UNIVERSIDAD JUAREZ DEL ESTADO DE DURANGO

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

MANUAL DE PRÁCTICAS
DEL LABORATORIO DE
LA MATERIA:

INMUNOLOGIA I

RESPONSABLE DE LA ELABORACION
QBP Hugo Alonzo Rojo

FECHA DE ELABORACION

Gómez Palacio, Dgo.

INDICE
PRACTICA 1…………………………………………………. Practica generales de seguridad
PRACTICA 2………………………………………………….Soluciones y diluciones
PRACTICA 3…………………………………………………. Anatomía del Sistema Inmunologico
PRACTICA 4…………………………………………………. Resistencia no específica (fagocitosis)
PRACTICA 5…………………………………………………. Poder bactericida del suero normal
PRACTICA 6………………………………………………………… Preparacion de inmunogenos
PRACTICA 7………………………………………………………Manipulacion Inmunizacion sangrado de animales
PRACTICA 8……………………………………………………….. Determinación de inmunoglobulinas séricas
PRACTICA 9……………………………………………………….. Antígenos de superficie Grupo Sanguíneo
PRACTICA 10………………………………………………………. Reacciones Aglutinacion: Reacciones febriles
PRACTICA 11………………………………………………………. Pruebas Cruzadas
PRACTICA 12……………………………………………………….Pruebas de Coombs directa e Indirecta
PRACTICA 13……………………………………………………… Antiestreptolisinas, PCR, Factor reumatoide,VSG
PRACTICA 14……………………………………………………… Diagnostico Serologico de Sifilis
PRACTICA 15……………………………………………………… Aislamiento de Linfocitos mediante centrifugación
En gradiente de densidad

PRACTICA 16……………………………………………………… Pruebas Rapidas. Inmunocromatografia

 Inmunología I

SOLUCIONES Y DILUCIONES
Practica No. 2
Introducción
Desde la antigüedad, el uso de las matemáticas ha sido trascendental para el
desarrollo de la humanidad en todas las ramas del conocimiento. La inmunología no es la
excepción, de ahí que, por alta que sea la capacitación del inmunólogo, un error en los
cálculos matemáticos desprovee de sentido la labor realizada, y en la mayoría de las
ocasiones resulta en perjuicio del bienestar de terceros. Por lo tanto, se debe de recordar
que un error en los cálculos equivale un error en el análisis.
Para efectuar racionalmente los cálculos es necesario definir algunos conceptos.
Una solución se define como una mezcla homogénea y estable de moléculas o atomos de
dos o mas sustancias. Los componentes de una solución son el soluto y el diluyente,
entendiéndose como el diluyente al dispersor que contiene el al componente que se
encuentra en menor concentración, la cual se le llama soluto.
Existen varios sistemas para expresar la concentración de una sustancia en solución:

EMPIRICAS………………… Insaturadas
Saturadas
Sobresaturadas

SOLUCIONES VALORADAS...............… Molar

Molal
Normal

PORCENTUALES……………EN VOLUMEN
Peso a Peso
Peso a volumen
Volumen a volumen
Las soluciones empíricas son aquellas en las que su preparación no involucra cálculos
matemáticos previos para establecer la relación entre el soluto y el diluyente.
Dentro de las soluciones valoradas se distinguen las siguientes:
Una solución molar es la que expresa la cantidad de soluto en términos de gramos-mol de
dicha sustancia llevados a 1000 ml de diluyente
Las soluciones mólales, al igual que las soluciones molares, expresan la cantidad de
reactivo a disolver en moles pero la cantidad de diluyente se refiere a 1 Kg del mismo.
En las soluciones normales, la concentración se establece en base a la cantidad de
equivalentes químicos llevados a un volumen de 1,000 ml de diluyente.
Las soluciones porcentuales son aquellas que expresan los gramos o mililitros de soluto
en 100 gramos o mililitros de solución.

En la práctica, es útil saber que es posible utilizar soluciones de alguna concentración

conocida para lograr concentraciones menores, lo que facilita su control y almacenaje.
Cuando a una solución se le disminuye su concentración adicionando cantidades
conocidas del diluyente, se dice que se efectúa una dilución. Las diluciones pueden
expresarse en forma de proporciones (1:2, 1:3. 1:10 etc.), en donde el primer digito
representa el volumen de la solución original, mientras que el segundo numero indica el
volumen final de la solución a la concentración deseada. De esta forma una dilución 1:8
indica que se tiene un volumen de la solución original más siete volúmenes del diluyente.
Dichos volúmenes pueden referirse a cualquier unidad (mililitros, microlitros, litros, etc.)

Cuando se realizan diluciones seriadas como las siguientes 1:10, 1:100, 1:1,000,
1:10,000, se acostumbra a referirse a que se ha empleado un factor de dilución de 10, lo
que implica en que cada ocasión el factor de dilución se multiplica a la dilución inmediata
anterior (1:1x10=1:10x10=1:100x10=1:1,000, etc.). Es muy común hacer serie de
diluciones con un factor de dilución de 2 (1:2, 1:4, 1:8, 1:16 etc.) o de 3 (1:3, 1:9, 1:27 etc.)

I se tiene una solución a una concentración determinada y s e requiere diluir, se puede

calcular fácilmente si se divide la dilución final requerida entre la dilución con que se
cuenta. Asi, si se tiene una dilución 1:5 y se necesita una a 1:45, se divide 45/5=9, por lo
que se tomara un volumen de la dilución 1:5 y se le agregan 8 volúmenes del diluyente,
con ello queda una dilución 1:9 que corresponde a 1:45 de la solución original.

En ocasiones se requieren volúmenes finales precisos, diferentes a los teóricos calculados,

por lo que hay que hacer cálculos adicionales. Por ejemplo si se necesitan 20 ml de una
solución diluida 1:80, no es necesario preparar 80 ml de ella (1 ml de la solución original +
79 ml del diluyente) y luego descartar los 60 ml sobrantes, sino que bastara con calcular la
relación entre el volumen deseado (20 ml) y el teórico calculado(80 ml), que en este
ejemplo es de 0.25 (20/80). Por lo tanto, si la expresión 1:79 se multiplica por 0.25 (0.25 +
19.75 ml = 20 ml) se obtienen los 20 ml deseados y no se altera la proporción 1:80. Del
mismo modo, si se necesitan 400 ml de la dilución 1:80 se calcula la relación entre ambos
volúmenes (400/80) y el factor obtenido (5) se multiplica por la expresión 1+79= 80
(5ml + 395 ml=400 ml)
 I EJEMPLOS

1. Se tiene una solución al 80 %. Si se diluye 1:20 ¿cuál será la concentración final?

R: Se divide 80 entre 20, y el cociente (4) representa la concentración final 4%

2. ¿Cuántos mililitros de una suspensión de glóbulos rojos (GR) se necesitan para

preparar 130 ml a una concentración de 15 %
R: Para preparar una suspensión de GR al 15 %, se deben de tomar 15 ml de
paquete de GR y llevarlos a 100 ml con diluyente. Sin embargo, como se requieren
130 ml de la suspensión al 15 %, se hace la siguiente relación:

15 ml paquete GR-------------- 100 ml

X ml paquete de GR------------ 130 ml
130 ml x 15 ml
Donde x=______________ = 19.5 ml
100 ml
Por lo tanto, se toman 19.5 ml de paquete de GR y se llevan hasta un volumen de
130 ml con el diluyente.

