Abstracto

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Introducción
Durante su vida, los organismos vivos tienen que adaptar su crecimiento y desarrollo a
factores exógenos como el estrés y la disponibilidad de nutrientes. Por lo tanto, han
evolucionado diferentes vías reguladoras para aumentar la percepción de las señales
ambientales y para ajustar las modificaciones metabólicas requeridas. Estas vías emplean
jugadores clave conservados que vinculan el agotamiento de la energía, que a menudo es el
resultado del estrés y la limitación de nutrientes, a las actividades celulares anabólicas y
catabólicas. Una de las vías más importantes que se encuentran en todos los eucariotas es la
relacionada con el objetivo de la proteína quinasa rapamicina (TOR). TOR es una quinasa
grande, que opera en al menos dos complejos multi-proteínas (TORC1 y TORC2; para
revisiones, ver: Wullschleger et al., 2006 ; Laplante y Sabatini, 2012 ;Albert y Hall, 2015 )
y controla una gran cantidad de productos biológicos. En animales y levaduras, es bien
sabido que la TOR regula positivamente la síntesis de proteínas y las actividades anabólicas
cuando las condiciones de crecimiento son favorables, al tiempo que reprime los
mecanismos implicados en el reciclaje y el catabolismo ( Laplante y Sabatini,
2012 ; Shimobayashi y Hall, 2014 ). De hecho, la producción de proteínas consume mucha
energía, ya que requiere la biogénesis del ribosoma y la traducción del ARNm ( Warner,
1999 ).
En plantas, hasta ahora solo hay evidencia de la presencia del complejo TORC1 que
comprende la proteína asociada a la Regulación conservada de TOR (RAPTOR) y las
proteínas Lethal with Sec 13 (LST8), (para revisiones, ver: Robaglia et al. ,
2012 ; Henriques et al., 2014 ; Xiong and Sheen, 2014 ; Rexin et al., 2015 ; Dobrenel et al.,
2016 ). Ya se ha demostrado que TOR controla una amplia gama de procesos biológicos en
plantas ( Deprost et al., 2007 ; Caldana et al., 2013 ; Xiong y Sheen, 2014 ; Dong et al.,
2015) y se ha evidenciado un vínculo entre el complejo TOR y la traducción de
proteínas. De hecho, hemos demostrado anteriormente que la inactivación de TOR, ya sea
después del silenciamiento ( Deprost et al., 2007 ) o mediante el uso de un inhibidor de
TOR ( Sormani et al., 2007 ) conduce a una disminución de la abundancia de
polisomas. También se ha demostrado que la reiniciación de la traducción después de un
largo marco de lectura abierto hacia arriba por el transactivador-viroplasmina del factor de
reiniciación viral de la planta está mediada por su asociación física con la proteína TOR
( Schepetilnikov et al., 2011 ). Además, la actividad TOR parece esencial para la
reiniciación de la traducción de ARNm celular que contiene ORF cortos en la UTR 5
'( Schepetilnikov et al., 2013 ).
The biochemical analysis of the plant cytoplasmic ribosome showed that it contains 81
different proteins, 33 for the small 40S subunit and 48 for the large 80S subunit (Giavalisco
et al., 2005; Carroll et al., 2008; Carroll, 2013; Browning and Bailey-Serres, 2015; Hummel
et al., 2015). In animal cells, TOR regulates cap-dependent translation by phosphorylating
and stimulating the activity of the ribosomal protein S6 kinase (S6K), a conserved target of
TOR which phosphorylates the 40S ribosomal protein S6 (RPS6, Barbet et al., 1996; Holz
et al., 2005), and by repressing the inhibitory effect of eIF4E-binding protein (Ma and
Blenis, 2009; Albert and Hall, 2015). Consistently, in yeast, TOR inhibition by rapamycin
leads to an 80% reduction in overall translation (Barbet et al., 1996). It has been shown in
mammals that S6K is activated in a TOR-dependent manner by phosphorylation of Thr389
and Thr229 (Ma and Blenis, 2009), resulting subsequently in the phosphorylation of serine
residues in the C-terminal extremity of the ribosomal protein RPS6. Early on RPS6, which
is located at the right foot of the 40S subunit, was identified as the only phosphorylated
protein in the ribosome small subunit (Gressner and Wool, 1976).
Se ha postulado que TOR regula la traducción de un subconjunto particular de ARNm que
contiene un motivo de oligopirimidina del tracto terminal 5 '(TOP) (para una revisión,
ver Meyuhas y Kahan, 2015 ). Los ARNm de TOP canónicos albergan un residuo de C en
la posición 1, seguido de un estiramiento de 4 a 15 pirimidinas. La primera evidencia
sugirió que TOR activa la traducción del ARNm TOP a través de la fosforilación de S6K y
RPS6, pero esta hipótesis se cuestionó más tarde ya que el ARNm TOP se traduce
normalmente en ratones deficientes en S6K ( Meyuhas y Kahan, 2015 ). El genoma de
Arabidopsis contiene dos genes S6K repetidos en tándem y las proteínas codificadas por
estos genes están directamente fosforiladas por TOR ( Mahfouz et al.,
2006 ; Schepetilnikov et al., 2011 , 2013; Xiong et al., 2013 ). El nivel de fosforilación de
las proteínas S6K se correlaciona positivamente con su capacidad para fosforilar RPS6
( Turck et al., 1998 , 2004 ; Mahfouz et al., 2006 ; Browning y Bailey-Serres, 2015 ). En la
levadura, los análisis fosfoproteómicos no dirigidos señalaron que RPS6 era el principal
objetivo de fosforilación de la TOR en el ribosoma ( Huber et al., 2009 ). En plantas, se
encontró que RPS6 era la principal proteína ribosomal fosforilada en células de tomate y se
encontró que esta fosforilación se reducía después del estrés por calor ( Scharf y Nover,
1982 ) o en raíces de maíz privadas de oxígeno ( Bailey-Serres y Freeling,
1990). Posteriormente, un estudio de las modificaciones postraduccionales de las proteínas
ribosómicas de Arabidopsis solo identificó Ser240 en RPS6 y Ser137 en RPL13, junto con
proteínas ácidas, como fosforiladas ( Carroll et al., 2008 ). Se detectaron múltiples sitios de
fosforilación en la región C-terminal de RPS6, incluyendo Ser238 y Ser241 para maíz
( Williams et al., 2003 ) y Ser237 y Ser240 para Arabidopsis ( Chang et al., 2005 ). Además
se encontró fosforilación Ser240 ser inducida por la luz y alta CO 2 condiciones ( Turkina et
al., 2011 ; Boex-Fontvieille et al, 2013. ). Más recientemente, Nukarinen et al. (2016)han
observado una fuerte inducción de la fosforilación de RPS6 Ser240 cuando la actividad de
la quinasa 1 relacionada con la sacarosa no fermentadora 1 (SnRK1) disminuye. Sin
embargo, a pesar de la acumulación de datos que muestran variaciones en la fosforilación
de RPS6 de la planta en respuesta a varias tensiones, el papel preciso de esta fosforilación
C-terminal en la regulación de la traducción sigue siendo en gran medida esquivo.
Dado que se encontró que TOR afectaba la traducción en plantas, realizamos un análisis
global fosfoproteómico, transcriptómico y translatómico de la fracción ribosomal después
de la inactivación de TOR. Curiosamente, observamos un fuerte efecto de la inactivación
de TOR en la expresión de las proteínas ribosómicas plastídicas codificadas nuclearmente
(pRPs) y se encontró que el principal sitio de fosforilación controlado por la actividad de
TOR era Ser240 en la proteína ribosómica citoplasmática (cRP) RPS6. Finalmente, hicimos
uso de este sitio de fosforilación específico para diseñar un método robusto basado en el
oeste para cuantificar la actividad TOR en extractos de plantas.
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Materiales y métodos

Materiales vegetales y condiciones de crecimiento

Se cultivaron semillas de dos líneas TOR RNAi independientes inducibles por etanol (5.2 y
6.3, descritas en Deprost et al., 2007 ), así como una línea de sobreexpresión GUS inducible
por etanol (como control) ( Deprost et al., 2007 ) se cultivaron en in vitro en condiciones de
día largo (16 h luz / 8 h noche) durante 7 días en 1/5 sólido Murashige y medio Skoog
suplementado con sacarosa 0,3% (p / v) a una temperatura constante de 25 ° C y una
intensidad de luz de 75 μE.m -2 .s -1. Las plantas se trataron posteriormente con vapor de
etanol durante 3 o 10 días. Las plántulas completas de dos réplicas biológicas
independientes de cada condición se recolectaron luego en el medio del período de luz y se
congelaron directamente en nitrógeno líquido, se molieron y se sometieron inmediatamente
al protocolo de enriquecimiento de ribosomas.

