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Rev. Med. Univ. Navarra, XVII: 311.

1973

THE MIRIAN HOSPITAL


BROWN UNIVERSITY - SCHOOL OF MEDICINE

Esferoplastos, protoplastos y formas L bacterianas:


Su posible papel en el proceso infeccioso

']-. M. Parres*

I. Introducción Otro pionero en la investigación de las


formas L es Dienes 2 , quien en 1941 aisló
En los últimos años hemos sido testigos por primera vez una forma L (Bacte-
del creciente número de publicaciones re- roides) de material clínico. En 1948, Ea-
ferentes al hallazgo en material clínico gle publicó unos trabajos sobre la peni.
de ciertos microorganismos con propie- cilina, describiendo el "fenómeno para-
dades que han revolucionado el enfoque dójico de zona". El término protoplasto
del diagnóstico en algunas enfermeda- fue introducido en la literatura por Wei-
des infecciosas, así como su tratamien- bell en 1953, quien tomándolo prestado
to. A su vez estos microorganismos, dada de botánica, lo aplicó a unos microorga-
su sencillez, están siendo cada vez más nismos obtenidos en el laboratorio. En
utilizados como modelos bioquímicos pa- 1956, Lederberg enriqueció nuestro voca-
ra el estudio de procesos metabólicos. bulario con el término esferoplasto. Fi-
nalmente, ha sido MacDermott quien
insistentemente ha sugerido en los últi-
II. Historia mos años el posible papel patógeno de
las formas L.
Fue Pfeiffer. en 1894, el primero en ob-
servar, en sus estudios sobre Vibrío cho-
/erae lo que actualmente conocemos co- III. Terminología
mo formas L. Hoffstadt y Youmans des-
cribieron en 1932 las colonias G. En
Los términos que han ido apareciendo
193 'i Klieneberger-Nobel llevó a cabo el
en la literatura han sido utilizados por
primer estudio a fondo de las formas L
muchos investigadores indiscriminada-
del Stre ptobacíllus moníliformís (L hace
mente. creando cierta confusión sobre el
referencia al Instituto Lister, de Londres).
significado que encierran. En 1966, cierto
número de investigadores se reunieron en
* Brown University. S:.hool of Medicine. los Estados Unidos con el objeto de re-
The Mirian Hospital. Providence. U.S.A. copilar los conocimientos adquiridos en
312 J. M. PORRES Vol. XVII

la materia, pero no consiguieron adoptar Los diversos tipos de células, descritos


una nomenclatura que fuese universal- a continuación, tienen como común de-
mente aceptada. Desde entonces, la ma- nominador el poseer una pared celular
yoría de los trabajos que aparecen van con algún grado de alteración, siendo
acompañados de una breve descripción de e, tipo de alteración lo que las diferen-
lo que el autor entiende por los términos cia:
por él utilizados. Fase L: Es un término general, inespe-
cífico, aplicable a todas ellas.
A continuación referiremos algunos de
estos términos dando una descripción de Forma L: Célula osmóticamente frágil
los mismos que concuerde con el conte- sin pared celular y que puede multipli-
nido de este artículo, para claridad del carse indefinidamente sin revertir a la
lector. Estas definiciones no son acepta- forna original.
das universalmente, pero son aceptadas
por un gran número de investigadores Protoplasto: Célula osmóticamente frá-
con fines prácticos. gil, sin pared celular. No puede multipli-

CICLO DE LA FASE L

'INDUCTOR

BACTERIA

aroMlMO
ESl<'EROPLASTO

'
I
I
' ''
PROTOPLAS~ 'FB~ L

i PEQUEN O
Diciembre, 1973 ESFEROPLASTOS, PROTOPLASTOS Y FORMAS L

carse pero puede aumentar de tamaño. vía carecemos de una explicación acep-
No revierte. table, ha sido descrito con otros antibió-
ticos y parece ocurrir "ín vivo" igual-
Esferoplastos: Células cuya pared celu- mente.
lar está parcialmente alterada y ha per-
dido total o parcialmente su rigidez. Pue- De acuerdo con esta nomenclatura, la
de multiplicarse y revertir. Puede ser os- mayoría de los trabajos publicados tra-
móticamente frágil. tan en realidad de esferoplastos, ya que
casi todos ellos hacen referencia a la re-
Fragilidad osmótica : Cualidad por la versión de los microorganismos con los
que ciertas células pierden su integridad que operan.
si el medio en que están en suspensión
es de baja presión osmótica.

