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TALLER DE ACTUALIZACIÓN Y ENTRENAMIENTO

Carbones (Ustilaginales)

Metodología de análisis para su determinación y cuantificación.

Docente: Ing. Agr. Marta Mónica Astiz Gassó

LABORATORIO DE SEMILLLA “SANTA CATALINA”

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y FORESTALES


UNIVERSIDAD NACIONAL de LA PLATA

AÑO 2011
LABORATORIO DE SEMILLA “SANTA CATALINA”

CARBONES

FINALIDAD

Actualizar los conocimientos sobre las Ustilaginales (Carbones) en


Argentina

OBJETIVOS

• Proporcionar a los alumnos conocimientos para lograr una adecuada


detección, identificación y cuantificación de los principales carbones
presentes en semillas de cereales, forrajeras y plantas oleaginosas.

• Capacitar recursos humanos en las metodologías para el análisis sanitario


de semillas.

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LABORATORIO DE SEMILLA “SANTA CATALINA”

INDICE
Finalidades del curso 2
Objetivos 2
Indice 3
Importancia de los carbones 4
Tipos de infecciones producidos sobre el hospedante 4
Carbones en cereales 5
Caries o carbón hediendo del trigo (Tilletia spp.) 5-6
Carbón de la panoja de arroz (Tilletia barclayana) 7
Carbón parcial del trigo (Tilletia indica) 7-8
Carbón volador en trigo y cebada (Ustilago spp.) 8-9
Carbones en forrajeras 9
Carbón de la panoja de cebadilla (Ustilago bullata) 9-10
Carbones en otros cultivos 10
Carbón de frutos o cajas de maní (Thecaphora frezii) 10-11
Carbón del maíz (Ustilago maydis) y Carbón de sorgo y maíz (Sporisorium spp) 12
Carbón cubierto de Cebada (covered smut of barley) 14-15
Carbón de la cebolla Urocystis cepulae 16
Carbón de la hoja de trigo Urocystis agropyri
Métodos de análisis de semillas 17
Técnicas para Tilletia spp (carbón hediondo o caries del trigo) ISTA Hoja de 17
trabajo N° 53
Inspección directa 17
Método del filtrado 17
Método del hematocímetro (Pirson, 1978) 17
Cámara de recuento globular 18
Figuras: 1,2 19
Figuras: 3,4 20
Figuras: 5 21
Planilla para recuento de esporas Cámara de Neubauer 22
Técnica para diferenciar: T. tritici de T. controversa 23
Método de montaje en líquido de Shears para la diferenciación de la matriz o 23
vaina hialina de T. controversa.
Analisis del carbón volador (Ustilago spp), método del embrión ISTA hoja de 23
trabajo N° 48
Extracción y limpieza de embriones 24
Variante del método del embrión 24
Observaciones comunes en ambos métodos 25
Figura: 1 Embrión de la izquierda con hifas de CARBÓN VOLADOR O DESNUDO 25
DEL TRIGO (Ustilago spp.).
Figura: 2 Equipamiento para método de extracción de embriones 26
Microscopía de Fluorecencia 27
Técnica de la germinación de esporas 27
Técnicas moleculares 27-28
Observación histológica de Ustilago bullata en plántulas de Bromus sp. 28-29
Apéndice I: Ciclos de las enfermedades de carbones 30
Ciclo patológico del carbón de maíz 31
Ciclo patológico del carbón hediondo o caries del trigo 32
Ciclo patológico del carbón volador del trigo y cebada 33
Ciclo patológico del carbón de la panoja de sorgo y maíz 34
Ciclo patológico del carbón parcial del trigo 35
Bibliografía 36-38

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1.- IMPORTANCIA DE LOS CARBONES

Los carbones son patógenos de plantas que pertenecen a la Subdivisión


Basidiomicetes; Clase Ustilaginomicetes; Orden Ustilaginales. Se caracterizan por
formar una masa pulverulenta de teliosporas (basidiosporas) de color oscuro en
diversos órganos de los hospedantes. Los carbones incluyen 1200 especies en 50
géneros, que afectan en aproximadamente 4000 especies de plantas en 75 familia
de angiospermas. Los carbones son más conocidos en monocotiledoneas que en
dicotiledóneas y, principalmente fueron patógenos de importancia económica en
los cereales hasta el siglo XX, porque fueron considerados mundialmente dentro de
las causas más graves de pérdidas de las cosechas de granos, a veces igualando a
los daños producido por las royas.
Thecaphora frezii (carbón en maní), es una enfermedad emergente del
cultivo de maní (Arachis hypogaea) desde de su detección en 1993, se ha
incrementando su prevalencia e incidencia. Los estudios realizados hasta el
presente son: 1.- tipo germinación de las teliosporas, condiciones de
desarrollo in vitro; 2.- Incidencia y severidad del carbón de maní.

1.1.- Tipos infecciones producidas sobre el Hospedante

Estas enfermedades son transmitidas por semillas, suelo, agua y/o viento que
permiten su propagación a las plantas afectando la producción en los cultivos.
Existen diferentes parámetros para clasificar a los carbones como: 1.- forma,
tamaño y color de teliosporas, 2.- tipos de soros, 3.- hospedantes; entre otros
parámetros no influenciados por condiciones ambientales, con en el caso del tipo de
germinación.
También es importante conocer el tipo de infección en el hospedante (local o
sistémica) para detectar, identificar y cuantificar la presencia de estos patógenos
para realizar un manejo adecuado en el cultivo.

1.1.1.- Infecciones en plántulas: Infección de tipo sistémica. La fuente de


inóculo se encuentra en las semillas y/o suelo, se inicia la penetración del patógeno
en el estadio de plántula y el micelio se desarrolla en el meristema apical durante la
elongación del mismo. Las hifas infectivas son principalmente dicariotica y se
desarrollan Inter/intracelularmente, para luego esporular formando los típicos
“soros” en el ovario del hospedante.
Por ejemplo: Carbón común o carbón hediondo (Tilletia spp), Carbón de la avena
(Ustilago avenae), Carbón del Sorgo (Sporisorium spp), Carbón de la cebadilla
(Ustilago bullata), etc.

1.1.2.-Infección del embrión: Infección de tipo sistémica .La fuente de inóculo


proviene de las teliosporas llevadas por el viento. Se inicia la penetración cuando se
desarrolla el embrión, después el micelio del hongo permanece latente en la
semilla. Durante la germinación de la semilla, el hongo inicia la infección en las
plántulas y se desarrolla Inter/intracelularmente e infecta posteriormente la
inflorescencia desarrollándose el soro que reemplaza la inflorescencia excepto el
raquis.
Por ejemplo: Carbón volador (Ustilago spp) de trigo y cebada.

1.1.3.- Infección vástagos (rizomas o yemas): Infección de tipo sistémica. La


fuente de inóculo es el órgano vegetal y/o suelo. Se inicia la penetración durante la

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elongación de las plántulas o macollos del hospedante. En este tipo de infección se


observa como resultado la falta de desarrollo floral o aborto de inflorescencia. Los
soros se desarrollan en hojas, tallos y/o en parte de la inflorescencia.
Por ejemplo: En tallo e inflorescencias: el carbón de la caña de azúcar (Ustilago
scitaminea); en tallo el carbón de gramíneas: (U. hypoditis); en hoja: el carbón de
trigo Urocystis tritici, Agropyro, Lolium spp. (Urocystis agropyri), etc.