Enriquecimiento de ribosomas
Se aislaron subunidades ribosómicas (40S y 60S), monoribosomas (80S) y polirribosomas
del polvo de plántula según Bailey-Serres y Freeling (1990) con modificaciones
menores. Recién cosechadas y plántulas molidas se homogeneizaron a una concentración
final de 10% (w / v) en el tampón de extracción enfriado con hielo (0,2 M Tris-HCl [pH 9],
0,4 M KCl, 0,025 M EGTA, 0,035 M MgCl 2 , 0,2 M de sacarosa) suplementado con 2% (v
/ v) de Triton X-100, 2% (v / v) de Tween 20, 2% (v / v) de NP-40 y 1% (p / v) de
desoxicolato de sodio. Los extractos se incubaron en hielo durante 10 minutos para
solubilizar los ribosomas unidos a la membrana y se centrifugaron a 2880 xg durante 15
minutos a 4 ° C. Los sobrenadantes se dispusieron en capas sobre un colchón de sacarosa
(0,04 M Tris-HCl [pH 9], 0,2 M KCl, 0,005 M EGTA, 0,03 M MgCl 2, 1.75 M de sacarosa)
y ultracentrifugado a 225 000 × g durante 14 h. El sedimento enriquecido en ribosoma se
resuspendió en 300 μl de tampón Laemmli ( Laemmli, 1970 ) y se desnaturalizó a 100 ° C
durante 10 min.

Análisis LC-MS / MS
Para la caracterización proteómica, las fracciones enriquecidas con ribosomas se
sometieron primero a una corta migración a través del gel de apilamiento de una SDS-
PAGE, para eliminar el ARNr y el posible contaminante químico, incluidos los
detergentes. Después de una tinción con Coomassie, la banda única de proteínas, para cada
muestra, se cortó y se dividió en cinco piezas que se enviaron, en gel, a la digestión,
reducción y alquilación trípticas. Las fracciones que contenían péptidos fueron luego
analizadas por nano LC-MS / MS como se describió anteriormente ( Boex-Fontvieille et al.,
2013). Brevemente, la cromatografía de líquidos en línea se realizó en un sistema NanoLC-
Ultra (Eksigent). Los péptidos eluidos se analizaron con un espectrómetro de masas Q-
Exactive (Thermo Electron) utilizando una interfaz de nanoelectrospray (sonda capilar no
recubierta, 10 μ id; Nuevo objetivo). Los péptidos y las proteínas correspondientes se
identificaron y agruparon con X! Tandem Pipeline utilizando la liberación de X! Tandem
Piledriver (2015.04.01) ( Craig y Beavis, 2004 ) y la biblioteca de proteínas TAIR10 con la
fosforilación de la serina, treonina y tirosina como un péptido potencial. modificación. La
tolerancia de la masa del precursor fue de 10 ppm y la tolerancia de la masa del fragmento
fue de 0.02 Th. Las proteínas identificadas se filtraron y agruparon utilizando el X!
TandemPipeline v3.3.4 1 . El filtrado de datos se logró de acuerdo con un péptido E.-valor
inferior a 0.01. La tasa de descubrimiento falso (FDR) se estimó en 0,92%. La
cuantificación relativa se realizó utilizando el software MassChroQ ( Valot et al., 2011 )
mediante la integración del área de pico en cromatogramas de iones extraídos (XIC) dentro
de una ventana de 10 ppm, después de la alineación del cromatograma LC-MS / MS y el
filtrado de picos.

Enriquecimiento de fosfopéptidos
Las plántulas de Arabidopsis cultivadas en placas de agar MS en condiciones estándar de
16/8 hy 21/17 ° C día / noche se transfirieron a medio MS líquido complementado con
NAA 10 μM (Sigma-Aldrich). Los extractos de proteínas totales se precipitaron con acetato
de amonio 0,1 M en metanol al 100%, se redujeron, se alquilaron y se digirieron durante la
noche con tripsina (Promega, Madison, WI, EE. UU.) En bicarbonato de amonio 50
mM. Los péptidos resultantes se secaron al vacío y se resuspendieron en ácido acético 250
mM con 30% de acetonitrilo para enriquecimiento de fosfopéptidos con el gel de afinidad
de hierro Phos-Select (Sigma-Aldrich) de acuerdo con el protocolo de Thingholm et
al. (2008) . Los fosfopéptidos eluidos se desalaron y analizaron mediante nano LC-MS /
MS en un TripleTOF 5600 (Sciex, Canadá) acoplado a un sistema NanoLC-2DPlus con el
módulo nanoFlex ChiP (Eksigent, Sciex).

Transcriptome y análisis de translatome

Los análisis transcriptómicos y translatómicos se realizaron en dos réplicas biológicas
utilizando plántulas de 7 días de las dos líneas de control independientes TOR RNAi y
GUS cultivadas in vitro y tratadas con etanol durante 24 h. Se realizaron análisis de
transcriptomas utilizando matrices CATMA en preparaciones de ARN total como se
describió anteriormente ( Moreau et al., 2012 ). Para los análisis translatómicos, se extrajo
el ARN total y las fracciones polisómicas se purificaron en gradientes de sacarosa después
de la ultracentrifugación como se describió anteriormente ( Deprost et al., 2007 ; Sormani
et al., 2011). Los ARN unidos a polisomas se extrajeron utilizando hidroxicloruro de
guanidinio y se precipitaron con isopropanol y acrilamida lineal como
vehículo. Posteriormente, los ARN se transcribieron de forma inversa y se hibridaron en
matrices CATMA como se describe anteriormente para la determinación de los ARNm
traducidos diferencialmente ( Sormani et al., 2011 ). El análisis estadístico de cada
comparación se basó en dos cambios de tinte y siguió el análisis descrito por Gagnot et
al. (2008) y Moreau et al. (2012) . Brevemente, se realizó una normalización de arreglo por
arreglo para eliminar los sesgos sistemáticos. Para determinar los genes expresados
diferencialmente, realizamos una prueba t pareada en las relaciones logísticas promediadas
en el intercambio de tinte. El crudo p-los valores fueron ajustados por el método de
Bonferroni, que controla la tasa de error familiar para mantener un fuerte control de los
falsos positivos en un contexto de comparación múltiple. Consideramos como expresadas
diferencialmente las sondas con un valor de Bonferroni P ≤0.05, como lo describen Gagnot
et al. (2008) . Los resultados están disponibles en línea en la base de datos CatDB 2 .
Producción de anticuerpos
Los anticuerpos dirigidos contra el RPS6A fosforilado se obtuvieron conjugando la
hemocianina de lapa californiana con el péptido SRLpSSAAAKPSVTA (phosphoSer240)
(producido por Proteogenix, Schiltigheim, Francia) e inyectando dos conejos blancos New
Zealand White (realizados por Proteogenix). Se realizaron siete inyecciones durante un
período de 56 días. Luego se realizó una prueba ELISA preliminar en el día 63 para evaluar
el título de los anticuerpos y los conejos se sangraron en el día 70. Los antisueros obtenidos
se agotaron primero contra el péptido no fosforilado inmovilizado y luego los anticuerpos
específicos se purificaron utilizando el péptido SRLpSSAAAKPSVTA fosforilado. La
especificidad de los anticuerpos purificados se evaluó utilizando una prueba ELISA con los
péptidos fosforilados y no fosforilados (producidos por Proteogenix) (Figura
Suplementaria S3).).