3. ¿Cómo prepararía 1000 ml de HCl 1N?

Peso molecular HCl 36.5 g y su valencia es 1. Su peso equivalente es 36.5/1=36.5.
esto significa que se deben de tomar 36.5 g de HCl y aforar a 1000 ml con agua.
Este acido se encuentra usualmente en estado líquido, por lo que debe de
calcularse el volumen en que esta contenido el peso necesario. De la expresión
d=m/v, se despeja volumen (v), v=m/d. La densidad (d) del HCl es de 1.19 g/ml,
siendo la masa (m) de 36.5 g. Entonces, v=36.5/1.19=30.6 ml. Se requeriría de esta
cantidad si la pureza del HCl fuera del 100 %. Comercialmente se le encuentra con
una pureza del 35 %. Para calcular el volumen de la solución de HCl concentrado
que se necesita, se recurre a la siguiente relación:

30.6--------100% de pureza
X ml-------- 35 % pureza
30.6 ml x 100 %
Donde x=_________________ = 87.4 ml
35 %
Por tanto se necesitan 87.4 ml de HCl concentrado para preparar una solución de
HCl 1N

II PROBLEMAS A RESOLVER
1. ¿Cómo prepararía 250 ml de NaCl 3.5 M?
2. ¿Cómo prepararía 300 ml de HCl 2N? d=1.19 g/ml P.M. 36.5, pureza 35 %
3. Determine los factores de dilución de las siguientes series
 a) 1:5, 1:25, 1:125, 1:625
b) 1:1, 1:1.5, 1:2.25,1:3.375
c) 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000
4. ¿Cómo prepararía una suspensión de eritrocitos al 2 %
5. Se tiene una solución de cloruro de calcio 3N y se requiere utilizarla 2N ¿Qué
dilución debe de hacer?
6. Se tiene un suero humano diluido 1:80 y para realizar una prueba se requiere
diluido 1:5000 ¿Cuánto más se tiene que diluir el suero?
7. ¿ Cómo prepararía 1,000 ml de H2SO4 5N? d=1.84 g/ml PM 98 gmol
8. Se tienen 10 ml de una solución D, y se le agregaron 35 ml de agua para obtener
una solución C
a) ¿Qué dilución realizo?

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Ayres, G.H., 2002. Analisis Quimico cuantitativo. Editorial Harla. Mexico, D.F.
 ANATOMIA DEL SISTEMA INMUNOLOGICO
Practica No. 3
INTRODUCCION

El sistema inmunológico. Todas las expresiones de la respuesta inmunológica dependen

de la existencia y función del aparato o sistema inmunológico. El aparato inmunológico
incluye a los órganos linfoides, al tejido linfoide poli disperso y a los elementos de la
circulación sanguínea y linfática.
Los órganos linfoides. En los mamíferos, los órganos linfoides están representados por el
timo, la medula ósea, el bazo, las amígdalas, los nódulos linfáticos, el apéndice ileocecal y
las placas de Peyer. En las aves existe un órgano adicional llamada “Bolsa de Fabricio”.

Los órganos linfoides se clasifican en dos grandes grupos: los primarios o centrales
(medula ósea, timo y bolsa de Fabricio), y los secundarios o periféricos (bazo, amígdalas,
nódulos linfáticos, apéndice ileocecal y las placas de Peyer. En los órganos linfoides
primarios o centrales, las células del tejido linfoide terminan su proceso de diferenciación
y/o maduración que las hace inmunológicamente competentes. En los órganos linfoides
secundarios o periféricos, las células del tejido linfoide hacen contacto con el antígeno,
proliferan en respuesta al estímulo antigénico, y producen los efectores solubles de la
respuesta inmune celular (citosinas) y de la respuesta inmune humoral (anticuerpos).

Existe además tejido linfoide que no s e encuentra limitado por una capsula de tejido
conectivo. Este es el tejido linfoide polidisperso que se encuentra asociado a las mucosas,
principalmente a la región subepitelial. En el tejido linfoide encapsulado y en menor grado
en el polidisperso, las células linfoides se encuentran “contenidas” por el tejido de sostén
formado por células y las fibras reticulares.

Las células linfoides. Es común denominar células linfoides a todas las células móviles
encontradas en los órganos linfoides, independientemente de su origen. Es asi que las
células linfoides incluyen a los linfocitos, a los monocitos y macrófagos, a otras células
presentadoras de antígeno (células de Langerhans, células veladas, células interdigitantes
y algunas otras), y a las células K (citotóxicas o Killer), células con la apariencia morfológica
de linfocitos, pero distintas en otros aspectos incluyendo su función. Todas estas células
participan en la etapa de inducción de la respuesta inmunológica o como efectoras de la
misma.
Linfocitos. Aunque morfológicamente todos los linfocitos son indistinguibles, en realidad
estas células constituyen una población heterogénea. Para empezar existen dos tipos
fundamentales de linfocitos: los Linfocitos T, cuya diferenciación y maduración se
completan en el timo, y los linfocitos B, que terminan su maduración y diferenciación en la
medula ósea(o en la bolsa de Fabricio en las aves). Dentro de los linfocitos T se distinguen
dos subpoblaciones, los linfocitos T “cooperadores” (Th) y los linfocitos T citotóxicos (Tc).
Más aun, en la actualidad se reconocen al menos dos subpoblaciones de linfocitos T
cooperadores: linfocitos Th1 y Th2. Mientras que los primeros se consideran responsables
de la respuesta inmunológica celular, los segundos se involucran más con la respuesta
humoral. Los linfocitos Th2, a través de los factores solubles que producen, estimulan
proliferación de los linfocitos B, su transformación en células plasmáticas y su capacidad
de síntesis de anticuerpos.

OBJETIVOS
El alumno será capaz de localizar e identificar los órganos más aparentes del sistema
inmunológico: timo, nódulos linfáticos, bazo, placas de Peyer y apéndice ileocecal.
Describirá e identificara la estructura histológica general de los órganos linfoides más
prominentes (timo, bazo y nódulos linfáticos). Por ultimo deberá ser capaz de identificar y
describir las células linfoides que se encuentran en la circulación sanguínea.