Colonia L: Es una colonia en forma de


IV. Producción
"huevo frito" cuyo centro crece hacia el
espesor del agar. Su periferia permane- Desde los primeros trabajos llevados a
ce en la superficie y es delgada y vacuo- cabo con bacterias, se sabe que algunos
Iada. Su tamaño oscila entre 0'5-1 mm 0. cultivos presentan un cierto pleomorfis-
Están compuestas de cuerpos grandes, mo, desarrollando en ocasiones formas
cuerpos pequeños y formas L. A veces gigantes consideradas como formas de
presentan formaciones filamentosas. involución, incapaces de multiplicarse.
Estas "formas bacterianas" han sido ob-
Cuerpos grandes: Constituyen un estado servadas en cultivos de distintas especies
de transición en la fase L. Suelen con- bacterianas y también se ha visto que
tener un cierto número de elementos gra- son ca paces de reproducirse.
nulares. El medio ambiente condiciona
su forma y tamaño, el cual puede alcan- El cultivo pleomórfico, tan fácil de obte-
zar las 50 micras. Puede multiplicarse ner "in vitro", constituiría un estadio in-
por gemación, división o fragmentación termedio (inestable) entre las bacterias y
en cuerpos pequeños. rns fases. L. Las formas L serían bacterias
con una morfología alterada pero esta-
Cuerpos pequeños: Pueden verse conte- ble, que han adoptado un modo de re-
nidos en un cuerpo grande o creciendo producción diferente.
de su periferia, penetrando en el espesor
del agar. Constituyen la unidad mínima Todos los agentes capaces de inducir
reproductora y su tamaño oscila alrede- crecimiento en fase L pueden producir
dor de las O' 1 micras. cultivos pleomórficos si se emplean a
baja concentración. Este pleomorfismo
Colonia G: Compuesta de elementos
puede ocurrir, además, en cultivos enve-
granulares (de donde deriva su nombre).
jecidos, previamente a su lisis, o expues-
Difiere de las colonias L por no presen-
tos al frío, o a ciertas sales metálicas, y
tar el aspecto de "huevo frito". Muy pe-
tienen lugar tanto en medio sólido como
queñas, a veces microscópicas.
en medio líquido.
Fenómeno paradójico de zona: Eagle 1
Las sustancias con capacidad de inducir
observó, al estudiar lo acción de la peni-
crecimiento en fase L son muy diversas,
cilina, que a ciertas concentraciones se y entre ellas se encuentran:
obtiene inhibición del crecimiento bacte-
riano pero que concentraciones por enci- Prácticamente todos los antibióticos co-
ma o por debajo de ellos no producen nocidos y especialmente la presencia de
ese efecto. Este fenómeno, del que toda- suero.
314 J. M, PORRES Vol. XVII

Enzimas: tales como lisozima, leucozima fenómeno en algún modo relacionado


e y lisostafina. con el ciclo natural de las bacterias, re-
lativamente fácil de producir y que la
Aminoácidos tales como glicina, metio-
presencia de un estabilizador osmótico
nina y fenilalanina. es más importante que el tipo particular
Cíertos componentes del suero, tales co- de sustancia utilizada. No obstante, al-
mo anticuerpos, complemento y otros gunas especies de microorganismos pro-
componentes aún no identificados. ducen crecimiento en fase L en un deter-
minado medio con mayor facilidad que
Cuando se emplean antibióticos como otra~.

agentes inductores se producen esfero-


plastos con mayor facilidad. Las for- La elevada osmolaridad permitiría el au-
mas L aparecen únicamente si el medio mento de tamaño de la célula. Si la pa-
de cultivo es un medio sólido, mientras red celular está alterada, la capacidad
que en medio líquido los protoplastos de crecimiento subsiste pero la de divi-
son más fáciles de obtener. Parece ser sión dependerá del medio ambiente. Así,
que en medio líquido, únicamente las la formación de cuerpos grandes y pe-
células adheridas a una superficie (como queños únicamente tiene lugar si existe
la del recipiente) encontrarían el soporte una protección más sólida, como cuando
adecuado para su multiplicación. Algu- se utilizan agar o membranas de filtro
nos investigadores, como Lederberg 10 , como soporte para el cultivo.
opinan que la separación entre proto-
Se pensó que el suero, humano o de ca-
plastos y formas L es artificial y llama-
ballo, fresco o inactivado, era impres-
rían protoplasto a aquellas células que
cindible para su producción, pero varios
aumentan de tamaño en un medio líqui-
autores han comunicado recientemente
do, y formas L a las que producen una
colonia en "huevo frito" en un medio haber tenido éxito en sus cultivos sin su
sólido. utilización. Varios investigadores han ob-
tenido lo que ellos llaman forma R me-
Una vez obtenidas las colonias L en un diante la utilización de un sistema con
medio sólido, la ulterior multiplicación anticuerpos y complemento. Las formas R
de las mismas en medio líquido puede serían bacterias cuya morfología no ha
comeguirse únicamente inoculando el sufrido ninguna aparente modificación
caldo con un bloque de agar que con- pero que han perdido la capacidad de
tenga varias colonias. multiplicarse. Si estas formas R son so-
metidas a la acción de la lisozima, se
En la producción de cultivos en fase L, convierten en formas L -de nuevo ca-
además del inductor se requiere la pre- paces de multiplicarse en un medio só-
sencia de un estabilizador osmótico con lido- o en esferoplastos, capaces de
el objeto de impedir la lisis osmótica de multiplicarse y revertir.
los organismos producidos. Son muchas
las sustancias empleadas a tal fin, tales Poetschke ha producido fase L de Co-
como cloruro sódico, cloruro de cesio, rynebacterium (difteroides) simplemente
tartrato potásico, polietilenglicol, cloruro exponiéndolas al suero humano normal,
amomco, cloruro cálcico, sacarosa y lo que en cierto modo puede explicar
otras muchas. En ocasiones, utilizando la creciente frecuencia con que vemos en
un control con estabilizador osmótico pe- clínica casos de endocarditis bacteriana
ro sin inductor, se ha visto que tiene subaguda producida por difteroides, de
lugar cierta formación espontánea en curso persistente y resistente a la peni-
fase L, lo que sugiere se trata de un cilina.
Dicientbre, 1973 ESFEROPLÁSTO~, Pl<Ofül'LÁSTOS Y FORMAS L 315

