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ARTÍCULO DE INVESTIGACIÓN

La fijación de nitrógeno en una variedad local de maíz es


apoyado por microbiota diazotróficas amucilage asociada

Allen Van Deynze 1 ‡, Pablo Zamora 1 ‡, Pierre-Marc Delaux 2 ‡, Cristóbal Heitmann 1 † ‡,


Dhileepkumar Jayaraman 2, ShanmugamRajasekar 2, Danielle Graham 2, JunkoMaeda 3,
Donald Gibson 1, Kevin D. Schwartz 1, Alison M. Berry 1, Srijak Bhatnagar 4,
Guillaume Jospin 4, Aaron Darling, 4, Richard Jeannotte 5, Javier López 6, Bart C. Weimer 5,
Jonathan A. Eisen 4, Howard-Yana Shapiro 1,7, Jean-Michel Ane' 2,3, Alan B. Bennett 1 *
a1111111111
1 Departamento de Ciencias Vegetales de la Universidad de California en Davis, California, Estados Unidos de América,
a1111111111
2 Departamento de Agronomía de la Universidad de Wisconsin, Madison, Wisconsin, Estados Unidos de América,
a1111111111 3 Departamento de Bacteriología, Universidad de Wisconsin, Madison, Wisconsin, Estados Unidos de América,
a1111111111 4 Genome Center, Universidad de California, Davis, California, Estados Unidos de América, 5 Departamento de Salud de la Población y
a1111111111 Reproducción de la Universidad de California en Davis, California, Estados Unidos de América,
6 Instituto Tecnolo'gico del Valle de Oaxaca, Oaxaca, México, 7 Mars, Incorporated, McLean, Virginia, Estados Unidos de América

† fallecido.
‡ Estos autores comparten el primer autor en este trabajo.
ACCESO ABIERTO * abbennett@ucdavis.edu

Citación: Van Deynze A, Zamora P, Delaux PM, Heitmann C,

Jayaraman D, Rajasekar S, et al. (2018) La fijación de nitrógeno en

una variedad local de maíz está soportado por una microbiota


Resumen
diazotróficas mucílago-asociado. PLoS Biol 16 (8): e2006352. https: //

doi. org / 10.1371 / journal.pbio.2006352


Las plantas están asociados con una microbiota compleja que contribuye a la adquisición de nutrientes, crecimiento de las plantas, y la

defensa de las plantas. asociaciones microbianas fijadoras de nitrógeno son eficientes y bien caracterizado en las leguminosas pero
Editor Académico: Eric Kemen, Universidad de Tübingen,
están limitados en cereales, incluido el maíz. Estudiamos una autóctona indígena de maíz cultivado en suelos desprovisto de nitrógeno
Alemania
en la región SierraMixe de Oaxaca, México. Esta variedad local se caracteriza por el amplio desarrollo de las raíces aéreas que
Recibido: 13 de abril de, 2018
secretan un mucílago rica en carbohidratos. Análisis de la microbiota mucílago indicó que estaba enriquecido en taxa para los que

Aceptado: 03 de julio 2018 muchas especies conocidas se diazotróficas, se enriquecen de homólogos de genes que codifican subunidades de nitrogenasa, y

Publicado: 7 de agosto de, 2018 albergaba actividad de la nitrogenasa activa según la evaluación de la reducción de acetileno y 15 norte 2 ensayos de incorporación. Los

experimentos de campo en Sierra Mixe utilizando 15 N abundancia natural o 15 evaluaciones N-enriquecimiento de más de 5 años
Derechos de autor: © 2018 Van Deynze et al. Este es un

artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia indicaron que la fijación de nitrógeno atmosférico contribuyó 29% -82% de la nutrición de nitrógeno de maíz Sierra Mixe.

Creative Commons , Que permite el uso ilimitado, distribución y

reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y

la fuente se acreditan.

Disponibilidad de datos Declaración: Todos los datos numéricos se

encuentran ahora publicados en doi: 10.6084 / m9.figshare.6534545

y todos los datos de la secuencia de ADN / ARN en https: // figshare. com / s /

04997ae7f7d18b53174a .
resumen del autor
Fondos: Mars, Incorporated http: //www.mars. com / global . La
El nitrógeno es un nutriente esencial para las plantas, y para muchos cultivos que no son leguminosas, el requisito de nitrógeno se
investigación fue financiada por una donación sin restricciones y una
cumple principalmente por el uso de fertilizantes inorgánicos. Estos fertilizantes se producen a partir de combustibles fósiles por
subvención a ABB. El donante tenía ningún papel en el diseño del estudio,
procesos intensivos en energía que se estima utilizar 1% a 2% del suministro total de energía global y producir una proporción
la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del

manuscrito. La investigación fue financiada por subvenciones a ABB equivalente de gases de efecto invernadero. Debido a que el maíz ( Zea mays L.) es un receptor importante de la fertilización de

fromBioN2, Incorporated. El donante no tenía nitrógeno, una investigación

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La fijación de nitrógeno en una variedad local de maíz

papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a

publicar, o la preparación del manuscrito. La investigación preliminar fue objetivo durante décadas ha sido la identificación de mecanismos o ingeniero para la fijación biológica del nitrógeno atmosférico en
apoyado por una beca de investigación Disertación fromUCMexus a KS.
asociación con este cultivo. La hipótesis de que las variedades locales indígenas aislados de maíz cultivados usando prácticas
El donante tenía ningún papel en el diseño del estudio, la recogida y
tradicionales con estrategias poco o ningún fertilizante podría haber evolucionado para mejorar el rendimiento de la planta en
análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
condiciones de nutrientes bajo nitrógeno. Aquí, se muestra que para una de tales Landrace maíz cultivado en campos desprovisto

de nitrógeno cerca de Oaxaca, México, 29% -82% del nitrógeno planta se deriva de nitrógeno atmosférico. Los altos niveles de

fijación de nitrógeno son compatibles, al menos en parte, por la abundante producción de un mucílago rico en azúcar asociado con
Conflicto de intereses: Howard-Yana Shapiro está afiliado
raíces aéreas que proporciona un hogar a un complejo microbioma fijadoras de nitrógeno.
withMars, Incorporated, uno de los patrocinadores de la

investigación. Autor Cristóbal Heitmann no pudo confirmar la autoría

o contribuciones a sí mismo, y esto se llevó a cabo colectivamente

por los otros co-autores.

Abreviaturas:% Ndfa, por ciento de nitrógeno derivado de la atmósfera; %

Ndiff, ciento diferencia total de nitrógeno; ARA, ensayo de reducción de Introducción


acetileno; CCRC, hidratos de carbono complejos Centro Centro de
Las plantas crecen en estrecha asociación con las comunidades microbianas que influyen en rasgos de la planta relacionados con la
Investigación; GC / MS, cromatografía / espectrometría de masas de gas;

IRMS,-relación isotópica espectrometría de masas; NPGS, Sistema adquisición de nutrientes, desarrollo de la planta, defensas de las plantas, y las respuestas al estrés abiótico. La microbiota raíz asociada

Nacional de Germoplasma de Plantas; PCoA, análisis de componentes de las plantas se ha caracterizado y ha demostrado ser mucho menos complejo que la microbiota del suelo circundante, siendo enriquecido
principales; TMS, trimetilsililo. en Proteobacteria, Bacteroidetes, y Actinobacteria. Estos microbios se seleccionan en parte por las características de la pared celular

vegetal y señales metabólicas de las células huésped [ 1 , 2 ]. Caracterización de la microbiota asociada a la rizosfera 27 de maíz moderno ( Z.

mays) líneas endogámicas también indicaron diferencias sustanciales en la abundancia relativa de los taxones microbiana entre el suelo a

granel y la rizosfera, con el genotipo de maíz que contribuye una pequeña pero significativa influencia sobre la selectividad de la rizosfera [ 3 ].

Fijadoras de nitrógeno asociaciones microbianas con no leguminosas, especialmente cereales, han sido un tema de gran

interés desde hace más de un siglo [ 4 - 7 ]. endófitos fijadoras de nitrógeno contribuyen a la nutrición de nitrógeno de la caña de

azúcar en algunos entornos [ 8 - 10 ], Pero hay menos evidencia de la aparición de asociaciones diazotróficas eficientes en otros

cereales. Un estudio de 1 año sobre la base de 15 experimentos de dilución de N en Miscanthus x giganteus sugirió que esta

materia prima bioenergética perenne puede adquirir alrededor del 16% de su nitrógeno del aire [ 11 ]. También se ha demostrado

que el modelo de cereales, Setaria viridis, tanto como Setaria italica ( mijo de cola de zorra) puede adquirir una cantidad significativa

de nitrógeno fijado de asociaciones con Azospirillum brasilense [ 12 , 13 ]. Otros ejemplos de N atmosférica fijo 2 de ser transferido a

los cereales incluyen asociaciones entre Azoarcus sp. BH72 tensión y la hierba Kallar [ 14 ], seropedicae Herbaspirillum y arroz [ 15 , dieciséis

], Y Klebsiella pneumoniae y trigo [ 17 ]. Debido a su importancia económica, la búsqueda de asociaciones diazotróficas con maíz ( Z.

mays) [ 18 ] Ha sido un “santo grial” durante décadas, y varios estudios examinaron la contribución de la fijación de nitrógeno por H.
seropedicae

y Azospirillum sp. a diversas accesiones de maíz [ 19 , 20 ]. Sin embargo, a menudo es difícil en estos estudios para distinguir los beneficios

que promueven el crecimiento general de la planta de estas bacterias diazotróficas sobre el rendimiento de una transferencia real de

nitrógeno fijado a la sede de las plantas. Cinco técnicas se usan comúnmente para evaluar la fijación de nitrógeno: ensayos de reducción de

acetileno (ARAS), 15 N abundancia natural, 15 N enriquecimiento, 15 norte 2 de enriquecimiento de gas, y el equilibrio de nitrógeno experimentos [ 21

, 22 ]. Todos estos enfoques tienen dificultades potenciales, sin embargo, muy pocos estudios han comparado diferentes técnicas o llevado a

cabo evaluaciones durante varios años para evaluar la fijación de nitrógeno en no leguminosas.

