallo es
• La obtención de resultados exactos y fiables depende de una buena calidad de necesaria una comparación con los resultados de las demás muestras. Por ejemplo:
la secuencia. Un nivel elevado de fondo y datos con ruido pueden interferir con • Si los picos del fondo son los responsables del fallo del control y se observan en
la identificación precisa de las bases. todas las muestras, y si todas las muestras tienen ruido del mismo color en una
• La comprensión y el uso de las directrices de edición incluidas en este determinada base, repita la calibración espectral (consulte Realización de una
documento puede ayudar a obtener identificaciones de bases más precisas calibración espectral); debe repetir los procedimientos desde «Transcripción
y a identificar mutaciones que de otra forma podrían pasarse por alto. inversa» hasta «Análisis con el software ViroSeq» para todas las muestras y
• Se necesitan varios cambios de nucleótidos en el codón de tipo natural para controles.
generar algunas mutaciones, como: V82T, V82S, T215Y, etc. En estos casos, • Si el color de los picos de fondo es aleatorio, debe repetir los procedimientos
cuando existen mezclas del tipo natural y del tipo mutante, el informe del desde «Transcripción inversa» hasta «Análisis con el software ViroSeq» para
software indica la presencia de dos aminoácidos, pero también especifica los todas las muestras y controles.
aminoácidos correspondientes a otras posibles combinaciones del codón.
Por ejemplo, una mezcla de Val (GTC) y Ser (TCC) en el codón 82 hace que Si vuelve a repetirse el fallo, póngase en contacto con el servicio de atención al
el informe indique la presencia de Val, Ser, Ala (GCC) y Phe (TTC) – V, S, A cliente de Abbott Molecular.
y F. Esta es una limitación de todas las metodologías de secuenciación de Nota. El virus del HIV-1 8E5 Positive Control (control positivo de VIH-1 de 8E5)
poblaciones, que no definen el ligamiento de los nucleótidos a partir de una sola tiene una inserción de una sola base en el codón 219 del gen de la TI que lo convierte
plantilla. en no infeccioso. La mutación 219 no aparece durante la edición ni en el
De acuerdo con el documento Guidance document for HIV-1 genotyping (Guía para Antiretroviral Drug Resistance report (Informe sobre resistencia a antirretrovirales)
el genotipado del VIH-1) de la FDA, no han finalizado los estudios analíticos en el porque es una mutación que desplaza el marco de lectura y no se encuentra en las
límite de detección con el ViroSeq HIV-1 Genotyping System para las siguientes muestras virales clínicas.
mutaciones:

Gen Mutación
RT E44D, K65N, D67E/G, D67N, T69N, K70E, L74I, V75A/I/M/S/T, A98G, L100I,
K101E/P/Q, K103H/S/T/R, V106M, V108I, Y115F, E138K, Q151L, V179D/E/F,
Y181I/V, Y188H, G190A/C/E/Q/S/T/V, T215C/D/E/F/I/S/Y/V, K219N/R, P225H,
F227L/C, M230L, P236L, K238T, Y318F
Proteasa L10F/V, V11I, L23I, L24I, V32I, L33F, E35G, K43T, M46L/V, I47A/V, I50L, F53L,
I54A/L/M/S/T, Q58E, A71I/T, G73A/C/S/T, T74P, L76V, V82L, N83D, I84A/C,
N88D/S/T, L89V

Éxito del genotipado


El éxito del genotipado se determina de forma cualitativa durante el análisis del
software ViroSeq. Para genotipar correctamente una muestra, seis de los siete
cebadores del ViroSeq system deben compilarse en un proyecto para generar la
secuencia consensuada (A o D, B, C, F, G, H). Además, es necesaria una evaluación
cualitativa de la calidad de la secuencia para garantizar la fiabilidad y la exactitud de
los resultados. Un nivel alto de ruido de fondo puede interferir con la determinación
de las mezclas virales. El programa ViroSeq Software v2.8 identifica una mezcla
viral cuando existe un pico secundario que equivale al menos a un 30% del pico
principal.
Los resultados esperados para el genotipado de los controles ViroSeq son:

Control positivo Control negativo

Valor esperado • Se ensamblan los No utilice un control negativo para determinar el éxito
siete cebadores o el fracaso del genotipado. Los controles negativos,
• No hay mutaciones que no contienen ADN, pueden contribuir a que la
de resistencia muestra falle debido a los efectos eléctricos adversos
farmacológica que tienen los capilares vacíos sobre los instrumentos
• Dos mutaciones de secuenciación que utilizan capilares.
adicionales
– Proteasa V3I
– RT L214F
• No hay bases mixtas

Realice una inspección visual cualitativa de los


electroferogramas para evaluar la calidad de la
secuencia y el nivel de fondo en el control.
Examine los datos del análisis para comprobar
que la calibración del instrumento sea exacta.
Si el análisis muestra picos ascendentes
(pull-up) coherentes y proporcionales (es decir,
picos más pequeños de otro color), realice una
nueva calibración espectral (consulte
Realización de una calibración espectral).

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Sección 5: Eficacia Tabla 1. Lista de mutaciones plenamente verificadas con un límite de detección
(LOD) de 2.000 copias/mL

diagnóstica M41L A62V K65R


En la transcriptasa inversa

T69D K70R L74V F77L K103N


F116Y V118I Q151M Y181C M184V L210W T215Y T215F
K219E K219Q
Contenido:
Eficacia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 En la proteasa

L10I K20R D30N M36I M46I G48V I54V L63P


A71V V82T V82A I84V L90M
Eficacia
Tabla 2. Lista de mutaciones totalmente verificadas con un LOD de 1.000 copias/mL
La eficacia diagnóstica del ViroSeq HIV-1 Genotyping System se evaluó
utilizando muestras virales y clínicas con mutaciones definidas que confieren al
virus resistencia a los antirretrovirales. Las muestras clínicas utilizadas en el análisis En la transcriptasa inversa
se obtuvieron de forma prospectiva o retrospectiva de pacientes adultos y pediátricos
(entre 4 meses y 17 años de edad) tratados con antirretrovirales. Los resultados M41L A62V K65R L74V F77L K103N F116Y V118I
presentados definen la sensibilidad, especificidad, reproducibilidad y precisión del Y181C M184V L210W T215F K219Q
ensayo en cuanto a la detección exacta de mutaciones específicas en los genes de la
TI y la proteasa del VIH-1 que le confieren resistencia a medicamentos autorizados. En la proteasa
También se utilizaron muestras clínicas en los estudios para determinar la tasa de
éxito de la secuenciación y la capacidad para detectar mutaciones en las mezclas, L10I D30N M36I M46I G48V I54V L63P A71V
y para definir la utilidad clínica. Se evaluó la capacidad del ViroSeq HIV-1
V82T I84V L90M
Genotyping System para detectar mutaciones específicas que confieren al virus
resistencia en una muestra de paciente, para evaluar las interpretaciones de
resistencia farmacológica y para generar un informe final Antiretroviral Drug
Resistance Report (Informe sobre resistencia a antirretrovirales) que utilice con Tabla 3. Las mutaciones utilizadas en el algoritmo de interpretación basado en
precisión un algoritmo de interpretación basado en reglas. El uso del ViroSeq HIV-1 reglas para evaluar la resistencia viral son:
Genotyping System aumentará la capacidad de los médicos para evaluar la eficacia
de los fármacos y diseñar estrategias terapéuticas personalizadas en combinación En la transcriptasa inversa
con otros resultados clínicos, como el cuadro clínico, los marcadores de laboratorio
y el historial de uso de antirretrovirales. M41L* E44D A62V* K65N K65R* D67E D67G D67N

La tabla 1 muestra una lista de mutaciones totalmente verificadas a una T69D* T69N K70E K70R* L74I L74V* V75A V75I
concentración de 2.000 copias de ARN/mL, de acuerdo con el documento Guidance
V75M V75S V75T F77L* A98G L100I K101E K101P
for Industry: Class II Special Controls Guidance Document: In Vitro HIV Drug
Resistance Genotype Assay (Guía para la industria: documento guía sobre controles K101Q K103N* K103H K103R K103S K103T V106A V106M
especiales de clase II: análisis de genotipos de resistencia farmacológica del VIH in
vitro) de la FDA. V108I Y115F F116Y* V118I* E138K Q151L Q151M* V179D

La tabla 2 muestra una lista de mutaciones plenamente verificadas a una V179E V179F Y181C* Y181I Y181V M184I M184V* Y188C
concentración de 1.000 copias de ARN/mL, de acuerdo con el documento Guidance Y188H Y188L G190A G190C G190E G190Q G190S G190T
for Industry: Class II Special Controls Guidance Document: In Vitro HIV Drug
Resistance Genotype Assay (Guía para la industria: documento guía sobre controles G190V L210W* T215C T215D T215E T215F* T215I T215S
especiales de clase II: análisis de genotipos de resistencia farmacológica del VIH in T215V T215Y* K219E* K219N K219R K219Q* P225H F227C
vitro) de la FDA.
F227L M230L P236L K238T Y318F Mutación por inserción en el codón
La tabla 3 muestra una lista de mutaciones que se utilizan en el algoritmo basado 69 (inserción 69)
en reglas del ViroSeq System.
En la proteasa
La tabla 4 muestra una lista de fármacos para los que se evalúa la resistencia
farmacológica en el ViroSeq System Antiretroviral Drug Resistance Report L10F L10I* L10R L10V V11I L23I L24I D30N*
(Informe sobre resistencia a antirretrovirales del sistema ViroSeq).
V32I L33F E35G K43T M46I* M46L M46V I47A
I47V G48V* I50L I50V F53L I54A I54L I54M
Lista de mutaciones plenamente verificadas I54S I54T I54V* Q58E A71I A71T A71V* G73A
Tal como exige la FDA en el documento Guidance for Industry: Class II Special G73C G73S G73T T74P L76V V82A* V82F V82L
Controls Guidance Document: In Vitro HIV Drug Resistance Genotype Assay (Guía
para la industria: documento guía sobre controles especiales de clase II: análisis de V82M V82S V82T* N83D I84A I84C 184V* N88D
genotipos de resistencia farmacológica del VIH in vitro), a continuación se indican N88S N88T L89V L90M*
las mutaciones que cumplen la especificación de sensibilidad superior al 90% tanto
en los: * Mutaciones plenamente verificadas

• Estudios de rendimiento analítico en el límite de detección (2.000 copias/mL)


en muestras con un 40% de mutantes
• Estudios de validez clínica con un panel de 50 aislados clínicos (carga viral =
1.800 a 10.500)
Se detectaron las mutaciones M184I, V82F y V82S en muestras clínicas que
formaban parte de las muestras con una carga viral elevada (superior a 10.500) en el
estudio de validez clínica. Estas mutaciones no se incluyen en la lista de mutaciones
verificadas de la tabla 1.

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 47 de 66


Tabla 4. El ViroSeq Antiretroviral Drug Resistance Report (Informe sobre Tabla 5. Mutaciones detectadas con una sensibilidad del 100% en muestras 100%
resistencia a antirretrovirales del sistema ViroSeq) indica la resistencia viral a los mutantes con 1.000 copias/mL
siguientes fármacos:
En la transcriptasa inversa
Inhibidores nucleósidos Inhibidores no nucleósidos
Inhibidores de la proteasa
de la TI a de la TI M41L A62V K65R D67N T69D K70R
EPIVIR®/lamivudina/3TC INTELENCE™/etravirina/ETR AGENERASE®/amprenavir/ L74V V75I F77L K103N V106A Y115F
APV
F116Y V118I Q151M Y181C M184I/V Y188C/L
EMTRIVA®/emtricitabina/FTC RESCRIPTOR®/delavirdina/ APTIVUS®/tipranavir/TPV
DLV L210W T215F/Y K219E/Q T69S + SS
[mutación por
RETROVIR®/zidovudina/AZT SUSTIVA®/efavirenz/EFV CRIXIVAN®/indinavir/IDV inserción en el
codón 69
VIDEX®/didanosina/ddI VIRAMUNE®/nevirapina/NVP FORTOVASE®/INVIRASE®/ (inserción 69)]
saquinavir/SQV
En la proteasa
VIREAD®/tenofovir/TDF KALETRA®/lopinavir/ritonavir/
LPV/r
L10I/R K20R D30N M36I M46I G48V
ZERIT®/estavudina/d4T LEXIVA®/fosamprenavir/FOS
I50V I54V L63P A71V V82A/F/S/T I84V
ZIAGEN®/abacavir/ABC PREZISTA®/darunavir/DRV
L90M
REYATAZ®/atazanavir/ATV
VIRACEPT®/nelfinavir/NFV • Cuando la mutación estaba presente en una mezcla 40/60 de los tipos
mutante/natural, la sensibilidad acumulada fue superior al 97% y la especificidad
a El informe también evalúa la resistencia a varios nucleósidos a través de la presencia del acumulada de la detección fue superior al 99,9% para todas las mutaciones con
complejo Q151M o de la inserción 69.13 La resistencia a COMBIVIR® y TRIZIVIR® se puede cualquier carga viral superior a 1.000 copias/mL.
deducir a partir del informe. • Con una carga viral de solo 2.000 copias/mL y una mezcla 40/60 de los tipos
mutante/natural, la sensibilidad acumulada fue del 98,1% (4 negativos falsos
[NF]/206) y la especificidad acumulada fue del 99,9% (1 positivo falso
Sensibilidad analítica [PF]/1422).
• Con una carga viral de solo 1.000 copias/mL y una mezcla 40/60 de los tipos
Se utilizaron dos parámetros para definir la sensibilidad analítica. mutante/natural, la sensibilidad acumulada fue del 92,7% (15 NF/206) y la
especificidad acumulada fue del 99,9% (1 PF/1422).
• Determinación de la carga viral mínima de VIH-1 para detectar mutaciones de • La tabla 6 (transcriptasa inversa) y la tabla 7 (proteasa) muestran la sensibilidad
forma fiable. de cada mutación en una mezcla con un 40% de mutantes y cargas virales de
• Determinación de la menor cantidad de virus mutante en una mezcla que permite 1.000 copias/mL o más.
la detección fiable de la mutación. Además, se asignó un valor de límite de detección a cada mutación.

