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Sistemática serológica

La Sistemática serológica es la disciplina dentro de la Biología Sistemática que se vale de los


métodos serológicos para la determinación de parentescos entre taxones de organismos.
La sistemática serológica se desarrolló en los principios de 1900, luego del descubrimiento de las reacciones
serológicas y el advenimiento de la disciplina de la inmunología (Fairbrothers et al. 1975, Fairbrothers 1983).
El método consiste en extraer las proteínas de una especie en particular, y utilizarlas como antígenos
inyectándolas en conejos para que produzcan anticuerpos. Luego se extraen los anticuerpos de los conejos y
se mezclan con proteínas provenientes de otras especies en experimentos de reacción antígeno-anticuerpo.
Cuando la reacción es fuerte, las proteínas de la segunda especie son muy similares a las proteínas de la
primera especie, por lo que se deduce que las especies están altamente emparentadas. Cuando la reacción
es débil, las proteínas de la segunda especie son poco similares a las de la primera especie, por lo que se
deduce que las especies están lejanamente emparentadas.
Este método fue muy utilizado en Sistemática de plantas. En este caso, las proteínas utilizadas como
antígenos pueden ser desde extractos crudos de semillas o granos de polen, hasta extractos de una sola
proteína pura extraídos con métodos más elaborados.
Como ejemplo de las relaciones filogenéticas esclarecidas por este método, se puede citar en plantas, la
ubicación de Hydrastis en las ranunculáceas (y no las berberidáceas), la ubicación de Mahonia dentro
de Berberis (Berberidaceae), la existencia de un parentesco cercano entre Typha y Sparganium (Typhaceae),
y la remoción de Nelumbo(Nelumbonaceae) de las ninfáceas (Fairbrothers et al. 1975, Fairbrothers 1983)
Cita:
Fairbrothers, D. E. 1983. "Evidence from nucleic acid and protein chemistry, in particular
serology:" Nordic J. Bot. 3: 35-41

las técnicas de inmunodiagnóstico son eficientes en gran escala, tienen ciertas limitantes como las
bajas concentraciones de virus que reducen la efectividad, los altos niveles de compuestos
fenólicos, látex, algunos inhibidores en el tejido de las plantas, y la especificidad de los antisueros
necesarios para cada virus. Los avances recientes en biología molecular basados en la amplificación
de secuencias conocidas de DNA, mediante PCR son de gran ayuda en la detección rápida y
sensible de virus (Chavi et al., 1997);

Técnicas serológicas o inmunoquímicas

La reacción antígeno-anticuerpo es la base del inmunodiagnóstico. En la fitopatología, estas


técnicas ofrecen considerables posibilidades y ventajas para diagnosticar la causa de una
enfermedad, así como identificar y caracterizar los fitopatógenos. Para ello se realiza la detección
de antígenos, estructurales o no, presentes en estos patógenos.

Se han desarrollado diversos métodos sobre la base de las características de la reacción inmune y
las propiedades físico-químicas de los antígenos y anticuerpos, con la finalidad de detectar la
presencia de los patógenos. Actualmente, muchas de las técnicas más específicas, sensibles,
sencillas y económicas para analizar un gran número de muestras de forma rápida y rutinaria, se
basan en el uso de técnicas serológicas con anticuerpos específicos.

Técnica inmunoenzimática ELISA

Los métodos serológicos que emplean enzimas como marcadores se conocen como ensayos
inmunoenzimáticos. El ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) forma parte de estos
procedimientos. Esta técnica consiste en la inmovilización en una fase sólida, del antígeno o el
anticuerpo, sobre el cual se adicionan, de forma secuencial y previo lavado para eliminar los
elementos deficientemente fijados o no fijados, los demás componentes de la reacción. La
presencia de la reacción antígeno-anticuerpo se revela mediante la adición del sustrato específico
de la enzima y la consiguiente formación de productos coloreados, que permiten la evaluación de
los resultados de forma visual, cualitativamente, o mediante la lectura de la absorbancia en un
espectrofotómetro denominado lector de placas ELISA.
Introducción

Objetivos

CAPITULO II

Revisión bibliográfica.