1.1.4.- Infección Local: En este caso el hongo “no es sistémico” es de “tipo


local”. La fuente de inoculo se encuentra en el suelo y/o aire, el micelio y la
esporulación es restrictiva a la región de la planta en donde ocurre la infección.
Por ejemplo: Carbón del Maíz (U. maydis), carbón parcial del trigo (Tilletia indica),
Carbón de la panoja o grano de arroz (T. barclayana), Thecaphora frezii carbón de
frutos o caja del maní, etc.

2.- CARBONES EN CEREALES

2.1.- CARIES O CARBÓN HEDIONDO DEL TRIGO.

Esta enfermedad es cosmopolita y se la conoce desde la antigüedad y se encuentra


citada en todos los países de América del Sur.
En la determinación de las caries (Tilletia laevis, T. tritici y T. controversa), es
importante tener en cuenta para su identificación y diagnóstico: el signo en planta
y en grano/semilla. Las observaciones se basan en característica morfológicas y
morfométricas de las teliosporas de los granos carbonudos o “soros” y en la parte
externa, en donde se adhieren las teliosporas en el cepillo del grano.
En las observaciones a campo las plantas afectadas con el carbón común (T.
laevis y T. tritici) presentan una disminución moderada del crecimiento
comparándolas con las plantas sanas siendo muy difícil su identificación a campo
hasta la emergencia de las espigas. Las espigas afectadas por el carbón pueden ser
más erectas, delgadas, de color glauco y preservan este color más tiempo que las
espigas sanas. También se observan a las glumas de las espiguillas infectadas más
abiertas, los ovarios cubiertos con una masa carbonuda hasta el momento de la
maduración y secado de las espigas, donde este signo ya no se observa fácilmente
porque las glumas se contraen.
El carbón se forma a expensas de los ovarios, donde en lugar de los granos se
forma la masa de teliosporas. Los “soros” o granos carbonudos son ovalados a
ligeramente globosos, aunque este carácter varía con las formas fisiológicas, se
encuentran formados por una masa carbonosa compacta y blanda, castaño-oscura
recubiertos con una membrana delgada (epidermis de los granos) que se rompe
con facilidad durante la trilla infestándose así los granos sanos.
En el caso del carbón enano (T. controversa), el síntoma visible en el campo es la
presencia de plantas enanas o menor porte que las sanas, característica que varía
de acuerdo a la raza del hongo y el cultivar. La enfermedad se evidencia en las
espigas en forma similar al carbón común. (Ciclo de la enfermedad, Pag.32)

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2.1.1 CARBÓN COMÚN 0 HEDIENDO o CARIES DEL TRIGO

Tilletia laevis Kühn


Tilletia tritici (Bjerk.) Wint.

Otros nombres comunes: Carbón cubierto, carbón común, carbón hediondo,


caries, carvao comun, carvao coberto, carvao fétido, cárie, common bunt, stinking
bunt, covered bunt, hill bunt, complete bunt, low bunt, high bunt.

Sinonimia: Tilletia laevis Kühn, Tilletia foetida (Wall) Liro, T. foetens (Berk & Curt.)
Schöt.
Tilletia tritici (Bjerk.) Wint., Tilletia caries (DC.) Tul., T. tritici (Bjerk.) R. Wolff

2.1.1.1 HOSPEDANTES

El genero Tilletia son patógenos en gramíneas, como hospedantes además de


Triticum son Aegilops, Agropyron, Agrostis, Alope, Arrhenatherum, Beckmannia,
Bromus, Dactylis, Elymus, Festuca, Holcus, Hordeum, Koeleria, Lolium, Poa, Secale,
Trisentum y X Triticosecale.

2.1.1.2 MORFOLOGÍA DE LAS TELIOSPORAS


Las teliosporas de T. laevis son de color castaño oliváceo, a veces muy claras o
casi hialinas, globosas, sub globosas y muy irregulares, de 19-25 µ de Ø, con
episporio grueso y liso. Células estériles hialinas, globosas o sub globosas, de 12-18
µ de Ø, lisas o ligeramente reticuladas. Su cantidad varía con los ejemplares y
formas fisiológicas, desde muy escasas a abundantes.
Las teliosporas de T. tritici son de color castaño a castaño oscuro, globosas u
ovaladas de 14-25 µ de Ø, con episporio reticulado con celdillas de 1-1,5 µ de Ø, a
veces con aspecto cerebroide y de profundidad variable. Células hialinas estériles y
globosas de 10-18 µ de Ø, con episporio no muy grueso.

2.1.2.- CARBÓN ENANO

Tilletia controversa Kühn

Otros nombres comunes: Carbón enano, carvao enao, dwarf bunt, short smut,
stunt smut, stubble smut, TCK smut.

Sinonimia: Tilletia controversa Kühn, Tilletia brevifaciens Fisch.

2.1.2.1.-HOSPEDANTES

Tilletia es un patógeno muy frecuente en gramíneas, otros géneros que se


encontraron como hospedantes además de Triticum son Aegilops, Agropyron,
Alopecurus, Arrhenatherum, Bromus, Dactylis, Elymus, Festuca, Hordeum, Koeleria,
Lolium, Poa, Secale, entre otros.

2.1.2.2.-MORFOLOGÍA DE LAS TELIOSPORAS

Las teliosporas de T. controversa son de color castaño oscuro, castaño


amarillento o amarillento, globosas, sub globosas o irregulares, de 19-30 µ de Ø
incluyendo la membrana hialina que la rodea; episporio reticulado de celdillas penta
o hexagonales irregulares de 3-3,5 µ x 1,5-3 µ de Ø de profundidad; encerrados en

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una membrana hialina que sobrepasa el diámetro de las teliosporas o a veces es


tan estrecha que resulta imperceptible si no se observa con lente de inmersión.

Tabla Nº 1: Síntesis de caracteres microscópicos de teliosporas de


carbón hediondo.

Característic T. laevis T. tritici T. controversa


as
Globosas
Globosa ovaladas Globosas ovaladas o
irregulares,
irregulares o irregulares a
Forma Ovaladas
irregulares irregulares alargadas
irregulares
alargadas
19 - 24 µ
14 - 22 µ 14 - 23.5 µ
Diámetro ocasionalmente
ocasional. < ocasional. > 25µ
16.8 - 32.0 µ

Delgado a Delgado Delgado RETICULADO


Episporio grueso RETICULADO profundo
LISO pentagonal Envoltura hialina

Espínulas SI SI
NO
Poco marcadas Muy marcadas

2.1.2.3.- Control de la enfermedad

a.- Carbón común o hediendo o caries del trigo: Rotación de cultivos.


Cultivares Resistentes. Uso de fungicidas
b.- Carbón enano: Rotación de cultivos. Cultivares Resistentes. Uso de
fungicidas en suelo y semilla.

2.1.3.-CARBÓN DE LA PANOJA DE ARROZ:


Tilletia barclayana
Sinonimia: T. horrida, Neovosia horrida

2.1.3.1.- Morfología de teliosporas: Ver Tabla 2.