Límite de detección Tabla 6. Sensibilidad de la detección de mutaciones en el gen de la transcriptasa


inversa en una mezcla con un 40% de mutantes
Detección de mutaciones
El ViroSeq System fue capaz de detectar con exactitud las mutaciones Mutación en la Sensibilidad con Sensibilidad con
LOD propuesto
transcriptasa > 1.000 copias/mL > 2.000 copias/mL
de resistencia farmacológica específicas que se indican a continuación inversa (n.º de positivos reales) (n.º de positivos reales)
(comentarios)
en 1.000 copias/mL (para las muestras con un 100% de mutantes) o en
2.000 copias/mL (en las muestras con un 40% de mutantes). M41L 98,8 100 2.000
Descripción del estudio. Para estos estudios, el límite de detección se define como (82) (71)
la carga viral más baja con una sensibilidad del 100%. En este estudio se utilizó un
A62V 100 100 1.000
solo lote de reactivos. Se formularon doce virus recombinantes en plasma negativo (35)
(41)
como 100% puros y 40/60 de tipo mutante/natural.
K65R 100 100 1.000
Resultados (13) (11)

D67N 91,6 93 No determinado


• En los casos en los que la mutación estaba presente en el 100% de la población (76) (66) (1)
viral, el límite de detección para todas las mutaciones fue de 1.000 copias/mL, En un estudio posterior con
es decir, se obtuvo una sensibilidad del 100% y una especificidad del 100% con tres lotes, uno de los lotes
1.000 copias/mL para las mutaciones siguientes. mostró una sensibilidad del
• En estudios posteriores con 2.000 copias/mL en una mezcla 40/60, la 83% con 2.000 copias/mL y
los otros dos mostraron una
sensibilidad para D67N y T69D fue del 83% y del 50%, respectivamente, con sensibilidad del 100%.
uno de los tres lotes de reactivos.
T69D 92,9 100 2.000
(13) (12)
En un estudio posterior con
tres lotes, uno de los lotes
mostró una sensibilidad del
50% con 2.000 copias/mL y
los otros dos mostraron una
sensibilidad del 100%.

K70R 98,2 100 2.000


(54) (47)

L74V 100 100 1.000


(14) (12)

V75I 97,6 97,1 6.000 (2)


(40) (34)

F77L 100 100 1.000


(41) (35)

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Tabla 6. Sensibilidad de la detección de mutaciones en el gen de la transcriptasa Tabla 7. Sensibilidad de la detección de mutaciones en el gen de la proteasa en una
inversa en una mezcla con un 40% de mutantes (continuación) mezcla con un 40% de mutantes (continuación)

Mutación en la Sensibilidad con Sensibilidad con Sensibilidad con Sensibilidad con LOD
LOD propuesto Mutación en
transcriptasa > 1.000 copias/mL > 2.000 copias/mL > 1.000 copias/mL > 2.000 copias/mL propuesto
(comentarios) la proteasa
inversa (n.º de positivos reales) (n.º de positivos reales) (n.º de positivos reales) (n.º de positivos reales) (comentarios)

K103N 98,6 100 2.000 L63P 100 100 1.000


(68) (59) (26) (22)

V106A 100 100 1.000 A71V 91,7 90,0 1.000 (8)


(25) (21) (11) (9)

Y115F 85,2 95,7 6.000 (3) V82A 96,4 100 2.000


(23) (22) (27) (24)

F116Y 100 100 1.000 V82F 100 100 1.000


(41) (35) (13) (11)

V118I 100 100 1.000 V82S 85,7 83,3 1.000 (9)


(28) (24) (12) (10)

Q151M 97,6 100 2.000 V82T 100 100 1.000


(40) (35) (27) (23)

Y181C 100 100 1.000 I84V 100 100 1.000


(54) (46) (26) (22)

M184I 100 100 1.000 L90M 98,8 98,5 1.000 (10)


(14) (12) (79) (67)

M184V 98,9 98,7 1.000 (4)


(92) (78) Comentarios:
Y188C 100 100 1.000 1. El ensayo detecta la mutación D67N de la TI con una sensibilidad menor.
(14) (12) Se obtuvieron siete resultados NF en 83 detecciones con cargas virales de
>1.000 copias/mL. La mutación D67N se detectó con una sensibilidad del
Y188L 100 100 1.000 100% en cinco de los paneles virales (MC1, MC2, MC3, MC4 y MC5). Sin
(13) (11)
embargo, con uno de los miembros del panel (GT1a) se obtuvieron siete
L210W 100 100 1.000 resultados NF.
(53) (45)
2. El LOD propuesto es de 6.000 copias/mL para la mutación V75I de la TI
T215F 98,8 100 2.000 (6 positivos reales determinados). Con 2.000 copias/mL o más, se obtuvo un
(82) (71) NF en las 42 detecciones esperadas. Con solo 1.000 copias/mL, la
sensibilidad fue del 100%.
T215Y 95,8 100 2.000
(23) (20) 3. El LOD propuesto es de 6.000 copias/mL para la mutación Y115F de la TI
(4 positivos reales determinados). Se obtuvo una sensibilidad del 100% con
K219E 78,6 83,3 2.000 (5) cargas virales de 6.000 copias/mL o más; con 2.000 copias/mL, se obtuvo
(11) (10) un NF en las cuatro detecciones esperadas.
K219Q 97,6 97,1 1.000 (6) 4. La mutación M184V de la TI se detectó con una sensibilidad del 100%
(40) (34) (28 detecciones) con 1.000 y 2.000 copias/mL. Sin embargo, se obtuvo un
NF con 6.000 copies/mL (en 84 detecciones). Por lo tanto, el LOD propuesto
para esta mutación es de 1.000 copias/mL.
Tabla 7. Sensibilidad de la detección de mutaciones en el gen de la proteasa en una 5. La mutación K219E de la TI tuvo un total de tres resultados NF, uno con
mezcla con un 40% de mutantes 1.000 copias/mL y los otros dos con 60.000 copias/mL. Éste fue un resultado
anómalo, ya que la mutación se detectó con una sensibilidad del 100% con
Sensibilidad con Sensibilidad con LOD otras cargas virales (6.000, 20.000, 200.000 y 750.000 copias/mL). Por lo
Mutación en tanto, el LOD propuesto es de 2.000 copias/mL.
> 1.000 copias/mL > 2.000 copias/mL propuesto
la proteasa
(n.º de positivos reales) (n.º de positivos reales) (comentarios)
6. La mutación K219Q de la TI se asoció a un resultado NF con
6.000 copias/mL (de un total de 40 detecciones) y se detectó con una
L10I 100 100 1.000
(12) (10) sensibilidad del 100% con cargas virales de 1.000 y 2.000 copias/mL (12/12).
Por lo tanto, el LOD propuesto para esta mutación es de 1.000 copias/mL.
L10R 100 100 1.000 7. La mutación M46I de la proteasa se asoció a un resultado NF con
(14) (12)
2.000 copias/mL (en 40 detecciones) y se detectó con una sensibilidad del
K20R 91,7 100 2.000 100% con 1.000 copias/mL y cargas virales de más de 2.000 copias/mL. Por
(11) (10) lo tanto, el LOD propuesto para esta mutación en una mezcla del 40% es de
1.000 copias/mL.
D30N 100 100 1.000
(14) (12) 8. La mutación A71V de la proteasa se asoció a un resultado NF con
6.000 copias/mL (de un total de 12 detecciones) y se detectó con una
M36I 100 100 1.000 sensibilidad del 100% con cargas virales de 1.000 y 2.000 copias/mL. Por
(12) (10) lo tanto, el LOD propuesto para esta mutación es de 1.000 copias/mL.
M46I 97,6 97,1 1.000 (7) 9. La mutación V82S de la proteasa se asoció a dos resultados NF con
(40) (34) 6.000 copias/mL (de un total de 12 detecciones) y se detectó con una
sensibilidad del 100% con cargas virales de 1.000 y 2.000 copias/mL. Por
G48V 100 100 1.000 lo tanto, el LOD propuesto para esta mutación es de 1.000 copias/mL.
(14) (12)
10. La mutación L90M de la proteasa se asoció a un resultado PF con
I50V 100 100 1.000 6.000 copias/mL (de un total de 80 detecciones) y se detectó con una
(14) (12) sensibilidad del 100% con cargas virales de 1.000 y 2.000 copias/mL. Por
lo tanto, el LOD propuesto para esta mutación es de 1.000 copias/mL.
I54V 100 100 1.000
(12) (10)

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 49 de 66


Detección de mezclas
Virus relacionados Microorganismo coinfectante
El ViroSeq System puede detectar con exactitud:
VIH-2 Citomegalovirus
• 24 mutaciones presentes en una mezcla con un 40% de mutantes con
2.000 copias/mL HTLV-I Virus Epstein-Barr
• 11 mutaciones presentes en una mezcla con un 30% de mutantes con HTLV-II Hepatitis B
2.000 copias/mL
• 3 mutaciones presentes en una mezcla con un 20% de mutantes con Hepatitis C
2.000 copias/mL
Descripción del estudio. En este estudio se formularon once clones recombinantes
con tres cargas virales (2.000, 50.000 y 750.000 copias/mL) en seis mezclas virales Sustancias interferentes
(100%, 80%, 60%, 40%, 30% y 20% de mutantes).
Resultados. Se analizaron sustancias biológicas habituales y fármacos antitranscriptasa inversa
(anti-TI) o inhibidores presentes en el plasma de los pacientes con el fin de evaluar
• Con la carga viral de 2.000 copias/mL, las mutaciones se detectaron con una su capacidad para interferir con la detección de mutaciones que confieren resistencia
sensibilidad > 95% en las mezclas que se indican a continuación. viral en el ViroSeq HIV-1 Genotyping System. En este estudio se consideró como
interferente con la eficacia del ensayo cualquier sustancia que ocasionara una
Tabla 8. Detección con 2.000 copias/mL concordancia inferior al 90% entre el genotipo de la muestra problema y el genotipo
esperado.
Porcentaje de mutantes
Los resultados indican que las sustancias biológicas habituales y los inhibidores o
en la mezcla
Gen de la transcriptasa
Gen de la proteasa fármacos antitranscriptasa inversa presentes en las personas infectadas con el VIH-1
inversa no interfieren con el ensayo. Las sustancias evaluadas fueron:
(%)

20 — L10R • Antirretrovirales: AZT, ddI, 3TC, d4T, abacavir, nevirapina, efavirenz.