1.1. Serología:
1.1.1. HISTORIA:
1.1.2. CONCEPTO:
1.1.2.1. ANTIGENO-ANTICUERPO
1.1.2.2. producción ANTICUERPOS: producción
1.1.3. TECNICAS SEROLOGICAS:

Los diferentes test serológicos aprovechan una serie de fenómenos fisiológicos


como son el sistema de complemento, las reacciones entre anticuerpo y antígeno,
la precipitación y la aglutinación. Los sistemas más importantes aprovechados
para estas pruebas son:

a) El sistema de complemento
El sistema o la cascada de complemento consiste en veinte proteínas séricas
algunas de ellas termolabiles. La formación de un complejo de antígeno y
anticuerpo activa este sistema de proteínas que interaciona de forma secuencial.
Su activación resulta en una reacción con las membranas de células que puede
causar bien su activación, la alteración de su estructura o su destrucción.
Eritrocitos sobre la superficie de los cuales se han fijado anticuerpos son
destruidos mediante lisis por el sistema de complemento.
Una de las pruebas conocidas de serología aprovecha esta acción litica del
complemento. La técnica utiliza cantidades conocidas de complemento para medir
la cantidad de anticuerpos presentes en una muestra. Para no medir
concentraciones erróneas los factores de complemento próprios de la muestra,
todos ellos termolabiles, se desactivan mediante calentamiento a 56ºC durante 30
minutos previamente a la realización de la prueba. (BLANCO, SF).

b) La reacción de anticuerpos con el antígeno


La reacción entre anticuerpos y antígeno es muy específica, y por esta razón
constituye un instrumento muy valioso para mediante un componente conocido
(antígeno) identificar la presencia de uno desconocido con un alto nivel de
seguridad.
La aplicación de estos recursos es muy amplia, sobre todo en el diagnóstico y en
la monitorización de enfermedades infectocontagiosas. La reacción de un antígeno
con anticuerpos resulta en la formación de complejos inmunes de diferentes tipos
(precipitantes, etc.). Dependiendo del antígeno y el sistema de prueba utilizada se
pueden obtener y medir diferentes tipos de estos complejos. En general, en las
pruebas de serología se emplea una cantidad conocida de antígeno y se diluye el
suero que se investiga de forma seriada. Se mide la concentración del suero que
aún inhibe (mediante complejos anticuerpo antígeno) una acción concreta del
antígeno, o la que aún forma complejos que provocan una reacción demostrable.
Esta concentración del suero es expresado como el título de anticuerpos del
suero. (BLANCO, SF).

1.1.4. PRUEBAS SEROLOGICAS:

El uso de inmunoensayos en la detección de patógenos de plantas ha sido


rutinario en los últimos años, especialmente en virus (Clark, 1981 y Millar, 1988).
En el momento de realizar pruebas diagnósticas de enfermedades
infectocontagiosas hay dos posibles vías principales: pruebas directas
encaminadas a la detección del agente etiológico o de parte de su ADN en el
animal afectado, o pruebas indirectas que demuestran que el sistema inmune del
individuo afectado ha estado en contacto con el agente en cuestión. Cualquiera de
los tipos de prueba aporta una información diferente y las pruebas aplicables
varían en específidad y sensibilidad. En lo presente nos centramos principalmente
en las pruebas que permiten la detección de anticuerpos aunque algunas técnicas
son parecidas para la detección de anticuerpos y antígeno. (BLANCO, SF).

1- Precipitación/
Pueden ser en medios líquidos o en geles. Estos métodos han demostrado tener
una notable eficacia para individualizar y purificar los antígenos dotados de
diferencias particulares. La unión del Ag y Ac se traduce por la formación de un
precipitado insoluble con la condición que los reactivos se encuentren a con-
centración equivalente.