Triplett sugirió que podría ser interesante para estudiar los maíces primitivos de las zonas de origen del maíz para
identificar los endófitos diazotróficas maíz [ 5 ]. Estrada y colegas [ 23 ] Seguido esta sugerencia y se examina una variedad local
de maíz en la región de la Sierra Mixe de Oaxaca, México, y se aisló un endófito de fijación de nitrógeno de la variedad local
de maíz residente. El aislamiento fue identificado tentativamente como una nueva especie de Burkholderia, pero la contribución
de

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La fijación de nitrógeno en una variedad local de maíz

dinitrógeno atmosféricas (N 2) a la economía de nitrógeno de la planta no se ensayó. Este grupo también informó el
aislamiento de un endófito similar de plantas de teosinte cultivadas en el campo y especuló que la Burkholderia cepa podría
haber formado una simbiosis primitiva con teosinte que persistió durante domesticación del maíz.

También aprendimos de las variedades locales indígenas aislados de maíz en la región de la Sierra Mixe de Oaxaca informa, que

fueron cultivados usando prácticas tradicionales con poco o ningún fertilizante y especularon que las asociaciones de la comunidad

microbiana, únicas que no se encuentran en el maíz cultivado, podrían haber evolucionado. Esta variedad local de maíz indígena se

caracteriza por el amplio desarrollo de las raíces aéreas que producen grandes cantidades de mucílago. El mucílago de maíz asociado

con raíces subterráneas ha sido descrito previamente [ 24 , 25 ], Y se ha sugerido que los exudados de las raíces juegan un papel

importante en la estructuración de la rizosfera comunidades microbianas [ 26 , 27 ]. De hecho, se ha demostrado que el mucílago de la

raíz de guisante puede servir como única fuente de carbono para algunas bacterias de la rizosfera, incluyendo Rhizobium sp., Burkholderia

sp., y Pseudomonas sp. [ 28 ]. raíces aéreas en la base del tallo de maíz, también conocido como raíces de anclaje o raíces adventicias

nodales, a menudo puede llegar al suelo y se cree que proporcionar un anclaje para evitar alojamiento sino también pueden contribuir a

la absorción de nutrientes y agua, así como el intercambio de gases [ 29 - 31 ]. Sin embargo, se sabe muy poco sobre el papel de las

raíces aéreas que no alcanzan el suelo y el mucílago que producen. Aquí, se demuestra que un Landrace maíz mexicano puede

adquirir 29% -82% de su nitrógeno del aire y que al menos algo de este N está fijado por bacterias diazotróficas presentes en el

mucílago de raíces aéreas.

resultados

Sierra Mixe morfología maíz y mucílago


Las variedades de maíz Sierra mixes cultivadas localmente referidos como Rojo, Piedra Blanca, y Llano en acciones morfologías de

plantas similares, creciendo a una altura de más de 5 metros y que presenta una amplia formación de raíces aéreas en cada nodo. Se

comparó el desarrollo de raíces aéreas en la Sierra Mixe de maíz con otra variedad de maíz alto, Hickory Rey ( Fig 1A ). A diferencia de la

mayoría de las variedades modernas de maíz en el que la formación de raíces aéreas cesa después de la transición de juvenil a adulto

(flecha, Fig 1A ), La formación de raíces aéreas en el maíz Sierra Mixe continuó hasta bien después de esta transición, lo que resulta en un

veces 4 mayor número de 3 a de raíces aéreas ( Fig 1B ). Aproximadamente a mitad de camino a través del desarrollo (julio a septiembre),

estas raíces del maíz aérea secretan cantidades significativas de mucílago que es rica en arabinosa, fucosa, galactosa y cuando la

humedad está disponible

características Fig 1. fisiológicos de maíz Sierra Mixe. ( A) La transición entre juveniles y adultos fases (flecha negro) se produce 5 semanas después de la
siembra en el maíz Sierra Mixe (barras negras) y en el maíz alto heirloomHickory Rey (barras grises). (B) Número de raíces aéreas observadas en el maíz Sierra
Mixe y Hickory Rey después de 14 semanas de crecimiento en el campo de inMadison, Estados Unidos de América. Las barras de error representan los errores
estándar; un asterisco indica una diferencia significativa entre el maíz Sierra Mixe y Hickory Rey (Estudiante t prueba, P < 0,01). (Datos en doi: 10.6084 / m9.figshare.
6534545 ).

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La fijación de nitrógeno en una variedad local de maíz

Fig 2. aérea mucílago raíz. Las raíces aéreas de maíz Sierra Mixe (izquierda) secretan grandes cantidades de mucílago entre 3 y 6 meses después de la
siembra. El mucílago es carbohidrato rico, con la composición dominada por arabinosa, fucosa y galactosa (panel lateral).

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( Figura 2 ). Los azúcares comprenden un polisacárido complejo que presumiblemente contribuye a la viscosidad del mucílago y puede

ser desmontada para proporcionar monosacáridos para apoyar el crecimiento microbiano y el metabolismo. El mucílago producido por

las raíces del maíz subterráneos también contienen altos niveles de fucosa y arabinosa [ 32 ], Aunque aproximadamente a la mitad de

la concentración encontrada en mucílagos raíz aérea.

Sierra Mixe maíz microbiota diazotróficas


La microbiota asociada a las raíces subterráneas y aéreas, tallos y raíces aéreas mucílago de maíz Sierra Mixe crecido en Sierra
Mixe se investigó mediante la amplificación y secuenciación de los genes 16S rRNA y por secuenciación metagenoma escopeta.
Las muestras de la rizosfera fueron los más diversos, y entre muestras de plantas, el mucílago raíz aérea tenía la mayor
diversidad ( S1 Fig ) Y una mayor abundancia relativa de Bacteroidetes y proteobacteria (beta y gamma) en comparación con otras
partes de las plantas ( S2 Fig ). Muchos de los linajes que están sobrerrepresentados en mucílagos incluyen fijadores de nitrógeno
asociadas a las plantas conocidas. Una comparación de las muestras en base a la composición total de la comunidad mostró un
agrupamiento de muestras de mucílago que fueron estadísticamente distinto del resto de la planta y rizosfera muestras ( Fig 3A ).
La agrupación de las muestras en base a la abundancia de varianza-estabilizada de variantes de secuencia indica de nuevo que
mientras que las muestras de la rizosfera eran distintos y diversa, las muestras de mucílago eran distante de los otros tejidos
vegetales ( S3 Fig ). La lista completa de todos secuencia variantes identificadas en las muestras de maíz y de suelo Sierra mixes
se puede encontrar en (DOI: 10.6084 / m9.figshare.4789759 ). Además, los datos metagenomic se buscó homólogos del núcleo 6 nif
genes tal como se describe por Dos Santos y colegas [ 33 ]. Esta búsqueda reveló la presencia de los 6 núcleo nif genes en los
metagenomes frommucilage y rizosfera y sólo un subconjunto del núcleo 6 nif genes de tejido del tallo ( Fig 3B ). A mayor
abundancia normalizada de la mayoría

nif genes (excepto nifD) en mucílagos de tejidos del tallo sugiere que el mucílago puede enriquecerse en microbios
fijadores de nitrógeno.

Para evaluar la posibilidad de que el mucílago albergaba una comunidad microbiana diazotróficas, el mucílago se ensayó para

actividad de la nitrogenasa usando ARA [ 34 ] Y mediante la incorporación de 15 norte 2


gas. ARA se utilizó para evaluar las hojas, tallos, raíces subterráneas, raíces aéreas (con y sin mucílago), y mucílago recogidos
de las plantas de maíz Sierra mixes cultiva ya sea en Sierra Mixe, México, o Madison, EE.UU.. No se detectó actividad ARA en
las raíces bajo tierra, hojas, tallos, raíces aéreas o incluso antes de la producción de mucílago ( S4 Fig ). En contraste, se detectó
actividad ARA significativo en raíces aéreas que albergan mucílago ( S4 Fig ) Y en mucílagos aislado a partir de plantas
cultivadas en cualquiera Sierra Mixe o Madison ( Fig 4A ). La actividad ARA en mucílagos aislado a partir de

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La fijación de nitrógeno en una variedad local de maíz

caracterización del microbioma de maíz Sierra Mixe 3. ADN Fig secuenciación-basa. ( A) Las muestras agrupadas por PCoA en matriz de distancia disimilitud
Bray-Curtis. comunidades bacterianas se evaluaron utilizando la amplificación por PCR y secuenciación de genes de ARNr. Cada punto corresponde a una muestra
individual. PERMANOVA pruebas se ejecutan utilizando Adonis en
vegano muestras de mucílago reveladas fueron estadísticamente distinto (por ejemplo, mucílago frente rizosfera P = 0,002, mucílago frente a raíces P = 0,03, mucílago frente
raíces aéreas P = 0,03). (B) basado en el análisis de secuenciación Metagenomic de homólogos de núcleo
nif (genes nifH, nifD, Nife, nifK, nifN, y NIFB) y nitrogenasa alternativo ( anfG / vnfG). muestras Metagenomic se buscaron homólogos mediante mapeo lee en
referencia nif árboles. El número de accesos se normalizó a una estimación del número de genes bacterianos en la muestra metagenomic (medidos usando el
número de visitas al modelo oculto de Markov RecA). La menor abundancia de un núcleo nif gen en las bibliotecas de mucílago y la rizosfera. Sólo núcleo nif gen
golpeó en la biblioteca del tallo. anfG y vnfG nitrogenasa alternativo se observaron solamente en la biblioteca de mucílago. PCoA, análisis de componentes
principales.