D30N Nota. Las mutaciones V118I y Q151M de la transcriptasa inversa se detectaron
I50V en 14 de las 16 muestras (sensibilidad del 88%). Todas las demás mutaciones se
30 K65R V82F
detectaron con una sensibilidad superior al 94%.
K70R V82S • Lípidos (30 mg/mL), bilirrubina (0,6 mg/mL) y hemoglobina (5 mg/mL).
Y181C V82T
M184I
Y188C
T215F Precisión y reproducibilidad
K219E/Q
40 M41L L10I El ViroSeq System es capaz de detectar de forma reproducible mutaciones
T69D K20R de resistencia farmacológica específicas en distintos centros y con distintos
L74V M36I técnicos, distintos lotes fabricados, y diferente número de repeticiones y de
V75I M46I series analíticas en el ensayo.
F77L G48V
K103N I54V El estudio de imprecisión analítica y el estudio de reproducibilidad clínica apoyan
V106A L63P esta afirmación. El estudio de imprecisión muestra un intervalo de variabilidad entre
F116Y A71V
V118I V82A análisis (%CV) entre 0,1% y 1,4%, y un intervalo de variabilidad intraensayo
Y188L I84V (%CV) entre 0,1 y 5,3%. El estudio de reproducibilidad clínica muestra que el
M184V L90M ViroSeq System puede detectar de forma reproducible mutaciones específicas que
L210W confieren resistencia farmacológica en muestras de pacientes infectados con VIH-1
T215Y
con cargas virales bajas (1.800-10.500 copias/mL), cuando la mutación constituye el
40% o más de la cuasiespecie, con un %CV < 0,1%, muy inferior al nivel de
significación (> 5%).
Especificidad analítica
Estudio de imprecisión
El ViroSeq System es capaz de genotipar con exactitud mezclas de muestras virales
en presencia de otros agentes infecciosos encontrados en los pacientes infectados El estudio de imprecisión analizó por duplicado seis mezclas virales
con el VIH-1. Este estudio de especificidad analítica demuestra que la presencia mutantes/naturales con una carga viral de 2.000 copias/mL y un nivel de mezcla
de virus relacionados o no relacionados con el VIH-1, con una carga viral de del 40% en diez series analíticas, con el fin de evaluar la variabilidad entre análisis
aproximadamente cinco veces la del VIH-1, no afecta a la eficacia diagnóstica del del ViroSeq HIV-1 Genotyping System (consulte los resultados en la tabla 9).
ensayo. La presencia de estos agentes infecciosos no produjo valores de
concordancia inferiores al 90% en ninguna de las 72 muestras analizadas. Esto
demuestra que ninguno de los virus infecciosos reduce la especificidad del ViroSeq
System para detectar con exactitud las mutaciones específicas antes indicadas en
el VIH-1, que confieren al virus resistencia farmacológica.
Los resultados indican que ninguno de los microorganismos siguientes interfiere con
el ensayo ViroSeq ni es detectado por éste.

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Tabla 9. Coeficientes de variación calculados por virus y gen recombinantes TI-PCR y tasa de éxito de la secuenciación
%CV El ViroSeq System es capaz de genotipar correctamente una parte importante
Virus mutante Gen (≥ 98%) de las muestras de la población diana cuando se cuenta con una
Entre análisis Intraensayo cantidad suficiente de producto para la TI-PCR.
Se seleccionaron 100 muestras de pacientes adultos infectados con el VIH-1 que
RT < 0,1 2,6 representaran una sección transversal geográfica de distintas cargas virales y
GT-4
Proteasa < 0,1 < 0,1 mutaciones de resistencia. 50 de estas muestras se agruparon en la categoría de carga
viral baja (1.800 a 10.500 copias/mL) y 50 en la categoría de carga viral elevada
RT < 0,1 3,7 (superior a 10.500 copias/mL).
MC-1
Proteasa < 0,1 1,8 En el estudio PACTG 377, tres laboratorios (Johns Hopkins, UCLA y la University
RT < 0,1 2,3 of Medicine and Dentistry of New Jersey) y tres técnicos analizaron las 196
MC-2 muestras con cargas virales > 1.084 copias/mL.
Proteasa < 0,1 2,2
RT 1,4 1,6
MC-5
Proteasa < 0,1 < 0,1
Detección de mezclas en las muestras
RT < 0,1 10,9 a
de pacientes
MC-6
Proteasa < 0,1 3,3 El ViroSeq System es capaz de detectar con exactitud mutaciones de resistencia
RT < 0,1 5,3
farmacológica específicas en muestras clínicas de plasma con EDTA en un
MC-7 intervalo de cargas virales bajas (1.800 a 10.500 copias/mL) y con un límite bajo
Proteasa < 0,1 2,2 de mezclas virales (≥ 40% de mutantes).
El estudio de validez clínica, en el que se comparó el porcentaje de mutaciones
a Este valor es el resultado de una muestra en la que solo se detectaron 3 de 13 mutaciones. En detectadas en cada muestra por clonación del producto de la PCR con las mutaciones
esta muestra, el rendimiento de la TI-PCR no cumplió las especificaciones, ya que fue de detectadas mediante la secuenciación de la población con el ViroSeq System, apoya
aproximadamente 10 ng, es decir, inferior a los 20 ng mínimos de rendimiento de la TI-PCR la afirmación anterior. Este estudio muestra que las mutaciones que representan un
necesarios para las reacciones de secuenciación. 40% o más de la cuasiespecie en muestras con un intervalo de cargas virales bajo
(1.800 a 10.500 copias/mL) pueden detectarse de forma reproducible en tres centros
Los datos de la tabla 9 muestran que el %CV entre análisis está en el intervalo de distintos, con un valor de concordancia > 98% en el límite inferior del intervalo de
< 0,1 a 1,4. Cinco de los 6 valores de %CV fueron < 0,1 y uno fue de 1,4. El %CV confianza del 95%.
intraensayo estuvo en el intervalo de < 0,1 a 5,3. Tabla 11. Las mutaciones detectadas en este estudio fueron:
Los resultados de este estudio corroboran la afirmación de Celera de que el
ViroSeq HIV-1 Genotyping System tiene una variabilidad entre análisis que no En la transcriptasa inversa
es significativa (≤ 5%).
M41L E44D A62V K65R D67N S68G T69D K70R
L74V V75I F77L L100I K101E K103N V108I Y115F
Estudio de reproducibilidad clínica F116Y V118I Q151M Y181C Y181I M184V G190A G190S
L210W T215Y T215F K219Q K219E
La reproducibilidad clínica del ViroSeq HIV-1 Genotyping System se midió en
un estudio multicéntrico para determinar la variación del ensayo entre centros y En la proteasa
entre lotes. Se analizaron en 3 centros 11 muestras de pacientes con cargas virales L10I L10F L10V K20M K20R D30N V32I L33F
entre 1.800 y 10.500 copias/mL. Cada una de las 11 muestras se analizó por
duplicado con tres lotes distintos, lo que generó 18 puntos de datos por muestra M36I M46I M46L I47V G48V F53L I54V L63P
extraída (3 centros x 3 lotes x 2 repeticiones). Se evaluó la detección de todas las A71I A71T A71V G73S V77I V82A V82T I84V
mutaciones presentes en la muestra extraída y se comparó para determinar la N88D L90M
variabilidad (%CV). Los resultados de la tabla 10 muestran una variación entre
centros y entre lotes insignificante con el ViroSeq System. Para este estudio se utilizaron muestras con una carga viral baja, elegidas
aleatoriamente respecto a la edad (mayores de 18 años), el sexo, el historial clínico
Tabla 10. Resultados de reproducibilidad clínica
y el tratamiento de los pacientes. Las muestras se recogieron de forma prospectiva
de pacientes infectados con el VIH-1 en distintos puntos geográficos de la población
Intervalo del %CV diana. Las mutaciones detectadas y su frecuencia se consideran representativas de
la población diana infectada con el VIH-1. En esta población, la capacidad del
ViroSeq System para detectar la lista de mutaciones de resistencia farmacológica
Fuente de la variación RT Proteasa seleccionadas es siempre elevada para todas las mutaciones detectadas. En algunos
casos el ensayo fue capaz de detectar mutaciones presentes en una proporción
inferior al límite del 40%, aunque esto no ocurrió en todos los centros ni con todas
Entre centros < 0,1 < 0,1 las mutaciones.
El control de calidad de los datos de este estudio de validez clínica consistió en
Entre lotes < 0,1 < 0,1
un análisis filogenético de 300 muestras (50 muestras extraídas x 6 repeticiones
de cada una). El árbol filogenético obtenido no muestra indicios de contaminación
Intraensayo < 0,1 < 0,1 a 4,7 a por arrastre de los amplicones de la PCR. Este estudio muestra que la
uracil-N-glicosilasa AmpErase® y los procedimientos de contención recomendados
Total < 0,1 < 0,1 controlan eficazmente la contaminación relacionada con la PCR.
También se analizó la exactitud de los datos para todas las bases.
a
El %CV intraensayo para la mayoría de las muestras analizadas fue < 0,1. Dos muestras
tuvieron valores de 1,3 y 4,7.

Los resultados de este estudio corroboran la afirmación de Celera de que la


variabilidad entre centros, entre lotes e intraensayo del ViroSeq HIV-1
Genotyping System no es significativa (< 5%).

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 51 de 66


Estudio de utilidad clínica Tabla 13. Estadísticas de las muestras por gen para la concordancia con GART

El software del ViroSeq® System utiliza las mutaciones de resistencia


farmacológica para generar valoraciones de resistencia farmacológica de Gen
utilidad clínica demostrada.
La resecuenciación de las muestras del estudio GART con el ViroSeq System apoya RT Proteasa
esta afirmación. El estudio GART había demostrado anteriormente la utilidad clínica
de varias mutaciones de la TI y de la proteasa mencionadas en la tabla 12.14
Basándose en informes publicados recientemente, se incorporaron otras mutaciones Media 0,969 0,954
en el algoritmo de interpretación basado en reglas.
Mediana 1,000 1,000
Tabla 12. Otras mutaciones detectadas en el estudio GART, pero no en la lista de
mutaciones analizadas del estudio original
Desviación estándar 0,066 0,086

En la transcriptasa inversa
Error estándar de la media 0,005 0,007

M41L A62V K65R D67N T69D K70R L74V V75I


Mínimo 0,652 0,538
V75T F77L K103N V106A F116Y Q151M Y181C Y181I
Máximo 1,000 1,000
M184V Y188C L210W T215Y T215F K219Q K219E

En la proteasa La concordancia entre el ensayo «casero» del estudio GART y el ViroSeq HIV-1
Genotyping System es bastante buena (> 95%), y alcanza el nivel necesario para
L10I L10R L10V K20M K20R L24I D30N M36I
confirmar la utilidad clínica del ViroSeq System. Asimismo, la mayoría de las
muestras se analizaron correctamente (149/153, o 97%), lo que permite aplicar las
conclusiones de utilidad clínica originales del análisis de los datos sin necesidad de
M36L M46I M46L G48V I54V L63P A71T A71V repetir el análisis.
Por lo tanto, el estudio anterior apoya la afirmación de Celera de que se ha
V77I V82A V82F V82T I84V N88D L90M
demostrado la utilidad clínica de las mutaciones detectadas e incluidas en el
estudio GART cuando la detección se lleva a cabo con el ViroSeq HIV-1
Genotyping System.
El estudio GART (Genotyping Antiretroviral Resistance Testing [pruebas de
genotipado de resistencia antirretroviral]) fue uno de los estudios de utilidad clínica
fundamentales. Se demostró que cuando los médicos tienen acceso a los datos de
genotipado antes de modificar el tratamiento, toman mejores decisiones respecto al
tratamiento, y la respuesta a corto plazo de los pacientes al tratamiento mejora.14
El estudio incluyó dos grupos: uno (GART) permitía al médico responsable del
tratamiento acceder a los resultados del genotipado y a las recomendaciones de
tratamiento del panel de expertos, mientras que el otro (sin GART) no permitía
acceder a esta información antes de prescribir el tratamiento. Se comparó la
disminución media de la carga viral a las 4, 8 y 12 semanas en estos dos grupos.
El grupo GART mostró una disminución significativa en la carga viral en
comparación con el grupo sin GART, en particular cuando los médicos siguieron
las recomendaciones de tratamiento de los expertos. Gracias a este protocolo y
a otros similares, las pruebas de resistencia se han convertido en procedimientos
de referencia a la hora de diseñar estrategias terapéuticas para los pacientes que
experimentan fracasos del tratamiento. Para demostrar que nuestro ensayo detecta
las mismas mutaciones de resistencia que el ensayo «casero» utilizado en el estudio
GART, solicitamos a los investigadores originales del estudio GART las 153
muestras de paciente utilizadas, así como los resultados de secuenciación originales
de este estudio. En la tabla 13 se puede observar que la comparación de los datos de
genotipado muestra una elevada concordancia.

Página 52 de 66 ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0


Sección 6: Mantenim- Artículo

iento y calibración de los


ABI PRISM ® 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético 3100-AVANT
ABI PRISM® 3100-Avant) con: ¡IMPORTANTE! No debe
• Data Collection Software v.1.0 (software de recogida descargarse software de
de datos v.1.0) Internet para este uso

analizadores ABI PRISM ® •



Versión del firmware 6278000-01 ó 6278050-01
PC con:
– Microsoft® Windows NT® v.4.0, Service Pack 6 o 6a
específico.