La adición de un antígeno soluble a una solución con anticuerpos homólogos


resulta en la formación de complejos inmunes que precipitan de la solución.
Cuando se aumenta la cantidad de antígeno que se añade se forman cantidades
variables de complejos y con esto de precipitado, obteniendo la mayor cantidad de
complejos cuando la proporción de antígeno y anticuerpo en la solución es
equivalente o óptimo. Esto se aprovecha en los test serológicos de
inmunoprecipitación como por ejemplo para la identificación de diferentes
estreptococos. (BLANCO, SF).
2- Inmuno difusión
Cuando esta técnica se utiliza en un medio semisolido como los geles de agar en
los cuales los dos componentes el antígeno y el anticuerpo migran a través del
agar hasta que se encuentren y precipitan en el lugar donde su proporción es
óptima, se trata de inmunodifusión. Este método permite identificar anticuerpos y
antígenos desconocidos y comparar antígenos parecidos entre sí (método de
Ouchterloney).
También permite cuantificar el antígeno presente en una solución determinada.
Para ello se pueden obtener resultados más exactos mediante inmunodifusión
radial (el antígeno se encuentra en pequeñas indentaciones y difunde por un gel
que contiene una concentración conocida de antisuero, de modo que diámetro del
anillo de precipitación que se forma es proporcional a la cantidad de antígeno.
(BLANCO, SF).
3- Inmunoelectroforesis
En líquidos que contienen mezclas de antígeno se puede aplicar primero una
electroforésis para separar los antígenos presentes y luego la inmunodifusión para
su identificación. (BLANCO, SF).
4- Aglutinación
Consiste en hacer reaccionar cantidades equivalentes de los reactantes (Ag y Ac).
La formación de gránulos aglutinados o agregados indican una reacción positiva.
Las reacciones de aglutinación son menos específicas pues tienen la desventaja
de depender grandemente de los factores físico químicos, tales como,
concentración de electrolitos, pH, temperatura y el tiempo.

Anticuerpos pueden reaccionar con un antígeno determinado y luego interconectar


entre ellos o diferentes componentes antígenos presentes por ejemplo en la
superficie de una bacteria. Este proceso resulta en la aglutinación que es visible
macroscopicamente y es un instrumento útil en la identificación de bacterias,
hongos e incluso protozoos medinte antisueros especificos. Del mismo modo
utilizando un antígeno purificado específico se puede demostrar la presencia de
anticuerpos frente a este antígeno en una muestra. Ambos métodos se realizan
con frecuencia de forma directa en un porta y estan conocidos como Aglutinación
en porta. Ejemplos son la aglutinación en porta para la detección rápida de
anticuerpos frente a diferentes Mycoplasma spp. o Salmonella spp. Así como el
test de rosa bengala para la detección de anticuerpos frente a Brucella abortus.
Para determinar anticuerpos frente a Leptospira spp. se utilizan cultivos vivos de
Leptospira en una aglutinación en porta bajo el miscroscopio en campo obscuro.
Para cuantificar anticuerpos mediante aglutinación se puede utilizar el test de
aglutinación en tubo, diluyendo el antisuero en pasos de dos en dos (a veces dificíl
de interpretar y requeriendo muestras seriadas). En el caso de antígenos que se
pueden fijar sobre glóbulos rojos (de forma pasiva o mediante tratamiento
químico), por ejemplo de ovejas, la hemaglutinación en placas de
microtitración se puede utilizar para cuantificar anticuerpos (la mínima
concentración que aún aglutina los glóbulos rojos). (BLANCO, SF).
5- Fijación de complemento (CFT)
El test de fijación de complemente utiliza el hecho de que complejos de anticuerpo
y antígeno activan el sistema de complemento que, entre otras actuaciones, causa
la lisis de eritrocitos que muestran antígeno. la prueba se desarolla en dos pasos:
Tras la inactivación de los sueros (para eliminar la actuación del complemento
proprio del suero), en una placa de microtitración (pozos en V) se añade antígeno
y una cantidad conocida de complemento (de cobaya). Tras 30 minutos de
incubación se añaden eritrocitos de oveja (sensibilizados mediante suero de
conejo con hemolysina) y se incuba otra media hora. En los sueros que contenían
anticuerpos, se han formado complejos que se han ligado al complemento y han
evitado la destrucción de los eritrocitos mientras que en las muestras en las que
no hay anticuerpos se lisan los glóbulos rojos. Por ejemplo para detección de
anticuerpos frente a Chlamydia psittaci (mamíferos). (BLANCO, SF).
6- Hemaglutinación e inhibición de la misma (HA y HAI)
Algunos virus, especialmente los Paramixovirus aviares o los virus de influenza,
pueden adherirse a la superficie de los glóbulos rojos y aglutinarlos. Esto, y el
hecho que la presencia de anticuerpos inhibe esta aglutinación es utilizado en una
técnica serológica que se aplica con frecuencia. Primero se suele probar la
actividad aglutinante del virus que se va a utilizar como antígeno y determinarse
su concentración en cuatro unidades hemaglutinantes. El análisis también discurre
en dos pasos: Los sueros a analizar se diluyen en dos por dos en una placa de
microtitración, y se añade el antígeno en una concentración de 4 unidades
aglutinantes. Tras 30 minutos de incubación se añaden eritrocitos lavados y se
incuba otros 30 minutos y luego se determina el título de inhibición de
hemaglutinación de los sueros analizados. (BLANCO, SF).
7- Tecnica inmunoenzimatica (ELISA)
Técnica inmunoenzimática ELISA: El ensayo se basa en la interacción específica
de un antígeno (patógeno) y un anticuerpo (proteínas inmuno-globulinas
producidas en un vertebrado superior, usualmente conejos). La reacción se
visualiza a través de la acción de un conjugado enzima-anticuerpo sobre un
sustrato. Es un método rápido de gran sensibilidad, especificidad y bajo costo, que
supera a muchas técnicas de diagnóstico empleadas con anterioridad. Existen
diferentes variantes de la técnica de ELISA, todas basadas en el mismo principio.
El tipo de técnica y anticuerpo a emplear dependerá del objetivo de la aplicación
(campo, laboratorio), tipo de muestra (suelo, agua tejido) y nivel de sensibilidad y
rapidez requerida. La técnica ELISA con sandwich de doble anticuerpo es una de
las más empleadas, en este caso el antígeno es ubicado entre dos anticuerpos
específicos, el de captura y el de marcaje, este último está conjugado a una
enzima y puede cuantificarse en el espectrofotómetro. Esta técnica es de gran
utilidad en la detección de patógenos de mezclas complejas, tales como, suelo,
extractos de plantas.
Las técnicas de inmunodetección han sido usadas en la detección de
microorganismos fitopatógenos, principalmente virus y bacterias y en menor
escala para hongos. Una aplicación importante se ha encontrado en los estudios
de taxonomía de microorganismos, la fisiología de la enfermedad y la ecología de
los patógenos. Con el empleo de estas técnicas se pueden establecer estrategias
de manejo de patógenos, como la certificación de semillas o fijación de
cuarentenas.
Las técnicas serológicas ELISA- Inmunofluorescencia además de ser métodos
muy confiables y sensibilidad moderada tiene la ventaja de poder asimilar gran
cantidad de muestras en algunas horas y los resultados positivos y sospechosos
se confirman mediante la prueba de patogenicidad (González, 1999).