En cuanto a la cantidad de antibiótico, Se ha visto que en muchos casos, si no


por ejemplo penicilina, necesaria para en todos, el protoplasto emerge a nivel
producir crecimiento en fase L, la pro- del septo de división. La explicación de
ducción es máxima para una cierta con- este fenómeno parece ser que es precisa-
centración, siendo cualquier cantidad por mente a nivel del septo donde la sínte-
encima o por debajo de ésta, menos efi- sis de la pared celular es más activa, y
caz. Esto es particularmente cierto para por lo tanto más susceptible a la peni-
aquellos microbios sensibles a la penici- cilina. Este septo, ahora poco polimeri-
lina, ya que para los resistentes, cuanto zado por la acción de la penicilina, que-
mayor sea la concentración del antibió- da a la merced de los enzimas autolíticos
tico tanto mayor será la producción. La que, como se ha demostrado al menos
concentración óptima de antibiótico es, para el S.faecalis en nuestro laboratorio,
además, independiente para cada cepa están concentrados en forma activa a ni-
microbiana. vel de] septo. Las autolisinas encuentran
pues una pared poco polimerizada a ese
En muchos casos se ha podido ver la nivel y por lo tanto más fácil de romper.
formación espontánea de esferoplastos.
Tras l 00-120 horas de cultivo, el re- Gooder señala en sus trabajos que los
cuento de esferoplastos comienza a au- organismos en fase L podrían ser varian-
mentar y lo hace al mismo ritmo que el tes producidas espontáneamente y que
recuento del cultivo original disminuye. normalmente sufrirían lisis. Su hallazgo
Estos esferoplastos son osmóticamente en tejidos y otros materiales clínicos po-
resistentes. Los enzimas autolíticos jue- dría explicarse por la presencia en ellos
gan con toda probabilidad un papel im- de poliaminas, calcio, magnesio y otras
portante al actuar sobre los enlaces de sustancias que ejerzan un papel osmopro-
polimerización de la pared celular, como tector. En este caso, deberíamos hablar
sugieren los trabajos de Shockman 12'· B. i;, de supervivencia de la fase L "in vivo"
en los que se ve que las autolisinas del más que de la producción de fase L
S.faecalis potencian la acción de la liso- "in vivo". En este sentido apuntan igual-
zima en la formación de esferoplastos. mente los trabajos de Godzeski 1, quien
Se ha comprobado que las lisinas de sostiene que la capacidad de los microor-
ciertos fagos pueden producir crecimien- ganismos de perder al menos parte de su
to en fase L "in vitro" y que algunos envoltura rígida y existir en fase L, es
cultivos infectados con fagos dieron lu- una propiedad inherente de todos los
gar a la formación de crecimiento en microorganismos y cuya manifestación
fase L. Es posible que este mecanismo depende probablemente del medio am-
ocurra también "in vivo", lo que podría biente. No obstante, se ha podido aislar
explicar la marcha de ciertas infecciones de varios tejidos una sustancia, aún no
crónicas, pero hasta el momento actual, identificada, que incorporada a los me-
carecemos de evidencia de que tal sea dios de cultivo induce crecimiento en
el caso. fase L.

La acción de la lisozima en la inducción Poco se ha investigado sobre el fenóme-


de la fase L se basa en la degradación de no paradójico de zona descrito por Eagle.
la pared celular por la enzima, a menu- Lederberg 10 opina que los microorganis-
do seguida de la extrusión de los meso- mos que sobreviven en presencia de una
somas. Lo sorprendente es que los orga- concentración de antibiótico superior a
nismos en fase L sin mesosomas con- la mínima inhibidora, como la que apa-
serven su capacidad de reversión y de rece alrededor de un disco de antibiótico
multiplicación. de un antibiograma, por dentro de la
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zona de inhibición (donde la concentra- aisladas de material clínico representen