– Procesador Intel® Pentium® IV a 2 GHz

3100 y 3100-Avant •
– 1 GB de RAM
– 2 x discos duros de 36 GB
Kit de limpieza del bloque de polímero

Genetic Analyzers MicroAmp® 96-Well Support Base (Base de soporte de 96 pocillos


MicroAmp®)
N801-0531

(Analizadores genéticos
Separadores de depósitos 4315932
Base de placa de 96 pocillos 4317237
Retenedor de placa de 96 pocillos 4317241

ABI PRISM® 3100 y 3100- Separadores de placa de 96 pocillos


®
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate (placa óptica de
4315933
N801-0560

Avant)
96 pocillos para reacción MicroAmp®)
Jeringa de vidrio para llenado de la matriz, 250 μL 4304470
Jeringa de vidrio con polímero de reserva, 5,0 mL 628-3731
Juntas tóricas de jeringa 221102
Contenido:
ABI PRISM ® Sequencing Analysis Software v.3.7 para el 4317380
Material necesario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 ordenador con Windows NT® Si necesita licencias adicionales,
Cuidado de los analizadores 3100 y 3100-Avant Genetic Analyzers utilice 4310990 y especifique
(Analizadores genéticos 3100 y 3100-Avant) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53 la v.3.7
Matriz de capilares. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 ¡IMPORTANTE! No
descargue software de Internet
Jeringas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 para este uso específico.
Bloques de polímero . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
Inyector automático . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59 3100 Performance Optimized Polymer 6 (POP-6™) 4316357
Unidades de placa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 BigDye® Terminator Sequencing Standard v1.1 (patrón de 4336791
Mantenimiento del ordenador . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 secuenciación BigDye® Terminator v1.1)
Calibración espacial y espectral. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 Solución tampón 10X con EDTA del analizador genético 402824
Formamida Hi-Di™, 25 mL 4311320

Material necesario
Contiene formamida.
Si desea ver las ilustraciones y diagramas que explican cómo llevar a cabo una tarea
específica en el ABI PRISM ® 3100 Genetic Analyzer (Analizador genético ABI R 61 Riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto.
PRISM® 3100), consulte el ABI PRISM ® 3100 Genetic Analyzer User Guide (Guía R 36/38 Irrita los ojos y la piel.
S 53 Evítese la exposición – recábense instrucciones especiales
del usuario del analizador genético ABI PRISM® 3100), (PN 4334785). antes del uso.
Si desea ver las ilustraciones y diagramas que explican cómo llevar a cabo una tarea S 24/25 Evítese el contacto con los ojos y la piel.
específica en el ABI PRISM ® 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético S 35 Elimínense los residuos del producto y sus recipientes con
ABI PRISM® 3100-Avant), consulte el ABI PRISM® 3100-Avant Genetic Analyzer todas las precauciones posibles.
S 36/37/39 Úsense indumentaria y guantes adecuados, y
User Guide (Guía del usuario del analizador genético ABI PRISM® 3100-Avant), protección para los ojos/la cara.
(PN 4333549). S 45 En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente
al médico (si es posible, muéstresele la etiqueta).
Artículo

ABI PRISM ® 3100 Capillary Array (matriz de capilares


ABI PRISM® 3100), 50 cm
4315930
Cuidado de los analizadores 3100
ABI PRISM ® 3100-Avant Capillary Array (matriz de capilares
ABI PRISM® 3100-Avant), 50 cm
4333466
y 3100-Avant Genetic Analyzers
ABI PRISM ® 3100 Genetic
Analyzer (Analizador genético
ABI PRISM ® 3100 Genetic
Analyzer (Analizador genético ¡IMPORTANTE! No
3100-01
(Analizadores genéticos 3100
ABI PRISM® 3100) con: ABI PRISM® 3100) con:
• Data Collection Software
v.1.0.1 (software de

descargue software de Internet
Data Collection Software para este uso específico.
v.1.1 (software de
y 3100-Avant)
recogida de datos v.1.0.1) recogida de datos v.1.1)
• Versión del firmware • Versión del firmware
6286100-04 6286150-01
• PC con: • PC con: Mantenimiento
– Microsoft® Windows – Microsoft® Windows
NT® v.4.0 NT® v.4.0, Service Siga el plan de mantenimiento que se describe a continuación para obtener un
– Procesador Intel® Pack 5 o 6a rendimiento óptimo del instrumento.
Pentium® III a – Procesador Intel®
550 MHz Pentium® IV a 2 GHz ¡IMPORTANTE! La instalación de los analizadores 3100 y 3100-Avant Genetic
– 256 MB de RAM – 1 GB de RAM Analyzers (Analizadores genéticos 3100 y 3100-Avant) debe realizarla un ingeniero
– Disco duro de 18 GB – 2 x discos duros de de servicio técnico cualificado de Applied Biosystems. Mantenga los instrumentos
• Kit de limpieza del 36 GB en una habitación con una temperatura ambiente entre 15 °C y 30 °C (entre 59 °F y
bloque de polímero • Kit de limpieza del 85 °F). Las temperaturas que sobrepasen estos límites o un nivel alto de humedad
bloque de polímero pueden causar condensación, reducir el rendimiento y causar daños al instrumento.

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 53 de 66


Nota. Después de abrir la puerta del 3100 y 3100-Avant Genetic Analyzer
(Analizador genético 3100 o 3100-Avant), espere a que finalice la secuencia Calibre el inyector automático. Según sea necesario
de vuelta a la posición inicial del inyector automático antes de emitir un nuevo
comando.
Limpieza del instrumento
Tareas que hay que realizar antes de cada análisis
1. Pulse el botón Tray (Bandeja) de la parte frontal del instrumento para mover
Asegúrese de que los separadores de placa estén bien asentados y en posición el inyector automático a la posición de avance.
horizontal.
2. Limpie cualquier resto de líquido que haya en el inyector automático o
alrededor de éste utilizando un pañuelo desechable que no suelte pelusa.
Asegúrese de que la unidad de placa esté montada correctamente.
¡IMPORTANTE! Asegúrese de que los separadores de placa estén en posición
horizontal sobre la placa. Los orificios del retenedor de la placa deben estar 3. Limpie las bandejas de goteo con agua desionizada y un pañuelo desechable
que no suelte pelusa.
alineados con los orificios de los separadores; de lo contrario, podrían dañarse
las puntas de los capilares.
4. Limpie cualquier acumulación de polímero (cristales) que pueda haber en el
Asegúrese de que la unidad de placa esté colocada correctamente sobre la instrumento y limpie la placa de separación de los capilares con agua
desionizada y un pañuelo que no suelte pelusa.
plataforma para la placa. La placa debería asentar perfectamente sobre la
plataforma. ¡IMPORTANTE! Nunca utilice disolventes orgánicos para limpiar el
instrumento.
¡IMPORTANTE! No utilice nunca placas que estén combadas.

Rellene los depósitos de agua desionizada y de la solución tampón 1X con EDTA


del analizador genético del instrumento. Reinicio del instrumento
Compruebe si hay burbujas en el bloque de polímero y los canales de éste y
elimínelas. Reinicie el instrumento cuando
• Una luz de estado roja indique que se ha producido un error crítico
Compruebe que las puntas de los capilares no estén aplastadas ni dañadas. • El instrumento no responda al ABI PRISM ® 3100 o 3100-Avant Data Collection
software (Software de recogida de datos del analizador ABI PRISM® 3100 o
Compruebe el nivel de polímero en la jeringa con polímero de reserva para 3100-Avant)
asegurarse de que haya suficiente para todos los análisis. Hay dos formas de reiniciar el instrumento.

Compruebe que el bloque de polímero encaja firmemente en el instrumento. Reinicio con el botón Reiniciar
Limpie las superficies de los instrumentos.
1. Cierre las puertas del instrumento.

Compruebe si hay polímero seco alrededor del bloque y límpielo si fuera 2. Con un objeto largo y estrecho (por ejemplo, con un clip abierto), pulse el
necesario.
botón Reset (Reiniciar) situado en la parte frontal del instrumento.

Compruebe que no haya fugas alrededor de las jeringas ni de la tuerca del


tornillo.
Reinicio mediante el apagado del instrumento
Compruebe el espacio libre en la base de datos. Elimine registros de placas de la
base de datos del instrumento y archive los archivos de las muestras. 1. Cierre las puertas del instrumento.

2. Pulse el botón de encendido/apagado situado en la parte frontal del


Tareas que hay que realizar una vez a la semana instrumento para apagarlo.

3. Reinicie el ordenador.
Limpie las jeringas.
a. Seleccione Start > Shutdown (Inicio > Apagar).
b. En el cuadro de diálogo Shutdown Windows (Apagar Windows),
Limpie los bloques superior e inferior de polímero. seleccione Restart (Reiniciar) y haga clic en OK (Aceptar).
¡IMPORTANTE! Espere a que el ordenador se haya reiniciado
Cambie el polímero. completamente antes de continuar.

Compruebe el estado de conservación de las matrices usadas. 4. Encienda el instrumento y espere a que se encienda la luz verde continua.
Nota. Al apagar el instrumento, el firmware no se guarda. Al reiniciarlo, el
instrumento vuelve a cargar una copia del firmware y el archivo de
Tareas que hay que realizar siempre que sea necesario calibración del ordenador.

Tarea de mantenimiento Frecuencia 5. Abra el software de recogida de datos.

Limpie las bandejas de goteo. Según sea necesario

Cambie la matriz. Después de 100 series


analíticas

Cambie las jeringas. Una vez cada 3 meses

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Apagado del instrumento Cambie el polímero una vez por semana
El polímero se mantiene en buenas condiciones durante 7 días a 25 °C.
Si el instrumento va
a permanecer Cambio del polímero
desatendido Realice el siguiente procedimiento de apagado…
durante…
PELIGRO QUÍMICO. El polímero POP-6 causa irritación en los ojos, la
No más de una semana Apagado para periodos cortos. piel y el aparato respiratorio. Úsense gafas, indumentaria y guantes de protección
con el depósito de ¡IMPORTANTE! La clave para apagar correctamente adecuados.
solución tampón lleno el instrumento durante periodos cortos es mantener la
matriz de capilares en la solución tampón 1X con EDTA
del analizador genético. Esto evita que el polímero se 1. Seleccione Tools > Change Polymer Wizard (Herramientas > Asistente
seque en los capilares. para cambiar polímero).

Más de una semana Apagado para periodos prolongados. 2. Siga las instrucciones del asistente para colocar el polímero nuevo en el
instrumento.

Apagado para periodos cortos

1. Llene la matriz de capilares con polímero recién preparado, utilizando el Matriz de capilares
asistente Change Polymer Wizard (Asistente para cambiar polímero) o los
comandos de control manual.
Instalación y retirada
2. Pulse el botón Tray (Bandeja) para mover el inyector automático hacia
adelante.
Cuándo cambiar la matriz de capilares
3. Llene el depósito de una nueva solución tampón casi por completo con
La matriz de capilares debe durar para aproximadamente 100 series analíticas.
solución tampón 1X con EDTA del analizador genético.
Es posible que se necesite una matriz de capilares nuevas si:
4. Fije un separador en el depósito y coloque el depósito en la posición 1 del • La precisión en la determinación del tamaño no es la adecuada
inyector automático. • La resolución y/o la intensidad de la señal disminuyen

5. Llene los demás depósitos con agua desionizada fresca, fije los separadores Antes de instalar una matriz de capilares usada
y coloque los depósitos en las posiciones restantes del inyector automático.
• Limpie la parte frontal de la célula de detección
6. Cierre las puertas del instrumento. • Compruebe que la barra del cátodo esté seca
El inyector automático se moverá a la posición 1 y dejará las puntas de los
capilares en el depósito de solución tampón. Limpieza de la célula de detección
Nota. Este procesamiento no es necesario para las matrices nuevas a menos que el
7. Apague el ordenador y el instrumento. usuario haya tocado accidentalmente la célula de detección.

Apagado para periodos prolongados


PELIGRO QUÍMICO. El metanol líquido y sus vapores son inflamables.
La exposición puede causar irritación de los ojos, la piel y el aparato respiratorio,
1. Siga el procedimiento para quitar la matriz de capilares del instrumento y depresión del sistema nervioso central y ceguera. Úsense gafas, indumentaria y
guardarla. guantes de protección adecuados. Consulte la Ficha de datos de seguridad del
fabricante para obtener más información.
2. Retire del instrumento:
• Las jeringas del bloque superior de polímero. 1. Añada una gota de metanol a la superficie frontal de la célula de detección.
• Bloque superior de polímero.
• Bloque inferior de polímero.
2. Deje que la célula se seque al aire.
Nota. No utilice aire presurizado para secar la célula de detección.
3. Retire la unidad de placa y los depósitos del inyector automático.

