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EL CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

El cultivo de tejidos vegetales se define como un conjunto muy heterogéneo de


técnicas que presentan en común el hecho de que un explanto —o sea, una parte
separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos— se
cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se
incuba en condiciones ambientales controladas. Cada fragmento origina una
planta idéntica a la que se le tomó el fragmento, aunque puede ser modificada
genéticamente para tener variedades artificiales.
Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como herramientas
para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virusy
enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos,
cultivo de embriones, producción de fitoquímicos, ingeniería genética, mutación y
selección celular, producción de semillas sintéticas y estudios básicos de
anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal.

Iniciación
El cultivo de tejidos se inicia con la disección microscópica de la planta bajo
condiciones estrictamente higiénicas, con el propósito de transferir un tejido que
crece activamente (los tejidos meristemáticos) con seguridad y limpieza, dentro de
un recipiente estéril sin introducir microorganismos contaminantes. Las células y
tejidos que crecerán y se desarrollarán a partir del explanto original dependen de
los objetivos del cultivo de tejidos. En algunos casos las células conformarán una
masa aparentemente desorganizada, conocida como callo, en otros estarán
presentes otras estructuras reconocibles como tallos, raíces, bulbos u otros
órganos. Estos tejidos cultivados in vitro se hallan dentro de un
microcosmos estéril de un recipiente de vidrio o de plástico, protegidos del medio
exterior no estéril. Es esencial mantener la esterilidad del medio ambiente
confinado en el recipiente, debido a que cualquier microorganismo, que pueda
entrar al mismo, crecerá de forma oportunista a una velocidad mucho más rápida
que los tejidos vegetales y eventualmente colonizarán y matarán a los tejidos.
Con el propósito de sostener el vigor de los tejidos vegetales y permitir que ellos
crezcan, se multipliquen y desarrollen, esto es «cultivar los tejidos», deben
proveerse además ciertos requerimientos externos: los tejidos pueden necesitar
que se los apoye o sean colocados sobre o en el interior de la superficie de
un gel acuoso solidificado con agar o pueden colocarse en un medio líquido.
Algunos tejidos cultivados son lentos en su crecimiento. Para ellos habría dos
opciones: (i) la optimización del medio de cultivo, (ii) El cultivo sano y creciendo
vigorosamente tejidos o variedades. Necrosis podría estropear los tejidos
cultivados. Generalmente, plantas variedades son diferentes en cultivo de tejidos
de necrosis. De este modo, mediante el cultivo de forma saludable y creciendo
vigorosamente variedades (o tejidos) se puede controlar.
Los tejidos también necesitarán de un suministro de los
elementos minerales nutritivos que son esenciales para el crecimiento vegetal,
también posiblemente algunas vitaminas, azúcares como fuente de energía y una
mezcla de hormonas vegetales que se conoce que controlan el crecimiento y
desarrollo de estos tejidos particulares.
Para el correcto crecimiento y desarrollo del tejido en cultivo, en general, es
necesario el suministro de luz a intensidades muy bajas, mucho menores que la
de la luz solar. La acumulación en las plantas de la energía de
los carbohidratos provendrá de los azúcares agregados al medio de cultivo, más
que de la fotosíntesis, de manera que son innecesarios altos niveles de luz.
Sistemas para los cultivos
En las últimas décadas se han desarrollado diferentes sistemas para los cultivos
de protoplastos, células, tejidos y órganos vegetales; uno de ellos es el cultivo en
suspensión (suspensiones celulares), el cual constituye una forma para mantener
y propagar células vegetales.
Descripción y manipulación de las suspensiones celulares
Las suspensiones celulares consisten en células libres y agregados celulares
distribuidos en un medio en movimiento. Estas suspensiones pueden ser
permanentes mediante el suministro continuo de nutrimentos.
Medios de cultivo
Para el cultivo de suspensiones celulares de una gran variedad de plantas se ha
utilizado el medio MS desarrollado por Murashige y Skoog (1962) para el cultivo
de tejidos de tabaco, como también el medio B-5 de Gamborg et al. (1968).
También se han utilizado otros medios, pero su composición no difiere mucho de
los citados.
A menudo, los medios óptimos para la inducción y crecimiento de callos a partir de
explantes primarios no son los mismos que para el establecimiento de
suspensiones celulares; el nivel óptimo de auxinas y citocininas, p.ej. puede ser
diferente .
En ocasiones las células en suspensión necesitan de suplementos
orgánicos, aminoácidos, CH, extracto de levadura, y AC; la auxina más utilizada es
2,4-D.
Iniciación de las suspensiones
Las suspensiones celulares se inician generalmente mediante la incubación de
trozos de callos friables en medios líquidos que, están en movimiento continuo.
Comúnmente se emplean matraces Erlenmeyer, en los cuales se deposita el
medio líquido con los trozos de callo dispersos en él, hasta llenar
aproximadamente 1/5 de la capacidad de estos frascos; estos se ponen luego a
incubar en un agitador giratorio a 80-150 rpm, bajo luz continua y a 25 °C de
temperatura. Mediante subcultivos semanales, las suspensiones celulares quedan
establecidas después de varios días.
Durante los primeros subcultivos es recomendable usar una tasa de dilución baja
(por ej. 1:1 a 1:4) utilizando cuatro partes de medio fresco por cada parte de
suspensión celular. Posteriormente se puede utilizar una tasa de dilución más alta,
según el objetivo para el cual se haya establecido la suspensión.