ción del antibiótico es mayor que en la formas iniciales en el proceso de rever-
periferia de la zona de inhibición) perte- sión de organismos en fase L producidos
nec-c a la fase L. Tipper y Strominger is "in vivo".
sugieren como explicación de este fenó-
meno el que la penicilina a baja concen- En nuestra experiencia, las células com-
tración no inactivaría totalmente la trans- ponentes de las colonias G mostraron un
peptidasa responsable de la síntesis de gran pleomorfismo y en general su ta-
la pared celular y el resultado sería una malío era mayor que el de las células
pared celular débil, y por lo tanto muy del cultivo original. Hemos podido obser-
sensible a enzimas autolíticos y a diver- var su aparición en cultivos procedentes
sos agentes externos. Si la concentración de material clínico y alrededor de los
de penicilina es elevada, la inhibición de discos en los antibiogramas de rutina.
la síntesis de la pared celular sería más Generalmente desaparecen tras uno o dos
completa y como resultado de la misma subcultivos y ésta es probablemente b
e¡ microorganismo no adquiriría pared razón por la que son pocos los autores
nueva alguna, pero la pared que poseía que se han detenido a pensar sobre el
previamente presentará todavía una rigi- papel que puedan jugar en la etiología
dez normal, eficaz para proteger al proto- o persistencia del proceso infeccioso. En
]e, literatura se encuentran referencias a
plasto contenido en su interior.
aislamiento en material clínico de colo-
Las colonias G (granulares) han sido ob- nias G de estafilococo, estreptococo, shi-
servadas accidentalmente en ciertos estu- gela, salmonela, gonococo, brucela, pseu-
dios llevados a cabo con antibióticos, y domonas, E.coli y otras especies.
su aparición resulta difícil de predecir con
nuestros conocimientos actuales ya que
sólo aparecen dentro de una limitada V. Propiedades generales de los orga-
gama de concentraciones del antibiótico, nismos en fase L.
justo por encima de la concentración mí-
nima inhibidora. Los elementos que las La virulencia, resistencia al suero, faci-
componen muestran un metabolismo y lidad de conversión a la fase L, así co-
ritmo de multiplicación enlentecidos, mo los efectos sufridos por la fagocito-
aunque conservando la mayoría de las sis y por el sistema anticuerpo-comple-
características del cultivo original. Una mento, son propiedades que parecen es-
propiedad general de estas células es su tar de algún modo relacionadas.
gran resistencia a los antibióticos (2-1 O Los organismos en fase L de distintas
veces más resistentes que el cultivo origi- especies varían en su resistencia al me-
na]), probablemente por su metabolismo dio ambiente. Su estabilidad es suscep-
enlentecido. Las colonias G son muy di- tible de inducción y una vez obtenido su
fíciles de mantener y generalmente re- crecimiento en medio sólido, es posible
vierten al transferirlas a un medio sin adaptarlas primero a crecer en un medio
antibiótico. líquido hiperosmótico, y gradualmente
Las colonias G han sido descritas inde- reducir la concentración de suero o sa-
pendientemente de la fase L pero es más les hasta alcanzar las propias de los
que probable que ambos procesos estén medios de cultivo ordinarios. Es posible
relacionados ya que los dos son induci- que la multiplicación de las formas L
dos por los mismos agentes y en condi- no sea una división activa sino un sim-
ciones similares, presentando muchas ple fenómeno físico, producto del conti-
características en común. Así, por ejem- nuo crecimiento del citoplasma, sin alte-
plo, es muy probable que las colonias G ración aparente, que avanza en el medio
Dicie;nbre, 1973 ESFEROPLASTOS, PKUTUPLAS1üS Y FORMAS L 317

ambiente rodeándose de una membrana nes, han sido útiles para lograr la re-
celular de gran plasticidad. versión:
Susceptibilidad a los antibióticos: No l. Uso de medios de cultivo contenien-
existe acuerdo sobre la susceptibilidad do un 25 % de gelatina.
de los organismos en fase L a los anti-
bióticos. Unos investigadores creen que 2. Aumento de la concentración de agar
en general son altamente resistentes a en el medio hasta 2'5 %.
los antibióticos, a excepción de la anfo- 3. Pase a un medio sin suero de un mi-
tericina B, nystatina y algunas sulfami- croorganismo en fase L que previamen-
das. Sin embargo, la opinión más exten- te había sido cultivado en un medio con
dida es la de aquellos que consideran suero.
~ los organismos en fase L más resistentes
que el cultivo original a la penicilina, 4. Uso de medios a los que se ha aña-
cicloserina y otros antibióticos que actúan dido extractos de levaduras y precurso-
a nivel de la pared celular, pero más res de la pared celular.
sensibles a otros antibióticos como eri- 5. Inoculación in vivo en algunos teji-
tromicina, tetraciclina y oleandomicina. dos de animales de experimentación.
La razón de este desacuerdo es probable-
mente la heterogeneidad del material Una publicación de Landman 9 aparecida
con que cada investigador trabaja. Por recíentemente proyecta nueva luz sobre
ejemplo, parece demostrado que aquellos el problema de la reversión. Como la
organismos en fase L que presentan ma- mayoría de los organismos que revierten
yor estabilidad (menor tendencia a rever- carecen de mesosoma, él llega a la con-
tir) son más resistentes. De todos modos, lusión de que esta estructura no es im-
estos estudios sobre susceptibilidad a los portante para la reversión. En el caso
antibióticos no parecen tener una gran de la reversión en gelatina, el material
significación porque únicamente estudian nucleoide parece condensarse al mismo
la concentración mínima inhibidora (bac- tiempo que el organismo adopta un claro
teriostática) y resulta muy difícil de eva- pleomorfismo. Más adelante, la envoltura
luar la sensibilidad de organismos que de celular se hace patente, seguida por la
por sí son muy difíciles de cultivar. aparición del mesosoma. El proceso de
la reversión tiene lugar de forma sincró-
nica y previamente a la multiplicación.
VI. Reversión al cultivo original Landmann consiguió un 100 'X1 de rever-
sión sin aumento en el recuento total de
Este aspecto ha sido ampliamente estu- organismos. Las mejores condiciones pa-
diado por la importancia que presenta ra la reversión son un medio con gelatina
para el laboratorio clínico, donde es muy de consistencia firme, lo que hace pensar
difícil llegar a un diagnóstico de especie en un mecanismo puramente físico.
sin haber obtenido previamente su re-
versión. El uso de gelatina también ha dado bue-
nos resultados en nuestras manos al tra-
Parece haber acuerdo en que la facilidad
tar de recuperar microorganismos de te-
con que un organismo en fase L revierte
jidos de ratón sano. Las placas de gela-
es inversamente proporcional al tiempo
tina dieron invariablemente un recuento
en que ha estado en presencia del agente
mucho más alto que utilizando el mismo
inductor.
medio sin gelatina. La diferencia en nú-
En resumen, nuestros conocimientos se mero fue atribuida a microorganismos re-
limitan a diversos trucos que, en ocasio- vertidos.
318 J. M. PURRES Vol. XVII