4. Limpie el inyector automático y las bandejas de goteo con un pañuelo Comprobación de la barra del cátodo
desechable que no suelte pelusa y humedecido con agua.
Al volver a colocar una matriz usada en el instrumento, asegúrese de que la barra del
cátodo esté seca. Una barra húmeda podría arquearse.
5. Cierre las puertas del instrumento.

6. Apague el ordenador y el instrumento. PELIGRO DE DESCARGA ELÉCTRICA/INCENDIO. No deje


líquido en la barra del cátodo. Esto podría ocasionar una descarga eléctrica o incluso
7. Lave las jeringas, los bloques de polímero y los depósitos con agua tibia. fuego en ausencia de un mantenimiento adecuado.
Aclare con agua desionizada.
¡IMPORTANTE! Asegúrese de que todas las piezas se hayan secado
completamente al aire antes de almacenarlas durante un periodo prolongado
entre 15 °C y 25 °C.

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 55 de 66


Instalación o desinstalación de la matriz de capilares con Llenado de la matriz de capilares con polímero utilizando
el asistente el control manual
¡IMPORTANTE! Utilice guantes para llevar a cabo el siguiente procedimiento y
siempre que manipule la matriz de capilares, las jeringas de vidrio, los separadores 1. Seleccione Instrument > Manual Control (Instrumento > Control manual).
o los depósitos de solución tampón.
2. En la lista desplegable Command Category (Categoría de comandos),
seleccione Capillary (Capilares).
PELIGRO QUÍMICO. El polímero POP-6 causa irritación en los ojos, la
piel y el aparato respiratorio. Úsense gafas, indumentaria y guantes de protección
adecuados. 3. En la lista desplegable Command Name (Nombre del comando), seleccione
Fill (Llenar).
¡IMPORTANTE! Utilice una matriz de capilares de 50 cm para el ensayo ViroSeq.
La longitud de la matriz de capilares utilizada debe coincidir con la longitud de la
matriz de capilares que aparece en la base de datos del instrumento. 4. En la lista desplegable Value (Valor), seleccione 50 cm para la longitud de la
matriz y POP-6 para el polímero.
1. Cierre las puertas de la estufa y del instrumento y, a continuación, pulse el
botón Tray (Bandeja). 5. Haga clic en Send Command (Enviar comando).
Espere hasta que aparezca el mensaje Command complete (Comando
finalizado) antes de continuar.
2. Seleccione Tools > Install Capillary Array Wizard (Herramientas >
Asistente para instalar la matriz de capilares).

3. Siga las instrucciones del asistente para sustituir o instalar una matriz de
Almacenamiento de la matriz de capilares en
capilares. el instrumento
Nota. Debe introducir la información adecuada de la matriz de capilares (es Deje la matriz de capilares en el instrumento solo si va a permanecer sin utilizarse
decir, la longitud y el número de lote de la matriz de capilares). durante menos de una semana.
Para almacenar la matriz de capilares en el instrumento, siga el procedimiento de
4. Compruebe el cabezal del extremo de carga para asegurarse de que las puntas apagado para periodos cortos.
de los capilares no estén aplastadas o dañadas.
Almacenamiento de la matriz de capilares fuera
del instrumento
Mantenimiento Almacene la matriz de capilares fuera del instrumento si no se va a utilizar durante
más de una semana. Consérvela entre 15 °C y 25 °C.
Cuidado de la matriz de capilares ¡IMPORTANTE! Antes de almacenar la matriz de capilares durante periodos
prolongados, es conveniente llenar los capilares con polímero nuevo.
• Utilice guantes y manipule la matriz de capilares con cuidado.
• No toque la célula de detección. Si está sucia, consulte Limpieza de la célula
de detección. PELIGRO QUÍMICO. El polímero POP-6 causa irritación en los ojos, la
• Mantenga los extremos de la matriz de capilares mojados en todo momento. piel y el aparato respiratorio. Úsense gafas, indumentaria y guantes de protección
• Antes de extraer el bloque superior de polímero, afloje siempre la tuerca de la adecuados.
matriz de capilares.
• No apriete excesivamente la tuerca de la matriz de capilares. ¡IMPORTANTE! Utilice guantes para llevar a cabo el siguiente procedimiento y
siempre que manipule la matriz de capilares, las jeringas de vidrio, los separadores
o los depósitos de solución tampón.
Limpieza de la matriz de capilares
1. Llene la matriz de capilares con polímero recién preparado, utilizando el
asistente Change Polymer Wizard (Asistente para cambiar polímero) o
PELIGRO QUÍMICO. El polímero POP-6 causa irritación en los ojos, la los comandos de control manual.
piel y el aparato respiratorio. Úsense gafas, indumentaria y guantes de protección
adecuados.
2. Quite el protector de la jeringa.

1. Haga pasar polímero nuevo a través de la matriz de capilares, siguiendo las 3. Retire las dos jeringas del bloque superior de polímero y deseche
instrucciones que aparecen más adelante en la sección “Llenado de la matriz adecuadamente el polímero restante.
de capilares con polímero utilizando el control manual.”
4. Lave las jeringas.
2. Limpie cualquier acumulación de polímero (cristales) que pueda haber en el
instrumento, incluidos los electrodos y la placa de separación de los
capilares, con agua desionizada y un pañuelo que no suelte pelusa. 5. Retire la matriz de capilares del instrumento con ayuda del Install
Capillary Array Wizard (Asistente para instalar la matriz de capilares).
Nota. Al limpiar los electrodos de los capilares, tenga cuidado de no
doblarlos ni moverlos de su posición. Consulte las instrucciones en Instalación o desinstalación de la matriz de
capilares con el asistente.
¡IMPORTANTE! Nunca utilice disolventes orgánicos para limpiar el
instrumento.
6. Vuelva a colocar la cubierta sobre la célula de detección.
3. Limpie la célula de detección.
7. Llene un depósito de solución tampón con solución tampón 1X con EDTA
del analizador genético recién preparada. Introduzca las puntas de los
capilares en la solución tampón.

8. Llene el vial de transporte con solución tampón 1X con EDTA del


analizador genético e introduzca el extremo de detección de la matriz de
capilares.

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9. Conserve la matriz de capilares en posición vertical. Cebado y llenado de las jeringas
10. Compruebe una vez por semana el nivel de solución tampón 1X con EDTA Jeringa de polímero de reserva
del analizador genético en el depósito y en el tubo.
Siga este procedimiento después de limpiar la jeringa de polímero de reserva
o cuando el polímero tenga ya una semana en la jeringa.

Jeringas
PELIGRO QUÍMICO. El polímero POP-6 causa irritación en los ojos, la
piel y el aparato respiratorio. Úsense gafas, indumentaria y guantes de protección
adecuados.
Mantenimiento de las jeringas ¡IMPORTANTE! Utilice guantes para llevar a cabo el siguiente procedimiento y
siempre que manipule la matriz de capilares, las jeringas de vidrio, los separadores
o los depósitos de solución tampón.
Utilice únicamente las siguientes jeringas
• Jeringa de vidrio de 5,0 mL con polímero de reserva ( ABI 628-3731)
y 1. Introduzca aproximadamente 0,3 mL de polímero a temperatura ambiente
• Jeringa de vidrio de 250 μL para llenado de la matriz ( ABI 4304470) en una jeringa de polímero de reserva limpia.

2. Levante el émbolo hasta la marca de 5 mL.


Cuidado de las jeringas
¡IMPORTANTE! Para prolongar la vida del émbolo de las jeringas, no lo separe 3. Invierta la jeringa unas seis veces para recubrir las paredes de polímero.
de la jeringa. Deseche este polímero con los residuos acuosos.
¡IMPORTANTE! Al cebar las jeringas, aspire las soluciones lentamente. Nota. El cebado de la jeringa garantiza que el polímero utilizado para el
¡IMPORTANTE! Utilice guantes para manipular las jeringas de vidrio. análisis esté a la concentración deseada y no se diluya con el agua residual.

4. Llene la jeringa de polímero de reserva con un máximo de 4,5 mL de


Sustitución de las jeringas polímero.
Cambie las jeringas cada 3 meses. Nota. Se necesitan 80 μL de polímero en la jeringa de reserva para cada
serie analítica inyectada.
Cuándo limpiarlas ¡IMPORTANTE! Para evitar introducir burbujas de aire en el polímero,
mantenga la punta de la jeringa apenas sumergida en el polímero mientras
• Siempre que las retire del instrumento y al menos una vez por semana aspira lentamente.
• Cada vez que cambie el polímero (esto incluye el cambio a un nuevo lote
de polímero)
5. Invierta la jeringa y expulse un poco de polímero por la punta para eliminar
cualquier burbuja de aire que pueda haber.
Limpieza de las jeringas Nota. No devuelva la parte del polímero que no ha utilizado al frasco de
¡IMPORTANTE! Utilice guantes para llevar a cabo el siguiente procedimiento y polímero.
siempre que manipule la matriz de capilares, las jeringas de vidrio, los separadores
o los depósitos de solución tampón.
Jeringa para llenado de la matriz
1. Quite el protector de la jeringa.
PELIGRO QUÍMICO. El polímero POP-6 causa irritación en los ojos, la
2. Retire la jeringa. piel y el aparato respiratorio. Úsense gafas, indumentaria y guantes de protección
adecuados.
3. Limpie la jeringa aclarando el interior y el exterior del cilindro y la punta de ¡IMPORTANTE! Utilice guantes para llevar a cabo el siguiente procedimiento y
la jeringa con agua tibia. Para limpiar el interior, introduzca agua tibia en la siempre que manipule la matriz de capilares, las jeringas de vidrio, los separadores
jeringa y bombee lentamente con el émbolo. o los depósitos de solución tampón.
¡IMPORTANTE! Asegúrese de que no queda polímero seco en las
jeringas.
1. Introduzca un pequeño volumen de polímero a temperatura ambiente en una
jeringa limpia para llenado de la matriz.
4. Aclare el cilindro y la punta de la jeringa con agua desionizada.
2. Levante el émbolo hasta la marca de 250 µL.
5. Deje secar al aire.
3. Invierta la jeringa unas seis veces para recubrir las paredes de polímero.
Deseche este polímero con los residuos acuosos.
Inspección de una jeringa Nota. El cebado de la jeringa garantiza que el polímero utilizado para el
¡IMPORTANTE! Si la jeringa gotea, revísela para ver si falta alguna junta tórica o análisis esté a la concentración deseada y no se diluya con el agua residual.
está dañada.
4. Para evitar introducir burbujas de aire, aspire el polímero de forma suave y
lenta en la jeringa hasta alcanzar el volumen deseado.
1. Compruebe que la jeringa tiene dos juntas tóricas ( ABI 221102): una
detrás de la contera y otra alrededor de la contera.
5. Invierta la jeringa y presione ligeramente el émbolo para purgar el aire que
pueda haber.
2. Compruebe que la contera esté firmemente asentada en el extremo de la
Nota. No devuelva la parte del polímero que no ha utilizado al frasco de
jeringa. polímero.

3. Utilice un pañuelo desechable que no suelte pelusa para secar la jeringa.

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Instalación y retirada de las jeringas 5. Sujete el bloque superior de polímero con las dos manos y extráigalo
completamente.
Instalación
6. El bloque superior de polímero se asienta sobre dos ejes de acero y se desliza
fácilmente una vez que el muelle sobrepasa el punto de comprobación.
1. Siga los procedimientos para quitar, limpiar y secar el bloque superior de
polímero.
Bloque inferior de polímero
2. Coloque la punta de la jeringa de polímero de reserva en el puerto de la
izquierda de la parte superior del bloque superior de polímero y enrósquela
en sentido horario al bloque de polímero. 1. Retire el depósito del ánodo y deseche la solución tampón de forma
adecuada.
¡IMPORTANTE! Sostenga siempre la jeringa por la cubierta metálica (no
por la parte de vidrio) al enroscarla al bloque de polímero.
2. Sujete el bloque inferior de polímero y extráigalo completamente.
La jeringa debe apretarse al bloque con la mano.