El descubrimiento de que una serie de enzimas como por ejemplo la fosfatasa


alcalina se podían ligar a anticuerpos sin perder su actividad ni interferir con la
acción de los anticuerpos llevo al desarrollo de un gran grupo creciente de
pruebas diagnósticas que aprovechan la posibilidad de detectar los anticuerpos
mediante la actividad de la enzima ligada. Los llamados Enzyme-
linkedimmunosorbent assays (ELISA) son seguros y faciles de utilizar y permiten
tanto la determinación y cuantificación de anticuerpos (ELISA indirecto,
competitivo, o blocking) como de antígeno (ELISA directo o Sandwich) y por eso
tienen una amplia aplicación en el diagnóstico tanto de enfermedades viricas y
bacterianas como las causadas por hongos o parásitos.
El ELISA indirecto para la detección de anticuerpos utiliza antígeno adherido a
membranas o recipientes de poliestireno, al que se adiciona el suero a analizar y
sueros de control. Tras una incubación y el lavado para eliminar los anticuerpos
sobrantes se añade un suero anti-inmunoglobulina conyugado con una encima y
se incuba y lava de nuevo. Añadiendo ahora un substrato para la encima que esta
transforma causando una reacción de color que se puede determinar visualmente
o mediante un espectrofotometro. El problema de esta prueba es la necesidad de
una antiinmunoglobulina que sobre todo en aves es un impedimiento porque no
hay reacciones cruzadas entre las inmunoglobulinas de especies diferentes y las
inmunoglobulinas comerciales existentes solo pertenecen a muy pocas especies.
Un intento de obviar esta necesidad son los ELISAS bloqueantes (blocking
ELISA).
Para la detección de antígeno se utiliza una versión directa del ELISA o el método
de sandwich y se puede aplicar tanto en suero como en otras secreciones. Este
test utiliza anticuerpos específicos fijados en placas de poliestireno y que capturan
el antígeno al adicionar el suero. Tras incubación y un lavado se adiciona otor
anticuerpo especifico ligado una encima que al igual que con el método indirecto
luego transforma un substrato produciendose una reacción de color que se puede
leer luego. (BLANCO, SF).
8- Radioimmunoassay (RIA)
Este sistema utiliza una metodología similar a la del ELISA o de la
inmunofluorescencia, pero aplicando moleculas marcados con radioisotopos. Esto
hace el test extremadamente sensitivo y permite detectar cantidades mínimas de
antígeno o anticuerpos. (BLANCO, SF).
9- Inmunofluorescencia
Técnica de Inmunofluorescencia: Esta técnica se basa en la conjugación de
anticuerpos específicos con moléculas teñidas con productos, ejemplo, la
fluoresceína, que produce un color verde amarillento. Es muy sensible para
identificar bacterias fitopatógenas y útil para analizar un gran número de muestras.
La técnica de inmunofluorescencia permite identificar un antígeno con la ayuda de
un inmunosuero conocido, e investigar y titular un anticuerpo con la ayuda de un
antígeno conocido.