VII. Patogenicidad de los microorga- 4. Cultivos en fase L inoculados en sa-


nismos en fase L co alantoideo provocaron la infección y
muerte del embrión, con y sin reversión
Una vez vista la facilidad de convers10n de la fase L.
a la fase L, la frecuencia con que el 5. Guze ·1 inoculó enterococos en la mé-
proceso ocurre espontáneamente, la mul- dula renal de ratas vivas y administró pe-
tiplicidad de agentes capaces de inducir nicilina. Los ratones desarrollaron pielo-
esta conversión y los primeros aislamien- nefritis y de los tejidos en autopsia, sola-
tos "in vivo", el problema de la posible mente se pudieron recuperar organismos
patogenicidad de estas formas bacteria- en fase L.
nas atípicas adquirió gran importancia. 6. Koptelova 8 inoculó organismos en
En teoría, y para el fin que nos propo- fase L de estafilococos y de estreptococos
nemos aquí, tras la inoculación "in vivo" en conejos, pudiendo producir meningitis.
de un microbio en fase L, pueden pre- Parece ser que las meningitis producidas
sentarse tres eventualidades: por organismos en fase L son menos ma-
lignas que las producidas por sus formas
l. Que no reviertan ni produzcan toxi- originales.
nas.
7. Wittler 16 · 17 produjo, en ratones, in-
2. Que no reviertan, pero que produzcan fecciones de tipo benigno tras la inocu-
toxinas. lación de organismos en fase L que no
3. Que reviertan a la forma general. revirtieron.
8. Monos inoculados con la fase L de
Los experimentos diseñados para estu- estreptococos desarrollaron amigdalitis
diar estas posibilidades, utilizando diver- seguida de complicaciones cardíacas.
sos animales y esquemas de inoculación,
así como huevos embrionados y tejidos 9. Freeman observó la muerte de célu-
de cultivo, han proyectado cierta luz, las fagocitarias varias horas después de
aunque en ocasiones los resultados pa- la ingestión de organismos en fase L.
recen equívocos, probablemente por las 1O. La inoculación intracutánea de fa-
diferencias en el material inoculado, vía se L de salmonela da lugar a la forma-
y dosis de inoculación, edad y sexo de ción de abscesos asépticos.
los animales. 11. En muchos casos, la inoculación de
Resumiendo, se ha podido ver que: organismos en fase L va seguida de su
permanencia en los tejidos sin producción
l. Microbios en fase L que no revier- de síntomas. En otros casos, desaparecen
ten tras su inoculación parecen carecer sin dejar rastro.
de poder invasivo.
12. Freimer demostró antigenicidad cru-
2. Algunos microorganismos en fase L zada entre antígenos localizados en la
son capaces de producir toxinas tras su membrana celular de estreptococos y sar-
moculación, produciendo los consiguien- colema de músculo cardíaco, estriado y
tes síntomas en el animal inoculado. liso. lo que sugiere que estos antígenos
Scheibel demostró que la fase L del Cl.te- que normalmente permanecen inaccesi-
tani produce tanta toxina como el cul- bles para el huésped, se hacen aparentes
tivo original, y a veces más. cuando el microorganismo sufre la trans-
3. Algunas vacunas preparadas con or- formación a la fase L, siendo entonces
ganismos en fase L proporcionan protec- posible el desarrollo de complicaciones
ción contra infecciones producidas con la inmunológicas. Algunas enfermedades ge-
forma original. neralmente consideradas de índole inmu-
Diciembre, i973 ESFEROPLASTOS, PRüTüPLASTüS \' FORMAS L 319

nológica suelen precederse de una infec- gérmenes. Es bien sabido que muchos de
ción vana! o incluso de la simple coloni- estos pacientes se benefician de vacunas
zación por cepas bacterianas saprofíticas. confeccionadas con estos microbios.
Por ejemplo, en algunos procesos reuma-
tológicos -donde los cultivos son tra- En un paciente en tratamiento con anti-
dicionalmente negativos- un buen núme- bióticos, pueden aparecer organismos en
ro de investigadores está aislando ahora fase L. Estos organismos pueden rever-
fase L de estreptococo. No sería sorpren- tir más tarde, una vez interrumpido el
dente que un proceso análogo fuese res- tratamiento, y dar lugar a una recidiva.
ponsable de algunos "catarros de repeti- En algunos casos, organismos en fase L
ción", donde la colonización de nariz y han sido recuperados, incluso varios años
garganta por estreptococos, neisseria y después del tratamiento. También se ha
otros componentes de la flora normal se vist0 que la fase L de Brucella tiene una
seguiría de una reacción alérgica a antí- supervivencia intracelular mucho más lar-
genos de la membrana celular de estos ga que la forma original.