3. Coloque la punta de la jeringa para llenado de la matriz en el puerto de la


derecha de la parte superior del bloque superior de polímero y atorníllela en Limpieza de los bloques de polímero
sentido horario al bloque de polímero.
¡IMPORTANTE! Sostenga siempre la jeringa por la cubierta metálica (no Cuándo limpiarlas
por la parte de vidrio) al enroscarla al bloque de polímero.
La jeringa debe apretarse al bloque con la mano. • Antes de volver a colocar el polímero en el instrumento
• Si el polímero ha permanecido en el instrumento durante más de una semana
4. Empuje el bloque de polímero para introducirlo completamente en el Nota. El polímero viejo (de más de una semana) puede causar un aumento
instrumento. transitorio de corriente durante la electroforesis debido a la descomposición de la
urea. Puede utilizar el kit de limpieza del bloque de polímero:
5. Cambie el protector de las jeringas.
ABI 4322931 Kit de limpieza del bloque de polímero

Retirada Bloque superior de polímero


¡IMPORTANTE! No exponga los bloques de polímero a disolventes orgánicos.
1. Quite el protector de la jeringa.

2. Sujete la jeringa de polímero de reserva justo por encima del conector o por 1. Aclare todos los conectores con agua tibia y después, realice un último
la base (no por el cilindro de vidrio) y gírela en sentido antihorario. aclarado con agua desionizada. Ponga en remojo todos los conectores
¡IMPORTANTE! Tenga cuidado de no extraer el conector. Si lo hace, que estén cubiertos con polímero.
podrían salirse varias juntas y válvulas de comprobación. ¡IMPORTANTE! No utilice agua hirviendo para aclarar los conectores
ni el bloque de polímero.
3. Sujete la jeringa para llenado de la matriz y gírela en sentido antihorario.
2. Sostenga el bloque superior de polímero bajo agua tibia y termine con un
4. Deseche adecuadamente el polímero restante. aclarado con agua desionizada.

3. Acople el adaptador de jeringa de 6 mm a la jeringa de 20 mL sin


silicona del kit de limpieza del bloque de polímero.
Bloques de polímero 4. Enrosque el adaptador de jeringa de 6 mm a la válvula de comprobación
de acero inoxidable.

Retirada de los bloques de polímero 5. Con la jeringa, haga pasar varias cargas de agua tibia a través de cada
canal, tapando las aberturas con los dedos, y termine mediante un
aclarado con agua desionizada.
Bloque superior de polímero Nota. Haga pasar agua desionizada también a través de los tubos del
bloque de polímero.
1. Quite el protector de la jeringa.
6. Inspeccione visualmente si queda polímero seco (un residuo de color
2. Retire la jeringa. blanco) en los canales. Lave los canales parcialmente bloqueados con
agua tibia hasta eliminar el polímero seco y termine mediante un
aclarado con agua desionizada.
3. Desconecte la matriz de capilares del bloque de polímero:
¡IMPORTANTE! El agua tibia puede tardar bastante tiempo en
a. Pulse el botón Tray (Bandeja). eliminar la obstrucción. No utilice un instrumento punzante para limpiar
b. Abra las puertas del instrumento, de la estufa y del bloque de detección. el canal, aunque se encuentre completamente obstruido con polímero
c. Afloje la tuerca de la matriz de capilares. seco.
d. Extraiga parcialmente el bloque de polímero.
e. Retire la célula de detección del bloque de polímero.
f. Retire el manguito de la matriz de capilares del bloque de polímero.
Nota. Si va a volver a utilizar la matriz de capilares, guárdela
adecuadamente.

4. Desconecte el tubo del bloque inferior de polímero.

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7. Limpie y seque los canales del bloque de polímero. Conexión de los bloques de polímero
a. Elimine cualquier resto de agua del bloque superior de polímero y al instrumento
de los conectores para evitar que se diluya el polímero nuevo. Para
lograrlo puede hacer pasar aire a través de los canales con ayuda de
la jeringa sin silicona. 1. Si es necesario, limpie los bloques de polímero y los tubos.
b. Inyecte aire a través de los canales hasta que estén secos.
¡IMPORTANTE! No utilice la jeringa de vidrio de polímero de reserva 2. Empuje el bloque superior de polímero sobre las dos agujas guía del
de 5,0 mL para inyectar aire a través de los canales. Eso dañaría el instrumento. Deje un espacio de 2,5 cm entre el bloque y la parte posterior
émbolo y podría hacer que la jeringa de vidrio de polímero de reserva del instrumento.
goteara.
3. Instale el bloque inferior de polímero. Asegúrese de que el bloque quede bien
introducido en el instrumento.
Bloque inferior de polímero
4. Conecte los tubos entre los dos bloques.
1. Compruebe que la válvula de aguja de la solución tampón del ánodo esté a. Inserte una contera en el bloque superior de polímero y apriétela con los
abierta (hacia arriba). dedos en sentido horario.
b. Inserte la otra contera en el bloque inferior de polímero y apriétela con
2. Retire los tubos del bloque de polímero y los conectores del bloque superior los dedos en sentido horario.
de polímero, si no lo hizo anteriormente. ¡IMPORTANTE! No las apriete demasiado.

3. Extraiga el bloque inferior de polímero del instrumento. 5. Instale bandejas de goteo limpias si aún no están en el instrumento.

4. Aclare todos los conectores con agua desionizada. Remoje los conectores
que estén cubiertos con polímero y termine con un aclarado con agua
desionizada. Eliminación de las burbujas de aire del bloque
¡IMPORTANTE! No utilice agua hirviendo para aclarar los conectores ni superior de polímero
el bloque de polímero.

5. Sostenga el bloque inferior de polímero bajo agua desionizada. Con los 1. Presione hacia abajo la jeringa de polímero de reserva para hacer pasar las
dedos, mueva la válvula de aguja de la solución tampón del ánodo hacia burbujas a la parte inferior derecha del bloque.
abajo y hacia arriba para eliminar cualquier resto de polímero incrustado en Nota. Presione lentamente o dé unos golpecitos a la jeringa para reducir al
el canal guía, y termine con un aclarado con agua desionizada. mínimo la cantidad de polímero utilizado.
¡IMPORTANTE! No retire ningún componente del bloque inferior de
polímero. 2. Presione hacia abajo lentamente la jeringa para llenado de la matriz para
hacer pasar las burbujas por el canal. Las burbujas se acumularán en el punto
6. Acople el adaptador de jeringa de 6 mm a la jeringa de 20 mL sin silicona. donde se unen los canales.

7. Enrosque el adaptador de jeringa de 6 mm al bloque de polímero, en el lugar


en el que estaba situado originalmente el conector del tubo del bloque de 3. Expulse las burbujas.
polímero. a. Sujete la válvula de aguja de la solución tampón del ánodo hacia abajo a
la vez que empuja hacia abajo la jeringa para llenado de la matriz con el
8. Con la jeringa, haga pasar varias cargas de agua desionizada a través del fin de acumular presión en los canales.
canal. b. Suelte la válvula de aguja de la solución tampón del ánodo (mientras
sigue presionando hacia abajo la jeringa para llenado de la matriz) para
expulsar las burbujas al tubo del bloque de polímero.
9. Inspeccione visualmente si queda polímero seco (un residuo de color blanco)
en los canales. Lave los canales parcialmente bloqueados con agua
desionizada tíbia hasta eliminar el polímero seco y termine mediante un 4. Repita el paso 3 tantas veces como sea necesario.
aclarado con agua desionizada. ¡IMPORTANTE! Antes de continuar, compruebe que todas las burbujas de
¡IMPORTANTE! El agua tibia puede tardar bastante tiempo en eliminar la aire de la unidad de tubos se hayan expulsado al depósito inferior de solución
obstrucción. No utilice un instrumento punzante para limpiar el canal, tampón. No deben quedar burbujas en los tubos ni en el canal del bloque
aunque se encuentre completamente obstruido con polímero seco. inferior de polímero.

10. Aclare el bloque inferior de polímero y todos los conectores a fondo con
agua desionizada.
Inyector automático
11. Elimine cualquier resto de agua del bloque inferior de polímero y de los
conectores para evitar que se diluya el polímero nuevo.

12. Con la jeringa sin silicona, inyecte aire a través de los canales hasta que estén
Calibración
secos.
Calibre el inyector automático si observa:
¡IMPORTANTE! No utilice la jeringa de vidrio de polímero de reserva de
5,0 mL para inyectar aire a través de los canales. Esto dañaría el émbolo de • Una inyección deficiente en un número reducido de capilares
la jeringa y podría causar fugas en la misma. • Una intensidad baja de la señal
• Ningún indicio de muestra

1. Seleccione Tools > Autosampler Calibration Wizard (Herramientas >


Asistente para calibrar el inyector automático).

2. Siga las instrucciones del asistente.

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Unidades de placa 4. Utilice esta tabla para calcular cuánto espacio libre necesita.

Monte los componentes de la unidad de placa. Tipo de archivo


Espacio aproximado
necesario por archivo (kB)*

Preparación de una unidad de placa Archivo de muestras analizado para la 250


secuenciación de ADN

1. Fije un separador de placa limpio y seco a la placa de muestras. Archivo de muestras no analizado 100
¡IMPORTANTE! No utilice nunca placas que estén combadas.
¡IMPORTANTE! Asegúrese de que los separadores de placa estén en * Los valores indicados son solo estimaciones. El tamaño real del archivo depende del módulo
posición horizontal sobre la placa. Los orificios del retenedor de la placa de análisis seleccionado.
deben estar alineados con los orificios de los separadores; de lo contrario,
podrían dañarse las puntas de los capilares.
5. Si fuese necesario, libere espacio con alguno de los siguientes métodos:
• Copie los archivos de pacientes a un CD-RW o a otro volumen
2. Coloque la placa de muestras sobre la base de la placa. • Elimine los archivos originales de la unidad

3. Encaje el retenedor de la placa en la placa y en la base de la placa.

4. Asegúrese de que los orificios del retenedor de la placa estén alineados con
Archivado de los datos
los orificios de la tira de separadores.
¡IMPORTANTE! Si el retenedor de la placa y los orificios de la tira de Instalación de un dispositivo de almacenamiento SCSI
separadores no están alineados correctamente, podrían producirse daños en
las puntas de la matriz. No se recomienda añadir un dispositivo de almacenamiento SCSI a la estación de
trabajo. No obstante, si necesita instalar uno temporalmente, siga el procedimiento
que se describe a continuación.
Colocación de la placa en el inyector automático ¡IMPORTANTE! No instale un dispositivo SCSI en la estación de trabajo antes
de instalar el 3100 o 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético 3100 o
3100-Avant) con el 3100 o 3100-Avant Data Collection software (software de
1. Pulse el botón Tray (Bandeja). recogida de datos del analizador 3100 o 3100-Avant). La instalación de un
dispositivo SCSI antes del analizador genético cambiará las asignaciones de letras
2. Coloque la unidad de placa en el inyector automático. Utilice las posiciones de las unidades y no podrá instalar correctamente el instrumento ni el software.
A o B para el 3100 Genetic Analyzer (Analizador genético 3100) o la
posición B para el 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador genético
3100-Avant). 1. Apague la estación de trabajo.
Nota. La placa solo tiene una orientación posible, con el extremo con
muescas de la base de la placa orientado en sentido opuesto al usuario. 2. Conecte el dispositivo al puerto de SCSI externo.
¡IMPORTANTE! Asegúrese de que la unidad de placa queda horizontal en
el inyector automático. De lo contrario, las puntas de los capilares podrían 3. Vuelva a encender el ordenador.
levantar la unidad de placa y desplazarla del inyector automático.
4. Compruebe que las asignaciones de letras de las unidades no hayan
3. Cuando la placa esté colocada correctamente, el indicador de posición de la cambiado.
placa de la página Plate View (Vista de la placa) cambiará de color gris a
amarillo.
Compruebe que esto sea así antes de continuar. Nota. Antes de un análisis o de un lote de análisis, el software de recogida de datos
comprueba automáticamente el espacio disponible para confirmar que hay espacio
4. Cierre las puertas del instrumento. suficiente para almacenar los datos que se van a crear.
Nota. Al cerrar las puertas, el inyector automático volverá a la posición Si la base de datos no tiene suficiente espacio (está llena en un 75%
inicial y las puntas de los capilares se introducirán en la solución tampón. aproximadamente), emplee la utilidad Cleanup Database (Limpiar base de datos)
para eliminar los datos y los registros de las placas.

Para eliminar registros de la base de datos


Mantenimiento del ordenador
La utilidad Cleanup Database (Limpiar base de datos) elimina los datos
y registros de placa de todos los análisis de la base de datos. Antes de ejecutar la
Comprobación del espacio libre en el disco duro utilidad, asegúrese de haber extraído todos los análisis de la base de datos.