SDS-PAGE y Western Blotting

Los anticuerpos primarios utilizados en este estudio están dirigidos contra RPS6 de
mamíferos (Cell Signaling Technology # 2317S), RPL13 de colza ( Sáez-Vásquez et al.,
2000 ) y RPS14 de Arabidopsis (Agrisera AS09 477).
Para la detección de RPS6 fosforilado, las proteínas totales se extrajeron de líneas de tipo
salvaje (Col-0), TOR RNAi o de control de Arabidopsis utilizando el tampón Laemmli y se
secaron con nuestro anticuerpo específico para fósforo RPS6. El ensayo de Bradford (Bio-
Rad) se realizó para cuantificar las concentraciones totales de proteínas. Se separaron diez
microgramos de proteínas mediante geles de SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de
difluoruro de polivinilideno (PVDF, Bio-Rad) mediante electrotransferencia. Las
membranas se sondaron con antisuero policlonal de conejo antifosfo-RPS6 (P-RPS6)
(dilución 1: 5000) o con IgG monoclonal de ratón anti-RPS6 (dilución 1: 1000). Como
anticuerpos secundarios se usaron IgG-HRP anti-conejo de cabra (peroxidasa de rábano
picante 1: 2000, Santa Cruz Biotechnologies) y IgG-HRP anti-ratón de cabra (1: 2000,
Santa Cruz Biotechnologies). La inmunodetección se realizó mediante el uso de sustratos
quimioluminiscentes mejorados (ECL) para HRP según lo recomendado por el fabricante
(Clarity Western ECL substrato de transferencia Bio-Rad). Las proteínas transferidas en
membranas de PVDF se visualizaron mediante tinción con Ponceau S.

Análisis de motivos
Las secuencias 5 'UTR de los ARNm de las proteínas ribosómicas se obtuvieron de la
base de datos TAIR10 3 . La identificación de los motivos se realizó con el software en línea
MEME 4 ( Bailey et al., 2009 ) con un tamaño de reconocimiento de motivo comprendido
entre 6 y 50 nt. Sólo se utilizaron las isoformas representativas de los genes.

Números de acceso
Arabidopsis RPS6A: At4g31700 y RPS6B: At5g10360. Los datos brutos proteómicos están
disponibles en la base de datos Protic con el siguiente nombre de acceso: tor_inactivation 5 .
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Resultados

Enriquecimiento De Ribosomas Por Ultracentrifugación De Densidad

El objetivo de este estudio fue identificar, mediante un análisis proteómico no dirigido,
modificaciones en la fracción de ribosoma de Arabidopsis en respuesta a la inactivación de
TOR. Primero, evaluamos la idoneidad de nuestro método de extracción de ribosomas para
el análisis de LC-MS / MS. Para ello, se recolectaron plántulas de Arabidopsis (Col-0) de 7
días de edad y, para prevenir las actividades de proteasa, fosfatasa o quinasa, se enviaron de
inmediato al protocolo de purificación de ribosomas (ver Materiales y
métodos). Finalmente, las partículas de alto peso molecular, incluidos los polisomas, se
sedimentaron mediante ultracentrifugación a través de un cojín de sacarosa.
A continuación, presentamos la fracción ultracentrifugated a SDS-PAGE y proteínas
resueltas se tiñeron utilizando nitrato de plata ( Figura Figura 1a1A ). El perfil de proteína
obtenido es típico de las fracciones ribosómicas de plantas purificadas ( Carroll et al.,
2008 ). La presencia de proteínas ribosomales en esta fracción se confirmó por análisis de
transferencia Western que permitió normalizar las fracciones de proteínas mediante la
dilución de las muestras de acuerdo a cuantificaciones de Western blot
( Figura Figure1B1B ).
FIGURA 1
Determinación de las cantidades de proteína ribosomal antes de los análisis de LC-MS /
MS. Los extractos de plantas se sometieron a ultracentrifugación a través de un cojín de sacarosa
para obtener una fracción enriquecida en ribosomas. Las bolitas se resuspendieron en tampón
Laemmli y se analizaron para determinar la abundancia de proteínas ribosómicas mediante SDS-
PAGE y transferencia de Western. (A) Gel teñido con nitrato de plata después de SDS-
PAGE. (B) Western blot contra las proteínas ribosómicas RPS6, RPL13 y RPS14. Exp1 y Exp2
corresponden a dos réplicas biológicas independientes. GUS es la línea de control, RNAi1 y RNAi2
son las dos líneas independientes de TOR RNAi. Todas las líneas fueron inducidas con etanol. MM,
marcador molecular.
Para desactivar TOR, utilizamos dos líneas de ARN RNA de TOR inducibles por etanol
(basadas en el operón AlcR / AlcA) que obtuvimos y caracterizamos previamente ( Deprost
et al., 2007 ) y las comparamos con una línea de control que expresa un GUS inducible por
etanol. gen (control GUS, Deprost et al., 2007 ; Dobrenel et al., 2011 ).