2.1.3.2.- Ciclo de la enfermedad

La enfermedad se encuentra en el campo al momento de la madures del cultivo de


arroz. Cuando los granos son examinados, los que están enfermos muestran,
diminutas pústulas negras o un rayado apareciendo se las glumas. En una infección
severa, aparece como un corto pico sobrecrecido que es producido por ruptura de
las glumas. Esto ocurre porque frecuentemente solo una parte del grano es
afectado y la parte que no es afectada, causa la prominencia o enroscamiento del
grano, a veces el grano entero es reemplazado por un polvo negro de esporas del
carbón. Esta masa negra de esporas es esparcida sobre otros granos y hojas que es
la manera más fácil de detectar la enfermedad en el campo. Sin no son
severamente infectadas las semillas pueden germinar, pero las plántulas están
detenidas en el crecimiento. Las teliosporas viven por años y han sido viables
después de tres años en granos almacenados; también sobre viven el pasaje a
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través del tracto digestivo de los animales domésticos. Las teliosporas germinadas
producen muchas esporidias en en el promicelio. Estas esporidias producen
esporidias secundarias en gran cantidad o bien directamente sobre el micelio
producido por esporidias primarias. Las esporidias secundarias tienen forma de Hoz
y son descargas fuertemente, facilitando así su diseminación e infección. La
infección esta condicionada por el ambiente durante la antesis. Es una enfermedad
de tipo de infección local. (Ou, S.H. 1984). En Argentina en 1994 en la Provincia de
Corrientes, fue introducida por semillas infectadas por este patógeno, pero hasta el
presente T. barclayana es de baja incidencia.

2.1.3.3.- Control de las enfermedades


La enfermedad no es económicamente importante y medidas de control especiales
no normalmente necesarias.

2.1.4-CARBON PARCIAL- Enfermedad cuarentenaria en la Argentina


tipo A11

El carbón parcial es un patógeno originario de China e India, pero en la última


década se ha difundido en varios países de América (México y USA). En la
Argentina, en la actualidad es una enfermedad que tiene cuarentena para evitar su
difusión. El carbón parcial es una enfermedad que ataca principalmente al trigo
pan, pero el trigo fideo y los triticales pueden ser afectados. La presencia de
T.indica se evidencia en granos rotos y parcialmente llenos de carbón durante la
trilla. En la semilla se afecta el embrión y parte del endosperma, pueden ser
convertidos en masas de esporas negras, secas y olor semejantes al hediondo.
(Ciclo de la enfermedad en Apéndice II, Pag. 35) En las tablas 1-2 se encuentra
descriptos en forma comparativa las especies de Tilletia que tienen semejanza
morfológica, y que se deben tener en cuenta en los análisis sanidad en las semillas
de los cereales y forrajes.

2.1.5. Tabla Nº 2: Morfología y Morfometría de T. indica, T. barclayana y T.


walkeri

Característic T. indica T. barclayana T. walkeri


as
Globosas
Globosa ovaladas
irregulares, Globosas ovaladas o
irregulares o
Forma Ovaladas irregulares a
irregulares a
irregulares irregulares alargadas
elípticas
18 - 23.5 µ (ovadas) 28 - 35 µ ∅
Diámetro 24 - 47 µ
y 22.5-26.5µ

Gruesamente
Delgado a
cubierto reticulado tipo
Episporio grueso
con conspicuas cerebriforme
espinas

1
A1: Una peste cuarentenaria no presente en el área.
A2: Una peste cuarentenaria presente en el área pero no está ampliamente distribuida y que esta siendo controlada
oficialmente.
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SI
Espínulas SI SI
marcadas marcadas

Color Marrón-rojizo a
Marrón casi Marrón casi marrón-naranja,
negras negras marrón oscuro a casi
negras
Células
SI NO SI
estériles

2.1.6.- CARBÓN VOLADOR EN TRIGO Y CEBADA


Ustilago nuda (Pres.) Rostr. Y U. hordei

Otros nombres comunes: Loose smut, carbón desnudo

Sinonimia: Ustilago tritici (Jens.) Rostr., Ustilago nuda var. tritici Schaff. Y
Ustilago carbo dc hordei, Uredo hordei, Uredo segetum, respectivamente.

El carbón volador de los cereales se encuentra ampliamente distribuido por todo el


mundo, pero es más grave y abundante en las regiones húmedas y sub húmedas.
Esta enfermedad ocasiona daños al destruir los granos de las plantas que ha
infectado y manchar y disminuir la calidad del grano de las plantas no infectadas
después de la cosecha.
Las pérdidas ocasionadas por esta enfermedad pueden ser hasta de un 10 a 40 %
en ciertas localidades en un determinado año, pero las pérdidas totales en los
Estados Unidos son aproximadamente del 1 % por año.

2.1.6.1.- HOSPEDANTES

Triticum es el principal hospedante. Triticum spp. excepto T. timopheevi. Otros


géneros que se encontraron como hospedantes son Aegilops, Agropyron, Elymus,
Haynaldia, Hordeum, Secale, Taeniatherum y Triticosecale.

2.1.6.2.- Morfologías de las teliosporas:

Teliosporas de color castaño-amarillentas, pardo oscuras a casi negras; forma


globosa a ligeramente irregulares; Tamaño: 5-9µ de Ø o de 5-8 x11µ Ø; episporio
tenue y liso.

2.1.6.3.-Ciclo de la enfermedad:

Ambos patógenos invernan en forma de micelio latente en el cotiledón (en


ocasiones llamado escutelo) de los granos infectados. Cuando se siembran, los
granos infectados comienzan a germinar, el micelio reanuda sus actividades y crece
intercelularmente a través de los tejidos del embrión y de la plántula joven hasta
que llega a la zona del crecimiento de la planta. El micelio se adapta al crecimiento
de la planta y muestra mejor desarrollo justo detrás la zona de crecimiento, en
tanto las hifas en los tejidos de la parte inferior del tallo se atrofian y a menudo
desaparecen.

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Cuando la planta forma su espiga, e incluso antes de que emerja, el micelio


invade todas las espiguillas jóvenes donde crece intercelularmente y destruye la
mayor parte de los tejidos de la espiga excepto el raquis. En este momento, la
mayoría de las plantas infectadas son ligeramente más altas que la mayoría de las
plantas sanas, quizás debido a la acción estimulante del patógeno. El micelio en
los granos infectados en poco tiempo se transforma en teliosporas que quedan
cubiertas sólo por una delicada membrana del tejido del hospedante. Las
membranas se rompen poco después de la maduración de las teliosporas y éstas
son liberadas y diseminadas por las corrientes de aire hasta las plantas sanas
cercanas.
La liberación de esporas coincide con la apertura de las flores en las plantas sanas.
Las teliosporas que se depositan sobre las flores germinan mediante la formación
de un basidio, en el cual se forman las hifas haploides. Una vez que ha ocurrido la
fusión de las hifas haploides sexualmente compatibles, el micelio dicariótico
resultante penetra en la flor a través del estigma o por las paredes del ovario joven
y se establecen en el pericarpio, en tegumentos, etc., así como en los tejidos del
embrión antes de que los granos lleguen a la madurez. El micelio pierde entonces
su actividad y entra en reposo, principalmente en el escutelo, hasta que germina el
grano infectado. (Ciclo de la enfermedad Pag. 33)

2.1.7.- Control de la enfermedad


Rotación de cultivos. Cultivares Resistentes. Uso de fungicidas.