TABLA

ORGANISMOS EN FASE L AISLADOS EN PROCESOS INFECCIOSOS

Fibrosis pulmonar quística S.aureus


-
Endocarditis bacteriana subaguda Enterococo
Candida tropicalis
S.aureus
Difteroides
Leucemia S.aureus
Difteroides
Fiebre tifoidea Salmonela
Adenitis cervical Pseudomonas
-----
Reumatismo poliarticular agudo Estreptococo ---- -
Escarlatina Estreptococo
Artrosis S.aureus
Panadizos Estafilococo
Meningoencefalitis Listeria monocitogenes
Estafilococo
Estreptococo
Hemofilus influenza
~---
Pneumococo
Tuberculosis Mico bacteria
Nefritis Proteus
Enterococo
Estafilococo
Estreptococo
Alkaligenes faecalis
Difteroides
Hemofilus
Neisseria
Escherichia
Micobacteria
- ------~~ ~~-- ----------~

Proceso infeccioso Fase L identificada


320 J. M. PORRES Vol. XVII

TABLA II

MATERIAL CLINICO DEL QUE SE HA AISLADO FASE L

Líquido cefalorraquídeo Estafilococo


Enterococo
Hemofilus influenza
Pneumococo
~

Sangre Estreptococo
Difteroides
Candida tropicalis
Estafilococo
Salmonella
Enterococo
Mico bacteria
Pneumococo
Brucela
Leucocitos Escherichia
B2cteroides (Fusiforme)
··-
Orina Neisseria
Escherichia
Alkaligenes faecalis
Proteus
Enterococo
Difteroides
Hemofilus
Pus Estafilococo
Riñón Estreptococo
Enterococo
Estafilococo
Timo Difteroides
Biopsia
Médula ósea Difteroides
:
i
1 Corazón Estafilococo
Enterococo
1
Vejiga Proteus

Se ha estudiado intensamente la presen- que para la forma típica de micobacte-


cia de organismos en fase L, tanto en ria, tanto por inmunofluorescencia como
individuos sanos como enfermos. Las ta- por tinción con Zhiel-Nielssen. Esto po-
blas I y II resumen estos hallazgos. En dría explicar lo que en realidad ocurre
individuos sanos, sólo en algún caso ais- con los pacientes tuberculosos: poco
lado se ha podido demostrar su presen- tiempo después de comenzar el trata-
cia. En enfermos, se aislaron organis- miento, el esputo deja de ser positivo
mos en fase L en un 30 % de los hemo- para la forma bacteriana típica pero en
cultivos, mientras que las técnicas habi- muchos casos sigue siéndolo para la
tuales sólo detectaron un 10 % de culti- fase L.
vos positivos. En pacientes tuberculosos
(casos probados) son muchos más los La formación de fase L "in vivo" parece
esputos que son positivos para la fase L facilitarse por el tratamiento con antibió-
Diciembre, 1973 ESFEROPLASTOS, PROTOPLASTOS Y FORMAS L 321

ticos, desarrollo de inmunidad, larga du- la explicación en el propio microbio. Me