Identificación de proteínas ribosómicas mediante análisis LC-MS / MS

Las plántulas de dos líneas de ARNi independientes y del control de GUS se cultivaron
durante 7 días in vitro.y luego se trata con etanol para inducir la inactivación de
TOR. Repetimos el mismo experimento dos veces y luego analizamos las seis muestras
juntas. Con el fin de eliminar el rRNA contaminante eventual, así como los productos
químicos, las muestras se enviaron primero a una migración corta a través de un gel de
apilamiento SDS-PAGE. Los análisis proteómicos y fosfoproteómicos por LC-MS / MS
identificaron un total de 5936 espectros, correspondientes a 1508 secuencias peptídicas
únicas (los datos sin procesar están disponibles en la base de datos Protic). Los péptidos se
adaptaron a las secuencias de proteínas de TAIR10 y se agruparon de acuerdo con la
homología de la secuencia utilizando el Pipeline X! Tandem con la fosforilación de serina,
treonina y tirosina como una posible modificación del péptido. Por este método, 361
proteínas diferentes fueron potencialmente identificadas por al menos dos secuencias
peptídicas, pertenecientes a 217 grupos (que presumiblemente corresponden a familias de
proteínas, basadas en homologías de secuencia). Entre estas 361 proteínas, 210 se
identificaron por la presencia de al menos dos péptidos proteotípicos (es decir, específicos
de una proteína dada). Sobre la base de las anotaciones anteriores de las proteínas
ribosómicas (Sormani et al., 2011 ; Tiller and Bock, 2014 ; Hummel et al., 2015), se
encontró que más de la mitad de los 361 proteínas fueron proteínas ribosomales (147
corresponden a los ribosomas citosólicos y 46 a orgánulo ribosomas)
( Figura Figure2A2A ). Usando un análisis in silico , Sormani et al. (2011) refinó la
anotación de las proteínas ribosómicas (incluidas las plastídicas y las
mitocondriales). Utilizamos esta lista para identificar las proteínas (y, por lo tanto, los
péptidos) correspondientes a los ribosomas mitocondriales y plastídicos. Todos los péptidos
organelares identificados correspondieron a ribosomas plastídicos.
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FIGURA 2
Efecto de la inactivación de TOR en el citosol y orgánulo de las proteínas
ribosómicas. (A) Distribución de las proteínas identificadas en al menos una de las muestras
dependiendo de si forman parte del ribosoma citosólico, el organos ribosoma o no
ribosomal. (B) Diagrama de Venn que muestra el número de péptidos correspondientes a las
proteínas ribosómicas citosólicas identificadas en el control GUS y en las líneas de ARNR de
TOR. Las intersecciones de dos conjuntos de péptidos se muestran en naranja y la intersección de
los tres conjuntos en rojo. Se muestra el número total de péptidos y las áreas son representativas del
número de péptidos comunes o específicos. (C) , igual que (B)para el orgánulo ribosoma excepto
que las intersecciones se muestran en medio y verde oscuro para dos o tres conjuntos de péptidos,
respectivamente. (D) Diagrama de caja que representa la abundancia relativa (log 2 veces el cambio)
de los péptidos derivados de las proteínas ribosómicas en el ARNi TOR en comparación con las
líneas de control GUS dependiendo de su localización en los ribosomas citosólicos o
plastídicos. Para cada péptido se obtuvo una abundancia media de las cuatro repeticiones (dos
experimentos independientes utilizando las dos líneas de ARNi) y se compararon las relaciones de
abundancia.
El objetivo de la inactivación de la rapamicina en las líneas de ARNi no afectó en gran
medida el número de péptidos detectados que se originan en los ribosomas citosólicos y,
por lo tanto, la mayoría de los péptidos se encontraron tanto en el ARNi como en las líneas
de control (entre 419 y 449 péptidos para líneas de RNAi2 y GUS, respectivamente
; Figura Figure2B2B ). Por el contrario la piscina de péptidos procedentes de PRP se
agotó específicamente en las líneas de TOR de ARNi con solamente 116 y 111 péptidos
detectados para las líneas de TOR RNAi1 y RNAi2, respectivamente, en comparación a
201 péptidos en la línea de control GUS ( Figura Figure2C2C). Un tercio de los pRP
péptidos solo estaban presentes en la línea de control GUS (74 de 218), mientras que un
número mucho menor de péptidos (17) se encontraron específicamente en las líneas de
RNAi.

Análisis cuantitativo de la expresión de genes que codifican proteínas ribosómicas

Con el fin de excluir los sesgos que podrían ser causados por problemas técnicos
potenciales, como el espectrómetro de masas ocupado por algunos péptidos abundantes que
eluyen cerca de los péptidos de interés, cuantificamos las trazas de los picos
correspondientes a los péptidos identificados de las RP plastídicas y citoplásmicas. Estas
áreas de los picos fueron comparados entre las líneas de control de RNAi y GUS para cada
péptido ( Figura Figure2D2D ). Dicho enfoque cuantitativo confirmó que la mayoría de
los péptidos resultantes de la fragmentación de los pRP son, de hecho, menos abundantes
en las muestras TOR RNAi. Esto también confirmado que TOR inactivación no tenía
ningún efecto fuerte sobre la acumulación de los péptidos CRPS
( Figura Figure2D2D). Por lo tanto, estos resultados sugieren una disminución global en la
abundancia de pRPs que resulta en un menor número y cantidad de péptidos detectados en
el análisis LC-MS / MS.
Luego utilizamos el número de espectros (o aciertos de péptidos) por proteína para estimar
la abundancia de proteínas para los pRPs y cRPs. De hecho, se ha demostrado que existe
una relación proporcional entre estos dos valores ( Allet et al., 2004 ; Liu et al.,
2004 ). Utilizamos exclusivamente los espectros correspondientes a péptidos proteotípicos
para evitar un sesgo que sería causado por la muy alta homología de secuencia dentro de las
familias de proteínas ribosómicas. Por este método, se mostró un coordinado baja
regulación de las PPR mientras que los CRPS tienen un perfil mucho menos coordinada y
se encuentran globalmente sólo ligeramente afectados por la inactivación TOR
( Figura Figura 33). Para comprender mejor el papel de TOR en la regulación de la
expresión del gen de la planta, realizamos análisis transcriptómicos y translatómicos
después de la inactivación de TOR, en los que monitoreamos los niveles de ARNm en
muestras de ARN totales y unidas a polisomas. Las variaciones en la abundancia de ARNm
unido a polisoma se determinaron después de la purificación de los polisomas en un
gradiente de sacarosa, la extracción de ARN y la hibridación de microarrays. Para
identificar mejor los objetivos primarios de ARNm regulados por TOR, decidimos acortar
el tiempo de inducción de ARNi mediada por etanol. Se realizaron dos repeticiones
biológicas usando cada vez las dos líneas de ARNi independientes. Los cuatro
experimentos transcriptómicos y translatómicos resultantes se sometieron a un análisis
estadístico para identificar genes comunes expresados diferencialmente en comparación
con las líneas de control GUS (ver Materiales y Métodos).Figura Figura 33 ; Tabla
complementaria S1 ). Primero, casi todos los ARNm codificados en el núcleo que codifican
pRPs, ya sea que se encuentren en la subunidad pequeña o grande, no mostraron cambios
en la abundancia o se regularon a la baja después de la inactivación de TOR en
comparación con la línea de control de GUS tratada con etanol ( Figura Figure3A3A ). En
el lado opuesto, los ARNm que codifican para los cRPs estaban mayormente regulados al
alza ( Figuras 3B, C) excepto por RPL18a-1, que fue la única transcripción que mostró una
disminución reproducible de la abundancia. El análisis translatómico reflejó en su mayoría
las variaciones transcriptómicas, pero para algunos genes que codifican ribosomas
citosólicos, como RPL40 y RPL41, la abundancia total de ARNm no varió
significativamente mientras que se involucraron más en polisomas en comparación con el
control GUS, lo que sugiere una mayor traducción de estos genes
( Figura Figure3C3C ). Tomados en conjunto, estos datos sugieren que existe una
regulación coordinada hacia abajo de los genes nucleares que codifican para las PPR en la
transcripción, traducción (carga polysomal), y los niveles de proteína en respuesta a TOR
inactivación ( Figura Figure3A3A ).
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FIGURA 3
Efecto de la inactivación de TOR en la transcripción, traducción y abundancia de proteínas
ribosómicas. (A) Expresión de los genes nucleares que codifican proteínas ribosómicas
cloroplásticas a nivel de mRNA total (análisis transcriptómico: Tx), a nivel de mRNA unido a
polisoma (análisis translatómico: Tl) y a nivel de proteína (análisis proteómico). (B, C) Nivel de
expresión de los genes que codifican las proteínas ribosómicas citosólicas y se localizan en la
subunidad del ribosoma pequeña o grande, respectivamente. Para los experimentos de transcriptome
y translatome, se compararon las abundancias de ARNm en las líneas TOR RNAi con la línea de
control GUS tratada con el mismo tiempo de inducción de etanol de 24 h. Los resultados
representan la media de las dos líneas TOR RNAi en las dos réplicas biológicas independientes. Las
relaciones de intensidad se muestran en el registro2 escala según la escala de color que se muestra
en la figura de la parte inferior derecha para experimentos transcriptómicos y translatómicos
(Transcr./Transl.). Para el experimento proteómico, se presentan dos réplicas biológicas
independientes (X1 y X2) que usan las dos líneas TOR RNAi. El naranja y el verde pálido
representan una regulación cuantitativa ascendente y descendente, respectivamente, y el rojo y el
verde oscuro representan una regulación cualitativa, respectivamente (péptidos presentes o
ausentes). Sólo se utilizaron los espectros proteotípicos. Las cajas negras indican que no hay
cambios y las cajas blancas representan datos faltantes.
A continuación, examinamos si esta co-regulación implica el reconocimiento de un motivo
conservado en las secuencias 5 'UTR del ARNm codificado en el núcleo que codifica
pRPs. Estas secuencias se analizaron en busca de motivos enriquecidos utilizando el
software MEME ( Bailey y Elkan, 1994 ). Un motivo fuertemente significativa compuesta
de un tramo de pirimidinas se identificó en este conjunto de 5 'UTRs
( Figura Figure4A4A ). Esta secuencia es una reminiscencia del motivo TOP animal que
se encuentra dentro del 5'UTR de la proteína ribosomal de mamíferos que codifica los
ARNm, lo que confiere una regulación de la traducción por parte de TOR ( Meyuhas y
Kahan, 2015 ). El análisis MEME también reveló la presencia de un segundo motivo
enriquecido-G A / ( Figura Figure4A4A). Por el contrario, los 5 'UTRs de los ARNm que
codifican para CRPS fueron significativamente enriquecido para un motivo
TTTAGGGTTT ( Figura Figure4B4B ), que es similar a la secuencia consenso telo-box ya
identificadas en los promotores de estos genes ( Figura Figure4B4B ) ( McIntosh et al.,
2011 ; Wang et al., 2011 ). A continuación se analizaron los 5 'UTRs de los genes nucleares
que codifican PRP, que fueron menos involucrada en polisomas después de TOR
inactivación ( Figura Figure3A3A). Análisis MEME identificado un motivo pirimidina
ricos más corta que es más similar a canónica TOP motivos, pero aún más en el elemento
de traslación pirimidina ricos (prte), un motivo identificado en genes animales que
traducción es controlada por TOR ( Figura Figure4C4C ) ( Hsieh et al., 2012 ). Este
motivo se encuentra en la mayoría de los objetivos TOR de los animales y, a diferencia de
los motivos TOP convencionales, no reside en el inicio de la secuencia del ARNm ( Hsieh
et al., 2012 ). En consonancia, el motivo se identificaron también rara vez está presente en
el inicio de la analizado mRNAs ( Figura Figure4D4D ; Figura complementario S1) pero
está significativamente enriquecido en transcripciones pRP cuya traducción se ve afectada
por la inactivación de TOR. Un motivo ricos en purina también se identificó en este
subconjunto de genes y se encuentra a menudo 3 'al motivo prte similar
( Figura Figure4D4D ).
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FIGURA 4
Motivos identificados en las 5 'UTRs de genes que codifican proteínas ribosómicas. (A)
Los motivos identificados están significativamente enriquecidos en las 5 'UTR de los genes
nucleares que codifican los RP plastídicos después del análisis realizado por el software
MEME. (B) Lo mismo para los genes que codifican para las RP citosólicas. Se muestra el motivo
de teleducto encontrado en los promotores de cRPs. (C) Igual que para (A) pero solo se
mantuvieron las UTR 5 'de los genes que muestran una regulación negativa en los experimentos de
translatoma después de la inactivación de TOR. (D) Posiciones de los motivos identificados
en (C) en las 5 'UTR de las secuencias analizadas. Vea la figura complementaria S1 para más
detalles.
Luego, extrajimos la base de datos pública Transcriptome Genevestigator ( Hruz et al.,
2008 ) para obtener información sobre el perfil de expresión de los genes plastídicos
ribosómicos codificados por el genoma nuclear. De manera interesante, se encontró que
estos genes estaban regulados a la baja en las líneas de RNAi de TOR inducibles por
estradiol ( Xiong et al., 2013 ; Figura suplementaria S2) lo que sugiere que la inactivación
de TOR reduce de forma reproducible su expresión. Los genes nucleares que codifican los
pRP también se inducen fuertemente durante la germinación o después del tratamiento con
luz, lo que es consistente con su papel en la formación de la maquinaria fotosintética. A la
inversa, fueron reprimidos en respuesta a diversos estreses como la infección por
patógenos, sequía, hipoxia o aumento de la temperatura, así como en respuesta a una noche
prolongada. Finalmente, estos genes se indujeron ligeramente en un experimento de
alimentación con sacarosa, pero se reprimieron globalmente en varios experimentos de
inanición con nitrógeno (Figura Suplementaria S2 ).