1. Haga doble clic en el icono My Computer (Mi PC) del escritorio para ver 1. Asegúrese de que se esté ejecutando OrbixWeb™ Daemon.
las unidades.
2. Cierre el software de recogida de datos.
2. Desde My Computer (Mi PC), haga clic con el botón derecho del ratón en la
unidad D y seleccione Properties (Propiedades). 3. Con Windows NT Explorer, vaya a:
D:\AppliedBio\3100\Bin
3. Utilice el cuadro de diálogo Properties (Propiedades) para ver el espacio o
utilizado y el espacio libre. D:\AppliedBio\3100-Avant\Bin

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4. Localice y haga doble clic en CleanUpDB (Limpiar base de datos).
Evaluación y almacenamiento de los datos
Se ejecutará la utilidad Cleanup Database (Limpiar base de datos);
el proceso tardará unos segundos en finalizar. 1. Evalúe el perfil de la calibración espacial.
Al ver el perfil de calibración en cuadro de diálogo Details (Detalles), utilice
5. Apague y vuelva a iniciar OrbixWeb™ Daemon. los criterios siguientes para evaluar los datos:

Atributo del pico Criterios


Si omite este paso, los datos de análisis nuevos no se guardarán
en la base de datos. Altura Alturas similares para todos los picos
Cruces rojas Una cruz roja marca la parte superior de cada pico. Ninguna cruz
mal colocada.
Nota. No es necesario volver a importar los métodos de calibración espacial, Para mover una cruz:
espectral o del análisis, ni los datos de calibración obtenidos durante las últimas a. Cambie el valor en un cuadro Capillary Position
calibraciones. (Posición del capilar).
b. Haga clic fuera del cuadro.
c. Haga clic en OK (Aceptar) para aceptar el nuevo valor.
Forma • Un solo pico bien definido para cada capilar.
Calibración espacial y espectral • Se aceptan pequeñas mesetas.
Separación La separación teórica entre capilares es de 15.

Realización de una calibración espacial 2.


Si el perfil de
calibración Haga lo siguiente…
espacial es…
Cuándo realizarla
Satisfactorio Haga clic en OK (Aceptar) y continúe con el paso 3.
Debe realizar una calibración espacial siempre que instale una matriz de capilares
nueva o usada en el instrumento, después de retirar temporalmente la matriz del Insatisfactorio Siga uno o más de los procedimientos siguientes:
bloque de detección y cada vez que mueva el instrumento. • Haga clic en Cancel (Cancelar) para cerrar el cuadro Details
(Detalles) y, a continuación, haga clic en Start (Iniciar) para
Nota. Solo debe mover los analizadores 3100 y 3100-Avant Genetic Analyzers repetir la calibración.
(Analizadores genéticos 3100 y 3100-Avant) un ingeniero de servicio técnico • Vuelva a colocar una o más cruces rojas. Para mover una
cualificado de Applied Biosystems. cruz, cambie el valor del cuadro Capillary Position
(Posición del capilar) y después haga clic fuera del cuadro.
Una calibración espacial mapea la posición de cada capilar detectado en la cámara
CCD. • Sustitución de los datos por datos de un análisis anterior.

La calibración espacial tiene una duración de 2 minutos (6 minutos para el llenado


de los capilares y la calibración espacial). Durante ese tiempo, se recopilan y 3. Cuando se abra el cuadro de diálogo Question (Pregunta), haga clic en
sintetizan múltiples marcos de datos. Los datos recopilados se analizan y guardan Yes (Sí).
en un mapa espacial. Los datos se convierten en la calibración espacial actual y los datos se
guardan en el instrumento y en la base de datos.

Cómo realizarla
Si la calibración falla
1. Seleccione Tools > Perform Spatial Calibration (Herramientas > Realizar
calibración espacial). • Repita la calibración.
• Llene los capilares con polímero y repita la calibración.
2. En el cuadro de diálogo Perform Spatial Calibration (Realizar calibración • Limpie la célula de detección y a continuación repita la calibración.
espacial), seleccione Fill capillaries (Llenar capilares) únicamente si los • Vuelva a colocar la ventana de la matriz en la célula de detección y después
capilares no tienen polímero. repita la calibración.
• Pruebe con otra matriz de capilares.
No es necesario llenar los capilares cada vez que se lleva a cabo una
calibración espacial.

3. Haga clic en Start (Inicio).


Visualización del perfil de una calibración
La calibración dura aproximadamente: espacial
• 2 min sin llenar los capilares
• 6 min llenando los capilares
1. Seleccione Tools > Display Spatial Calibration (Herramientas > Mostrar
4. calibración espacial).
Si la calibración es… Haga lo siguiente…

2. Seleccione el perfil de la matriz de capilares que desee en el cuadro de


Correcta Se abrirá el cuadro de diálogo Perform Spatial Calibration diálogo Question (Pregunta).
(Realizar calibración espacial) y deberá:
a. Hacer clic en Details (Detalles) para abrir la ventana
Spatial Calibration Profile (Perfil de la calibración
espacial). Si desea ver el
b. Continúe con la sección «Evaluación y almacenamiento Haga lo siguiente…
perfil…
de los datos», más adelante.
De la matriz actual Haga clic en Current Array (Matriz actual).
Incorrecta Se abrirá un cuadro con un mensaje de error que proporciona Se abrirá el cuadro Spatial Calibration Profile (Perfil de la
cierta información sobre las causas del fallo; debe calibración espacial) para los datos de calibración actuales.
a. Hacer clic en Details (Detalles) para abrir la ventana Nota. La barra de título indica ahora Current Spatial
Spatial Calibration Profile (Perfil de la calibración Calibrations (Calibraciones espaciales actuales).
espacial).
b. Haga una de las cosas siguientes: De un análisis a. Haga clic en Previous run (Análisis anterior).
– Hacer clic en Cancel (Cancelar) y después en Start anterior b. Seleccione el análisis que desee en el cuadro de diálogo
(Iniciar) para repetir la calibración. Select the source to display (Seleccione el origen que
– Aplique las medidas de corrección apropiadas. desea mostrar).
c. Haga clic en OK (Aceptar).

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 61 de 66


Sustitución del mapa de calibración espacial actual Preparación y carga del patrón BigDye® Terminator
Si los datos del análisis son incorrectos cuando se utiliza el mapa actual, puede Sequencing Standard (patrón de secuenciación BigDye®
sustituir los datos de calibración por: Terminator) en los analizadores 3100 o 3100-Avant
• Datos obtenidos durante un análisis anterior con la misma matriz de capilares, Genetic Analyzers (Analizadores genéticos 3100 o
siempre que la célula de detección no se haya movido. 3100-Avant)
• Un mapa de calibración espacial utilizado para procesar cualquier análisis de
muestras anterior que aún esté almacenado en la base de datos.
1. Resuspenda un tubo de BigDye Terminator Sequencing Standard (patrón de
¡IMPORTANTE! La sustitución de los datos de calibración solo es posible si no se secuenciación BigDye Terminator) con 170 μL de formamida Hi-Di.
ha movido la célula de detección ni la matriz de capilares. No utilice los datos de
calibración obtenidos con otra matriz de capilares.

1. Seleccione File > Override Spatial Calibration (Archivo > Sustituir Contiene formamida.
calibración espacial). R 61 Riesgo durante el embarazo de efectos adversos para el feto.
R 36/38 Irrita los ojos y la piel.
2. Seleccione el archivo de calibración espacial que desee utilizar y haga clic en S 53 Evítese la exposición – recábense instrucciones especiales antes del
OK (Aceptar). uso.
S 24/25 Evítese el contacto con los ojos y la piel.
3. Vea el perfil espacial y acéptelo o rechácelo. S 35 Elimínense los residuos del producto y sus recipientes con todas las
precauciones posibles.
Si el perfil es… Haga clic en… S 36/37/39 Úsense indumentaria y guantes adecuados, y protección para los
Aceptable OK (Correcto)
ojos/la cara.
S 45 En caso de accidente o malestar, acúdase inmediatamente al médico
Inaceptable Cancel (Cancelar) (si es posible, muéstresele la etiqueta).
Repita los pasos 1 y 2.

2. Agite el patrón en el vórtex entre 10 y 15 segundos para mezclarlo bien.

4. Cuando se abra el cuadro de diálogo Question (Pregunta), haga clic en


Yes (Sí). 3. Centrifugue la mezcla entre 10 y 15 segundos a 2.000 x g en una
microcentrífuga.
Este cuadro de diálogo se convertirá en el mapa de calibración espacial
actual y se cerrará el cuadro de diálogo Question (Pregunta).
4. Dispense 10 µL del patrón en la MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate
(placa óptica de 96 pocillos para reacción MicroAmp), en los pocillos A1
hasta H2 para el 3100 Genetic Analyzer (Analizador genético 3100) o en los
Realización de una calibración espectral pocillos A1 hasta D1, para el 3100-Avant Genetic Analyzer (Analizador
genético 3100-Avant).

Cuándo realizarla 5. Cubra la placa y centrifúguela entre 5 y 10 segundos a 2.000 x g.


Se debe realizar una calibración espectral:
6. Caliente la placa a 95 °C durante 2 minutos para desnaturalizar los patrones.
• Siempre que se utilice un conjunto de colorantes nuevo en el instrumento.
• Siempre que un ingeniero de servicio técnico realinee o sustituya el láser,
el sistema óptico o la cámara del dispositivo acoplado a carga. 7. Enfríe rápidamente la placa en hielo durante 2 minutos.
• Si empieza a ver que la separación espectral disminuye (picos ascendentes
o descendentes). 8. Cargue de inmediato la placa en el 3100 o 3100-Avant Genetic Analyzer
(Analizador genético 3100 o3100-Avant).
Cómo realizarla ¡IMPORTANTE! No guarde la placa.
Una calibración espectral es un análisis que produce una descripción matemática
de la superposición en los espectros de emisión de un conjunto determinado de
colorantes. Esta descripción matemática se denomina una matriz y es necesaria para Creación de un registro de placa
cada capilar. El proceso de aplicar una matriz a los datos de las muestras se
denomina «separación en multicomponentes».
1. En la página Plate View (Vista de la placa) del software de recogida de
datos, haga clic en New (Nuevo).
Calibración espectral del ViroSeq System
Utilice: 2. Asigne un nombre y una categoría a la placa:
a. Escriba un nombre.
ABI ®
4336791 BigDye Terminator Sequencing Standard v1.1 (patrón de b. Seleccione Spectral Calibration (Calibración espectral).
secuenciación BigDye® Terminator v1.1) c. Seleccione 96-Well (96 pocillos).
d. Haga clic en Finish (Finalizar).

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3. Rellene la hoja de cálculo del Plate Editor (Editor de placas) con los datos 4. En la Matrix (Matriz) del conjunto de colorantes, utilice los botones de
de los pocillos cargados. flecha o la barra deslizante para revisar los datos de cada capilar.
a. Escriba el nombre de las muestras. Para que la calibración sea de buena calidad, cada capilar debe tener un:
b. Seleccione Dye Set E (Conjunto de colorantes E). Q-value (Valor de Q) superior a 0,95
c. Seleccione el módulo de análisis: Spect50_POP6DefaultModule Condition number (Número de condición) entre 3,0 y 5,0
d. Seleccione el nombre del archivo de parámetros espectrales:
SeqStd{Sequencing-SetE}.par
e. Haga clic en OK (Aceptar). 5. Para obtener una vista más detallada:
a. Pulse la tecla Mayús mientras hace clic y arrastra el puntero para
¡IMPORTANTE! Compruebe que ha seleccionado el archivo de crear un recuadro alrededor de la zona de interés.
parámetros espectrales correcto. Si selecciona un archivo de parámetros b. Suelte el puntero para ver una ampliación del recuadro.
espectrales incorrecto, la calibración espectral fallará.
c. Para restablecer la vista, pulse R.
Este procedimiento crea un registro de placa para la calibración en la base de
datos. Al cabo de unos segundos aparece la entrada del registro de la placa en
6. Haga clic en Cancel (Cancelar) para cerrar el cuadro de diálogo.
la tabla Pending Plate Records (Registros de placa pendientes) de la página
Plate Setup (Configuración de placas).
Evaluación de los perfiles utilizados en análisis anteriores
Inicio de la calibración
1. Seleccione Tools > Display Spectral Calibration (Herramientas > Mostrar
calibración espectral).
1. Haga clic en Run Instrument (Accionar el instrumento) en la barra de
herramientas para comenzar el análisis.
El análisis tarda aproximadamente 65 minutos. 2. En el cuadro de diálogo Question (Pregunta), haga clic en Previous run
(Análisis anterior).