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maíz Sierra Mixe que se cultiva en Madison sugiere que o bien las semillas de maíz Sierra mixes llevan un inóculo endógeno de

bacterias fijadoras de nitrógeno o que el maíz Sierra Mixe puede reclutar bacterias fijadoras de nitrógeno adecuadas de los

ambientes locales. La fijación de nitrógeno por las muestras de mucílago también se midió mediante la incorporación directa de 15 norte

2 en muestras de mucílago recogidos de maíz Sierra Mixe ( Fig 4B ). Al igual que con el maíz Sierra Mixe, un pariente silvestre, Z.

mays ssp. mexicana ( teosinte), también produjo extensas raíces aéreas ( S5 Fig ), Pero cantidades mucho menores de mucílago
secretado. Para probar la capacidad de la mucílago teosinte para apoyar la fijación de nitrógeno, se recogieron mucílago de varias

plantas de teosinte y actividad de la nitrogenasa endógeno medido utilizando ARA. reducción de acetileno se observó fácilmente en

mucílago teosinte ( Fig 4A ), Lo que sugiere que la producción de mucílago que soporta la fijación de nitrógeno por una microbiota de

fijación de nitrógeno asociado puede ser un antiguo rasgo de maíz y potencialmente introgresión de Z. mays ssp. Mexicana en el

postdomestication Landrace Sierra Mixe.

Para evaluar las características de mucílago que soportan la fijación de nitrógeno, hemos probado la capacidad de 2 bacterias

fijadoras de nitrógeno distintos filogenéticamente para reducir acetileno cuando se inocula en el mucílago recogido de raíces aéreas

de maíz Sierra Mixe. Antes del experimento, el mucílago se congeló durante 2 semanas a -80 ° C y se descongeló, que abolió la

actividad de la nitrogenasa endógeno ( Fig 4C ). Dos bacterias fijadoras de nitrógeno, H. seropedicae, y A. brasilense, mostraron

actividad ARA fácilmente detectable cuando se añade a la mucílago ( Fig 4C y 4D ). nitrogenasa bacteriana

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La fijación de nitrógeno en una variedad local de maíz

Fig 4. nitrogenasa y N 2 actividad de fijación en mucílagos producida por el maíz Sierra Mixe. ( A) El mucílago de varias líneas de maíz Sierra mixes recogidos en
Sierra Mixe o plantas cultivadas en el campo inMadison, EE.UU., y de una fuerte actividad de reducción de acetileno pantalla teosinte. (-, no acetileno; +, 10% de
acetileno). Los asteriscos indican diferencias significativas ( P < 0,05;
P < 0,01, prueba de Mann-Whitney). (B) La fijación de nitrógeno en mucílagos maíz Sierra Mixe por 15 norte 2 asimilación. El mucílago recogido de maíz Sierra Mixe
crecido en Sierra Mixe se incubó en viales impermeables a los gases llenas 15 norte 2 o 14 norte 2 gas durante 70 horas a 37 ° C. 15 N (átomo% de exceso) se determinó
por IRMS. (C y D) H. seropedicae y A. brasilense mostrar la actividad de reducción de acetileno cuando se añade a no fijación mucílago, mientras que el mismo
mucílago suplementado con medio estéril (-) o las mismas bacterias sin mucílago (-) no lo hacen. (E) La concentración de oxígeno a los 8 mm en el interior del
mucílago. Los medios y los errores estándar se muestran. Letras diferentes indican grupos apoyados estadísticamente (test KruskalWallis). (Datos en doi: 10.6084 /
m9.figshare.6534545 ). IRMS,-relación isotópica espectrometría de masas.

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Yo asi 2- sensible y necesita ser protegido por un ambiente bajo en oxígeno (<5%) o mecanismos de protección fisiológicos, así
como una fuente de carbono abundante para derivar la energía para este proceso [ 35 ]. Para determinar si mucílago podría
cumplir estos requisitos, se midió la concentración de oxígeno libre en el mucílago de maíz Sierra Mixe y teosinte a la
profundidad de 8 mm y pareció que era <5%, lo que indica que el mucílago puede proporcionar un entorno microaeróbica

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compatible con la fijación de nitrógeno por estas bacterias [ 36 ] ( Fig 4D ). El mucílago también se compone de azúcares complejos que

pueden catabolizar para proporcionar azúcares-principalmente libres arabinosa, fucosa y galactosa-capaz de soportar el crecimiento

bacteriano y la fijación de nitrógeno. Para determinar si estas propiedades de la mucílago son suficientes para apoyar la fijación de

nitrógeno, creamos un artificial mediummimicking estas propiedades mucílago mediante el uso de un bajo Nmedium, solidificado con

0,2% de agar, que reduce la concentración de oxígeno a niveles casi tan bajas como las que se encuentran en el mucílago ( S6A Fig ) Y

complementado con una mezcla de azúcares libres correspondientes a la composición de los hidratos de carbono de mucílago

totalmente hidrolizado. H. seropedicae, A. brasilense, y

unamae Burkholderia ( S6B, S6C y S6D Fig ) Mostraron actividad ARA significativo en este mucílago reconstruida, lo que indica
que la baja O 2 y azúcares libres provistos por el mucílago raíces aéreas son suficientes para apoyar la fijación de nitrógeno por
estas diazótrofos.
Sobre la base de ARA, podemos concluir que el mucílago de los puertos de maíz Sierra Mixe diazótrofos nativos y también
puede apoyar la N 2- la fijación de la actividad de los diazótrofos exógenamente inoculados, H. seropedicae, A. brasilense, y B.
unamae. Sin embargo, estos datos no demostró que las raíces aéreas tenían la capacidad de tomar y asimilar el N. fijo Para
probar si N atmosférica 2 que ha sido fijado por diazótrofos mucílago asociada podría transferirse a y utilizado por el maíz Sierra
Mixe, una más directa 15 norte 2 se utilizó experimento gas de enriquecimiento. raíces aéreas, junto con su mucílago generado,
inoculadas con A. brasilense Sp7 exhibió significativa 15 norte 2 incorporación de gas en comparación con el 14 norte 2 raíces de gas
tratada ( Fig 5 ), El análisis y-relación isotópica espectrometría de masas (IRMS) confirmó enriquecimiento significativo de 15 N en
la clorofila (convertido a feofitina para el análisis) de estas raíces en comparación con los controles negativos ( Fig 5 ).

Fig Análisis 5. de muestras de maíz Sierra mixes para 15 norte 2 el enriquecimiento en mucílagos, raíces aéreas, y feofitina de raíces aéreas. El mucílago se generó a partir
raíces aéreas y se inoculó con A. brasilense Sp7. 15 norte 2 gas se bombeó, y después de incubationmucilage, se separó de los raíces aéreas. Mucílago solo y aéreas raíces solamente
se sometieron a análisis por IRMS. Los resultados revelaron un enriquecimiento significativo de 15 norte 2 en mucílagos solo y raíces aéreas solo (a la izquierda del eje Y). Puesto que las
raíces aéreas inoculados pueden contener A. brasilense Sp7 unido a la superficie, se extrae feofitina a partir de estas raíces aéreas para poner a prueba 15 norte 2 incorporación en
feofitina. Los resultados revelaron un enriquecimiento significativo de 15 norte 2 en estas raíces aéreas, lo que indica que las raíces aéreas son de hecho los sitios para transferencia de
nitrógeno fijado a las plantas (eje y derecho). 14 norte 2 muestras se utilizaron como controles negativos. n = 4 (raíces aéreas y mucílago), n = 3 (feofitina). El asterisco ( ) Indica una
diferencia estadísticamente significativa ( p < 0,05). (Datos en doi: 10.6084 / m9.figshare.6534545 ) IRMS,-relación isotópica espectrometría de masas.

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La fijación de nitrógeno en una variedad local de maíz

La fijación de nitrógeno contribuye al maíz N nutrición

La transferencia de 15 norte 2 frommucilage al tejido de las raíces aéreas y la clorofila demostró el potencial de esta comunidad

diazotróficas contribuir a la nutrición de nitrógeno de la planta, sino una cuestión importante de este estudio es si la microbiota

diazotróficas mucílago asociada sirvió para transferir nitrógeno fijado para cumplir, al menos, en parte, los requerimientos de

nitrógeno reducidos de maíz Sierra Mixe en condiciones de campo. La contribución de la fijación de nitrógeno atmosférico para el

maíz Sierra Mixe se estimó por primera vez en el campo utilizando abundancia natural 15 Nmeasurements [ 37 , 38 ]. Este método se

basa en la abundancia relativa de los isótopos estables 15 N en la atmósfera y el suelo, con 15 N abundancia siendo más abundante

en el suelo que en el aire. Como consecuencia, las plantas que se derivan N de la atmósfera exhibirá reducida δ 15 los niveles de N

cuando se compara con referencia a las plantas de no fijación. En 2006, se recogieron muestras de maíz y de referencia plantas

Sierra mixes de las Asteraceae y Ranunculaceae (familias con no hay miembros conocidos fijadoras de nitrógeno) que crecen

cerca de uno al otro de cada uno de 2 campos. En este experimento preliminar, el maíz Sierra Mixe δ 15 N fue significativamente

menor que las plantas de referencia, lo que indica la asimilación de nitrógeno atmosférico ( Tabla S1 ). En 2010, 2011, y 2012, los

métodos de [ 38 , 39 ] Se utilizaron en experimentos en Sierra Mixe mediante el muestreo de especies de referencia de plantas no

fijadoras de nitrógeno que crecen cerca de las plantas de maíz Sierra mixes y una variedad de maíz convencional, Maiz Blanco