MATERIAL Y METODOS
Material por grupo
Papel Higiénico
Cloroformo
Solución salina (SS)
Colorante hematológico
Regulador de fosfatos pH 7.0

Material por equipo

Rata joven (4 a 6 semanas)
Equipo de disección (indispensable)
Charola o tabla de disección
2 portaobjetos de bordes romos (para extensión de sangre)
2 cubreobjetos
Alfileres para sujetar los animales
3 pipetas Pasteur con bulbos
Algodón
Caja Petri
Puente de tinción
Microscopio

Método

I. DISECCION DEL ANIMAL DE EXPERIMENTACION

Se recomienda manejar los animales extremando las precauciones para evitar
mordeduras
1. Sacrificar los animales con cloroformo, utilizando el frasco preparado para este
efecto.
2. Colocar los animales boca arriba sobre la charola de disección y fijarlos a la misma
utilizando alfileres o agujas
3. Limpiar toda la superficie del animal con una torunda empapada de alcohol
4. Hacer una incisión longitudinal en el animal, desde el cuello hasta la cola,
afectando solamente la piel y evitando cortar las capas más profundas (usar
pinzas, tijeras y bisturí)
5. Utilizando las pinzas y la parte roma de las tijeras, romper las adherencias para
separar la piel del cuerpo del animal. Fijar la piel “suelta” a la charola de diseccion
utilizando alfileres o agujas.
6. Disectar la piel, según se muestra en la figura 1, evitar lesionar las zonas marcadas
con asteriscos. Esto es importante porque en estas zonas, cubiertos por la piel a
adheridos a ella, se localiza los nódulos linfáticos cervicales, los inguinales y los
axilares.
7. Localizar las áreas vascularizadas señaladas en la figura 2. Notar el depósito de
grasa en la piel correspondiente a la región abdominal y ubicar la posición de los
nódulos linfáticos inguinales, estos se encuentran adheridos a la piel protegidos
por la grasa subcutánea y se observan como protuberancias discretas.
8. Levantar la piel del cuello para descubrir los nódulos cervicales, estos son los
nódulos de mayor tamaño y se encuentran constituyendo un “cinturón nodular”
alrededor del cuello. Su forma ovoide permite distinguirlos de las glándulas
submaxilares localizadas también en la parte anterior del cuello.
9. Seguir las indicaciones del instructor y proceder a disectar los nódulos linfáticos
cervicales, axilares e inguinales utilizando pinzas y tijeras finas. Tener cuidado de
no destruir los nódulos y colocarlos en una caja Petri que contenga solución salina.
10. Cortar en el plano longitudinal la membrana que recubre la cavidad peritoneal y
descubrir la cavidad torácica cortando la pared anterior de la misma (incluyendo
las costillas) como se muestra en la figura 3. Cuidar de no dañar los órganos
internos. Observar los órganos protegidos por la cavidad torácica, localizar la
posición del timo (este se encuentra en el mediastino, descansando sobre la parte
apical del corazón en la región anterior de los grandes vasos) y removiendo sin
lesionarlo. Depositarlo en la caja Petri.
11. Si durante el proceso de extirpación del timo ocurre la ruptura de algún vaso
sanguíneo, con una pipeta Pasteur recoger una pequeña gota de sangre y
depositarla sobre un portaobjetos para hacer una extensión. Para esto, seguir las
indicaciones del instructor. Si no hay ruptura de vasos sanguíneos, seccionar
alguno de ellos para promover el sangrado y proceder a hacer la extensión de
sangre.
12. En la cavidad abdominal localizar el bazo (figura 3) y proceder a su extirpación.
Separar el órgano, cuidadosamente del tejido conectivo que lo fija al estómago y al
intestino delgado. Depositarlo en la caja Petri.
13. Localizar la región duodenal del intestino delgado (aquella parte que lo conecta al
estómago) y, con cuidado, extender el tubo intestinal cortando la fina membrana
colectiva que lo mantiene en posición. Identificar las placas de Peyer distribuidas a
intervalos en esta región intestinal. Localizar la parte donde el intestino delgado se
une al intestino grueso e identificar el apéndice ileocecal. Dada la composición del
intestino intestinal, no se considera conveniente extirpar estos órganos linfoides.
 Buscar los nódulos linfáticos mesentéricos que se encuentran azarosamente
distribuidos en las membranas que mantienen unidas las asas intestinales (figura
4).

II. EXTENSIONES DE SANGRE

1. Colocar los portaobjetos en posición horizontal y cubrirlos con 1-2 ml de colorante
durante 3 minutos
2. Sin quitar el colorante adicionar regulador de fosfatos sin que se derrame.
Promover la mezcla del colorante y el regulador soplando con cuidado sobre los
portaobjetos. Dejar actuar la mezcla por 10 minutos
3. Lavar los extendidos con agua destilada ayudados de una piceta hasta eliminar el
colorante. Lavar los portaobjetos con una corriente moderada de agua de la llave.
4. Secar las laminillas ventilándolas al aire y proceder a su examen microscópico.

RESULTADOS
Anotar las características morfológicas, de consistencia y color de los nódulos linfaticos,
del timo, del bazo y de las placas de Peyer.
Esquematizar las células observadas en las extensiones de sangre identificando los
diferentes tipos celulares: linfocitos, monocitos y leucocitos polimorfonucleares
(neutrófilos, basófilos y eosinofilos).

BIBLIOGRAFIA
 RESISTENCIA NO ESPECÍFICA FAGOCITOSIS

Practica No. 4

INTRODUCCION
En 1884, Elie Metchnikoff observo la ingestión de diversos microorganismos por
leucocitos de conejo y de humano, fenómeno que denomino fagocitosis. También noto
que la fagocitosis aumentaba cuando los animales estaban recuperándose de alguna
infección o después de una vacunación. Posteriormente, el mismo Metchnikoff demostró
la existencia de dos tipos de leucocitos circulantes capaces de fagocitar: los
polimorfonucleares (PMN) y los macrófagos, proponiendo el término general de
fagocitosis para todas estas células.
La fagocitosis efectuada por los polimorfonucleares se puede dividir, para su estudio, en
cinco etapas relacionadas: quimiotaxis, opsonizacion, ingestión, degranulacion y
destrucción
Quimiotaxis. Es el proceso mediante el cual los fagocitos son atraídos al lugar de invasión
microbiana.
Opsonizacion: Las opsoninas presentes en el suero interaccionan con los
microorganismos y los hacen más susceptibles a la ingestión por los fagocitos.
Ingestión: Los seudópodos citoplasmicos de los fagocitos se extienden al ponerse en
contacto con las bacterias fusionándose sobre el lado distal del material que va a ser
ingerido, englobando a la partícula y formando una vesícula fagocitica denominada
fagosoma.
Desgranulacion: A medida que se forma el fagosoma, los gránulos lisososomales del
PMN adquieren movimiento en la proximidad del fagosoma, se fusionan con la vacuola
fagocitica y desaparecen en el citoplasma.
Destrucción. En los fagocitos existen múltiples sistemas microbicidas. Estos mecanismos
antimicrobianos pueden dividirse en dos categorías: dependientes de oxigeno e
independientes de oxigeno
La respuesta bioquímica de las células fagocíticas al contacto con el microorganismo
conduce a la generación de substancias tóxicas derivadas del metabolismo del oxígeno y el
nitrógeno (radicales libres del oxígeno y el nitrógeno) que incluyen al anión superóxido, al
peróxido de hidrógeno, a los iones hidroxilo, a los singletes de oxígeno, al óxido nítrico y a
otros intermediarios inestables y muy reactivos. (11) Los radicales libres del oxígeno y el
nitrógeno y las enzimas y proteínas microbicidas de los lisosomas se concentran en los
fagolisosomas y son la causa de la muerte y digestión de los microorganismos ingeridos.