Objetivos
El cultivo de tejidos vegetales es utilizado como herramienta fundamental en un
número importante de áreas y técnicas de la investigación y la producción vegetal,
todas ellas relacionadas con lo que actualmente se conoce como biotecnología
vegetal.
A continuación se enumeran algunas de las más importantes:

 Estudios básicos de anatomía, desarrollo y nutrición vegetal.

 Variación somaclonal y gametoclonal a través de selección celular.

 Aislamiento de protoplastos. Utilizado para realizar fusión celular


(hibridación somática) e ingeniería genética .

 Producción de plantas haploides a través de cultivo de anteras o cultivo de


polen.

 Rescate de óvulos fecundados y embriones de cruzamientos


interespecíficos e intergenéricos

 Ingeniería Genética: incluye todas las técnicas que utilizan organismos


vivos o sus componentes para producir o modificar sus productos. La variedad
de aplicaciones incluye las áreas de energía, manejo medio ambiental y
productos farmacéuticos y agrícolas.

 Micropropagación vegetal. Propagación clonal o propagación in vitro o


propagación vegetativa.

 Embriogénesis somática.

 Cultivo de meristemos para la eliminación de virus y enfermedades


presentes en las plantas.

 Producción de fitoquímicos o producción de sustancias de metabolismo


secundario.
Base biológica
La reproducción asexual de plantas por cultivo de tejidos es posible gracias a que,
en general, las células de una planta poseen la capacidad necesaria para permitir
el crecimiento y el desarrollo de un nuevo individuo, sin que medie ningún tipo de
fusión de células sexuales o gametos. Esta capacidad se
denomina totipotencialidad celular y es característica de un grupo de células
vegetales conocidas como células meristemáticas, presentes en distintos órganos
de la planta. La potencialidad de una célula diferenciada (una célula de
conducción, epidérmica) para generar tejidos nuevos y eventualmente un
organismo completo, disminuye con el grado de diferenciación alcanzado por esa
célula, pero puede revertirse parcial o completamente según las condiciones de
cultivo a las que se la someta. 5
El éxito en la propagación de una planta depende de que se logre la expresión de
la potencialidad celular, es decir, de que algunas células recuperen su condición
meristemática. Para ello debe inducirse primero la desdiferenciación y luego la
rediferenciación celular.
En condiciones naturales, un proceeso de este carácter sucede durante la
formación de las raíces adventicias en el enraizamiento de estacas, la formación
de yemas adventicias o cuando se busca la propagación de cualquier planta.
Entre los factores más importantes para lograr la respuesta morfogenética
deseada se encuentra la composición del medio de cultivo. En todo intentoo de
propagación vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el carácter del processo de
diferenciación está regulado por el balance hormonal propio y por el estado
fisiológico del órgano, tejido o célula puesta en cultivo. Sin embargo, ese balance
puede ser modificado por el agregado de compuestos que imiten la acción de
las hormonas vegetales. Esos compuestos, denominados reguladores del
crecimiento, son los que se emplean en los medios de cultivo para conseguir la
micropropagación de una planta.
Historia
La totipotencialidad celular fue enunciada como teoría por Gottlieb Haberlandt en
1902, quien propuso que todas las células vegetales tienen la capacidad de
regenerar plantas completas. Haberlandt no llegó a demostrar su hipótesis debido
a que no pudo lograr la división celular ya que los medios de cultivo que empleaba
no incluían reguladores del crecimiento debido a que esos compuestos eran
desconocidos en ese momento. En 1934, Philip White pudo mantener, en forma
ilimitada, el crecimiento de raíces en medios líquidos a partir de ápices del tallo
del tomate.
Al mismo tiempo se identificó el ácido indolacético (AIA), que posibilitó el
mantenimiento indefinido de callos de zanahoria y tabaco in vitro. Posteriormente
se descubrió el efecto de la leche de coco como estimulante de la formación de
callo sobre el cultivo de embriones de Datura stramonium. En 1948 Folke
Skoog y Cheng Tsui, trabajando con cultivos de callo de tabaco, demostraron la
existencia de una regulación química en la parte aérea y en la raíz. Trabajos
posteriores en callos de la misma especie, con el agregado de cinetina, la primera
citocinina descubierta, permitieron demostrar que la diferenciación de brotes,
raíces o de ambos, estaba regulada por el balance de auxinas y citocininas.