3.- CARBONES EN FORRAJERAS

3.1.- Carbón de la panoja de cebadilla:


Ustilgo bullata Berk

Sinonimia: Ustilago carbo cv vulgaris, Ustilago bromivora, Ustilago lorentziana,


Ustilago hordehicola, Ustilago agropyri, Ustilago broma-mollis, Ustilago broma-
arvensis

Es una especie nativa de las planicies templadas del cono sur de América del Sur,
fue llevada a Australia donde se multiplicó y desde allí volvió a la Argentina para su
difusión como cultivada, el ciclo de vegetación es otoño-invierno, primavera. Los
ecotipos bianuales se hacen perennes en pasturas por su facilidad de semillar. En la
Argentina ocupa el segundo lugar como especie sembrada después de Festuca alta
(Festuca arundinacea). En esta pastura se ven frecuentemente limitada la
resiembra por el ataque de Ustilago bullata Berk que deforma las espiguillas de las
panojas y reemplaza a las semillas por una masa carbonosas constituidas por
teliosporas del parásito. Es un hongo cuya infección es “tipo sistémico”.

3.1.1.-Hospedantes: Bromus cantharticus (= B. unioloides, B willdenowii),


nombre vulgar es: cebadilla, cebadilla criolla, cebadilla australiana Rescue grass,
Brome grass, Bromus spp. Agrpropyri spp.

3.1.2.- Morfología de las teliosporas : Las teliosporas son castaño oliváceo, con
matices variables a mas claro o mas oscuro; globosos, sub- globosos o ligeramente
irregulares; de 6 a 12 μ de diámetro, predominando los de 7 a 10 μ de diámetro;
episporio equinulado o algo verrugoso, a veces con la ornamentación mas profusa
en la región ecuatorial, lo que le confieren aspecto de banda.

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3.1.3.- Ciclo de la enfermedad:

El ciclo se inicia cuando teliosporas germinan y alcanzan la superficie de las


plántulas donde penetra mediante una aparente desintegración de la epidermis del
hospedante. El hongo llega al tejido parenquimático donde se ubica en los espacios
inter/intracelulares, luego crece en forma sistémica sin presentar síntomas del
ataque. El parásito completa el ciclo reemplazando al ovario por una masa
carbonosa, envuelta en una membrana que al romperse libera las esporas ya
maduras, las que caen al suelo o se adhieren a la glumelas para iniciar un nuevo
ciclo de infección.- la viabilidad de las esporas es de varios años (Hirschhorn, E
1986; Falloon, 1979 a,b,c; Falloon, R and Hume, 1988). Otro forma de infección ha
sido observado en rebrotes de cultivos implantados Falloon (1979) y Astiz Gassó M.
(datos sin publicar).
La fuente de inóculo de las teliosporas del patógeno es la semilla del hospedante y
además las que se encuentran en el suelo o de rastrojos con panojas infectadas. (
por lo que se aconseja tratar las semillas con el funguicida adecuado)También
existe información que indica que las masas carbonosas son tóxicas para el ganado
(Vallejos,L.C. et. Al 1974). Además, este parásito produce importantes mermas en
la producción de semillas en la región pampeana, afectando la resiembra natural y
la disponibilidad comercial de semillas.

3.1.3- Control de la enfermedad


Rotación de cultivos. Cultivares Resistentes. Uso de fungicidas.

4.- CARBONES EN OTROS CULTIVOS

4.1 CARBÓN DE FRUTOS O CAJAS DE MANÍ: Marinelli A. y Colaboradores


(1995-2003, Facultad de Agronomía Universidad Nacional de Río Cuarto. (Astiz
Gassó M.M. y Marinelli, A. 2003, Astiz Gassó, M.M. et al 2008)

Thecaphora frezii

4.1.1.- Morfología de las teliosporas: Las teliosporas son de color castaño


solitarias y en glomérulos 2-7, se encuentran solitarias o en glomérulos; Forma:
globosas, con espínulas en el espisporio; Tamaño teliosporas solitarias 13,8 x
15,3µ. Los glomérulos son irregulares a esféricos formados por 2-7 teliosporas,
siendo las más frecuentes de 2 y 3 esporas de 16,1 x 24,8µ y 24 x 26,2µ
respectivamente. Las paredes en contacto de las esporas en los glomérulos son
rectas y lisas, y las libres o solitarias redondeadas y espinulescentes.

4.1.2.-Características generales de la enfermedad:

En las campañas 1994/95, se observaron por primera vez en la zona centro-


norte manisera de la provincia de Córdoba frutos de maní (Arachis hypogaea) en
los cultivares Florunner y Colorado Irradiado INTA afectados por este patógeno.
Esta enfermedad fue identificada previamente por Carranza y Linquist sobre maní
silvestre procedente de Brasil en 1962. Las cajas de maní afectadas presentan
hipertrofia (mayor tamaño y deformaciones) en algunos casos observaron semillas
con pequeñas zonas hipertrofias, con el tegumento blanquecino debajo del cual se
encuentra una masa carbonosa compacta y otras totalmente transformadas en un
grano carbonoso duro o al abrirlas una o todas las semillas son carbonosas de color
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LABORATORIO DE SEMILLA “SANTA CATALINA”

castaño-oscura constituídas por teliosporas del patógeno (Marinelli, A. et. al 1995,


2002). Los estudios realizados hasta el presente fueron sobre el tipo germinación
de las teliosporas, condiciones de desarrollo in vitro, incidencia y severidad del
carbón de maní. (Astiz Gassó, M.M. y Marinelli, A. 2003 ; Astiz Gassó, M.M. et al
2008)

4.1.3.- Avances hasta el presente sobre la enfermedad:

1.- Tipo de infección es local.


2.- La infección se produce cuando el ginecóforo se introduce en el suelo.
3.- El inóculo es transportado por semillas.
4.- La fuente del inóculo se encuentra en el suelo.
5.- El cultivo in vitro de las teliosporas está influenciada por la presencia de
extracto de órganos de la planta de maní, por lo tanto la interacción
hospedante-patógeno estás íntimamente relacionada para que se produzca
la infección.
6.- Cuantificación de la incidencia y severidad
7.- Escala arbitraria de severidad.

4.1.4- Control
Con la información recopilada hasta el presente se puede inferir el uso de
cultivares resistentes, rotación de cultivo y curasemillas.
Figura 1: Teliosporas de T. freís; soros del carbón

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Figura 2: Escala para la determinación de la severidad del carbón.


Escala de 5 grados para evaluar severidad de
Thecaphora frezzi (Astiz Gassó, Leis y Marinelli)

GRADO-0: Frutos (cajas) y semilla sin síntoma

GRADO-1: frutos y Semilla con ataque imperceptible


visualmente

GRADO-2: Frutos (cajas) que presentan hipertrofia,


mayor tamaño que el normal y consistencia
esponjosa, y con semilla parcialmente carbonosa

GRADO-3: Frutos (cajas) que presentan hipertrofia,


mayor tamaño que el normal y consistencia esponjosa
con una semilla carbonosa y otra parcialmente
carbonosa

GRADO-4: Frutos (cajas) que presentan hipertrofia,


mayor tamaño que el normal y consistencia esponjosa
y todas las semillas carbonosas

5. CARBÓN DEL MAÍZ

5.1.-Carbón del maíz - Ustilago maydis: carbón de la agalla o bolsa de maíz, es


una enfermedad que no tiene mucha importancia económica porque aparece en
forma aislada en los cultivos y el porcentaje de aparición es 2-10%. Actualmente en
algunos casos se han producido porcentaje elevados de la enfermedad de hasta el
40% por la distribución de híbridos susceptibles y las condiciones ambientales
favorables para la producción de infecciones del patógeno. Tipo de infección Local.
El control se realiza principalmente con cultivares resistentes y rotación de cultivos.
(Ciclo de la enfermedad Apéndice II)