OBJETIVO
El alumno será capaz de determinar algunas etapas del proceso de fagocitosis por
observación microscópica después de ensayos in vitro
MATERIAL
Equipo de venopuncion
3 Tubos rojos sin anticoagulante
Perlas de vidrio
Portaobjetos
Jeringa desechable de 10 ml
2 cajas Petri de vidrio
2 pipetas serológicas 5 y 10 ml
1 pipeta serológica de 1 ml
3 pipetas Pasteur con bulbo
Gradilla
Pinzas con extremos planos
Microscopio óptico
3 portaobjetos
Solución salina
Matraz Erlenmeyer de 125 ml
Colorante NBT (nitroazul de tetrazolium)
Safranina (solo un equipo)

METODO
Levaduras (utilizar material estéril: soluciones, tubos, frascos).
1. Preparar una suspensión de levaduras dispersando 1.0 g de levaduras (de
pan) en 100 ml de agua destilada (usar un matraz de 250 ml). Calentar al
autoclave a 15 libras/ 10 min) y luego dejar enfriar.
2. Centrifugar a 1000 rpm durante 5 min (usar tubos de centrífuga de 50 ml).
3. Descartar el sedimento y centrifugar el sobrenadante a 1000 rpm por 5 min.
4. Repetir el paso 3.
5. Descartar el sedimento y recuperar el sobrenadante. El sobrenadante
contiene levaduras “finas” (de pequeño tamaño).
6. Hacer una cuenta de levaduras en una cámara de Neubauer.
7. Ajustar la suspensión a 100 x 106 levaduras por ml con solución salina
fisiológica.
8. Envasar la suspensión en alícuotas (de 10 o 20 ml cada una).

Solución de NBT.
1. Preparar una suspensión de NBT al 0.1% en solución salina fisiológica (disolver 10 mg de
NBT en 10 ml de agua y luego adicionar 85 mg de NaCl sólido, en ese orden). Colorante
safranina

1. Pesar 0.5 g de safranina y disolver en 100 ml de agua destilada (solución al 0.5%)

Opsonización de las levaduras.
1. Tomar 2 alícuotas de 1.0 ml de la suspensión de levaduras con 100 x 10 6 células
por ml y centrifugarlas a 3000 rpm por 5 min (se pueden usar tubos de
microcentrífuga de 1.5 ml).
2. Eliminar el sobrenadante de una de las alícuotas y suspender el botón en 1.0 ml de
suero fresco o suero mantenido a -70ºC.
3. Eliminar el sobrenadante de la otra alícuota y suspender el botón en 1.0 ml de
solución salina fisiológica 4. Incubar las dos alícuotas a 37ºC durante 30 min
4. Centrifugar las dos alícuotas a 3000 rpm por 5 min.
5. Eliminar el sobrenadante de las dos alícuotas y sustituirlo con 1.0 ml de solución
salina fisiológica.
6. Centrifugar las dos alícuotas a 3000 rpm por 5 min (lavado de las levaduras)
7. Eliminar el sobrenadante de las dos alícuotas y sustituirlo con 1.0 ml de la solución
de NBT.
8. Mantener las levaduras en refrigeración hasta su uso, o congeladas a -20ºC si se
van a usar varios días después.
Preparación de los portaobjetos
1. Lavar los portaobjetos (un portaobjetos por prueba) con detergente en polvo
corriente, sin aromatizantes ni aditivos. Usar una esponja para lavarlos.
2. Enjuagar los portaobjetos con suficiente agua corriente y finalmente con agua
destilada.
3. Dejar secar los portaobjetos al aire. De aquí en adelante no tomar los portaobjetos
de las superficies sino de los bordes.
4. Marcar sobre los portaobjetos 3 círculos equidistantes de 1 cm de diámetro (se
puede usar lápiz de diamante o plumón de tinta indeleble. Si se usa lápiz de
diamante los círculos se pueden marcar antes del lavado de los portaobjetos).
Alternativamente, estos portaobjetos se pueden adquirir de un distribuidor
comercial. Hacer alguna marca sobre el portaobjetos para identificar los círculos
control (C, para cuenta diferencial), levaduras opsonizadas (LO), y levaduras no
opsonizadas (LN).
Preparación de las monocapas de células.
1. Tomar 5 ml de sangre venosa y depositarla en un tubo de vidrio de 10 o 15 ml de
tapón de rosca conteniendo aproximadamente 10 perlas de vidrio (o cuerpos de
ebullición) de tamaño pequeño.
2. Mezclar la sangre con las perlas de vidrio por inversión continua del tubo hasta
que se forme la fibrina y se atrape entre las perlas. La mezcla por inversión
requiere de 5 a 10 min.
3. Evitando el coágulo de fibrina, tomar alícuotas de 50 microlitros de sangre
desfibrinada y depositarlas en el centro de cada círculo marcado sobre el
portaobjetos.
 4. Colocar cada portaobjetos dentro de una caja de Petri provista de papel
humedecido en la tapa (cámara húmeda).
5. Incubar las cajas a 37ºC durante 30 min (etapa de adherencia de las células).

Estimulación de las células.

1. Recuperar los cubreobjetos, escurrir el exceso de sangre desfibrinada y lavar las
preparaciones con 2 – 3 ml de solución salina a temperatura ambiente. Este paso
es crítico y la solución de lavado no debe depositarse sobre los círculos que
contienen las células sino por fuera de ellos. El lavado se logra oscilando al aire (no
sobre la mesa) las preparaciones cubiertas con solución salina (cuidado, el lavado
enérgico ocasionará que las células se despeguen).
2. Repetir el lavado una vez más y no se preocupe si todavía observa demasiada
sangre sobre las preparaciones de células.
3. Secar, cuidadosamente, con papel higiénico el líquido que queda alrededor de los
círculos (¡no toque los círculos y no deje que las monocapas se sequen!).
4. Regresar el portaobjetos a la caja de Petri (cámara húmeda) y colocar 50
microlitros de solución salina al círculo control, 50 microlitros de levaduras
opsonizadas al círculo LO, y 50 microlitros de levaduras no opsonizadas al círculo
NO.
5. Incubar las placas a 37ºC durante 30 min.
6. Recuperar los portaobjetos y repetir el proceso de lavado como se indica en los
incisos 1 y 2 de esta sección
Tinción de las preparaciones.
1. Cubrir los círculos con las monocapas celulares con safranina al 0.5% en agua
durante 10 min
2. Enjuagar cuidadosamente las preparaciones teñidas con agua destilada hasta que
se elimine el colorante en exceso (aquí es mejor sumergir las preparaciones en
agua en jarras de Copling, haciendo 2 o 3 cambios del agua de lavado.
3. Recuperar las preparaciones, dejarlas secar al aire (puede ayudarse de aireación
manual).
4. Montar las preparaciones con resina sintética entre porta- y cubreobjetos.
5. Dejar secar la resina y hacer las observaciones al microscopio.