Etapas del proceso


El cultivo de tejidos vegetales es el proceso que se inicia con un explanto y
termina con la obtención de plantas completas, lo que involucra una serie de
etapas, las cuales se enumeran a continuación:

 Elección de la planta y/o tejido donante de explantos. En esta fase se


incluyen los tratamientos, preparación y selección de las plantas madre a partir
de las cuales se inicia el cultivo, siendo imprescindible comprobar la identidad
(especie, variedad o cultivar) y su estado de salubridad (libre de patógenos,
deficiencias o estrés).

 Establecimiento: consiste en la desinfección de los explantos (generalmente


con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial para
inducir: tallo, brote, raíz o embrión somático, según se desee. Se requiere
desinfectar superficialmente el material escogido para evitar que en el medio
de cultivo crezcan microorganismos, principalmente bacterias y hongos, que
competirán ventajosamente con el explanto

 Multiplicación: consiste en generar una cantidad de masa vegetal suficiente


para la regeneración del número de plantas necesarias.
 Enraizamiento: es el proceso de inducción de la formación de raíces con el
fin de convertir a los brotes o embriones somáticos en plántulas completas. El
enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. En
el primer caso se transfieren los brotes obtenidos en la etapa anterior a un
medio libre de reguladores de crecimiento o que sólo contenga auxinas. Esta
operación se realiza en condiciones de esterilidad (en cabina de flujo). En el
segundo caso los brotes se sumergen en una soluciónconcentrada de auxinas
y se transfieren a un sustrato limpio, no necesariamente estéril, que puede ser
una mezcla de turba con perlita o vermiculita. Los brotes que se utilicen en el
enraizamiento ex vitro deben ser vigorosos y poseer hojas bien desarrolladas,
ya que las plantas deben realizar la fotosíntesis para obtener la energía
necesaria para desarrollarse y formar las raíces.
 Rusticación: es el paso de aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a
las condiciones del ambiente usuales fuera del tubo o frasco, es decir al suelo
o algún sustrato inerte
 El enraizamiento ex vitro
permite que la fase de
enraizamiento y la fase de
aclimatación se logren
simultáneamente y que
raramente se forme callo en
la base de los explantos,
asegurando así una conexión
vascular continua entre el
vástago y la raíz.

Tipos de morfogénesis
En condiciones de cultivo in vitro, las células somáticas pueden regenerar
embriones o bien, brotes, raíces y/o flores. La embriogénesis somática y la
organogénesis son dos procesos morfogénicos muy frecuentes en el cultivo in
vitro de especies vegetales.
La embriogénesis somática es el proceso por el cual se obtiene una estructura
similar a un embrión cigótico sin que medie la fertilización de las gametas,
mientras que por organogénesis pueden obtenerse tallos, raíces o flores.
Estos órganos se obtienen a partir de una célula o de un grupo de células a través
de un complejo proceso denominado regeneración. La regeneración comprende
diferentes fases que se suceden de manera similar tanto para la organogénesis
como para la embriogénesis somática.
Estas fases se denominan: adquisición de la competencia, fase de inducción y
fase de realización. En la primera fase, las células no responden al estímulo
organogénico pero adquieren esa competencia durante una fase de
desdiferenciación. En la segunda fase o fase de inducción, las células son
receptivas al estímulo morfogénico y hay una relación directa con el tipo,
concentración y combinación de reguladores del crecimiento agregados al medio
de cultivo y el órgano a desarrollar. En la fase de realización, la célula sufre las
sucesivas divisiones para formar el órgano determinado.
A partir de la siembra in vitro de diferentes explantos relativamente grandes y en
condiciones de cultivo adecuadas, puede inducirse la formación de nuevos
órganos de manera directa, sin la formación de callo.
Si la formación es de brotes, raíces o flores se denomina organogénesis directa. Si
en cambio, se induce la formación de embriones somáticos, este proceso se
denominará embriogénesis directa. Si por el contrario, a partir de la siembra de un
explante in vitro se observa la proliferación de células en forma desordenada y sin
ninguna función predeterminada, se iniciará la producción de callos o
suspensiones celulares. La diferenciación de órganos a partir de callos,
denominada morfogénesis indirecta, estará condicionada a la previa formación de
los meristemoides.