La tecnología del ADN recombinante comprende una serie de métodos para identificar un gen (o segmentos

concretos de ADN) en un organismo, aislarlo, analizarlo, si es preciso, modificarlo

y reinsertarlo dentro de otro organismo consiguiendo que se exprese con normalidad.
Los objetivos de este conjunto de técnicas son, principalmente:

1. Obtener grandes cantidades del producto del gen.

2. Conocer las consecuencias de una determinada modificación

del gen en el funcionamiento celular.

3. Sustituir un gen defectuoso por otro normal.

Estas técnicas han permitido un avance considerable de la biología y genética molecular, la medicina, la
agricultura y la ecología. En medicina están proporcionando nuevos métodos de diagnóstico, de agentes
terapéuticos y revelando el mecanismo molecular de diversas enfermedades.
FUNDAMENTOS DE LA CLONACIÓN

El conjunto de bacterias que surgen de una bacteria aislada en una placa de cultivo, y que se conoce como colonia,
es, sencillamente, un clon. Clonar es hacer copias idénticas de unos organismos, células, virus o moléculas de
ADN derivadas de la replicación de un único progenitor genético. Mediante la clonación
se puede disponer de cantidades suficientes de un único tipo de células.
La clonación de un gen o un fragmento de ADN implica la separación del resto del genoma, la unión a una
molécula portadora y la inserción en un organismo para poder amplificarlo
muchas veces. Con este procedimiento se pueden obtener miles e incluso millones de copias del gen o fragmento
de ADN inicial.
La clonación requiere básicamente las siguientes etapas:
1. Corte del ADN genómico por sitios específicos y obtención
de los fragmentos de ADN.

2. Elección de moléculas de ADN (vectores) capaces de

autorreplicarse y corte específico de las mismas.

3. Unión de los fragmentos de ADN a las moléculas autorreplicativas

(recombinación).

4. Introducción de ambas en una célula huésped.

5. Selección e identificación de células huésped que contienen

el ADN recombinante.
El corte del genoma para obtener fragmentos de ADN se realiza mediante enzimas de restricción o endonucleasas
de restricción. Estas sustancias reconocen secuencias específicas de ADN de doble cadena y cortan ambas en
lugares específicos. Las secuencias reconocidas son palindrómicas, esto es, poseen simetría rotacional respecto a
un eje. Los cortes son de dos tipos: uno en que se cortan las cadenas simétricamente respecto a un eje y otro en
que se cortan en el mismo punto. El primero deja extremos cohesivos o adhesivos y el segundo extremos romos
Se han caracterizado y purificado cientos de enzimas a la que se denomina por una abreviatura correspondiente a
la especie
bacteriana de la que derivan. Así, Bam de Bacillus amgloliquefaciens,
Eco de Escherichia coli, Hal del Haemophilus
aegyptius, etc. Los fragmentos de ADN resultantes dependiendo del tamaño, se pueden separar por electroforesis
en geles de poliacrilamida o agarosa; los geles de poliacrilamida separan fragmentos de unos mil pares de bases
y los de agarosa de 15.000 a 20.000 pares de bases. Los fragmentos se separan en bandas que se pueden visualizar
añadiendo a la disolución de los geles colorantes como bromuro de etidio, que a la luz ultravioleta
presenta una intensa fluorescencia de color naranja. La longitud o tamaño de los fragmentos de ADN se puede
conocer mediante la comparación de las bandas con fragmentos patrones de longitud conocida (marcadores). Cada
fragmento de ADN se puede purificar cortando la banda correspondiente del gel, eliminando la matriz del gel y
el colorante. Para identificar en cuál de las bandas se encuentra el gen o
la secuencia de ADN de nuestro interés se suele realizar una hibridación.
Esta técnica consiste en desnaturalizar los fragmentos de ADN que aparecen en el gel después de la eletroforesis
y transferirlos a membranas de nitrocelulosa o nylon. Las posiciones de los fragmentos en el gel se mantienen en
la membrana. Después la membrana se introduce en una disolución que
contiene una sonda radiactiva marcada con 32P Posteriormente se observa por autorradiografía el fragmento o
fragmentos de restricción que posean una secuencia complementaria a la sonda y que, por consiguiente, haya
hibridado con ella. Esta técnica se denomina trasferencia Southern (Sout- hern blotting) en honor a su diseñador
E. M. Southern. De forma similar se pueden separar moléculas de ARN por electroforesis
en gel e identificar secuencias concretas por hibridación. En este caso se denomina transferencia Northern.
También se
puede aplicar esta técnica para detectar una proteína determinada uniéndola a un anticuerpo específico y entonces
se denomina transferencia Western. Resumiendo, las técnicas Southern, Northern y Western se corresponden
respectivamente con las transferencias de ADN, ARN y proteína.
Preguntas

¿Que es clonar?

Clonar es hacer copias idénticas de unos organismos, células, virus o moléculas de ADN derivadas de la
replicación de un único progenitor genético