5.2.- Carbón de la panoja en sorgo y maíz - Sprorisorium spp. (=


Sphacelotheca spp.): Este género produce los carbones del sorgo y maíz. Sp
reilianum (=Sp. holci-sorghi) : Carbón de la panoja en sorgo y maíz.; Sp. sorghi:
carbón duro del sorgo; Sp. cruentum (=Sp. cruenta) carbón volador del sorgo. Tipo
de infección Sistémica. Teliosporas externas en las semillas y/o en el suelo. El
control se realiza utilizando cultivares resistentes y curasemillas (contacto y
sistémicos). (Ciclo de la enfermedad Pag.36).
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LABORATORIO DE SEMILLA “SANTA CATALINA”

6. -Carbón cubierto de Cebada (covered smut of barley)

Ustilago hordei
Ustilago nuda f sp hordei
Ustilago kolleri
Ustilago segetum

El organismo causal de la enfermedad es Ustilago hordei (Pers.) Lagerh. A causa


del ataque del carbón cubierto se presentan serias pérdidas en los cultivos de
cebada y avena. Las especies que causan esta enfermedad tienen características
morfológicas idénticas, pero difieren en su habilidad para parasita cebada o avena.
Una forma infecta cebada, pero no avena y la otra infecta avena, pero no cebada.
Los carbones cubiertos difieren de los carbones voladores en el grado de desarrollo
de las brácteas florales y aristas, y el grado de persistencia de las membranas que
cubren las masas de esporas. Estas últimas tienden a quedar relativamente intactas
hasta que el cultivo se aproxima a su madurez, entonces son dispersadas
durante la trilla contaminando el grano sano.
El hongo tiene varias razas fisiológicas. El carbón sobrevive como teliosporas en la
semilla, sobre todo en las hendeduras, y en la tierra. Las teliosporas son de color
castaño claro cuando se observan al microscopio y miden 5-9µ, su forma es
globosa a subglobosa con paredes lisas. También puede sobrevivir como el micelio
inactivo bajo las cáscaras en la semilla, (brácteas florales) y aristas. Se encontrar
distribuida mundialmente y puede ser más severa en campos dónde el pH ácido a
neutro. Las esporas germinan cuando el rango de temperatura de la tierra es 14-
25º C y cuando la humedad de la tierra es baja. Un basidio se forma en la
germinación. Las basidiosporas son haploide (esporidia primaria). Las esporidias
primarias pueden formar el esporidias secundarias brotando. La hifa invade el
coleoptile entre la germinación y emergencia. El grado de infección es determinado
por la cantidad de tejido del coleoptile colonizado. Una vez el coleoptile es
penetrado por la hifa, el hongo se establece cerca del meristema de crecimiento y
crece el intracelularmente. Micelio invade los primordios de la flor y el micelio se
fragmenta para formar las teliosporas de la pared gruesa. Se producen millones de
esporas en cada espiga del carbonosa. Estas esporas reemplazan el tejido del grano
en vías de desarrollo y a veces el bracteas florales. Las teliospores se agrupan en
las estructuras llamadas “soro” y se rompen las membranas delgadas que cubren
el soro, en este momento, las esporas se sueltan y mezclan con la semilla sana o se
caen al suelo. Cuando la membrana se rompe durante la cosecha las esporas son
llevadas por viento a campos vecinos. Las esporas que caen entre el grano y la
cáscara, y germinan cuando la humedad adecuada está presente. Los micelio
inactivos se asociados con las cáscaras es también responsable de la infección en la
estación siguiente.
Las plantas infectadas parecen normales hasta espigar. Las espigas carbonosas
surgen al mismo tiempo o ligeramente después que sanas. En algunos casos ellos
pueden entramparse por la vaina de hoja de bandera. Las espigas infectadas son
prontamente visibles en el campo. Los granos son reemplazados por soro de carbón
negro que se cubre por una membrana gris. La membrana permanece en las
glumas hasta que se rompen con el tacto o trillan. Las masas de teliosporas pueden
ser visibles en el grano segado la mies si la incidencia de la enfermedad es mayor
que unos por ciento. Cuando esta situación ocurre que la porción de la semilla se
designa como "tiznado" por los inspectores de grano y su valor económico está
reducido. Los soro del carbón también pueden desarrollarse excepcionalmente en la
hoja bandera que aparecen como las rayas largas, y en el tejido nodal. El hongo

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LABORATORIO DE SEMILLA “SANTA CATALINA”

pasa de un ciclo a otro en la semilla, ya sea como esporas en estado de


dormancia o como micelio en las glumas y la cubierta del grano.
Los fungicidas apropiados, usados para tratar la semilla para el control de carbones
son efectivos para U. hordei. Las variedades que son resistentes al carbón volador
son también resistentes al carbón cubierto.
Distribución en Argentina hasta la 1985 fue en la Buenos Aires.

Figura 1: Espigas con carbón y teliosporas

7.- Carbón de la cebolla o Tizoncillo de la cebolla


Agente causal:
Urocystes cepulae Frost.
U. colchiciçi (Schlectend) Labenh.
Síntomas: La enfermedad se manifiesta em los cotiledones de las plantas de
cebolla, apenas emergen del suelo. La infección progresa de hoja a hoja,
provocando un engrosamiento a nivel del cuello de la plántula. Luego, las lesiones
se abren longitudinalmente, dejando salir las esporas del hongo de color negro. Las
plantas afectadas no progresan y se produce la muerte de la planta. Sobrevivencia:
El hongo permanece viable en el suelo como teliosporas durantes varios años.

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LABORATORIO DE SEMILLA “SANTA CATALINA”

Figura 1: Plantas con carbón Urocystes cepulae

8.- Carbón de la hoja del trigo:


Urocystis agropyri
El carbón de la bandera ataca las hojas y tallos de plantas del trigo. El hongo
produce líneas gris-negras de esporas que corren paralelo a las venas de la hoja.
Las plantas infectadas son a menudo achaparradas y la hoja de la bandera torció.
La espiga, si produjo, es a menudo pequeña y granos de menor calibre. A la
cosecha, se extienden esporas en las hojas infectadas y paja hacia el grano y
superficie de la tierra. Si la semilla esta infectada producirá las plantas infectadas.
Si la semilla no esta contaminada las plantas se infectara por las esporas que se
encuentran en la tierra después de sembrar, se producirán las plantas infectadas.
Sobrevivencia: En la semilla y el suelo.

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LABORATORIO DE SEMILLA “SANTA CATALINA”

.- METODOS DE ANALISIS DE SEMILLAS

1.- TÉCNICAS PARA TILLETIA SP “CARBÓN HEDIONDO O CARIES DEL


TRIGO.”
Traducción parcial de la hoja de trabajo Nº 53 para trigo del ISTA, preparada por
M. Kietreiber, Bundesanstalt für Pflanzenbau, Wien, Austria.

Aplicable para los siguientes patógenos, que se encuentran infestando las semillas,
como esporos adheridas externamente a la superficie de la semilla:

HOSPEDANT PATÓGENO ENFERMEDAD


E
Trigo Tilletia laevis Caries o carbón hediondo

Trigo Tilletia tritici Caries o carbón hediondo

Trigo Tilletia controversa Caries o carbón del enano

Trigo Tilletia indica Carbón parcial

Cebadilla Ustilago bullata Carbón de la panoja

Sorgo y Maíz Sporisorium reilianum Carbón de la panoja

1.1.-Inspección Directa

Los granos carbonudos de Tilletia controversa son globosos y duros, en cambio


aquellos que presentan Tilletia laevis y Tilletia tritici son pulvurulentos y de forma
similar a la semilla sana. Usualmente no aparecen en la semilla limpia. Las
teliosporas adheridas a las semillas causando el cepillo negro y el típico olor a
pescado debido de la trimetilamina solo puede observarse en semillas con alto
grado de infestación. Se ha encontrado que 5 mg de soros (aglomeraciones de
teliosporas) contienen aproximadamente un millón de esporas.