En la inmunofluorescencia se utilizan inmunoglobulinas marcadas con sustancias


fluorescentes como isotiosyanato de fluorescina o rhodamina, parecido a las
enzimas empleados en los ELISA. Se trata de un método muy sensible pero que
requiere el uso de un microscopio de fluorescencia con lampara de mercurio y
experiencia en la interpretación para evitar errores. Tiene un campo muy amplio de
aplicación y se utiliza con frecuencia para la detección de antígeno en tejidos.
(BLANCO, SF).
10- Inmunoperoxidasa
Este método permite la detección de entígeno en tejidos mediante el uso de
inmunoglobulins marcadas con una encima (peroxidasa o fosfatasa alcalina) que
generan una coloración desde un substrato sin color. La ventaja ante las técnicas
de fluorescencia son el equipo necesario y que se puede aplicar en material
incluido en parafina. Para eata prueba también hace falta mucha experiencia para
su correcta interpretación. (BLANCO, SF).
11- Test de neutralización de virus
Este método utiliza la habilidad de los anticuerpos de anular la acción biológica de
un virus o de una toxina. Esto se aplica en algunas pruebas para la neutralización
de toxinas bacterianas (prueba de Nagler para Clostridium perfringens) y sobre
todo para un gran número de virus. El método consiste en la infección de un
cultivo celular receptivo con un virus que causa lesiones visibles en este cultivo. La
concentración del virus es conocido mientras que los sueros a analizarse diluyen
en pasos de dos en dos.
Si el suero contiene anticuerpos específicos estos inhiben la infección de las
celulas por el virus en cuestión y con ello la aparición de lesiones en el cultivo
celular. Para muchos virus de importancia para los animales domésticos el test de
neutralización de virus constituye el "gold standard" por su especifidad y
sensibilidad. Sin embargo también es el análisis más costoso y que más tiempo
requiere debido a la necesidad de trabajar con cultivos celulares o huevos
embrionados. (BLANCO, SF).
12- Test de protección
Este método funciona según el mismo principio que el test de neutralisación de
virus, pero se realiza en vivo. Se aplica por ejemplo para la detección de tóxinas
producidas por Clostridium botulinum. (BLANCO, SF).
13- Método del látex:
Está basado en la prueba de aglutinación. Los Ac son adheridos a partículas de
látex. Al enfrentarse el látex sensibilizado con el Ag específico se produce la
agregación entre estas esferas y los Ag. Esta prueba ha sido usada principalmente
en Virología, en Bacteriología la técnica ha sido usada con éxito para detectar
Clavibacter michiganense subps sepedonicum y Ralstonia solanacearum en papa
y Xanthomonas albilineans en caña. El método es de 100 a 1000 veces más
sensible que una aglutinación normal, la reacción aparece más rápida,
generalmente no es necesario el microscopio para observar la reacción, se
necesita muy poco inmunosuero, no requiere la clarificación de la savia.

1.1.5. ELEMENTOS QUE SE UTILIZAN EN LAS PRUEBAS SEROLOGICAS


1.1.6. VENTA DE ANTICUERPOS.
1.1.7. IMPORTANCIA

CONCLUSIONES

OBJETIVOS