Fosforilación dependiente de TOR de RPS6 en Ser240

Incluso si la mayoría de los CRPS no fueron afectados por TOR inactivación
( Figura Figure2D2D ) encontramos 30 péptidos que fueron regulados significativamente
hacia abajo ( t -test p -valor <0,05; cuadro complementario S2 ). En la mayoría de los
casos, estos péptidos no son proteotípicos, lo que hace que las conclusiones sean más
complicadas. Los dos parálogos RPS6 citosólicas se identificaron con tres diferentes
péptidos proteotípicos que son significativamente abajo reguladas de una manera
cuantitativa siguiente TOR inactivación ( Figura Figure3B3B). En total, se detectaron 15
péptidos para esta familia de proteínas. Entre estos 15 péptidos, identificamos un péptido
fosforilado que corresponde a la extremidad C-terminal RPS6B. ! El análisis X Tandem
predijo un sitio de fosforilación en Ser240 (SRLpSSAPAKPVAA: Figura Figura55 ;
Figura complementario S3 ). Esta serina parece estar conservada en las proteínas RPS6
eucariotas, incluyendo plantas, y se identificó previamente como ser fosforilada después de
la activación TOR en levaduras y animales ( Pende, 2006 ; Meyuhas, 2008 ; . Yerlikaya et
al, 2016 ) ( Figura Figure66). Con el fin de aclarar la posición real del residuo fosforilado
en este péptido, los resultados fosfoproteómicos se enviaron a un análisis estadístico de
Phoscalc ( MacLean et al., 2008 ). Este análisis no pudo identificar claramente el sitio
fosforilado entre Ser237, 240 o 241 (Figuras complementarias S3C, D ). Sin embargo,
mostró que este péptido RPS6B C-terminal porta solo un grupo fosfato. También se realizó
un análisis fosfoproteómico independiente de plántulas de Arabidopsis tratadas con auxina
(ver Materiales y Métodos). De hecho, estudios anteriores sugirieron que la auxina media la
TOR y, por lo tanto, la activación de S6K1 en Arabidopsis, como se muestra en la
fosforilación de TOR en Ser2424 y S6K1 en Thr449 ( Schepetilnikov et al., 2013). Dado
que S6K1 participa directamente en la fosforilación de RPS6, preguntamos si esta proteína
ribosomal está fosforilada en Ser240 en extractos de Arabidopsis tratados con
auxina. Después de la purificación de los fosfopéptidos mediante cromatografía de afinidad
con metales inmovilizados (IMAC), se identificó de nuevo Ser240 como un sitio de
fosforilación potencial tanto en RPS6A como en B (Tabla complementaria S3 ; Figuras
complementarias S3E, F ). En algunos casos, RPS6A Ser240 se identificó junto con Ser237
(pSRLpSSAPAKPVAA), pero de nuevo la discriminación entre Ser240 fosforilado y
Ser241 no siempre fue posible (Tabla suplementaria S3 ).