Conasupo. Además de determinar δ 15 N de cada muestra de maíz y planta de referencia, se utilizaron muestras de hojas de cada

planta de referencia para el análisis de secuencia de ARNr 18S para identificar las especies de referencia ( Tabla 1A ). los δ 15 N

valores de maíz Sierra Mixe crecido en el campo en Sierra Mixe se determinaron en un solo punto de tiempo de desarrollo en 2010

y a los 5 puntos de tiempo de desarrollo en 2011 y 2012. En 2010, el δ 15 N valores para el maíz Sierra Mixe fueron

significativamente inferiores a los de las especies de plantas de referencia y de la variedad de maíz convencional, Maiz Blanco

Conasupo ( Tabla 1A ), Indicando que el maíz Sierra Mixe fue capaz de derivar una parte significativa de su nitrógeno tejido de

dinitrógeno atmosférica. Similar δ 15 N valores

Tabla 1. Abundancia natural 15 N determinaciones. ( UNA) δ 15 N valores de maíz Sierra Mixe, una variedad de maíz convencional (Maiz Blanco Conasupo), y las plantas de referencia cultivadas en Sierra Mixe, 3 meses después de la siembra.
Los valores se dan como media y desviación estándar. Las comparaciones estadísticas se realizaron entre las medias de las plantas de referencia, Maiz Blanco Conasupo, y Z. mays S. Mixe, usando Estudiante t (pruebas p < 0,05). Letras
diferentes indican grupos apoyados estadísticamente. (SEGUNDO) δ 15 N valores de plantas de maíz Sierra mixes cultivan en los campos 1 y 2 en Sierra Mixe durante 2011 y 2012 a los 2, 3, 4, 5, y 6 meses después de la siembra. Los valores se
dan como media y desviación estándar. Se hicieron comparaciones estadísticas entre las plantas de referencia y significan Z. mays S. Mixe significa en cada punto de tiempo usando Estudiante t (pruebas p < 0,05). Letras diferentes indican
grupos apoyados estadísticamente. Plantas de referencia se enumeran en Tabla S3 . (Datos en doi: 10.6084 / m9.figshare.6534545 ).

UNA segundo

Muestra Muestra 2011 δ N15 (‰) 2012 δ N15 (‰)

Rumex obtusifolius 5,88 ± 0,44 campo 1

Ipomoea purpurea 4.55 ± 029 Plantas de referencia significan 5.86 ± 0.61 una 4.14 ± 0.35 una

Bougainvillea sp. 6,31 ± 0,49 Z. mays S. Mixe segundo mes 4,57 ± 1,39 ab 6.38 ± 1.09 una

Sambucus canadensis 6,76 ± 0,09 Z. mays S. tercera Mes Mixe 2,36 ± 0,67 b 0,78 ± 1,26 c

chiapasiana Hymenocallis 4,08 ± 0,16 Z. mays S. Mixe cuarto mes 3,92 ± 0,30 b 3,27 ± 1,98 b

Physalis philadelphica 6.12 ± 0.18 Z. mays S. Mixe quinto mes 4,04 ± 0,36 b 3,77 ± 0,33 b

YO. purpurea 5,53 ± 0,20 Z. mays S. Mixe sexto mes 3,39 ± 0,20 b 2,66 ± 0,22 b

perfoliatum Melampodiu 4,29 ± 0,09

Plantas de referencia significan 5.42 ± 0.21 una campo 2

Maíz Blanco Conasupo significa 4.87 ± 0.57 una Plantas de referencia significan 5.19 ± 0.64 una 2.72 ± 0.26 una

Z. mays S. Mixe campo 1 3.05 ± 0.82 Z. mays S. Mixe segundo mes 4.86 ± 1.39 una -1,02 ± 0,90 bc

Z. mays S. Mixe Campo 2 2,36 ± 0,94 Z. mays S. tercera Mes Mixe 2,10 ± 0,74 bc -2.73 ± 1.07 c

Z. mays S. Mixe significa 2,71 ± 0,60 b Zea mays S. Mixe cuarto mes 2,35 ± 0,52 b -0,61 ± 0,23 b

Zea mays S. Mixe quinto mes 1,20 ± 0,22 c 0,37 ± 0,31 b

Zea mays S. Mixe sexto mes 2,74 ± 0,41 b -0,41 ± 0,20 b

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La fijación de nitrógeno en una variedad local de maíz

a partir de muestras de raíces y de hojas también mostraron que las muestras de hojas analizados eran representativos de toda la

planta ( Tabla S2 ). En 2011 y 2012, la δ 15 N valores de maíz Sierra Mixe fueron significativamente menores que las plantas de

referencia en 4 de los 5 puntos de tiempo de desarrollo, lo que sugiere que el maíz Sierra Mixe deriva una porción de su nitrógeno

tejido de nitrógeno atmosférico ( Tabla 1B ). El porcentaje calculado de nitrógeno derivado de la atmósfera (% Ndfa) de la

δ 15 N valores en tabla 1 osciló entre 30% y 80% ( S7 Fig ). El método de uso de abundancia natural 15 N y otras especies como
plantas de referencia para calcular el% de Ndfa está limitando potencialmente debido a diferencias en la raíz y brote
crecimiento y fenología de plantas de referencia y de prueba y el rango limitado de δ 15 N encuentra en los suelos. Un método
alternativo, 15 N enriquecimiento, es similar a los métodos abundancia natural pero enriquece suelo 15 N por la adición de 15 N
fertilizante, lo que aumenta la diferencia entre el suelo y la atmósfera

δ 15 N y sensibilidad del ensayo. Varias comparaciones directas han indicado que ambos métodos pueden dar resultados comparables,

pero ligeramente diferentes [ 38 , 40 ].

Otro método de estimación de N 2 la fijación es el método “NDifference”, que determina la diferencia entre el contenido total
de N de un N 2- la fijación de la planta y el contenido total de N de una planta de no fijación de referencia. N total se calcula
multiplicando el contenido total de N (%) en una muestra específica de la planta y la biomasa total (kg / ha o kg) producido por
la planta. El% Ndiff se calcula como inMaterials y métodos descritos.

En 2016 y 2017, se evaluó la fijación de nitrógeno atmosférico usando el 15 método N-isótopo de enriquecimiento (1% -10% de

enriquecimiento) en 3 etapas-V9 crecimiento vegetativo, V12, y borla con [ 41 ] En un diseño aleatorio de bloques completos (5

repeticiones) en 3 campos de bajo N Sierra mixes y en la etapa de la borla en 2017 en los mismos campos utilizando el mismo diseño ( Tabla

2 ). El campo 3 (con un historial de 0-1 años de la producción de maíz), produjo diferencias significativas en Atom% 15 N sólo para SM2 en

la etapa de la borla en 2016, pero disparar Nwas significativamente diferente en ambos 2016 y 2017. En 2016, Sierra mixes variedades

Landrace maíz exhibió Atom significativamente menor% 15 N niveles que las plantas de referencia en el campo 4, (con una historia de 1-2

años de la producción de maíz) en la borla y en V9 en 2016, y en la borla en ambos años para disparar N. Tanto en 2016 y 2017, el

maíz Sierra Mixe

Tabla 2. 15 determinaciones N-isótopo de enriquecimiento en las pruebas de campo. Ndfa ciento y Ndiff se calcularon para las variedades Sierra Mixe cuando Atom% 15 N exceso o disparar N para toda la planta fueron significativamente
diferentes de las variedades de referencia tal como se evaluó mediante ANOVA y contrastes de un solo grado de libertad ( p = 0,05), respectivamente. Los valores seguidos por asteriscos son significativamente diferentes de las variedades de
referencia basados ​en contrastes con un solo grado de libertad ( p < 0,05). Porcentaje Ndfa y Ndiff no se calcularon para la referencia (guiones). (Datos en doi: 10.6084 / m9.figshare.6534545 ).

2016 9-hoja 2016 12 hojas 2016 borla 2017 borla

Átomo Ndfa Disparar N Ndiff Átomo Ndfa Disparar N Ndiff Átomo Ndfa Disparar N Ndiff Átomo Ndfa Disparar N Ndiff
15 N (%) 15 N (%) 15 N (%) 15 N (%)
(%) (kg / ha) (%) (%) (kg / ha) (%) (%) (kg / ha) (%) (%) (kg / ha) (%)

El campo 3

Referencia 0.60 - 5.1 - 0.28 - 21.3 - 0.21 - 12.0 - 0.24 - 5.9 -

SM1 0.35 43.5 11.1 46.4 0,19 30.2 31.7 29.1 0.18 21.5 27.3 46.5

SM2 0.57 10.3 6.6 22.0 0.24 14.9 27.5 23.3 0.15 29.0 34.2 60.6 0.23 5.0 24.2 75.0

El campo 4

Referencia 0.16 - 21.8 - 0.12 - 58.5 - 0.09 - 58.2 - 0.21 - 28.5 -

SM1 0.17 5.6 31.5 28.5 0.07 32.9 84.5 29.2 0.05 48.1 122,3 48.7 0.17 15.0 30.2 13.0

SM2 0.10 33.4 19.9 1.9 0.08 30.4 94.6 30.1 0.05 43.2 101,8 37.6 0,19 6.0 51.3 46.0

El campo 5

Referencia 0.45 - 6.2 - 0.23 - 16.4 - 0.18 - 9.8 - 0.41 - 8.4 -

SM1 0.23 48.5 14.9 56.8 0.16 33.3 46.2 61.1 0.08 55.3 61.4 82.2 0.27 32.0 30.5 70.0

SM2 0.24 46.4 10.5 37.9 0.12 48.0 37.2 52.7 0.08 55.1 43.1 76.6 0.27 33.0 27.0 71.0

Abreviatura: Ndfa, nitrógeno derivado de la atmósfera; Ndiff, diferencia total de nitrógeno.