ACTIVIDADES
I. Cuenta diferencial
Observe a 40X las preparaciones de las células control (no estimuladas) y haga una cuenta
diferencial (PMN, MN, Lc y otras células). Prepare una gráfica de barras (porcentaje de
cada tipo celular).
 Observar las células fagociticas notando la diferencia en la endocitosis de levaduras
opsonizadas y levaduras no opsonizadas. Distinguir entre células que redujeron el NAT
(levaduras azules en su interior) de aquellas que no lo hicieron (solamente levaduras rojas)
El grado de endocitosis ocurrido y la capacidad de las células para reducir el NAT se puede
evaluar determinando el porcentaje de células que, habiendo endocitado, han reducido el
colorante.

REFERENCIAS
1. Stites, D.P.; Terr, A.I. & Parslow, T.G. Medical Immunology. 11th Ed. Appleton &
Lange, a Simon & Schuster Co., Stanford, Connecticut.
2. Roitt, I.M.; Brostoff, J. & Male, D. 2007. Immunology 7th Ed. Mosby Publ. London.
PRACTICA No. 5
PODER BACTERICIDA DEL SUERO NORMAL
El suero normal contiene una serie de sustancias, que son capaces de destruir a
las bacterias. Estas sustancias están presentes en mayor o menor grado en todos
los sueros, y por lo tanto no son el resultado de una inmunización previa. Por
esta razón están clasificadas dentro de las defensas inespecíficas del organismo
La cantidad de las diversas sustancias presentes en el suero varía de especie a
especie, y entre individuos. Su eficacia depende también del agente infeccioso
que se trate.

Entre las sustancias más importantes se encuentran:

Lisozima. Esta es una poderosa sustancia bactericida que actúa destruyendo la
pared celular de un gran número de bacterias, sobre todo las Gram (+), se
encuentra presente en forma abundante en las lágrimas (formando el mecanismo
más importante de defensa del ojo), y en el suero. Se encuentra también en
saliva y secreciones mucosas, aunque en menor concentración.

Interferón. Esta es una sustancia viricida de gran poder, que se forma dentro de
las células después de que éstas han sido infectadas. Actúa inespecíficamente
contra todos los virus, y se puede utilizar como protección pasiva en individuos
de la misma especie. Su papel como posible agente inmunizante a nivel de
población está bajo estudio.
Fagocitina, Leuquina: Estas sustancias juegan un papel importante en la
actividad bactericida de las células fagocitarias, aunque su mecanismo de acción
no se conoce con exactitud.
OBJETIVO
Evaluar la sobrevivencia de una bacteria patógena en suero hiperinmune, suero
normal y solución salina fisiológica.
METODOLOGÍA
1) Coloca 0.25 ml de solución salina (SS) estéril en el tubo A
2) Coloca 0.25 ml de suero 1 en el tubo B
3) Coloca 0.25 ml de suero 2 en el tubo C
4) Coloca 0.25 ml (o una asada) de cultivo de Salmonella en todos los tubos.
5) Incuba los tres tubos a 37°C durante 30 min.
6) Diluye el contenido de los tubos 1:20 con SS
7) Inocula 0.1 m de esta dilución en una caja de agar nutritivo.
8) Incuba tus cajas a 37°C durante 24 h.
9) Lee tus resultados y compara con tus compañeros.

Nota: El procedimiento debe realizarse usando técnica estéril.

INVESTIGACIÓN PREVIA AL EXPERIMENTO
1) ¿Qué es un suero hipermmune?
2) ¿Qué es el complemento?
3) Investiga que es la catalasa y el peróxido de hidrógeno
4) ¿Qué es lisozima?
5) ¿Qué es Salmonella?
CUESTIONARIO PARA ANEXAR AL REPORTE
1) ¿Cuántas colonias crecieron en cada caja?
2) ¿En base a esa información, cual suero era hiperinmune y cual el normal?
3) ¿Porque?
4) ¿Cuál es la acción del complemento en el suero normal y en el hipermmune?
5) ¿Cuál es la relación entre catalasa y peróxido de hidrógeno desde el punto de
vista patógeno?
6) Realiza una lista de cinco bacterias en orden decreciente de su sensibilidad a
la lisozima.
 PREPARACION DE INMUNOGENOS
PRACTICA. 6
INTRODUCCION
El concepto antígeno ha sido utilizado para denominar aquellas sustancias extrañas al
organismo que puedan reaccionar específicamente con los anticuerpos o con receptores
celulares. En la actualidad, además del concepto de antígeno, cabe mencionar los
conceptos de inmunogeno y de hapteno. Se define como inmunogeno aquella sustancia
capaz de inducir o estimular una respuesta inmunológica. Por otra parte, el concepto
hapteno fue introducido por Landstainer para denominar aquellas sustancias que son, en
general, de bajo peso molecular, capaces de reaccionar con los anticuerpos o los
receptores celulares sin que por sí mismo generen una respuesta inmunológica, a menos
que se acoplen con un acarreador, generalmente una proteína.
La importancia de trabajar en la obtención de antígenos radica en las diferentes
aplicaciones que se les pueda dar a estos. Por ejemplo, se pueden utilizar en pruebas de
diagnóstico, en la preparación de vacunas, con fines epidemiológicos y de investigación
para estudiar los mecanismos inmunológicos que participan en el reconocimiento
antigénico.
La inmunogenicidad de los antígenos radica en varias de sus características
fisicoquímicas. Su capacidad inmunogenica depende grandemente de su naturaleza
química.

OBJETIVO
Obtener inmunogeno de levadura o de bacteria, uno de naturaleza proteínica y otro
lipopolisacarida.
El porcentaje de polisacáridos que puede contener la pared celular de la levadura puede
ser de alrededor de un 85 a un 90 %, y de un 10 a un 15 % de proteínas. En cuanto a
polisacáridos las paredes celulares de levadura son fuentes importantes de tres tipos de
polisacáridos, polímeros de manosa o manano-proteinas en un 50 % de la masa,
polímeros del tipo beta-glucanos en un 45 % y en menor proporción polímeros de n-acetil-
glucosamina o quitina en un 5 %. Este tipo de polisacáridos son reconocidos como
sustancias inmunoestimulantes.