FIGURA 5
Regulación a la baja de la fosforilación de RPS6A y RPS6B en respuesta a la inactivación de
TOR. (A)Nivel de fosforilación del péptido C-terminal RPS6B después de 72 h de tratamiento con
etanol. (B) Lo mismo para el RPS6A y (C) para las proteínas RPS6B después de 10 días de
tratamiento con etanol. Cada barra corresponde a la intensidad máxima del péptido fosforilado
normalizado por un péptido proteotípico de la misma proteína (GENDLPGLTDTEKPR para
RPS6A y GVSDLPGLTDTEKPR para RPS6B). Para cada experimento, se presentan los resultados
del control GUS (GUS), el TOR RNAi1 (R1) y las líneas TOR RNAi2 (R2). Exp1 y Exp2
corresponden a dos réplicas biológicas independientes con 72 h o 10 días de inactivación TOR.
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FIGURA 6
Comparación de secuencias de aminoácidos de RPS6. RPS6s de Arabidopsis (AtRPS6A,
At4g31700.1, y AtRPS6B, At5g10360.1), Nicotiana tabacum RPS6 (NtRPS6, P29345.2 ), Zea
mays RPS6s (ZmRPS6-1, NP_001105544.1 y ZmRPS6-2, NP_001105634.1 ), Homo sapiens RPS6
(HsRPS6, NP_001001.2 ), Mus musculus RPS6 (MmRPS6, NP_033122.1 ), Drosophila
melanogaster RPS6s (DmRPS6A, NP_727213.1 y DmRPS6B, NP_511073.1 ) y Saccharomyces
cerevisiae RPS6 (ScRPS6, NP_015235.1) las secuencias de proteínas se alinearon con T-Coffee
( http://tcoffee.crg.cat ). El nivel de conservación está representado por un código de color en el que
los residuos más conservados están en negro, los que tienen una conservación intermedia son grises
y los menos conservados están en blanco. Los péptidos RPS6 identificados en Arabidopsis por el
análisis proteómico están representados por líneas sobre las secuencias de aminoácidos
correspondientes (negro para los péptidos comunes a las dos isoformas y gris para péptidos
específicos de una isoforma). Un asterisco muestra el resto de Ser240 fosforilado conservado.
Incluso si la localización precisa del residuo de serina fosforilada en el término C de la
proteína RPS6B no se pudiera determinar sin ambigüedades, se comparó la abundancia del
péptido monofosfo-SRLSSAPAKPVAA C-terminal entre las líneas TOR RNAi y los
controles GUS. Después de 72 h de exposición a etanol se observó una modesta
disminución en la RPS6B péptido fosforilado C-terminal ( Figura Figure5A5A). Esta
disminución en la fosforilación solo se observó en uno de dos experimentos. Dado que la
abundancia del péptido fosforilado ya era baja en la línea de control para el segundo
experimento, podría ser que la disminución en el nivel de fosforilación fuera menos obvia
en este caso. El péptido RPS6A correspondiente no se encontró en este análisis. Por lo
tanto, para confirmar esta disminución dependiente de TOR en la fosforilación del término
C de RPS6, realizamos una inducción de silenciamiento más prolongada con etanol durante
10 días. En cuanto al tratamiento de 72 h, se han utilizado duplicados biológicos. Se
comparó la abundancia de los péptidos C-terminales monofosfos para las proteínas RPS6A
y RPS6B entre el ARNi y las líneas de control GUS ( Figuras 5B, C). La cantidad de
péptido C-terminal fosforilado fue menor (con una disminución media del 40%) para las
proteínas RPS6A y RPS6B en las líneas de RNAi de TOR cuando se trató con etanol
durante 10 días.
Para confirmar este análisis fosfoproteómico, se generó un anticuerpo fosfoespecífico
contra un péptido sintético SRLpSSAAAKPSVTA en el que solo se fosforiló Ser240. El
anticuerpo policlonal obtenido se purificó contra este péptido y la fracción de anticuerpo se
eluyó detectó una única banda correspondiente en tamaño a las proteínas RPS6
(Figura S4A ; Figura Figura77 ). Además, se encontró que este anticuerpo era altamente
específico para el péptido SRLpSSAAAKPSVTA fosforilado, que no muestra reacción con
el péptido no fosforilado de control en una prueba ELISA (Figura Suplementaria S4B ).
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FIGURA 7
Detección de la fosforilación de RPS6 por Western blot. Los extractos de proteínas totales
obtenidos de plántulas se separaron por SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana. Después de
la incubación con el anticuerpo fosfoespecífico contra RPS6 Ser240 (P-RPS6) o un anticuerpo
monoclonal contra el RPS6 total de mamíferos, un anticuerpo secundario vinculado a la actividad
de HRP se reveló con una cámara CCD (ver Materiales y Métodos para detalles y Figura
complementaria S4 ). (A) Los tratamientos con AZD inhiben la fosforilación de Ser240 RPS6. Las
plántulas de seis días de edad fueron simuladas o tratadas con AZD durante 24 h. NT, plantas no
tratadas a las 0 y 24 h. (SEGUNDO)El tratamiento con sacarosa induce la fosforilación de
RPS6. Las plántulas de seis días se transfirieron a un medio sin azúcar durante 24 hy luego se
trataron de forma simulada (0–24 h) o sacarosa (0,5%) durante 24 h. 0: plantas antes de la inducción
de sacarosa en el momento 0. (C) El silenciamiento de TOR disminuye la fosforilación de
RPS6. Las líneas de control (GUS) o TOR RNAi se cultivaron durante 7 días y se indujeron con
etanol al 5% (v / v) (EtOH). Los paneles inferiores muestran la tinción roja de Ponceau de las
membranas.
Este anticuerpo se usó en un ensayo de transferencia de Western optimizado y la señal
obtenida fue muy fuerte incluso cuando el anticuerpo se diluyó 1/5000. Esta banda co-
migra con la banda decorada por un anticuerpo monoclonal específico contra RPS6 de
mamíferos ( Figura Figura77 ) que se usó posteriormente para cuantificar la cantidad de
RPS6 totales en extractos de proteínas. Tanto el tratamiento de plántulas de Arabidopsis
con AZD-8055, un inhibidor de TOR de segunda generación fuerte y específico ( Montané
y Menand, 2013 ), o el silenciamiento de la expresión de TOR mediante un tratamiento de
etanol de 7 días, dio lugar a una disminución significativa y dependiente de la dosis en el
señal obtenida con el anticuerpo específico de RPS6 fosfo, mientras que la cantidad total de
proteína RPS6 solo disminuyó ligeramente ( Figuras7A, C ). Dado que este anticuerpo es
altamente específico para la proteína RPS6 fosforilada, esto confirma que hay una
disminución reproducible en el nivel de fosforilación de Ser240 después de la inactivación
de TOR. En consecuencia, se demostró previamente en animales que AZD inhibe TOR, y
como consecuencia la actividad S6K y la fosforilación de RPS6 (Chresta et al., 2010). TOR
y S6K se mostraron previamente activados por azúcares como la sacarosa y la glucosa
(Xiong et al., 2013). Consistentemente fosforilación RPS6 fue aumentada por la adición de
sacarosa cuando se suministra a las plantas de semillero de Arabidopsis de azúcar de
hambre (FiguraFigure7B7B ). A continuación, examinamos la cinética de los cambios en
la fosforilación de RPS6 después de los tratamientos con AZD-8055 o con sacarosa
(Figura Figure88 ). Tan pronto como 1 h después de la adición AZD, se observó una
disminución significativa en la fosforilación de Ser240 ( Figura Figure8A8A ). Para la
sacarosa, se detectó un aumento en la fosforilación 2 h después del suministro. Sin
embargo, es difícil en esta etapa de discriminar entre un efecto de señalización directa de
sacarosa y una consecuencia indirecta del metabolismo del azúcar
( Figura Figure8B8B). En conjunto, estos datos sugieren una fuerte correlación positiva
entre el nivel de fosforilación de RPS6, según lo detectado por este anticuerpo policlonal
específico, y la actividad TOR. Por lo tanto, parece que en plantas, como en animales y
levaduras, la fosforilación de RPS6 se puede usar como una lectura robusta y sensible para
la actividad TOR.
FIGURA 8
Cinética de variaciones en la fosforilación de RPS6 después de la adición de AZD-8055 o
sacarosa. Los extractos de proteínas totales obtenidos de plántulas se separaron por SDS-PAGE y
se transfirieron a una membrana. Después de la incubación con el anticuerpo fosfo-específico contra
RPS6 Ser240 (P-RPS6), las transferencias se revelaron mediante un anticuerpo secundario
vinculado a la actividad HRP y se tomaron imágenes con una cámara CCD. (A) Cinética de la
inhibición de la fosforilación de RPS6 Ser240 por AZD 8055. Las plántulas de siete días se trataron
de manera simulada (DMSO) o AZD-8055 (2 µM) y luego se cosecharon en el momento
indicado. (SEGUNDO)Cinética de la inducción de RPS6 Ser240 fosforilación por sacarosa. Las
plántulas de siete días se transfirieron en medio sin azúcar durante 24 hy luego se trataron
simulacros (0) o sacarosa (0,5%). Las plántulas fueron cosechadas en el momento indicado. Los
paneles inferiores muestran la tinción roja de Ponceau de las membranas.
Ir:

Discusión
Varios estudios han investigado el impacto de la inhibición de TOR en Arabidopsis en los
niveles de transcripción o metabolito ( Deprost et al., 2007 ; Moreau et al., 2012 ; Caldana
et al., 2013 ; Xiong et al., 2013 ; Dong et al., 2015 ) pero hasta ahora el proteoma global no
ha sido examinado. En este trabajo, investigamos la expresión de proteínas y genes
ribosómicos utilizando los análisis de transcriptoma, translatoma, proteoma y
fosfoproteoma después del silenciamiento del gen TOR. Con respecto al ribosoma
citoplásmico, identificamos en nuestros experimentos proteómicos 65 familias de proteínas
ribosómicas, correspondientes a 69 isoformas de proteína ribosomal identificadas con al
menos dos péptidos proteotípicos. Hummel et al. (2015)identificaron 165 cRPs isoformas
por LC-MS / MS después de una digestión tríptica. Pudimos encontrar más de un tercio de
estos parálogos de proteínas y solo 16 familias no se encontraron en este análisis. Siete de
estas 16 familias no pueden ser identificadas por LC-MS después de una digestión tríptica
debido principalmente al pequeño tamaño de los péptidos resultantes debido a su alto
contenido en lisina y arginina. Por lo tanto, solo nueve de las 81 familias de proteínas
ribosómicas faltaban en nuestro análisis (RPL22, RPL35a, RPL38, RPP3, RPS27, RPS28,
RPS29, RPS30 y RACK1). Además, este trabajo se ha centrado únicamente en las plántulas
jóvenes, mientras que Hummel et al. (2015) también utilizaron rosetas en su análisis y
algunos parálogos específicos pueden expresarse solo en tejidos específicos o en algunas
etapas específicas de desarrollo ( Weijers et al., 2001; Sormani et al., 2011). Dado que
realizamos nuestros análisis proteómicos utilizando plantas silenciadas para la expresión de
TOR mediante un tratamiento prolongado con etanol (3 y 10 días), nuestro análisis de los
cambios en la abundancia de proteínas puede revelar una adaptación a largo plazo en estado
estable, y en ocasiones indirecta, a una disminución en los TOR. actividad.
En plástidos, la traducción ocurre en los ribosomas de tipo bacteriano
70S. Aproximadamente la mitad de las proteínas de la subunidad del ribosoma pequeño
(30S) del plástido y la mayoría de las proteínas de la subunidad (50S) grandes están
codificadas por el genoma nuclear ( Yamaguchi y Subramanian,
2000 ). Silenciamiento TOR ( Deprost et al., 2007 ; Xiong y Sheen, 2012 ; Caldana et al.,
2013 ), inhibición por rapamicina ( Sormani et al., 2007 ; Ren et al., 2011 ) o por AZD-
8055 ( Montané y Menand, 2013 ; Li et al., 2015 ), así como las mutaciones que afectan el
complejo TORC1 ( Moreau et al., 2012 ; Kravchenko et al., 2015) dan lugar
constantemente a la clorosis de las hojas y al amarilleo. Mostramos aquí que los resultados
de inhibición de TOR en una disminución en la expresión coordinada pRP, a nivel de la
abundancia de proteínas, sino también en el total y traducidos los niveles de ARNm, lo que
podría explicar estos fenotipos cloróticas ( Figura figure33 ). Queda por determinar si esto
es el resultado de una síntesis disminuida o una degradación incrementada de los
componentes del cloroplasto por autofagia, que se induce después de la inactivación de
TOR ( Liu y Bassham, 2010 ). Curiosamente, la expresión de los genes nucleares que
codifican las proteínas citosólicas se encontró que era principalmente inducida, mientras
que el nivel de proteínas a menudo disminuía. Las mismas tendencias se observaron
en Chlamydomonas N-limitadas.donde los niveles de pRPs, así como sus ARNm
correspondientes disminuyeron en respuesta a la falta de nitrógeno, mientras que solo los
niveles de proteína disminuyeron para los cRPs ( Schmollinger et al., 2014 ). El mismo
efecto de la inactivación de TOR en el perfil de expresión de los pRPs se confirmó
mediante la comparación con los datos transcriptómicos obtenidos utilizando la línea de
RNA RNA tor inducible por estradiol (Figura S2 suplementaria ) ( Xiong et al.,
2013). Curiosamente, los genes nucleares que codifican para los pRP se regularon a la baja
en respuesta a varios estreses abióticos o bióticos, lo que sugiere que pueden jugar un papel
importante en la adaptación al estrés (Figura S2 complementaria).). Estos genes también
fueron reprimidos por ABA pero fuertemente inducidos por la aplicación de
brassinolide. Esto es consistente con los efectos inhibidores de ABA sobre las hormonas
que promueven el crecimiento como el brassinosteroid y con el papel de TOR en
brassinosteroid ( Zhang et al., 2009 , 2016 ) y señalización ABA ( Kravchenko et al.,
2015 ; Li et al. , 2015), lo que podría resultar en la inhibición de TOR. Como se informó
anteriormente por Pal et al. (2013)encontramos respuestas diversas y descoordinadas a las
variaciones en el suministro de azúcar para los genes nucleares que codifican pRPS,
mientras que su expresión fue reprimida por la falta de nitrógeno como se observa en
Chlamydomonas ( Schmollinger et al., 2014). En conjunto, estos datos sugieren que los
genes nucleares que codifican los pRPs están controlados por TOR en niveles múltiples
para integrar señales ambientales para la regulación de la traducción del cloroplástico.
En animales, se sabe que la TOR regula la traducción de ARNm que contienen TOP
( Hsieh et al., 2012 ; Thoreen et al., 2012 ; Meyuhas and Kahan, 2015 ). Este motivo está
particularmente presente en la UTR 5 'de genes que codifican proteínas ribosómicas o
componentes de la maquinaria de traducción ( Meyuhas y Kahan, 2015 ). Al utilizar un
análisis MEME, no detectamos ningún enriquecimiento específico para el motivo TOP en
los cRPs. El motivo más abundante estaba relacionada con el telo-box
( Figura Figure4A4A ). Este motivo de ADN se encuentra en las regiones 5 ', a menudo
cercanas al codón de inicio, de genes nucleares que codifican RP tanto mitocondriales
como citosólicos, pero no en los genes que codifican pRPs ( Wang et al., 2011 ). A la
inversa, encontramos una aparición altamente significativa de un motivo rico en pirimidina
en la UTR 5 'de genes nucleares que codifican pRPs. Este motivo es una reminiscencia de
los motivos de arriba ( figuraFigure4A4A ). También se identificó previamente un motivo
similar a TOP en el ARNm que codifica las proteínas ribosómicas en los ejes embrionarios
del maíz (Jiménez-López et al., 2011), pero estos motivos están muy poco descritos en las
plantas. Los motivos TOP canónicos se encuentran al inicio del ARNm, lo que no es el
caso en nuestro análisis. Sin embargo, un estudio previo ha demostrado la presencia de
varios sitios de inicio de transcripción en genes que codifican pRPs (Lagrange et al.,
1993). Es interesante que para el gen plastídico RPL21, el sitio de inicio utilizado
específicamente en las hojas produjo un ARNm que comienza con un motivo TOP