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La fijación de nitrógeno en una variedad local de maíz

variedades locales en el campo 5 (más de 3 años de la producción de maíz continua) exhibieron Atom significativamente

menor% 15 N y disparar N en todas las etapas muestras, lo que indica un nivel significativo de la fijación de nitrógeno atmosférico

en esos experimentos. El% calculado Ndfa osciló entre 31% y 55%, y Ndiff varió de 29% -82%. La correlación entre Ndfa y

Ndiff era 0,55 y 0,44 ( P < 0.01) a través de localizaciones en 2016 y 2017, respectivamente. medidas significativas de N 2

fijación se detectaron en 4 de 6 experimentos por Atom% δ 15 determinaciones NN (NDFA) y en 6 de 6 experimentos por

determinaciones Ndiff. Raíz y brotes mostraron diferencias significativas en la biomasa, altura y diámetro entre híbridos y

variedades locales de control del tallo ( Tabla S4 ). Los análisis del suelo ( Tabla S5 ) Mostraron que todos los sitios se agotaron en

nitrógeno del suelo todavía produjo una cosecha mayor de 2.000 kg / ha. Es posible que las diferencias entre la microbiota asociada

a los 3 campos en diferentes etapas de la rotación de cultivos es necesario (0 a> 4 años de continua producción de maíz) dan

cuenta de las diferencias observadas entre los campos y entre años, pero más investigación para responder a esta pregunta.

Discusión
Hemos demostrado que el mucílago asociado con las raíces aéreas de maíz Sierra Mixe puede soportar un complejo microbiota

diazotróficas enriquecido para homólogos de genes que codifican subunidades de nitrogenasa que albergan actividad de la nitrogenasa

activo, y que el nitrógeno se transfiere de manera eficiente de las bacterias fijadoras de nitrógeno para el huésped tejidos de la planta.

En conjunto, durante varios años y las ubicaciones, las 15 N abundancia natural y 15 N los resultados de enriquecimiento de 2 selecciones

de una variedad local de maíz indígena Sierra Mixe sugieren que la nutrición de nitrógeno cuando se cultiva en su medio natural se ha

cumplido en parte, por la fijación del nitrógeno atmosférico. La fijación de nitrógeno es un fenotipo particularmente difíciles de evaluar,

como todas las técnicas disponibles son propensos a artefactos y pueden dar estimaciones distintas para la fijación de nitrógeno [ 42 , 43 ].

En este estudio, hemos utilizado varias técnicas clásicas con el maíz Sierra Mixe y hemos demostrado en múltiples localidades y años

que el maíz Sierra Mixe pueden fijar el nitrógeno a tasas (29% -82%) no se informó anteriormente, a nuestro entender, en el maíz.

Este estudio también reveló una nueva e importante función de las raíces aéreas y el mucílago que producen además de
prevenir albergues o absorción de agua [ 30 ]. Este papel en la fijación de nitrógeno es probablemente el más importante para las
raíces aéreas que no alcanzan el suelo. Será interesante explorar si las raíces aéreas producidas por otros cereales como el
sorgo pueden desempeñar una función similar [ 44 ]. No podemos descartar que la actividad diazotróficas en otras partes del maíz
Sierra Mixe también puede contribuir a la adquisición de la reducción de nitrógeno de la atmósfera. El momento del desarrollo de
la aparición de N atmosférica fijo 2 en plantas de maíz Sierra Mixe (Tablas 1 y 2 ) Antes de que el amplio desarrollo de las raíces
aéreas sugiere que puede, de hecho, ser sitios adicionales de fijación de nitrógeno. Sin embargo, no hemos detectado ninguna
actividad de la nitrogenasa significativo fuera del mucílago raíces aéreas.

La base genética del rasgo o la fuente del inóculo microbiano, que puede ser o bien del medio ambiente o las semillas,
portadas, son sin resolver. La observación de que una especie de teosinte ( Z. mays ssp. mexicana) también exhibe una actividad
similar en diazotróficas aérea mucílago raíz asociada sugiere que este es un rasgo antigua que puede haber sido introgresión y
amplificado en la Landrace Sierra Mixe. Será importante, en el futuro, para determinar la base genética del rasgo, la identidad de
diazótrofos microbianos asociados, y los mecanismos de reclutamiento microbiana. Esta investigación, junto con otras
investigaciones publicadas [ 5 , 18 , 23 ], Sugiere nuevas vías de investigación en potencialmente nuevos mecanismos de N
biológica 2 la fijación en el maíz. Esto podría tener un impacto significativo en la productividad de los cultivos de maíz y la
eficiencia del uso del nitrógeno, especialmente en las regiones del mundo donde la agricultura se caracteriza por una mala
nutrición del suelo.

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La fijación de nitrógeno en una variedad local de maíz

Materiales y métodos

Material vegetal

semillas de maíz Sierra Mixe se obtuvieron en Sierra Mixe de Oaxaca, México, a partir de una población de polinización
abierta. Z. mays ssp. mexicana ( teosinte), LH123HT, Mo17, PHG39, LH82, se obtuvieron semillas PH207, y B73 Sistema de
germoplasma fromUSDA Nacional Plant (NPGS) (adhesiones Ames 8083, PI601079, PI558532, PI600981, PI601170,
PI601005 y PI550473, respectivamente). La línea de maíz Hickory Rey se obtuvo Seeds fromVictory (adhesión 3.140.041).
Tornado-F21 y H-377 se obtuvieron a partir de Semillas Ceres en Oaxaca. SM1 y SM2 son diferentes selecciones de la raza
criolla Sierra Mixe. SM1 es una población uniforme basado en el tamaño del núcleo, la forma y color, y SM2 es una población
heterogénea que representa el Landrace.

Se accede a los materiales biológicos y utilizados bajo un Acuerdo de acceso y distribución de beneficios entre la
comunidad Sierra Mixe y BioN2, Inc., y con el permiso del gobierno mexicano. Un certificado internacionalmente
reconocido de cumplimiento del Protocolo de Nagoya (ABSCH-ARI-MX-207343-3) se ha emitido para este tipo de
actividades.

Cepas bacterianas y medios

A. brasilense Sp7 y B. unamae MTI-641 fueron amablemente proporcionados por el Dr. G. Alexandre (Universidad de Tennessee,
Knoxville, EE.UU.) y el Dr. A. Hirsch (Universidad de California, Los Ángeles, EE.UU.), respectivamente. H. seropedicae Z152 (ATCC

35894) fue proporcionado por la ATCC ( http: // www.atcc.org/ ). Las bacterias se cultivaron en medio EEB líquido.

Coleccion de muestra

Los tejidos de la rizosfera de plantas y que incluyen tallos, hojas, raíces aéreas, raíces subterráneas, y el mucílago de maíz Sierra Mixe Se

tomaron muestras durante las temporadas 2010, 2011 y 2012 de los campos 1 y 2 en Sierra Mixe. Para el análisis de endófito de plantas,

tejidos se esterilizaron superficialmente enjuagando con MQH 2 O, se agitó suavemente en 70% de etanol durante 5 minutos, se colocaron

en 1% de blanqueador de hipoclorito, se agitó suavemente durante 10 minutos, se enjuagó 3 veces en MQH 2 0, y se secó en una cabina de

flujo laminar. Las raíces y tallos también se diseccionaron para eliminar tejidos epidérmicos antes de la extracción. Para el análisis de

endófito semilla, embrión y endospermo de Sierra Mixe, Hickory King, y B73 fueron retirados de las semillas a mano usando una hoja de

afeitar en una cabina de flujo laminar y se recogieron en 1,5 ml tubos de microcentrífuga estériles. Para este estudio, la rizosfera se definió

como una capa de suelo que cubre la superficie exterior del sistema de raíces que podrían ser lavado de raíces en una solución tampón /

detergente. Roots se separaron primero y se agitaron para retirar libremente tierra adherida. Todos los suelos y las muestras de material

vegetal se utilizaron inmediatamente para la extracción de ADN. análisis fertilidad del suelo, que incluía parámetros físicos, la reacción del

suelo, y la salinidad, se realizó en AGROLAB (Pachuma, México).

fenotipado vegetal

El número de nodos con raíces aéreas se controló semanalmente (invernadero) o después de 14 semanas (de campo). El

número total de raíces aéreas se cuantificó después de 14 semanas. La desaparición de la cera de la hoja y la apariencia de

tricomas se monitorizaron semanalmente para determinar la transición entre la etapa juvenil y etapa adulta en el maíz Sierra Mixe

y Hickory King.

Invernadero y de campo experimentos, Madison, EE.UU.