ración de la enfermedad y el tipo de lo- Dermott ll, quien tanto esfuerzo ha puesto
calización de la infección. Así, se ha en el estudio de estos problemas, habla
visto que la supervivencia de la fase L de un estado de "indiferencia antibiótica"
es mucho más prolongada en pulmón y que ocurriría "in vivo" y que, en esencia,
riñón que en peritoneo. Muchas veces consistiría en un estado en el que la bac-
estos organismos resultan difíciles de re- teria ni es fundamentalmente inhibida por
cuperar a menos que primero se trituren la droga ni tampoco capaz de multipli-
los tejidos cuidadosamente. Sobre la per- car~e libremente en su presencia, como
sistencia en riñón, se piensa que varios sería el caso de los microbios genética-
factores pueden jugar algún papel: Los mente resistentes al antibiótico. McDer-
iones amonio excretados por el riñón mott asocia este estado de "indiferencia
inactivan el componente C'4 del comple- antibiótica" con un desvío hacia el ci-
mento, lo que puede ayudar a explicar clo L por parte de la bacteria.
la persistencia en médula renal. Además,
la médula renal goza de cierta hiperos- Corrientemente, para distinguir entre sa-
molaridad, al menos mayor que en híga- lud e infección, ponemos nuestra aten-
do o bazo. ción en los cambios desarrollados en los
mecanismos de defensa del huésped, con-
Se solía pensar que la terapia antibiótica siderando al parásito como algo pasivo
podía fracasar si el antibiótico no llegaba y relativamente constante, tanto si está
hasta el microbio, y que esto podía ocu- produciendo enfermedad como cuando
rrir de alguna de las siguientes maneras: está en forma saprofítica. Pero parece
1. Por la presencia de barreras impene- más que probable que el paso de una
trables, tales como las vegetaciones de infección de la forma latente a la activa
fibrina o las paredes de un absceso. requiera cierta adaptación por parte del
pan,sito más que un simple fallo de los
2. Por residir los microbios intracelular- mecanismos de defensa del huésped. Me
mente. Dermott cita como ejemplo el que toda-
3. Por cierta inhibición ejercida por el vía no se haya podido aislar Treponema
medio ambiente de una lesión inflamato- pálido en casos de tabes dorsal, a pesar
ria, antagonizando al antibiótico. de admitirse generalmente como su agen-
te causal.
No es este lugar adecuado para exten-
derse en estos detalles, pero baste el de-
cir que se ha demostrado que los anti- VIII. Identificación de los organismos
bióticos penetran en las vegetaciones de en fase L
fibrma, en las paredes de los abscesos y
que así mismo alcanzan a los organismos La mayoría de las técnicas habituales en
residentes dentro de una célula. La reac- el laboratorio de microbiología clínica
ción inflamatoria no interfiere directa- presentan limitada utilidad en este caso.
mente con los antibióticos en general sino La situación ideal sería la de obtener la
para ciertos pares antibiótico-bacteria y reversión de la fase L seguida de su iden-
sólo en ciertos tejidos, y que en otros tificación, pero en ocasiones es muy difí-
casos puede incluso potenciar el efecto cil o sólo se consigue tras prolongado
antimicrobiano o al menos incrementar tiempo (2-12 meses) de subcultivo, del
la 2fluencia de antibiótico al aumentar que nunca se dispone en un laboratorio
la vascularización localmente. de diagnóstico.
Si estas razones aludidas no explican el El enfoque más reciente es el del estu-
fallo de los antibióticos, es lógico buscar dio genético, investigando y comparando
322 J. M. PORRES Vol. XV!l

la composición y secuencia de las bases inmunosueros las hace poco prácticas en


nucleotídicas del ácido desoxirribonuclei- este caso, salvo para confirmar un diag-
co del material cromosómico, ya que éste nóstico de sospecha.
se supone idéntico en la fase L y en su
~i todos los pasos previos muestran un
forma bacteriana típica. Por consiguiente,
el primer paso sería determinar la rela- buen acuerdo, como prueba final confir-
ción (G+C) del organismo en fase L en matoria de gran especificidad se puede
cuestión, seguida por la búsqueda en la utilizar la hibridación de DNA-DNA.
literatura de aquel género microbiano
que presente una composición más simi- IX. Terapia
lar. Ulteriormente, algunas pruebas bio-
químicas pueden ayudar a aproximar la
especie a que pertenece. Se ha sugerido una serie de sistemas pa-
ra impedir la formación de fase L "in
Dado que muchas de las características vivo" o para eliminarla una vez produ-
bioquímicas del cultivo bacteriano se cida, pero estas sugerencias teóricas to-
conservan en la fase L, pueden ser em- davf a carecen en general de la confirma-
pleadas como técnica auxiliar en su iden- ción por la experimentación en animales
tificación. Cohen, Wittler y Faber 1 han y humanos. En este sentido, sería de in-
llevado a cabo un extenso estudio a fin terés que varios grupos de investigado-
de determinar qué pruebas bioquímicas res y clínicos abordaran el problema en
pueden ser de mayor utilidad en este sen- distintos sentidos a fin de poder obtener
tido. Ellos llegaron a la conclusión de la suficiente información sobre estos gér-
que las pruebas de la fosfatasa, oxidasa, menes atípicos que nos permita desarro-
catalasa, glucosa (oxidación-fermenta- llar una logística adecuada contra ellos.
ción), desaminación de la fenilalanina, Han sido utilizadas con éxito vacunas
reducción de los nitratos, telurito y sales autógenas en el tratamiento de endocar-
de tetrazolio son las más convenientes ditis bacterianas subagudas por difteroi-
por su reproducibilidad. La utilización des donde los antibióticos, a los que es-
de los carbohidratos, por ser más sus- tas bacterias eran sensibles (penicilina),
ceptible de cambios genéticos o fenotípi- no habían logrado erradicar la infección
cos, no es considerada tan práctica. y se aislaron repetidamente organismos
en fase L que demostraron ser de esa
La mayoría de los organismos en fase L misma especie bacteriana.
conservan la capacidad de producir las
toxinas propias de su especie, las cuales Algunos autores recomiendan una terapia
pueden a veces detreminarse con facili- antibiótica combinada o alternant~, uti-
dad mediante pruebas de rutina. lizando dos antibióticos de distinto meca-
nismo de acción. Generalmente se reco-
Aunque una identificación por medios mienda que uno de los antibióticos sea
serológicos sería muy interesante, hay eritromicina, triacetiloleandomicina o te-
que tener en cuenta que las reacciones tractclina, y el segundo antibiótico uno
inmunológicas dependientes de compo- que sea activo frente a la forma bacte-
nentes de la pared celular pueden no riana de que se trate.
tener lugar aquí, según el grado de ca-
rencia de pared celular que la fase L La kanamicina, en asociación con peni-
en estudio presente. Las pruebas de in- cilina o cefalotina, parece ser eficaz en
munodifusión, fijación del complemento prevenir la formación de fase L y es su-
e inmunofluorescencia figuran entre las perior a la combinación penicilina-estrep-
más recomendadas, pero el hecho de te- tomicina, ya que muchos de los organis-
ner que ensayar toda una batería de mos que desarrollan resistencia a la es-
Diciembre, 1973 ESFEROPLASTOS, PRO! OPLAS! OS Y FORMAS L