1.2- Método del Filtrado.


Es otro método descripto en la hoja de trabajo del ISTA que permite determinar
presencia de las esporas en la muestra, y por inferencia en el lote, pero que no
cuantifica, por lo que solo nos limitaremos a nombrarlo.

1.1.3.- Método del Hematocímetro (Pirson, 1978)

Muestra de trabajo:
50 g de semilla libre de soros o aglomeraciones de teliosporas.

Lavado: agitar las semillas en un erlenmeyer con 50 ml de agua conteniendo 0.1


% de detergente en forma intermitente, durante unos 10 minutos. Si se espera un
bajo nivel de contaminación la suspensión debe concentrarse por centrifugación a
1800 rpm por 4 min. Se extrae con una pipeta el líquido sobrenadante menos 0.3
ml sin agitar el fondo del tubo para no remover el pellet formado. El sedimento se
resuspende agregando 0.2 ml de agua o líquido de montaje (Lactofenol o Shears).

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LABORATORIO DE SEMILLA “SANTA CATALINA”

Exámen: Se mezcla bien la suspensión, tomar algunas gotas de esta con una
pipeta Pasteur, y llenar ambas mitades del hematocímetro. Esto se debe hacer
desde el margen del cubreobjeto hasta llenar el espacio entre el cubreobjetos y la
cámara evitándose que caigan gotas sobre las acanaladuras. Una vez que el
espacio se encuentra correctamente lleno las esporas dejarán de moverse. Se
requiere un manipuleo rápido y cuidadoso para evitar la sedimentación de las
esporas. Con un aumento de 250 - 400 X se cuentan las esporas dentro de todo el
cuadrado del hematocimetro. Volver a llenarlo y contar 10 veces. Si se encuentran
esporas solo fuera del cuadrado, se registra como “menos de 1” y no 0.
El número de esporas por g de semilla se puede calcular de la siguiente manera:

Prom. del Nº de esporas x Vol.Suspensión


Nº de esporas / g de semilla = en el Vol registrado mm3 .
3
Vol.registrado mm x Peso muestra trabajo en g

Si la suspensión fue concentrada por centrifugación el número de esporas calculado


por gramo de semilla debe ser corregido y el número de esporas por gramo de
semilla encontrado en los aglomerados de esporas debe ser agregado.

Evaluación:

Pirson encontró que una contaminación con menos de 40 esporas por semilla
difícilmente sea revelado por este método a menos que se concentre la suspensión
por centrifugación. Una fuerte correlación existe entre la carga de inóculo en la
semilla y la ocurrencia de la enfermedad a campo, pero el porcentaje de plantas
enfermas producidas por una determinada carga de esporas depende de mucho del
genotipo utilizado y las condiciones ambientales.

CÁMARA DE RECUENTO GLOBULAR:

Las dos grillas de la cámara Fuchs-Rosental se definen de la siguiente manera, la


superficie de cada grilla es de 16mm2 y está dividida en 16 cuadraditos de 1 mm de
lado, cada uno de los cuales a su vez está dividido en cuatro cuadraditos de 0.25
mm de lado. El volumen que se lee en cada uno de estos cuadraditos menores se
calcula 0.25 mm x 0.25 mm = 0.0625 mm2. Esta superficie se multiplica por la
altura de la columna de líquido ( = “Tiefe” en alemán) 0.0625 mm2 x 0.2 mm =
0.01250 mm3. Con lo cual, si contamos las esporas presentes en 80 cuadraditos (o
sea 5 cuadrados grandes), estaremos leyendo la cantidad presente en 0.01250 x
80 = 1 mm3. Estos valores de altura de columna y superficie pueden leerse
impresos en la cámara.
1 mm2. Los centrales tienen más subdivisiones que los de los extremos y la
columna tiene una altura de 0.1 mm. También en ésta pueden leerse impresos los
valores de altura Por su parte, la cámara de Neubauer tiene sus grillas divididas
en 9 cuadrados de (Tiefe = 0.100 mm) y superficie: 0.0025 mm2 y 0.0625 mm2.
En cuanto a los valores límites de contaminación en otros países es de 50
teliosporas por semillas para Tilletia lavéis (=T foetida) y T. tritic (T. caries), y de
30 teliosporas por semilla para T. controversa. En general un lote con 30-100
teliosporas por grano se recomienda el tratamiento con fungicidas, valores mayores
de carga de esporas se desecha. Aunque para T. controversa según al país que se
exporte el grano la tolerancia es cero.

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LABORATORIO DE SEMILLA “SANTA CATALINA”

Figura 1: Tilletia laevis (=T. foetida), carbón hediondo, soros y teliosporas.

Figura 2: Tilletia tritici (=T caries), carbón hediondo, soros y teliosporas

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LABORATORIO DE SEMILLA “SANTA CATALINA”

Figura 3: Tilletia controversa (carbón enano), soros y teliosporas.

Figura 4: Espigas de trigo y semillas de trigo con carbón hediondo T laevis


(=T. foetida)

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LABORATORIO DE SEMILLA “SANTA CATALINA”

Figura 5: Tilletia indica (soros y teliosporas). Enfermedad cuarentenaria


para Argentina.

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LABORATORIO DE SEMILLA “SANTA CATALINA”

CÁMARA DE NEUBAUER

N°ctos/N°obs 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

10

11

12

13

14

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PROMEDIO

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LABORATORIO DE SEMILLA “SANTA CATALINA”

2.-TÉCNICA PARA DIFERENCIAR T. tritici DE T. controversa.

Existen a veces dificultades para realizar una adecuada identificación positiva de


T. controversa porque las reticulaciones de las teliosporas y la membrana hialina
o matriz que envuelve al episporio de la espora, suelen ser poco prominentes y es
confundida fácilmente con T. tritici.

2.1.- OBSERVACIÓN DIRECTA

- MÉTODO DE MONTAJE EN LÍQUIDO DE SHEARS PARA LA


DIFERENCIACIÓN DE LA MATRIZ O VAINA HIALINA DE T. controversa.