canónico. Las 5 'UTR de los genes de cRP que se traducen menos después de la
inactivación de TOR se enriquecieron en un motivo que es sorprendentemente similar al
PRTE encontrado en las 5' UTR de los genes animales controlados por TOR al nivel de
traducción ( Figuras 4C, D ) ( Hsieh et al., 2012 ). Por lo tanto, es tentador suponer que se
ha reclutado TOR en plantas para regular específicamente en las hojas la traducción de
ARNm nucleares que codifican proteínas ribosómicas cloroplásticas. Anteriormente se
demostró que la traducción de los ARNm que contienen TOP animal se puede regular de
forma diferencial in vitro en un extracto de germen de trigo (Shama y Meyuhas, 1996 ) y
que la auxina estimula la fosforilación de la proteína ribosomal S6 en los ribosomas del
maíz y el reclutamiento de ARNm tipo TOP para su traducción ( Beltrán-Peña et al.,
2002 ). Dado que TOR también se activa con la auxina ( Schepetilnikov et al., 2013 ), estos
datos sugieren que los ARNm de plantas que contienen motivos relacionados con TOP
también podrían regularse de manera dependiente de TOR y S6 fosforilada.
Solo la fosforilación de la proteína RPS6 pudo identificarse de manera reproducible en
análisis fosfoproteómicos no sesgados previos de los ribosomas realizados en eucariotas
( Huber et al., 2009 ; Hsu et al., 2011 ; Yu et al., 2011 ). Sin embargo, a pesar de una gran
cantidad de estudios y varias hipótesis, el papel biológico preciso de estos eventos de
fosforilación conservados sigue siendo controvertido y poco claro. Por ejemplo, la
expresión de RPS6 humano que contiene alanina en todos los restos de serina fosforilados
no modificó la velocidad de traducción general, incluso para los ARNm de TOP ( Ruvinsky
et al., 2005 ). En cambio, el crecimiento y el tamaño de las células, así como la biogénesis
de los ribosomas, se vieron afectados ( Ruvinsky et al., 2005 ; Chauvin et al., 2014). El
mismo resultado se observó en levaduras que expresan RPS6 no fosforilable ( Yerlikaya et
al., 2016 ). Sin embargo, la fosforilación de los residuos de Ser C-terminal de RPS6 se ha
utilizado como una lectura robusta y reconocida de la actividad TOR en animales y
levaduras ( Meyuhas, 2008 , 2015 ; Yerlikaya et al., 2016 ). En este estudio, se observó una
disminución en la fosforilación RPS6 en respuesta a TOR inactivación
( Figuras Figures55 y 77). El análisis fosfoproteómico identificó un sitio de fosforilación
C-terminal en las proteínas RPS6A y RPS6B que es dependiente de la actividad TOR sin
determinar de forma inequívoca cuál de los residuos de serina C-terminal está
modificado. En Arabidopsis, Ser237 fue identificado previamente por MALDI-TOF como
fosforilado, pero la ausencia de fragmentación en la región C-terminal dificultó la
localización precisa de los otros sitios de modificación mediante análisis MS / MS
( Turkina et al., 2011 ; Boex-Fontvieille et al., 2013 ). Un análisis global de fosfoproteomas
de Arabidopsis identificó a Ser237 y 240 como fosforilados junto con Ser247 y Thr249
( Reiland et al., 2009). Chang et al., 2005 ). Varios estudios fosfoproteómicos del ribosoma
de la planta ya han demostrado la presencia de un sitio de fosforilación en el péptido C-
terminal del RPS6 y han sugerido que Ser240 podría ser uno de los residuos modificados
junto con Ser229, 231 o 237 ( Carroll et al. ., 2008 ;). Ser240 se conserva en todas las
plantas de secuencias RPS6 mientras que Ser241 está ausente en las secuencias de maíz y
de tabaco ( Figura Figure66 ). A la inversa Ser237 se encuentra en todas las secuencias de
plantas pero sólo Ser240 se puede alinear con una de las serina fosforilada conocido en la
levadura (Ser232) o (Ser235) secuencia humana RPS6 ( Figura Figure66 ;Meyuhas,
2015 ). Es bien sabido en la levadura y en los animales que la actividad TOR controla la
fosforilación de RPS6 mediante la activación de S6K ( Wullschleger et al., 2006 ; Biever et
al., 2015 ; Meyuhas, 2015 ) y Mahfouz et al. (2006)han establecido que TOR interactúa con
S6K a través de RAPTOR para activar la fosforilación de RPS6. Sin embargo, se debe tener
en cuenta que S6K también se activa por la proteína quinasa 1 dependiente de 3-
fosfoinositida (PDK1) que operó después de la fosforilación de S6K por TOR (Mahfouz et
al., 2006 ; Otterhag et al., 2006 ). Es interesante que la quinasa SnRK1, que probablemente
actúa de manera antagónica con la TOR ( Dobrenel et al., 2016).), recientemente se
demostró que interactúa con y fosforila a RAPTOR en Arabidopsis ( Nukarinen et al.,
2016 ). Además, también se observó un fuerte aumento en la fosforilación de RPS6 Ser240
después de la inactivación de SnRK1. Esto es coherente con la hipótesis de que SnRK1
inhibe la actividad TOR y, por lo tanto, la fosforilación de RPS6, presumiblemente a través
de la fosforilación de RAPTOR ( Nukarinen et al., 2016 ).
Ensayos de Western blot utilizando el fosfato de anticuerpos específicos RPS6 Ser240
demostraron que la fosforilación de este residuo se redujo después de la inactivación TOR
ya sea por silenciar o mediante el uso de un inhibidor específico ( Figura Figura77 ). Por
lo tanto, este ensayo podría usarse como una lectura de TOR en plantas. Los ensayos
anteriores para la actividad de TOR en plantas se basaron en la detección de la fosforilación
de Thr449 en S6K por anticuerpos comerciales dirigidos contra Thr389 fosforilado en el
animal S6K. Sin embargo, estos anticuerpos producen muchas bandas no específicas en los
análisis de Western blot ( Schepetilnikov et al., 2011 ; Xiong y Sheen, 2012 ). Además, la
abundancia de plantas S6K es baja en plantas mientras que RPS6 está presente en grandes
cantidades.
Tomados en conjunto, estos datos muestran que la fosforilación del RPS6 C-terminal
dependiente de TOR se conserva en plantas como en otros eucariotas. Hemos aprovechado
esta fosforilación conservada para diseñar un ensayo sensible y específico para monitorear
la actividad de TOR en plantas. La pregunta que permanece abierta es el papel biológico de
la fosforilación de RPS6. Los estudios estructurales han demostrado que RPS6 es accesible
para el solvente y, por lo tanto, para las cinasas, pero desafortunadamente la región C-
terminal desordenada está ausente de la estructura del ribosoma resuelto (Khatter et al.,
2015). Sin embargo, las modificaciones de carga producidas por la fosforilación de RPS6
probablemente tienen importantes funciones biológicas dentro del ribosoma o para
funciones extra-ribosómicas de RPS6. De hecho, recientemente se informó que el RPS6
afecta la producción de ARN ribosomal e interactúa con la histona desacetilasa HD2B
( Kim et al., 2014 ). Por lo tanto, se necesita más trabajo para dilucidar el papel de los TOR
en la regulación de la traducción o el desarrollo a través de la fosforilación conservada de
RPS6.