El antígeno H se encuentra localizado solamente en los flagelos de la bacteria. Su

naturaleza es proteica, y por lo tanto es lábil a temperaturas mayores de 60 C, y al
tratamiento con alcohol y ácidos diluidos. Una determinada cepa de Salmonella en cultivo
puede generar en distintos momentos dos diferentes tipos de antígenos “H”. Los del
primer tipo, denominado de fase uno, o específicos, se comparten entre pocos serotipos
de Salmonella. Los de segundo tipo, llamados de fase dos, son menos específicos. La
clasificación de las enterobacterias se basa en características morfológicas, reacciones
bioquímicas y propiedades antigénicas. Por lo tanto, al trabajar con diferentes antígenos
de un mismo grupo de enterobacterias puede ayudar en la clasificación.
 El antígeno “O” se encuentra en la superficie de la bacteria formando parte de su
membrana externa. A este antígeno se le conoce como la endotoxina de la bacteria.
Debido a que es un polisacárido, este antígeno resiste temperaturas hasta más de 100 C
durante tiempos prolongados y no se destruyen con alcohol ni con ácidos diluidos.

Material por grupo

Centrifuga clínica
Baño maría a 37 C
Charola con solución de Benzal
1 mechero Bunsen
Bote metálico de boca ancha
Tripie
Estándar del nefelómetro de McFarland

Material por equipo

Tubos de Salmonella y Levadura

1 tubo caldo nutritivo
2 tubos con agar nutritivo
2 tubos con caldo tioglicolato con aceite mineral
50 ml de solución salina con 0.3 % formaldehido. Estéril.
50 ml de solución salina al 0.85 % estéril
5 pipetas Pasteur, estériles y bulbo de hule.
5 pipetas de 5 ml
1 frasco gerber
1 mechero bunsen
5 tubos de ensayo de 13X100 mm con tapon de rosca
1 gradilla.

Metodología

Trabajar en condiciones de esterilidad

Para la obtención del antígeno “O”

1. Seleccionar las formas móviles de Salmonella y sembrarlas en un tubo con caldo

nutritivo. Incubar a 37 C de 18 a 24 horas. Sembrar de igual forma la cepa de
Saccharomyces en caldo nutritivo.
2. Agregar a los cultivos solución de formaldehido hasta una concentración final de
0.3 % para la bacteria y al 0.6 % para la levadura.
3. Incubar a temperatura ambiente de 24 – 48 h
4. Cosechar los cultivos por centrifugación a 3000 rpm por 15 minutos.
5. Deshechar el sobrenadante y resuspender el sedimento bacteriano y de levadura
en solución salina formalinizada al 0.3 % con el objeto de fijar químicamente los
 componentes microbianos y levaduriformes hasta igualar la turbidez del tubo No.
3 del nefelómetro de McFarland.
6. Probar esterilidad del producto sembrando dos gotas sobre agar nutritivo y en un
tubo de caldo tioglicolato, incubando los tubos a 37 C para bacterias y a 28 C para
la levadura por 24 h.
7. Mantener las suspensiones en refrigeración hasta su uso.
8. Si hay crecimiento en alguno de los tubos para la prueba de esterilidad, desechar el
producto.

Para la obtención del antígeno “H”

1. Cosechar el crecimiento de salmonella spp y de la levadura Saccharomyces
obtenidos en un tubo inclinado con agar nutritivo, agregando 2 ml de solución
salina estéril, y agitar vigorosamente hasta obtener una suspensión homogénea.
2. Pasar la suspensión a un tubo de ensaye estéril con la ayuda de una pipeta Pasteur
estéril
3. Colocar el tubo en un baño maría a ebullición durante 90 minutos.
4. Centrifugar a 3000 rpm por 15 minutos.
5. Desechar el sobrenadante y resuspender el paquete bacteriano en solución salina
formalinizada al 0.3 % para bacterias y de 0.6 % para levaduras, hasta igualar con la
turbidez del tubo No. 3 del nefelómetro de McFarland
6. Probar la esterilidad del producto sembrando dos gotas en un tubo de agar
nutritivo y en un tubo con tioglicolato, incubando los tubos a 28 C y a 37 C por 24 h
7. Mantener la preparación antigénica en refrigeración hasta su uso.
8. Si hay crecimiento en las pruebas de esterilidad desechar producto.

Bibliografia
Campbell, D.H., Garvey, J.S.; Cremer, N.E., Sussdorf, D.H.1970 Methods in immunology. 2a
edicion.W.A. Benjamin Editor
Hudson, L., Hay, F.C. Practical immunology. Editorial Blackwell Scientific Publications.
 DETERMINACION DE INMUNOGLOBULINAS SERICAS
Practica No. 7

INTRODUCCION Y OBJETIVO

El alumno determinara la presencia de inmunoglobulinas séricas llevando a cabo la prueba

de precipitación de sulfito de sodio.

FUNDAMENTO
Esta prueba se basa en la precipitación de inmunoglobulinas del suero por sales de sulfito
de sodio. Esta prueba es útil cuando se determina la presencia de inmunoglobulinas
séricas en recién nacidos hasta tres semanas de edad. Su interpretación es de tipo
objetivo y tiene un porcentaje de confiabilidad de aproximadamente 93 %. Es
indispensable que la muestra sea suero y no plasma, ya que este contiene proteínas que
se precipitan con las inmunoglobulinas dando falsos resultados. La hemolisis parcial de la
muestra parece no afectar los resultados de esta prueba.

Criterios de Desempeño
Al final de la práctica
Determinará la presencia de inmunoglobulinas por precipitación
Conocerá la importancia de las inmunoglobulinas en suero de recién nacidos

MATERIA Y EQUIPO
Suero fisiológico
Sulfito de sodio
3 matraces aforados de 100 ml
1 espatula
1 pizeta con agua destilada
1 balanza
3 tubos de ensaye}6 pipetas de 1 y 2 ml
Pipeta automática de 10 a 100 ul
Puntillas
Gradilla

DESARROLLO EXPERIMENTAL
1. PRUEBA CON SULFITO DE SODIO
Se preparan tres soluciones de sulfito de sodio al 14%, 16 % y 18 % en agua
destilada. Se colocan 1.9 ml de cada solución en tres tubos de ensaye (con
 capacidad de 3-5 ml) y se añade 0.1 ml de suero a cada uno de los tubos,
mezclando perfectamente bien el contenido.
INTERPRETACION
En caso de haber titulación de inmunoglobulinas, se observara turbidez en forma
inmediata y la formación de un precipitado al cabo de 30-60 minutos. Los resultados se
interpretan de la siguiente manera:
Precipitacion en los tubos con 14, 16, 18 % > 15 mg Ig/ml de suero
Precipitacion en los tubos 16, 18 % 5-15 mg Ig/ml de suero
Precipitacion en los tubos con 18 % o ninguna precipitacion < 5 mg Ig/ml de suero