Cuadro de resultados de la calibración espectral 3. En la lista desplegable, seleccione el análisis que desea ver y haga clic en
OK (Aceptar).
Un capilar aprobado se representa con un punto «.». Un capilar rechazado se
representa con una equis «X». 4. En el archivo del espectro, utilice la barra deslizante para examinar cada
Para aceptar la calibración finalizada, haga clic en OK (Aceptar). capilar.
¡IMPORTANTE! Revise y evalúe el perfil de calibración espectral de cada capilar,
aunque el cuadro Spectral Calibration Results (Resultados de la calibración 5. Cuando termine de examinar los datos, haga clic en Cancel (Cancelar).
espectral) indique que están todos aprobados.

Si un capilar falla
A un capilar que no supere la calibración, se le asigna automáticamente el perfil
espectral del capilar más cercano de la izquierda que la haya pasado. Si no hay
capilares válidos hacia la izquierda, se le asignará el perfil del capilar más cercano
hacia la derecha. Estos capilares aparecen marcados de color amarillo en vez de
verde en la Array View (Vista de la matriz).
¡IMPORTANTE! Para el análisis realizado por ViroSeq, en el que los picos
ascendentes y descendentes ocasionan errores críticos, repita la calibración espectral
y utilice un espectro único para cada capilar.

Si la calibración falla
Pruebe uno o más de los procedimientos siguientes:
• Verifique que se hayan seleccionado el archivo de parámetros y módulo de
análisis correctos. Si no es así, hágalo y repita el análisis.
• Verifique que los reactivos utilizados sean recientes. Si los reactivos son
antiguos, se han conservado inadecuadamente o han caducado, prepare reactivos
nuevos y repita el análisis.
• Compruebe que se hayan detectado todos los picos. Un sistema lento puede
hacer que el pico de color azul aparezca cortado total o parcialmente. Aumente el
tiempo del análisis o cambie los reactivos, si parecen sospechosos, y repita el
análisis.

Visualización del perfil de una calibración espectral

Evaluación del perfil actual

1. Seleccione Tools > Display Spectral Calibration (Herramientas > Mostrar


calibración espectral).

2. En el cuadro de diálogo Question (Pregunta), haga clic en Dye set


(Conjunto de colorantes).

3. En el cuadro de diálogo que se abre, utilice la lista desplegable para


seleccionar el conjunto de colorantes E y, a continuación, haga clic en
OK (Aceptar).

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21. Quillent, C., Dumey, N., Dauguet, C., and Clavel, F. 1993. Reversion of a
Sección 7: Bibliografía polymerase-defective integrated HIV-1 genome. AIDS Res Hum Retroviruses
9(10):1031-1037.
22. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Stock no. 017-040-
00547-4. U.S. Department of Health and Human Services.
Referencias citadas 23. Protection of Laboratory Workers from Infections Disease Transmitted by
Blood, Body Fluids, and Tissue, specifically dealing with all aspects of this
1. Barre-Sinoussi, F., et al. 1983. Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a issue. NCCLS, M29-T.
patient at risk for acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). Science 220: 24. Folks, T. M., et al. 1986. Biological and biochemical characterization of a
868-871. cloned Leu-3− cell surviving infection with the acquired immune deficiency
2. Popovic, M, et al. 1984. Detection, isolation, and continuous production of syndrome retrovirus. J Exp Med 164(1):280-290.
cytopathic retroviruses (HTLV-III) from patients with AIDS and pre-AIDS. 25. Winters, M. A., et al. 1998. A 6-basepair insert in the reverse transcriptase gene
Science 224: 497-500. of human immunodeficiency virus type 1 confers resistance to multiple
3. Hammer, S. M., et al. 1997. A controlled trial of two nucleoside analogues plus nucleoside inhibitors. J Clin Invest 102:1769-1775.
indinavir in persons with human immunodeficiency virus infection and CD4 26. Lukashov, V., et al. July 2000. Selection by AZT and rapid replacement in the
cell counts of 200 per cubic millimeter or less. N Engl J Med 337: 725-733. absence of drugs of HIV-1 resistant to multiple nucleoside analogs. AIDS Res
4. Palella, F. J., Jr., et al. 1998. Declining morbidity and mortality among patients Hum Retroviruses 17(9):807-818.
with advanced human immunodeficiency virus infection. N Engl J Med 338: 27. Richman, D. D. 1998. How drug resistance arises. Scientific American, July:88-
853-860. 89.
5. Furtado, M. R., et al. 1999. Persistence of HIV-1 transcription in peripheral- 28. Guidance for Industry: Class II Special Controls Guidance Document: In Vitro
blood mononuclear cells in patients receiving potent antiretroviral therapy. N HIV Drug Resistance Genotype Assay. August 2007 (Tables A and B).
Engl J Med 340: 1614-1622. 29. Moyle, G. J. 1997. Viral resistance patterns selected by antiretroviral drugs and
6. Zhang, L., et al. 1999. Quantifying residual HIV-1 replication in patients their potential to guide treatment choice. Exp Opin Invest Drugs 6(8):943-964.
receiving combination antiretroviral therapy. N Engl J Med 340: 1605-1613. 30. D’Aquila, R. T., et al. 2003. Drug Resistance Mutations in HIV. Topics in HIV
7. Condra, J. H., et al. 1995. In vivo emergence of HIV-1 variants resistant to Medicine 11(3):92-96.
multiple protease inhibitors. Nature 374: 569-571. 31. DeGruttola, V., et al. 2000. The relation between baseline HIV drug resistance
8. Shafer, R. W., et al. 1998. Multiple concurrent reverse transcriptase and and response to antiretroviral therapy: re-analysis of retrospective and
protease mutations and multidrug resistance of HIV-1 isolates from heavily prospective studies using a standardized data analysis plan. Antivir Ther
treated patients. Ann Intern Med 128: 906-911. 5(1):41-48.
9. Little S. J., et al. 2002. Antiretroviral-drug resistance among patients recently 32. Demeter, L., and Haubrich, R. 2001. Phenotypic and genotypic resistance
infected with HIV. N Engl J Med 347:385-394. assays: Methodology, reliability, and interpretations. J Acquir Immune Defic
10. U.S. Food and Drug Administration, Drugs Used in the Treatment of HIV Syndr 26, Suppl 1:S3-9.
Infection. January 2008. Available at http://www.fda.gov/oashi/aids/virals.html. 33. Deeks, S. G., et al. 2001. Virologic and immunologic consequences of
11. Richman, D., et al. 1991. Human immunodeficiency virus type 1 mutants discontinuing combination antiretroviral-drug therapy in HIV-infected patients
resistant to nonnucleoside inhibitors of reverse transcriptase arise in tissue with detectable viremia. N Engl J Med 344:472-480.
culture. Proc Natl Acad Sci USA 88:11241-11245. 34. Harrigan, P. R., and Côté, H. C. F. 2000. Clinical utility of testing human
12. Havlir, D. V., et al. 2000. Drug susceptibility in HIV infection after viral immunodeficiency virus for drug resistance. Clin Infect Dis 30, Suppl 2:S117-
rebound in patients receiving indinavir-containing regimens. JAMA 283: 229- 122.
234. 35. Pellegrin, I., et al. 1999. Emergence of zidovudine and multidrug-resistance
13. Johnson, V. A., et al. 2007. Update of the Drug Resistance Mutations in mutations in the HIV-1 reverse Transcriptase gene in therapy-naive patients
HIV-1:2007. Top HIV Med 15(4):119-25. receiving stavudine plus didanosine combination therapy. STADI Group. Aids
14. Baxter, J. D., et al. 2000. A randomized study of antiretroviral management 13:1705-1709.
based on plasma genotypic antiretroviral resistance testing in patients failing 36. Rhee, S. Y., M.J. Gonzales, et al. 2003. Human immunodeficiency virus reverse
therapy. AIDS 14: F83-93. transcriptase and protease sequence database. Nucleic Acids Res 31(1):298-303.
15. Durant, J., et al. 1999. Drug-resistance genotyping in HIV-1 therapy: the 37. Parkin N. T., et al. 2004. Natural variation of drug susceptibility in wild-type
VIRADAPT randomized controlled trial. Lancet 353: 2195-2199. HIV-1. Antimicrob Agents Chemother 48:437-43.
16. Zolopa, A. R., et al. 1999. HIV-1 genotypic resistance patterns predict response 38. Kempf D. J., et al. 2001. Identification of genotypic changes in human
to saquinavir-ritonavir therapy in patients in whom previous protease inhibitor immunodeficiency virus protease that correlate with reduced susceptibility to
therapy had failed. Ann Intern Med 131: 813-821. the protease inhibitor lopinavir among viral isolates from protease inhibitor-
17. Panel on Antiretroviral Guidelines for Adult and Adolescents. Guidelines for experienced patients. J Virol 75:7462-9.
the use of antiretroviral agents in HIV-1-infected adults and adolescents. 39. Colonno R. J., et al. 2003. Activities of Atazanavir (BMS-232632) against a
Department of Health and Human Services. January 29, 2008; 1-128, Available Large Panel of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Clinical Isolates
at http://www.aidsinfo.nih.gov/ContentFiles/AdultandAdolescentGL.pdf. Resistant to One or More Approved Protease Inhibitors. Antimicrob Agents
18. The European HIV Drug Resistance Guidelines Panel. In collaboration with the Chemother 47: 1324-33.
European AIDS Clinical Society. European HIV Drug Resistance Guidelines 40. Rhee S. Y., et al. 2004. Distribution of human immunodeficiency virus type 1
2006 update. Available at http://www.rega.kuleuven.be/cev/fileadmin/ protease and reverse transcriptase mutation patterns in 4,183 persons
guidelines/GuidelinesPocketGuide2006.pdf. undergoing genotypic resistance testing. Antimicrob Agents Chemother
19. Mukaide, M., et al. 2000. Evaluation of ViroSeq-HIV version 2 for HIV drug 48:3122-6.
resistance. Jpn J Infect Dis 53: 203-205. 41. Doyon, L., et al. 2005. Selection and characterization of HIV-1 showing
20. Cunningham, S., et al. 2001. Performance of the Applied Biosystems ViroSeq reduced susceptibility to the non-peptidic protease inhibitor tipranavir. Antiviral
human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) genotyping system for Res. 68(1):27-35.
sequence-based analysis of HIV-1 in pediatric plasma samples. J Clin Microbiol 42. Larder B. A., et al. 2000. Tipranavir inhibits broadly protease inhibitor-resistant
39:1254-1257. HIV-1 clinical samples. AIDS 14(13):1943-8.

Página 64 de 66 ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0


43. Parkin N., et al. 2005. Protease mutations associated with higher or lower than
expected Tipranavir (TPV) susceptibility based on the TPV mutation score
[poster 637]. 13th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections,
Denver, CO.
44. Katlama, C., et al. 2007. Efficacy and safety of TMC114/ritonavir in treatment-
experienced HIV patients: 24-week results of POWER 1. AIDS. 21(4):395-402.
45. Clotet, B., et al. 2007. Efficacy and safety of darunavir-ritonavir at week 48 in
treatment-experienced patients with HIV-1 infection in POWER 1 and 2: a
pooled subgroup analysis of data from two randomised trials. Lancet. 369:1169-
1178.
46. De Meyer, S., et al. 2005. TMC114, a Novel Human Immunodeficiency Virus
Type 1 Protease Inhibitor Active against Protease Inhibitor-Resistant Viruses,
Including a Broad Range of Clinical Isolates. Antimicrob Agents Chemother.
49(6):2314-2321.
47. Lambert-Niclot, S., et al. 2007. Factors associated with the selection of
mutations conferring resistance to protease inhibitors in PI-experienced patients
displaying treatment failure on darunavir. Antimicrob Agents Chemother.
http://aac.asm.org/cgi/content/abstract/AAC.00909-07v1.
48. Andries, K., et al. 2004. TMC125, a Novel Next-Generation Nonnucleoside
Reverse Transcriptase Inhibitor Active against Nonnucleoside Reverse
Transcriptase Inhibitor-Resistant Human Immunodeficiency Virus Type 1.
Antimicrob Agents Chemother. 48(12):4680-4686.
49. Lazzarin, A., et al. 2007. Efficacy and safety of TMC125 (etravirine) in
treatment-experienced HIV-1-infected patients in DUET-2: 24-week results
from a randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 370:39-48.
50. Vingerhoets, J., et al. 2005. TMC125 Displays a High Genetic Barrier to the
Development of Resistance: Evidence from In Vitro Selection Experiments. J
Virology. 79(20):12773-12782.

ViroSeqTM HIV-1 Genotyping System v2.0 Página 65 de 66


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