Para los experimentos en el invernadero, semillas de Sierra Mixe de campos 1 y 2 y Hickory Rey se esterilizaron superficialmente y

germinaron como se describe anteriormente. Después de 1 semana, las plántulas se trasplantan en macetas de 40 litros llenos de una

mezcla de arena y perlita (v: v) y se cultivaron en un alto

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La fijación de nitrógeno en una variedad local de maíz

de efecto invernadero en las instalaciones de techo Biotron (Universidad de Wisconsin, Madison, EE.UU.). Las plantas se regaron dos

veces al día durante 2 minutos con un medio-fuerza de solución de Hoagland. Para los experimentos en el campo, se plantaron 3

parcelas independientes de 20 plantas por genotipo, con 3 filas de frontera (B73) entre cada genotipo. Plantas de Sierra mixes y

teocintle que se cultivaron en Madison para el ARA fueron plantados en el mismo campo al mismo tiempo. Este experimento se repitió

en 3 parcelas de campo diferentes.

composición glicosilo mucílago

análisis de la composición de glucosilos se realizó por cromatografía de gases combinada espectrometría de masas / (GC /
MS) de la per- O- trimetilsililo (TMS) derivados de los glucósidos metílicos de monosacáridos producidos a partir de la muestra
por metanólisis ácida. glucósidos de metilo se prepararon primero a partir de muestras de mucílago se secan por metanolisis
en 1 MHCl en metanol a 80 ° C (18-22 horas), seguido de re- NORTE- acetilación con piridina y anhídrido acético en metanol
(para la detección de amino azúcares). Las muestras fueron entonces per- O- trimetilsililada por tratamiento con Tri-Sil (Pierce) a
80 ° C (0,5 horas). Análisis de GC / MS de los glicósidos de metilo TMS se realizó en un HP 6890 GC interfaz con un 5975b
MSD, usando una columna capilar de sílice fundida All Tech EC-1 (30 m x 0,25 mm ID). El análisis se realizó en el Complejo de
carbohidratos Centro Centro de Investigación (CCRC) de la Universidad de Georgia, Athens, EE.UU..

Extracción de ADN

ADN (80-150 l ng -1) se extrajo a partir de 100 mg de los tejidos de la planta rizosfera utilizando un kit de aislamiento de ADN (Mo Bio

laboratorios, Carlsbad, EE.UU.). El control de la PCR para el aislamiento de ADN microbiano se realizó en genes 16S rRNA. PCR se

realizó usando los cebadores 27F eubacterial (5 0- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 0) y 1492R (5 0- GGTTACCTTGTTACGACTT3 0), y el

producto fue de aproximadamente un fragmento de 1450 pb. La amplificación se llevó a cabo con 1 M de cada cebador en 3

mMMgCl 2, 20! M de cada dNTP, 1,25 unidades de Taq la polimerasa (Promega) en un volumen total de 20 l de tampón de reacción 1X

(Promega, Madison, EE.UU.). Las condiciones de PCR incluían una desnaturalización inicial a 95 ° C durante 3 minutos seguido de

35 ciclos de desnaturalización a 94 ° C durante 1 minuto, hibridación a 56 ° C durante 1 minuto y elongación a 72 ° C durante 1,5

minutos, con una elongación final a 72 C durante 7 minutos. ADN se resolvió usando una ejecución de gel de agarosa a 100 V

durante 30 minutos para el análisis de ADN total y la amplificación de productos de PCR, respectivamente. Los geles se visualizaron

mediante tinción con bromuro de etidio bajo luz UV en un sistema de documentación de gel. Los productos obtenidos se purificaron

con un kit de extracción NucleoSpin Gel (Clontech, Palo Alto, EE.UU.).

la secuenciación de genes 16S rRNA basado en Illumina

16S rRNA gen PCR y secuenciación de la rizosfera de plantas y tejidos se llevaron a cabo utilizando el protocolo Caporaso [ 45 ]. Hemos

ampliado el enfoque Caporaso [ 46 ] A un esquema de código de barras dual para cada muestra y se sustituye los códigos de barras de Golay

con un conjunto diferente de códigos de barras con capacidad para un Illumina que fueron diseñados para equilibrar la composición de bases

y tolerar hasta 4 errores de secuenciación en las secuencias de código de barras. El cebador directo usado fue

AATGATACGGCGACCACCGA GATCTACAC [código de barras] TATGGTAATTGTGTGCCAGCMGCCGCGGTAA, y el cebador inverso fue

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [código de barras] AGTCAGTCAGCCGGACTA CHVGGGTWTCTAAT. Los códigos de barras

utilizados fueron diseñados para permitir la puesta en común de múltiples muestras dentro de una única ejecución MiSeq. Diez ciclos de PCR

con los cebadores con código de barras se realizaron a temperatura de recocido bajo (55 C); muestras se agruparon y se limpian usando una

columna Qiagen para retirar los cebadores no incorporados. En esta etapa, un adicional de 10 o 20 ciclos de PCR se realizaron en la piscina

usando los cebadores del estante FlowCell de gama emparejado Illumina con un mayor

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La fijación de nitrógeno en una variedad local de maíz

temperatura de recocido (65 C). El producto de PCR resultante se sometió a control de calidad con un Bioanalyzer Agilent y la

concentración estimada usando kit KAPA Biosystems qPCR. Las muestras se diluyeron a la concentración de carga apropiada para una

carrera MiSeq, claveteado con la biblioteca de control phix 25%, y se secuenciaron utilizando un instrumento Illumina MiSeq con 150

nucleótidos de extremo emparejado protocolo de secuenciación del fabricante estándar de doble índice y los cebadores de

secuenciación personalizados.

Las secuencias de Illumina se obtuvieron de carreras 2 MiSeq (2x150 pb emparejado-end) y se demultiplexan mediante un
script personalizado ( https://figshare.com/s/04997ae7f7d18b53174a ). los

822.804 lecturas así obtenida fueron recortados a un Phred-equivalente de 20 y se filtra para la contaminación adaptador utilizando

BBDuk (de los paquetes BBTool https://sourceforge.net/projects/bbmap/ ). Debido a la baja calidad del par compañero inversa, se

lee del mate adelante se utilizaron en el análisis. Las lecturas fueron luego procesados ​previamente y se analizaron usando DADA2

[ 47 ]. Se utilizaron parámetros de filtrado estándar prescrito, como verificación de contaminación PhiX y la eliminación de lee con

más de 2 errores o bases ambiguas o con un error esperado se identificaron y se eliminó usando la función removeBimeraDenovo

de DADA2 mayor que 2. Las quimeras. La limpia lecturas fueron luego se derrumbó en variantes de secuencia y se clasificó usando

conjunto de entrenamiento RDP (versión

14). Las variantes de la secuencia que fueron clasificados como cloroplastos o mitocondrias fueron retirados de nuevos análisis. A partir de

las muestras con tamaño de la biblioteca que van desde 84 a 20.597 lecturas (media de

Se identificaron 4.703), 995 variantes de secuencia únicos.

Alfa y Beta métricas de diversidad se generaron usando los paquetes Phyloseq 3.4.2 R [ 48 ]. La diversidad alfa se calculó

utilizando índices de Shannon y Simpson. Además, se utilizó una parcela PCoA basada en matriz de disimilitud Bray-Curtis para

visualizar las diferencias en las muestras. La tabla de variante de secuencia fue utilizado para generar un mapa de calor después

de la transformación de varianza-estabilizador en DESeq2 [ 49 ]. PERMANOVA pruebas se realizaron utilizando el Adonis función de

la

vegano 3.4.3.R paquete ( https://CRAN.R-project.org/package=vegan ) Realizado en la ordenación NMDS.

secuenciación metagenómica

bibliotecas de secuenciación Illumina de las mismas extracciones de ADN como anteriormente se hicieron usando una adaptación

del método de construcción de bibliotecas a base de transposasa Nextera con códigos de barras multiplex. Las muestras fueron

luego secuenciados en los instrumentos MiSeq y HiSeq. secuencias Illumina así obtenido fueron demultiplexado y recortado usando

Trimmomatic (ver 0.33) [ 50 ] Con el siguiente parámetro: Illuminaclip 02:30:10, Headcrop: 15, de ejecución: 20, arrastrando: 20, la

ventana de deslizamiento: 4: 20, andMinlen: 100. El lee entonces fueron seleccionados para PhiX y secuencias de maíz (genómico,

cloroplasto, y mitocondrial) usando Bowtie2 alineador [ 51 ] En contra del genoma PhiX (Genbank acc # NC_001422.1) y Z. mays cultivar

proyecto B73 genoma (RefSeq conjunto acc # GCF_000005005.2). La limpia lee fueron asignados utilizando taxonomía Kaiju [ 52 ]

Con la base de datos nr. Para el cálculo de la diversidad beta de las muestras, se utilizó Phylosift (ver 1.0.1) [ 53 ], Que identifica y

lugares lee a juego 37 genes marcadores filogenéticos conservadas en un árbol de referencia. A partir de estas colocaciones, un

borde PCA-análisis [ 54 ] Se llevó a usando Guppy [ 54 ].

nif Búsqueda de genes

Las secuencias de péptidos del núcleo 6 nif (genes nifH, nifD, Nife, nifK, nifN, NIFB) y nitrogenasa alternativo ( anfG, vnfG) de diazótrofos

conocidos como publicado previamente [ 33 ] Fueron recuperados de GenPept como referencia. alineación Amultiple-secuencia de

estas secuencias se generó como una alineación de referencia utilizando ClustalW2 [ 55 ]. Una explosión de búsqueda (E-valor < 0,001)

de 6 metagenomic frame-traducido lecturas se llevó a cabo en contra de estas secuencias de referencia. Los golpes fueron alineados

en contra de la alineación de múltiples secuencias de referencia utilizando Clustal-Omega [ 56 ]

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La fijación de nitrógeno en una variedad local de maíz

seguido por la generación de árboles filogenéticos para cada individuo nif gen, utilizando Fasttree2.1 [ 57 ] Con un WAGmodel de la

evolución de aminoácidos y la probabilidad gamma20. Las lecturas fueron asignados como pertenecientes a la nif genes si fueran

dentro del clado de las secuencias de referencia. Cada lectura que tenía una importante similitud con uno de los núcleos nif genes se

analizó adicionalmente por análisis filogenético para confirmar su asignación como uno de los núcleos 6 nif genes. Los recuentos de

genes nif así obtenidos se normalizaron por recA recuentos (determinaron utilizando recA TIGRFAM HMM [ 58 ] Con HMMER3 y un

E-valor de corte de correo -10).