2. PRUEBA DE TURBIDEZ DEL SULFATO DE ZINC

OBJETIVO:
El alumno determinara la presencia de inmunoglobulinas sericas llevando a cabo la
prueba de turbidez de sulfato de zinc
FUNDAMENTO:
Esta prueba se basa en la precipitación de inmunoglobulinas del suero al entrar en
contacto con sales de sulfato de zinc. Esta prueba es útil cuando se determina la presencia
de inmunoglobulinas en recién nacidos hasta tres semanas de edad. Su interpretación es
de tipo objetivo, el grado de turbidez desarrollado por la reacción tiene una correlacion de
0.96 con el contenido de IgG o IgM del suero.
Sin embargo esta prueba puede ser afectada por la temperatura ambiental, el periodo de
incubación, la presencia de bióxido de carbono en el reactivo y el grado de hemolisis de la
muestra.
Es indispensable que la muestra sea suero y no plasma, ya que este último causa lecturas
más altas en los resultados. Esta prueba permite diagnosticar la FTI (Falla en la
transferencia de inmunoglobulinas)

MATERIAL
Suero fisiológico
20.8 mg de Sulfato de Zinc heptahidratado)
1 probeta de 100 ml
1 espatula
1 piceta con agua destilada
1 balanza
1 tripie
1 tela de asbesto
1 mechero
1 vaso de precipitado de 150 ml
1 frasco color ambar
Cinta adhesiva
2 tubo de ensaye de 13x100
1 pipeta de 1 ml
1 pipeta de 10 ml
Incubadora
Espectrofotómetro
Pipeta automática de 10 – 100 ul
Puntillas
Gradilla

TECNICA
1.- Se colocan 20.8 mg de Sulfato de zinc heptahidratado dentro de un frasco ambar de
100 ml de capacidad, se añade agua destilada a temperatura ambiente hasta llegar a la
marca de 100 ml. Inmediatamente se cierra el frasco con su tapon y se agita hasta lograr
una disolución total de la sal. Se fija el tapon a la botella para lograr un buen sellado.

La solución del reactivo debe sustituirse aproximadamente cada dos meses,

ya esta absorbe gradualmente bióxido de carbono, lo que altera los resultados
de la prueba. También la exposición excesiva a la luz afecta la solución, la
solución debe guardarse en refrigeración a una temperatura de 4 a 7°C
2. Se toman 0.1 ml de suero y se colocan en un tubo de ensayo al que se
agregan 6 ml de la solución de ZnSO4 7H2O.
3. Se agita suavemente la muestra y se deja incubar por una hora a 20°C.
4. Se calibra el espectrofotómetro a 0, utilizando un tubo control con el reactivo
de ZnSO4 7 H4O. A continuación, se mezcla bien el contenido del tubo prueba
y se lee en el espectrofotómetro.
5. Se lee el grado de absorbancia (turbidez) a una longitud de onda de 660 nm.
6. El resultado se multiplica por 10 y se expresa como el número de unidades de
turbidez del ZnSO4 7 H4O. El número de U. TSZ corresponde a los miligramos
de Ig’s totales por mililitro de suero. El número de U. TSZ se ha relacionado
con las posibilidades de supervivencia del neonato. Menos de 10 U. TSZ
(menos de 10 mg/ml): estos niveles son insuficientes para una protección
adecuada (septicemia, diarrea por E. coli, etc. De 10 a 20 U. TSZ (de 10 a 20
mg/mI): acción de organismos patógenos sobre la mucosa intestinal
ocasionando diarreas, principalmente. Más de 20 U. TSZ (más de 20 mg/ml):
lactación exitosa. A medida que aumentan los niveles de anticuerpos (Ab’s), la
mortalidad por causas infecciosas, se reduce hasta eliminarse por completo
cuando sobrepasan las 40 U. TSZ.
3° PRUEBA DEL GLUTARALDEHÍDO
Se colocan 50μl de una solución de glutaraldehído al 10% en un tubo de ensaye, agregar
0.5 ml de suero y mezclar perfectamente. El tiempo requerido para que ocurra la
coagulación es inversamente proporcional a la concentración de
Ig’s en suero. Las muestras séricas con alta concentración de Ig’s coagulan la muestra
entre 5 y 15 min.
INVESTIGACIÓN PREVIA AL
EXPERIMENTO
1. Investigue la estructura de una Ig

2. Describa las características de cada una de las Ig’s

3. ¿Porque es importante determinar la presencia de las Ig’s?

PRACTICA NO.
ANTÍGENOS DE SUPERFICIE DE GRUPOS SANGUÍNEOS
SISTEMA ABO
INTRODUCCIÓN
Los antígenos son proteínas, polisacáridos voluminosos o grandes complejos de
Lipoproteína, que se encuentran principalmente pero no exclusivamente en la
superficie de las membranas celulares y están colocadas de tal manera que las
cadenas glucosídicas polares se encuentran en el ambiente externo de las
células. Las estructuras exactas de estos glúcidos unidos a lípidos y proteínas de
membrana están determinadas genéticamente.