treptomicina, suelen ser sensibles a la casi el doble que el del micoplasma más
kanamicina todavía, mientras que lo in- grande.
verw no es cierto.
Aquellos autores que en un principio
Una medida muy clásica y de base pura- creyeron haber conseguido la revers10n
mente empírica en sus orígenes, es la de un micoplasma a una forma bacte-
ingesta frecuente de amplias cantidades riand, como es el caso de Klieneberger-
de líquido en caso de infección renal, Nobel, estaban trabajando en realidad
que es una de las infecciones donde es con fase L, como se han podido dar
más probable la formación de fase L. Al cuenta ellos mismos más tarde 7 •
disminuir la osmolaridad en el riñón se
puede reducir la cuantía de organismos
en fase L, como Kalmanson y Guze 6 XI. Conclusiones
han demostrado en animales de experi-
mentación, y ello a pesar de que el po- Parece más que probable que la fase L
der antiséptico de la orina, función de su constituye un fenómeno mucho más co-
osmolaridad, pH y contenido en urea, rriente en la naturaleza de lo que inicial-
disminuya temporalmente como conse- mente se pensó, que está muy relaciona-
cuencia de la dilución de la orina. do con el fracaso aparente de muchos
tratamientos con antibióticos, cronicidad
y recidiva de procesos infecciosos.
X. Micoplasmas y fase L de las
bacterias Para aumentar la eficacia en el diagnós-
tico de laboratorio deberían utilizarse
Debida a ciertas semejanzas en su mor- medios capaces de recuperar la fase L.
fología, durante mucho tiempo se supuso Aunque es preciso investigar más para
que ambos tipos de organismos eran una obtener un medio de cultivo ideal, la
misma cosa, creando cierta confusión. grar1 cantidad de muestras procedentes
Esta semejanza es debida probablemente de enfermos claramente infecciosos donde
a que el micoplasma también carece de las técnicas de rutina no consiguen po-
pared celular. ner de manifiesto agente patógeno algu-
no, requiere que tanto médicos como per-
Hoy día, sin embargo, no cabe lugar a sonal de laboratorio tengan presente la
duda sobre la falta de identidad de es- posibilidad de estar frente a un caso
tos microorganismos, ya que se ha po- por fase L.
dido demostrar que la relación (G + C)
es mucho menor en el micoplasma que Nuestros conocimientos actuales hacen
en la fase L o que en cualquier bacteria suponer que el uso de medios de cultivo
conocida. También, los micoplasmas con- con agarosa (el agar a veces inhibe el
tienen en su membrana ciertos colestero- crecimiento de la fase L) y el uso de
les nunca hallados en la bacteria. medios con un 25 % de gelatina, cons-
tituirían una gran ayuda en el estudio
A pesar de que los micoplasmas son de las muestras procedentes de este tipo
mucho más exigentes en cuanto a la com- de pacientes. Estos medios de cultivo no
posición del medio de cultivo se refiere, sólo facilitarían la recuperación de la
son mucho más fáciles de aislar y culti- fase L sino que además acelerarían su
var que la fase L, y se encuentran más reversión a la forma bacteriana, más fá-
profusamente en la naturaleza. Otra dife- cil de identificar. ·Estos cultivos deberían
rencia es que el tamaño de la menor mantenerse en estudio por lo menos una
fase L hasta ahora encontrada es todavía o dos semanas antes de de~1cartarlos.
324 T. M. PORRES Vol. XVII

Los organismos en fase L suelen ser ex- c10n. Con la tinción de Gram, suelen
tremadamente frágiles y por ello es pro- aparecer rosa, aunque nosotros hemos
bab1e que en las extensiones aparezcan obtenido repetidamente, de material hu.
como material amorfo, consecuencia de mano, formas teñidas en azul. Se ha re-
su mal trato. El estudio de preparaciones comendado filtrar las muestras a estudiar
en fresco, o con colorantes en solución previamente a su cultivo, con el objeto
hipertónica, puede poner de manifiesto de separar las formas bacterianas que, de
organismos que de otro modo se perde- estar presentes en el cultivo, podrían eclip-
rían. A tal efecto se ha propuesto el uso sar el crecimiento de la fase L.
de naranja de acridina que, por su espe- En los medios líquidos, deberían añadir-
cificidad por los ácidos nucleicos, puede se sustancias que aumenten la presión os-
diferenciar los organismos en fase L de mótica, tales como sacarosa o sales --par-
otros materiales presentes en la prepara- ticularmente magnesio.

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