Cuando se detectan teliosporas reticuladas en las muestras de granos se procede


al montaje entre porta y cubreobjeto, con líquido de Shear que facilita la
caracterización morfológica y la presencia de la matriz o vaina hialina que envuelve
a la espora de T. controversa. Los preparados se observan al microscopio
compuesto con objetivo de 40X, luego con aceite de inmersión con objetivo de
100X para visualizar los detalles de la ornamentaciones.
Para preparar el Medio de Montaje de Shears se procede de la siguiente forma
propuesta por Jim Hoffman. Se prepara inicialmente una Solución A en la que se
disuelve 19.212 g de ácido cítrico en 1 litro de agua, y una Solución B disolviendo
28.392 g de fosfato disódico en 1 litro de agua. Posteriormente se mezcla 8.25 ml
de la Solución de stock A con 291.75 ml de la Solución de stock B, se agrega 6.0 g
de acetato de potasio, 120 ml de glicerina y 190 ml de alcohol 95º (etanol) y
finalmente se debe alcanzar un pH final de 8.0

2.4.-ANÁLISIS PARA CARBÓN VOLADOR

2.4.1.- MÉTODO DEL EMBRIÓN (Rennie & Seaton, 1975; Khanzada,


Rennie, Mathur & Neergard, 1980)
Traducción parcial de la hoja de trabajo Nº 48 para trigo del ISTA, preparada por
W.J. Rennie, Agricultural Scientific Services, East Craigs, Edimburgh, Scotland.
MODIFICADA

Aplicable para los siguientes patógenos, que se encuentran infectando las


semillas, como micelio durmiente en el embrión de la semilla:

HOSPEDANTE PATÓGENO ENFERMEDAD

TRIGO Ustilago tritici Carbón volador

CEBADA Ustilago hordei Carbón cubierto


(U. kolleri)

AVENA Ustilago avenae Carbón volador


(U. nigra)

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LABORATORIO DE SEMILLA “SANTA CATALINA”

Se considera un tamaño conveniente para una muestra de trabajo unos 100-120 g,


conteniendo 2000-4000 semillas. La muestra debe ser extraída al azar y
representativa del lote.

- Extracción y limpieza de embriones:


Este test es una adaptación de la prueba para la detección del “carbón volador de
la cebada”. La muestra de trabajo se sumerge en un litro de solución de NaOH al
5% recientemente preparado conteniendo 0.2 g de azul de tripan o azul de algodón
y se lo deja por unas 22-24 hs a aproximadamente 20º C. Una solución menos
concentrada o una temperatura menor hacen dificultosa la extracción. Luego de
este período de extracción se lava la muestra con agua caliente para facilitar la
liberación de los embriones. Puede utilizarse un aparato de Fenwick, del tipo
utilizado para la extracción de nematodes, o bien una batería de 3 tamices (3.5; 2 y
1mm de abertura). Esta extracción debe ser realizada con gran cuidado, pues los
embriones de trigo son muy delicados y hay que evitar la rotura del escutelo. Una
vez separados los embriones, estos son pasados a un embudo provisto de un tubo
de goma y pinza de Mohr, y suspendidos en partes iguales de ácido láctico y agua
destilada en partes iguales. En estas condiciones los embriones flotan y las
impurezas acompañantes bajan y son fácilmente removidas usando la pinza de
Mohr. Este proceso se repite varias veces hasta obtener una muestra de embriones
razonablemente limpia. Los embriones se transfieren a un vaso de precipitados en
ácido láctico puro, libre de agua y se hierven durante unos 30 segundos a un
minuto. Posteriormente escurrir la muestra para eliminar el acido láctico y para la
observación se utiliza como líquido de montaje glicerina pura.
Los embriones totalmente inmersos en el líquido de montaje son dispuestos en
líneas para facilitar el examen y el conteo. Se examina cuidadosamente cada
embrión bajo lupa de 18-25 aumentos con iluminación desde abajo. Se cuentan los
embriones infectados y el total de embriones revisados. El porcentaje de carbón se
calcula sobre el total de embriones contados, no sobre el total de embriones de la
muestra. El micelio de Ustilago tritici en embriones de trigo no puede detectarse
sin el agregado de un colorante. Cuando se agrega el azul de tripan al NaOH el
micelio se colorea de azul en los embriones infectados. Este ataque puede
manifestarse desde unas pocas hifas cortas hasta la invasión completa de los
tejidos del escutelo.

- Observaciones
El ISTA recomienda este mismo método es para la observación de embriones de
cebada, pero en este caso no se utiliza colorante pues las hifas aparecen de un
color castaño dorado que se distingue sin necesidad de tinción.

2-4.2.- VARIANTES DEL MÉTODO DEL EMBRIÓN

A.-Método con Cloruro de Sodio.


Se considera un tamaño conveniente para una muestra de trabajo unos 100-120
g, conteniendo 2000-4000 semillas. La muestra debe ser extraída al azar y
representativa del lote.

- Extracción y limpieza de embriones.


La muestra de trabajo se sumerge en un litro de solución de NaOH al 5%
recientemente preparado y se lo deja por unas 22-24 hs a aproximadamente 20ºC.
Luego de este período se revuelve el contenido del vaso con una varilla de vidrio y
se vierte sobre una batería de tamices (3.5; 2 y 1 mm de abertura) y se lava la
muestra con agua caliente. Se recogen los embriones en el último tamiz, se los
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LABORATORIO DE SEMILLA “SANTA CATALINA”

escurre y se los vuelca en un embudo de Baerman (embudo provisto de un tubo de


goma y pinza de Mohr); se agrega NaOH al 5% y se vá incorporando sal común de
mesa (ClNa) hasta observar la separación de los embriones que flotan, de las
impurezas que sedimentan. Abriendo la pinza se dejan caer estas impurezas, pero
se recoge el NaOH, colado, que vuelve al embudo para repetir esta operación varias
veces hasta obtener una muestra razonablemente limpia.
Esta muestra bien escurrida se coloca en una caja de Petri con aproximadamente
25ml de ácido láctico al 85% y se le agrega 1-2 gotas de una solución acuosa
saturada de azul de tripan o azul de alinina. Se coloca la muestra en estufa a 80ºC
hasta el día siguiente, se la recoge en un colador de té y se lava con agua destilada
hasta eliminar el exceso de colorante, se escurre bien y se procede a su lectura.
Similar al caso anterior, durante el examen se observarán hifas azules en los
embriones celestes.

- Modificaciones de este método para la determinación de carbón


volador en cebada:
Para extraer embriones de granos de cebada la concentración de NaOH será de 9%
y de 12% para cebadas de 2 hileras y 6 hileras respectivamente. En este último
caso puede mejorarse la extracción de embriones dejando la muestra en baño de
agua a 35ºC.

• OBSERVACIONES COMUNES A AMBOS MÉTODOS

Se recomienda contar por encima de 1000 embriones y hasta 2000. Este número
puede ser menor cuando el porcentaje de embriones infectados es muy alto, pero
para valores por debajo o alrededor del 1% solo un recuento alto dará una
razonable seguridad. Las técnicas expuestas solo permiten detectar PRESENCIA de
micelio y no distinguen entre micelio viable y no viable. La tolerancia que se admite
para las semillas fiscalizadas en otros países es 2 %º, en nuestro país no existe
legislación al respecto, y se toma de referencia este dato. Los resultados se
expresan como porcentaje de semillas infectadas.
Figura 1: Embrión de la izquierda con hifas de CARBÓN VOLADOR O DESNUDO DEL TRIGO
Ustilago spp. (Foto Astiz Gassó, M.M.)

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LABORATORIO DE SEMILLA “SANTA CATALINA”

Figura 2: Equipamiento para el método de extracción del Embrión.

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LABORATORIO DE SEMILLA “SANTA CATALINA”

3.- MICROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA

Las teliosporas se suspenden en agua para montarlas en portaobjetos secándolas


al aire a temperatura ambiente. Una vez secas, se les agrega el aceite de
inmersión no fluorescente y se procede a observarlas con microscopio (Carl Zeis
con lámpara de mercurio 50W y con equipo de Zeis de filtros de 487709-485 nm
excitación, 520 nm filtro de barrera). Si el reticulado de la pared de la teliospora
se observa fluorescente amarillo-anaranjado, el citoplasma fluorescente y las
esporas aparecen esféricas (no deformadas), se la considera como T. controversa,
si las teliosporas no se ven fluorescentes y sí las esporas se deforman es T. tritici.
Existe un porcentaje de teliosporas que no sufren deformación o no fluorescen,
esta diferencia se debe a la variación genética que sufren estas especies. Trabajos
realizados a nivel molecular tienden a demostrar que T. controversa es una
variante de la especie o que tiene un antecesor común a T. tritici y T. laevis.