Reducción de acetileno Ensayo ARA

Para ARA con el mucílago, se introdujeron 2 ml de mucílago recién recogidos de 1 o 2 raíces aéreas (Sierra mixes) o varias
plantas (teosinte) cultivadas en el campo en 14,5 ml viales (Wheaton, Millville, EE.UU.) que fueron herméticamente cerrados.
Para ARA con bacterias añadidas, A. brasilense, H. seropedicae, y B. unamae fueron cultivadas en medio BSE durante 48 horas.
Entonces, las bacterias se recogieron por centrifugación (5 minutos, 4.000 × sol) y se suspende en el medio Fahraeus. los

14,5 ml viales, conteniendo cada uno 5 ml de mucílago previamente almacenada durante varios meses a -20 ° C para reducir las

bacterias fijadoras de nitrógeno endógenos, se inocularon con la suspensión bacteriana a una DO final 600 nm = 0.01. Los tubos de

control se prepararon ya sea sin bacterias o con 5 ml de medio de Fahraeus en lugar de mucílago. Entonces, 850 l de acetileno

(Airgas) se inyectaron en cada vial. sobredosis 600nm se midió para cada tubo después de 72 horas. Para ambas condiciones, los

controles sin acetileno se realizaron en paralelo. Para ARA con raíces aéreas, 1 raíz aérea sin mucílago se introdujo en cada vial

14,5 ml (10 repeticiones). Se inyectó un ml de acetileno (Airgas) en cada vial. Para ARA con las plantas de semillero, las plántulas

Sierra mixes se inocularon con A. brasilense y se cultivaron durante 3 semanas. Las plantas se transfirieron a continuación a 500 ml

frascos, y se inyectaron 50 ml de acetileno en cada frasco. Para ARA con raíces subterráneas, se recogieron trozos de raíces

(alrededor de 10 cm de longitud) a partir de plantas cultivadas en macetas y introducidos en 14,5 ml viales (3 repeticiones). la

cuantificación de etileno se hizo mediante la inyección de 1 ml de la fase de aire, la muestra después de 72 horas, en una

cromatografía de gases (GC-2010 Shimadzu) equipado con una columna Rt-Alumina ENLACE / KCL (Restek).

Mucílago 15 norte 2 asimilación

El enriquecimiento de mucílago en 15 N atomwas logra mediante la eliminación de 4 ml de gas de espacio de cabeza y su sustitución con 4

ml de cualquiera 15 norte 2 ( Sigma-Aldrich) o 14 norte 2 gas nitrógeno directamente en un vial que contiene 1,0 ml de mucílago. El mucílago se

recogió de las plantas de maíz Sierra mixes cultivadas en Sierra Mixe y se almacenó a 4 ° C durante hasta 2 semanas entre el muestreo y

la determinación de
15 norte 2 asimilación. Las muestras de mucílago se incubaron a 37ºC durante 0 y 70 horas en presencia de 15 norte 2. 15 norte 2 asimilación

se detuvo mediante la congelación de las muestras de mucílago a -20 ° C. Las muestras se liofiliza a continuación y se pesaron. los 15

norte 2 análisis en las muestras de mucílago se realizó en la Instalación de UC Davis isótopos estables (Davis, EE.UU.) y la ciencia

de suelo Facility UW-Madison (Madison, EE.UU.). El análisis estadístico se realizó usando SYSTAT versión 10 (Chicago, EE.UU.).

Medición de la concentración de oxígeno libre

Para la medición en mucílagos recogido, se introdujo 2 ml de mucílago en un tubo de 15 ml. La sonda (robusta Mini oxígeno
sonda, Pyroscience) se introdujo 8 mm de profundidad en las mediciones de mucílago y oxígeno realizados hasta que se
observó la estabilización de la señal. De control corresponde a la concentración de oxígeno libre en el medio Fahraeus
líquido. calibración de un punto se hizo en agua aireada, según lo aconsejado por el fabricante.

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La fijación de nitrógeno en una variedad local de maíz

15 norte 2 experimentos de enriquecimiento de gas

raíces aéreas se recogieron a partir de maíz Sierra Mixe crecido en las instalaciones de invernadero Biotron (Universidad de
Wisconsin, Madison, EE.UU.). El mucílago se generó a partir de cada uno de estos raíces aéreas mediante su incubación en 5 ml
de agua a temperatura ambiente durante 48 horas. El mucílago, junto con las raíces aéreas, se inoculó con A. brasilense Sp7.
Entonces, el 10% -15% (v / v) de 15 norte 2 gas se bombeó en los viales y las muestras se incubaron a 30 ° C durante 48 horas.
Después de la incubación de mucílago solo, o raíces aéreas solamente, feofitina extraído de estas raíces aéreas se sometió a
análisis IRMS. Para obtener feofitina, la clorofila se extrajo de las raíces aéreas y se convierte a feofitina por tratamiento ácido,
tras como se describe [ 59 ]. 14 norte 2- mucílago tratada y raíces aéreas se utilizaron como controles negativos.

15 N abundancia natural

La proporción (%) de nitrógeno derivado de fijación biológica de nitrógeno (% Ndfa) se estimó a partir de la 15 N abundancia
natural (expresada en unidades delta, ‰) del maíz Sierra Mixe ( δ 15 norte planta de fijación) y el de las especies de plantas de referencia ( δ 15
norte árbitro). En cada una de las temporadas de campo de 2011 y 2012 en Sierra Mixe, 90-114 muestras individuales de maíz
(dependiendo del año) y 270 muestras de plantas de referencia, que representan 8-10 especies (dependiendo del año) de plantas
no fijadoras de nitrógeno, fueron analizados. Para el punto de tiempo único en 2010, se analizaron 12 muestras de maíz
individuales y 33 muestras de plantas de referencia, que representan 8 especies de no fijadora de nitrógeno plantas. Las especies
de plantas de referencia en el campo se identificaron utilizando universales fromDNA análisis de 18S de PCR en la muestra
usando la tarjeta FTA Plant Saver (GE Ciencias de la Vida, Pittsburg, EE.UU.) simultáneamente con las muestras de tejido
recogidas para 15 análisis N. PCR se realizaron usando el kit Extract-N-Amp Plant PCR de Sigma de acuerdo con el fabricante para
la secuenciación y la comparación BLASTN. por 15 N abundancia natural, se recogió el tercio hoja más joven de plantas de maíz o
de referencia Sierra mixes de campo 3 y 4 de la segunda a la sexta meses postplanting y se analizó para la composición de
N-isótopo. nitrógeno orgánico total se determinó por digestión Kjeldahl seguida de destilación de vapor. Análisis de naturales 15 N
abundancia se llevó a cabo como se describe por Bremer y van Kessel [ 38 ]. los 15 análisis N se realizó a UCD Facility Isótopos
Estables ( http://stableisotopefacility.ucdavis.edu/13cand15n.html ). El porcentaje de nitrógeno derivado de la fijación de nitrógeno
(% Ndfa) se calculó como sigue:

re 15 norte fixingplant
% Ndfa ¼ re 15 norte referencia X 100;
re 15 norte referencia segundo

dónde " δ 15 N”es isótopos de nitrógeno estable‘ ref’es el valor de la no-N-fijación de plantas de referencia,‘planta de fijación’es
el maíz Sierra Mixe, y‘B’es la 15 N abundancia en el aire, que se supone
0,0 ‰.

15 experimentos de campo N-enriquecimiento

En 2016, se eligieron 3 localidades: Campo 3, la tierra que no había sido sembrada con cultivos de más de 10 años; El campo 4,

tierras que el maíz por 1 año; y el Campo 5, la tierra con maíz continuo. Un ensayo en bloques al azar se estableció en cada sitio,

con 5 repeticiones con 4 variedades. Cada parcela consistió en 6 Matas rodeadas por una frontera común de SM2 en todos los

lados y un borde doble en las filas exteriores. Amata es el diseño tradicional de siembra en la región Sierra Mixe, similar a una

parcela colina en el que múltiples plantas se siembran juntos. Cada mata se sembró con 5 semillas y adelgazado a 3 semillas

durante 18 plantas por parcela. Matas se plantaron en una cuadrícula de 80 x 100 cm unas de otras. 15 Nwas aplica a una dosis de

0,36 gramos por parcela en una solución líquida, llegando el enriquecimiento deseado de 1% para los 3 campos, con 50 ml

añadidos por mata.

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La fijación de nitrógeno en una variedad local de maíz

En 2017, los mismos 3 lugares se plantaron con el mismo diseño y las entradas, excepto el campo 3 consistía sólo en las entradas

H377 y SM2. En los 3 campos, 15 N se aplicó a una dosis de 0,95 gramos por parcela, alcanzando el enriquecimiento deseado de mayor que

1%. Una disolución se extendió uniformemente sobre cada parcela usando una regadera de jardín puede, de manera que toda el área

experimental recibió una cantidad igual de enriquecido 15 Las plantas de N. se cubrieron con bolsas de plástico en el momento de aplicación

(V5) para asegurar que 15 N no se aplicó directamente a las hojas y que la 15 N era uniformemente a disposición de todas las plantas.