4.- TÉCNICA DE LA GERMINACIÓN DE ESPORAS

Para verificar la presencia de teliosporas de T. controversa se recomienda realizar


las pruebas de germinación. Existen diferencias fisiológicas entre las especies T.
tritici y T. controversa, las mismas se deben a la temperatura y al tiempo
requeridos para la germinación. Los requerimientos para T. tritici y T. laevis son de
16ºC y 3-5 días para germinar las teliosporas, a diferencia de T. controversa que
requiere 5ºC- 10ºC y 3-6 semanas, a baja intensidad de luz. Para realizar esta
técnica se necesitan granos carbonosos que contengan teliosporas del carbón.
Se tritura el grano carbonoso en un tubo de ensayo con una varilla de vidrio e
inicialmente puede enjuagarse en un volumen de agua conocido. Luego la
suspensión se filtra con gasa estéril para remover los restos del soro, la muestra
obtenida se centrifuga durante 30 segundos y se elimina el sobrenadante. Este
pellet se resuspende con hipoclorito de sodio al 0.25 -0.30 % en agua de la canilla
y se agita durante 3 minutos a temperatura ambiente para facilitar la
desinfestación de las esporas y se centrifuga 3-4 minutos.
En su lugar las teliosporas pueden suspenderse en peróxido 10 Vol, % que ayuda a
ablandar las paredes de las esporas y reduce el tiempo de germinación en 3 a 7
días. El pellet obtenido se enjuaga con agua estéril dos veces mediante
centrifugación para eliminar el hipoclorito de sodio y se resuspende en 2 ml de
agua estéril. Esta suspensión se plaquea a razón de 0.25-0.5 ml, en medio de
cultivo de agar agua al 2% para el caso del carbón común y agar agua al 3% para
el carbón del enano.Se lleva a estufa de cultivo para incubar y favorecer la
germinación de las teliosporas de las diferentes especies según el requerimiento de
temperatura y luz de cada una.

5.- TÉCNICA MOLECULARES: (para PRESENCIA/AUSENCIA)

5.1.- PCR de teliosporas germinadas Tilletia spp :

Este método se basa en la extracción del DNA de cepas de T controversa, T.


laevis, y T. tritici para identificar y diferenciar las especies en lote de trigo.
Actualmente se usa para otras especies dentro del Orden.

Ventajas del método: Se utiliza por medio de técnicas moleculares la extracción


DNA de cepas de la diferentes especies de Tilletia se establecido las diferencia
genéticas entre T. tritici y T. controversa. También por está técnica se ha
comparado el DNA de T. indica y T barclayana, además se ha determinado una
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LABORATORIO DE SEMILLA “SANTA CATALINA”

nueva especie en Lolilum multiflorum (ryegrass anual) T. walkeri. Estas especies a


igual que el carbón enano se controlan utilizando cultivares resistentes y/o con
tratamientos de funguicidas en semillas y por la supervivencia de las teliosporas en
el suelo que dificulta su erradicación.

Desventaja: En el caso de T. controversa que es una especie que requiere


condiciones ambientales especiales de bajas temperaturas y luz con respecto a las
otras especies y aproximadamente tardan 3-4 semanas para la germinación de las
teliosporas y obtención de los cultivos para realizar las pruebas.

5.2.- PCR de teliosporas no germinadas de Tilletia spp.:

Está técnica la extracción DNA de teliosporas sin germinar se utiliza para


diferenciar: T. indica y T. controversa en trigo, T. barclayana en arroz y T. walkeri
en rye-grass anual. Estos estudios demuestran que partiendo de muestras de 1000
teliosporas o menos se determina la presencia/ausencia entre 100-10% de estas
especies en los lotes de trigo o gramíneas forrajeras. Actualmente se usa para
otras especies dentro del Orden.
Ventajas: A diferencia del anterior método los resultados se obtienen en pocos días.
Desventaja: Costos operativos.

6.-Observación de histología Ustilago bullata en plántulas de Bromus sp.

Esta técnica permitirá determinar en estadios tempranos la presencia del hongo sin
la necesidad de llegar al de panoja para la observación de los típicos “soros” del
carbón. La misma sería una herramienta útil en los screening de mejoramiento
para resistencia o en prueba de eficiencia de fungicida para el control del
fitopatógeno.

Material y Métodos
Se considera un tamaño conveniente para muestra de trabajo 15 gr conteniendo
aproximadamente entre 1000 y 1500 semillas dependiendo del cultivar. Debe ser
extraída al azar y ser representativa del lote a analizar.
Se siembran 4 bandejas o contenedores plásticos desinfectadas con hipoclorito de
sodio concentración 55g cl/l (lavandina comercial), conteniendo arena esterilizada.
Cada bandeja se colocó en bolsa de celofán y se riegan con agua estéril, tratando
de mantener el medio lo más aislado posible.
De un lote de 200 semillas extraídas al azar de la muestra se colocan 50 plántulas
en cada bandeja se mantienen en cámara de luz 12 x 12 horas luz/ oscuridad a
temperaturas de 20 ± 2ºC.

Muestra a Observar:
Se toman de cada bandeja el 25% de las plántulas, que son extraídas al azar, entre
los 40 y 60 días de ser sembradas, se lavan con agua corriente, se cortan en 1 cm
a partir del cuello hacia arriba. Si las observaciones son negativas en más de 10
plántulas por contenedor, se recomienda observar las 200 plántulas.
.
Técnica 1- (Menéndez et. al 1997)
Los segmentos obtenidos son clarificados en lactofenol durante 10 a 15 minutos,
dejándolos en reposo toda la noche a temperatura ambiente. Luego los segmentos
decolorados fueron teñidos con azul de Tripán en lactofenol al 0,05% durante 15

28
LABORATORIO DE SEMILLA “SANTA CATALINA”

minutos en estufa a 60°C. Posteriormente se observa al microscopio óptico con


aumento 10X/40X.
Técnica 2- Variación de la Técnica 1: (Astiz Gassó M.M.)
Los segmentos también se clarifican en lactofenol durante 1 hora en estufa a 40°C,
luego estos serán teñidos con azul de Tripán en lactofenol o Azul de Algodón
0,05% durante 60 minutos en estufa a 40° C. Posteriormente se observa al
microscopio óptico con aumento 10X/40X.

Figura 1: Procedimiento para observación de Ustilago bullata en tejidos de


plántulas de cebadilla criolla (Bromus catharticus).

Figura Nº 2: Observación histológica de la germinación teliosporasde Ustilago


bullata en tejido de plántulas de Bromus catharticus. (Foto Astiz Gassó M.M.)

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APENDICE I
Ciclo de las enfermedades

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LABORATORIO DE SEMILLA “SANTA CATALINA”

-BIBLIOGRAFÍA
Agrios, G. N. 1999. Fitopatología. Editorial Uthea 838 pp.
Agrios, G.N. 2005. Plant Pathology. Ed. 5ta. ELEVIER ACADEMIC PRESS 922 pp.
Astiz Gassó, M.M. 1994. Physiological specialization of Ustilago bullata Berk on
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International maize and wheat Improvement Center CIMMYT, El Batán D.F. México.
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