Las muestras de suelo fueron tomadas de una profundidad de 0-60 cm en cada parcela, mezclan, y se envían para su
análisis en UC Davis laboratorio del suelo. Las medias se calcularon a través de localizaciones. En 2016, en V9 y V12, 1 mata
(3 plantas) fue muestreada; y en la borla, se tomaron muestras de 4 matas (12 plantas). En 2017, un solo muestreo de 6 matas
(18 plantas) se muestreó en la borla. Para cada toma de muestras, las plantas fueron excavadas para incluir todas las raíces.
Debido a la alta precipitación (2.100 mm concentradas en la temporada de cultivo de junio a octubre), las raíces eran de poca
profundidad para ambas variedades de referencia y de prueba. Cada planta fue fotografiado, y los datos se registran para el
número de plantas, altura de la planta, el peso fresco total de brotes y las raíces y el diámetro del tallo. plantas enteras fueron
picados, molidos, submuestras, y se secaron en un horno para registrar el peso total en seco de los brotes y raíces. 15 N.
nitrógeno total y Atom% 15 N se determinaron para cada trama en cada punto de tiempo para el rodaje. nitrógeno orgánico total
se determinó por digestión Kjeldahl seguida de destilación de vapor. los 15 análisis N se realizó a UCD Facility Isótopos Estables ( http://stable
13cand15n.html ). % Ndfa se calculó utilizando la 15 método N-enriquecimiento [ 40 ] como

% Ndfa ¼ Ð 1 Átomo% 15 norte exceso re norte 2 fijador Þ


Átomo% 15 norte exceso re referencia thth X 100:

Atom% de exceso se calcula con el valor de muestra obtenida de la UC Davis isótopos estables hospitalaria de 0,37 (n en el

aire).

diferencia de nitrógeno (% Ndiff) método se calculó como

% Ndiff ¼ NKG = ha re norte 2 fijador Þ norte kg = ha re referencia Þ X 100:


kgN = ha re referencia Þ

El promedio de Tornado F21 y H377 se utilizó como referencia para calcular el% Ndfa y% Ndiff. Para los cálculos Ndiff,
el área cosechada se ajustó basado en matas cosechadas en cada punto de tiempo.

Los análisis de datos de campo

Los datos se analizaron usando el paquete de R lme4. Los datos fueron verificados para los valores extremos y se sometieron a

ANOVA y significan separación usando mínima diferencia significativa ( p = 0,05) para cada ubicación. LSDs se calcularon sólo cuando

ANOVA F-pruebas fueron significativas a p = 0.05. Para Ndfa% y% Ndiff, contrastes con un solo grado de libertad se calcularon para

comparar variedades de prueba a la media de las variedades de referencia ( P> 0,05). los coeficientes de correlación de Pearson se

calcularon entre% Ndfa y% Ndiff.

Información de soporte
S1 Fig. Parcela casilla que indica la diversidad alfa calculado por Phyloseq usando (A) índice de Simpson y el índice (B)

Shannon.

(EPS)

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La fijación de nitrógeno en una variedad local de maíz

S2 Fig. Distribución taxonómica a nivel de familia de las 25 familias bacterianas más abundantes en las bibliotecas de genes

rRNA (A) y (B) las bibliotecas de escopeta de todo el genoma.

(EPS)

S3 Fig. Mapa de calor que muestra la jerárquica completa vinculación agrupación de las muestras. El mapa de calor
representa la abundancia de 1.000 SVs (A) más abundantes y (B) 20 SVs más abundantes en el conjunto de datos que se
transformaron usando la transformación de varianza-estabilizador en DESeq2. Las bibliotecas son mucílago (azul;
OLMC00, OLMD00, OLMV00, OLMX00), Raíz aérea (gris; OLAR00, OLAR02, OLAR04, OLAR05), Raíz aérea con el
mucílago (rosa; OLAR01, OLAR03), Stem (verde; OLST00, OLST01, OLST02, OLST03), metro Root (Brown; OLUR01,
OLUR02, OLUR03), y la rizosfera (Magenta; OXRZ11, OXRZ12, OXRZ13, OXRZ21, OXRZ22, OXRZ23, OXRZ32,
OXRZ31, OXRZ33). (EPS)

S4. Fig nitrogenasa (reducción de acetileno) la actividad en diferentes órganos de maíz Sierra Mixe.

la actividad de la nitrogenasa significativa sólo se ha encontrado en las raíces aéreas con mucílago. (EPS)

S5 Fig. Desarrollo de la raíz aérea en el teosinte, maíz Sierra Mixe, y una variedad convencional, Hickory Rey cultiva en el

campo inMadison, EE.UU.. ( A) El número de nodos con raíces aéreas y) el número de raíces aéreas observadas en el teosinte,

maíz Sierra Mixe, y Hickory Rey después de 14 semanas (B. Barra = error estándar de la media. Letras diferentes indican grupos

estadísticamente compatibles de acuerdo con la prueba de Kruskal-Wallis. (EPS)

S6 Fig. Efecto de mucílago reconstituido en la difusión de oxígeno y la reducción de acetileno.

(A) de oxígeno medida a 3 profundidades en Fahraeus mediumwith (barras negras) o sin (barras grises) 0,2% de agar. (B) Efecto

de los diferentes azúcares presentes en el mucílago de la capacidad de H. seropedicae, ( DO) A. brasilense, y (D) B. unamae para

reducir acetileno. (EPS)

S7 Fig. Proporción de nitrógeno derivado de N biológica 2 fijación (% Ndfa) en el maíz Sierra Mixe. Las plantas que crecen en Sierra

Mixe durante 2010 (barras de color gris claro), 2011 (barras de color gris oscuro), y 2012 (barras negras) fueron evaluados para Ndfa%;

valores se calcularon utilizando δ 15 N valores en

tabla 1 . Barra = error estándar de la media. % Ndfa, por ciento de nitrógeno derivado de la atmósfera. (EPS)

Tabla S1. δ 15 N (‰) se determinó en el maíz Sierra Mixe, y las plantas de referencia tomaron muestras de tres 10 × 10 m ubicaciones

fueron seleccionados al azar a partir de campos de los agricultores en Sierra Mixe.

De cada ubicación, 6 muestras de hojas se tomaron muestras al azar de las plantas de maíz Sierra mixes y 6 muestras de hojas de cada

una de 2 plantas de referencia. Se tomaron muestras de la tercera hoja emergente de cada planta de maíz. Plantas de referencia fueron

seleccionados de las especies de malas hierbas más abundantes dentro de cada ubicación de la muestra, y a partir de una familia de

plantas (Asteraceae y Ranunculaceae) que no es ni actinorrícicas ni leguminosa ni tiene miembros conocidos de asociarse con bacterias

diazotróficas.

δ 15 N se determinó para cada planta muestreada, y% Ndfa se calculó para el maíz Sierra Mixe acuerdo con la ecuación 2 en
[ 19 ]. Los valores se expresan como media y SE Letras diferentes indican grupos apoyados estadísticamente (ANOVA de
una vía, P < 0,05). % Ndfa, por ciento de nitrógeno derivado de la atmósfera. (DOCX)

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La fijación de nitrógeno en una variedad local de maíz

Tabla S2. δ norte 15 ( ‰) de distribución en muestras de raíces y brotes. Los datos son de un solo fecha de muestreo (mayo de 2012)

en el maíz Sierra Mixe, con 30 réplicas analizadas para cada muestra informaron. (DOCX)

Tabla S3. Plantas de referencia muestreados en los campos 3 y 4 en Sierra Mixe en 2011 y 2012 y se resumen en 2B
Tabla .
(DOCX)

Tabla S4. Disparar y mediciones de la altura de la raíz y de diámetro para ensayos de campo en Sierra Mixe en 2016 y 2017. Los

números seguidos por diferentes letras son significativamente diferentes en función de mínima diferencia significativa en p = 0.05. (DOCX)

Tabla S5. Análisis del suelo por las muestras tomadas a 0-60 cm antes de la siembra de los campos en Sierra Mixe, México. ( A)

macroelementos y características del suelo. (B) Los microelementos para campos en

2017.
(DOCX)

Expresiones de gratitud

Este trabajo está dedicado a la vida y la memoria de Cristóbal Heitmann. energía y de Cristóbal enthusiasmwas un catalizador importante

en la realización de esta investigación. Murió trágicamente mientras que el manuscrito fue objeto de revisión. Agradecemos a Vicente

Vázquez y María del Refugio Vásquez para la asistencia en el desarrollo del programa en México; Carmen Ortega y Saulon Zamora para

la recogida de muestras y la asistencia ensayo de campo; Shawn Kaeppler, Natalia de León, y Jillian Foerster de asistencia sobre el

terreno; Nguyet Dao para microbiana 15 Los ensayos de N-fijación; Harry leyó para su procesamiento

15 norte 2- muestras de enriquecimiento; John Zhang para obtener ayuda con la construcción de la biblioteca; y Armando García-Llanos para

la ayuda en el procesamiento de muestras. Agradecemos al Comisiriado de la Sierra Mixe, México, por su apoyo y el acceso a los

recursos genéticos de la comunidad.

Contribuciones de autor

conceptualización: Allen Van Deynze, Pablo Zamora, Bart C. Weimer, Jonathan A. Eisen,
Howard-Yana Shapiro, Jean-Michel Ane', Alan B. Bennett.

Investigación: Allen Van Deynze, Pablo Zamora, Pierre-Marc Delaux, Cristóbal Heitmann,
Dhileepkumar Jayaraman, Shanmugam Rajasekar, Danielle Graham, Junko Maeda, Donald Gibson, Kevin D.
Schwartz, Alison M. Berry, Srijak Bhatnagar, Guillaume Jospin, Aaron de Darling, Richard Jeannotte, Javier López.

Metodología: Pierre-Marc Delaux, Alison M. Berry, Alan B. Bennett.

Supervisión: Allen Van Deynze, Bart C. Weimer, Jonathan A. Eisen, Howard-Yana Shapiro,
Jean-Michel Ane', Alan B. Bennett.

Escribiendo - proyecto original: Jean-Michel Ane', Alan B. Bennett.

Redacción - revisión y edición: Allen Van Deynze, Pablo Zamora, Bart C. Weimer, Jonathan A.
Eisen, Howard-Yana Shapiro, Jean-Michel Ane', Alan B. Bennett.

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