Los componentes antigénicos de la membrana del eritrocito se han estudiado en

detalle debido a su importancia en el tratamiento con transfusiones. Se han
distinguido más de 100 antígenos del eritrocito constituyendo por lo menos 15
sistemas de grupos sanguíneos genéticamente distintos; sin embargo, no todos
desencadenan reacciones de transfusión tan severas como los antígenos que
conforman el denominado sistema ABO y el sistema Rh.
Los antígenos A, B y O son oligosacáridos estructuralmente relacionados que
pueden estar unidos a lípidos o a proteínas. El antígeno O (también llamado
antígeno H) es una cadena de fucosa, galactosa, N-acetilglucosamina y glucosa
unido a un lípido ceramida (o un hidroxilo de la cadena lateral de una proteína) a
la glucosa. El antígeno A difiere del O solamente en que contiene un resto de
Nacetilgalctosamina unido al resto más externo de la galactosa, en cuanto al B que
también es parecido al O se diferencia por poseer un resto más de galactosa
unido a la galactosa exterior.
Todas las personas tienen la enzima que produce el antígeno O, las personas con
el grupo sanguíneo A tienen, además, la enzima que adiciona Nacetilgalactosamina
de más, mientras que los de tipo B tienen la enzima que adiciona la galactosa extra; los
que tienen el tipo AB sintetizan ambos antígenos, el A y el B, mientras que los que son del
tipo O solo producen el antígeno O.
Los Ab’s contra los antígenos ABO son isohemaglutininas, pues los antígenos son
de origen humano (iso, de la misma especie) y se descubren ordinariamente por
una reacción de aglutinación con células de un tipo ABO conocido; en otras
palabras, el suero que contiene anticuerpos contra los antígenos A y B hace que
se aglutinen los eritrocitos en cuya superficie existen dichos antígenos. Hay
cuatro fenotipos ABO básicos, tipo O (eritrocitos sin antígenos A ni B), tipo A
(eritrocitos con antígeno A), tipo B (eritrocitos con antígenos B) y tipo AB
(eritrocitos con antígeno A y B).
Los antígenos Rh de los grupos sanguíneos recibieron su nombre por haberse
identificado inicialmente en los eritrocitos del mono Rhesus (Macaca mulata). Los
hematíes Rh+ poseen un antígeno denominado Rho en una nomenclatura y D en
otra. El antígeno D es el que determina que un individuo sea Rh+ ó Rh-, las
personas con genotipo DD o Dd son de tipo Rh+, los individuos con genotipo dd
pertenecen al tipo Rh-. El antisuero antiD es sinónimo de antisuero anti Rh.
Para determinar los grupos sanguíneos en la práctica se hacen pruebas con los
antígenos ABO y Rh, provocando reacciones de antígeno-anticuerpo, mediante
pruebas de aglutinación. El mecanismo de una reacción de aglutinación se
produce por medio de anticuerpos multivalentes que se combinan con partículas
de antígeno, formando complejos antígeno-anticuerpo. La reacción de
aglutinación se da cuando en una mezcla de las partículas de antígeno con los
antisueros específicos provoca una agrupación de dichas partículas de antígeno
con los antisueros específicos provoca una agrupación de dichas partículas
antigénicas. Por lo general la aglutinación es perceptible a simple vista, pero en
ocasiones se requiere de observaciones al microscopio de la preparación
estudiada.
METODOLOGÍA
1. Acomodar al paciente de manera que este cómodo, e inspirarle confianza.
2. Explicarle al paciente lo que se le va a practicar.
3. Colocar el torniquete aproximadamente a la mitad entre el codo y el hombro.
4. Inspeccionar el área que planeamos usar (vena cefálica, vena basílica, vena
cubital mediana, vena mediana).
5. Retirar el torniquete, ya que no puede durar mucho tiempo.
6. Ya localizada la vena, nuevamente colocamos el torniquete.
7. Se hace la asepsia con una torunda alcoholada al 7O%, procurando limpiar de
arriba hacia abajo y dejar que se seque.
8. Fijar la vena en posición sujetando el antebrazo del enfermo con la mano y
comprimiendo y empujando los tejidos blandos con el pulgar justo por debajo del
punto donde se va a intentar la punción.
9. Se empuja la aguja al interior de la vena con una punción directa única de piel
y vena.
10. Hay que desatar el torniquete para que la sangre fluya libremente.
11. Se retira la jeringa y la aguja.
12. Se le aplica una presión suave (tres min) en el punto de la punción con una
torunda sin friccionar, ya que la fricción provoca hematomas, también, se le pide
al paciente mantener extendido el brazo, para prevenir la formación de un
hematoma.
13. La sangre se coloca en sus respectivos tubos y en ese momento se etiqueta
con el número de registro o las iniciales del nombre del paciente, los exámenes
solicitados por el médico y la firma de quien hizo la extracción.
14. Si utiliza una lanceta estéril, se desinfecta el dedo medio y se pincha la
yema del dedo, se colocan tres gotas en sobre una placa de vidrio, se añade una
gota de antisuero A, Rh y B, con diferente aplicador se mezcla cada antisuero con
la gota de sangre. Se observa la reacción de aglutinación por debajo de la placa a
contra luz y de ser necesario en el microscopio.
15. Al terminar, se sumerge la placa de vidrio en una solución de cloro comercial
al 50%.
INVESTIGACIÓN PREVIA AL EXPERIMENTO
1. Describe la importancia que tiene conocer la técnica de extracción de
sangre venosa y porque es necesario que un Químico conozca esta técnica.
2. Describe los grupos sanguíneos.

GRUPO INVERSO
El termino de sangre ( grupo sanguíneo) se refiere al tipo de antigenos existentes en la
membrana de eritrocitos.
Aunque existen una gran cantidad de antigenos en la membrana de los eritrocitos, los
antigenos A, B y D (Rh) son los mas importantes en los que respecta a las transfusiones
sanguíneas.
MATERIAL
Tubo de ensayos
Células A, B, O Suero del paciente
Centrifuga
Gradilla
Pipetas Pasteur
PROCEDIMIENTO

1. En tres tubos rotulados se añadirán 2 gotas de células A; B y O respectivamente.

2. A cada uno de los tubos se le añadirán 2 gotas del suero problema, se mezcla y
centrifuga 15 segundos a 3000 rpm.
3. Observa a contra luz agitándolos levemente para observar si hay o aglutinación.

INTERPRETACION

Grupo sanguíneo A: solo habrá aglutinación en el tubo con las células B.

Grupo sanguíneo B: solo habrá aglutinación en el hubo con las células A.
Grupo sanguíneo AB: no habrá aglutinación en el tubo con las células A y B
Grupo sanguíneo O: solo habrá aglutinación en los tubos con las células A y B

(En esta prueba no se realiza Rh)

Resultado:
Aglutino el tubo A eso quiere decir que es un tipo de sangre B.
PRACTICA NO. 8
REACCIONES FEBRILES
METODO: Inmunológico; Prueba rápida de aglutinación o placa
INTRODUCCIÓN
Esta prueba consiste en detectar en la sangre la presencia de anticuerpos o
células de memoria, las que indican que el organismo ha estado en contacto
previamente con diferentes tipos de bacterias, o bien que el organismo ha
padecido ciertas enfermedades. Las reacciones febriles son particularmente útiles
para apoyar el diagnóstico de padecimientos como la fiebre tifoidea, brucelosis,
paratifoideas y de Rickettsiosis.

FUNDAMENTO
La fiebre tifoidea, la fiebre malta y la tifoidea (salmonelosis, brucelosis y
Rickettsiosis respectivamente) se confirman demostrando la presencia de los
anticuerpos homólogos en el suero del paciente. Las diferentes salmonelosis se
detectan usando antígenos específicos de la bacteria correspondiente seleccionados
según la clase de salmonelosis que son más comunes en la región y esta prueba se conoce
como reacción de Widal. La Brucelosis se comprueba con la reacción de Rosa de Bengala
usando antígenos de B. abortus. Las Rickettsiosis se detectan usando antígeno
procedentes de algunas cepas de Proteus OX que comparten un antígeno común con las
Rickettsias (como el Proteus OX-1 9), en la Reacción de Weil Félix.
MUESTRA: Suero, Separarlo de 5 ml sangre sin anticoagulante previo reposo de 30 min.
Para separarlo, centrifugar a 3,000 x g X 5 min.
Antígenos:
1. Tífico O
2. Tífico H
3. Paratífico A
4. Paratífico B
5. Brucella
6. Proteus OX 19

METODOLOGÍA: PRUEBA CUALITATIVA

1. Revisar la caducidad de los antígenos, los cuales deben estar a temperatura
ambiente. Marcar con el número del paciente una serie de 6 anillos de la
placa de aglutinación y sobre estos anotar los números de los antígenos (1 al
6).
2. Trasladar a la placa de vidrio 0.08 ml. de suero x c/u de los 6 anillos.
3. Agregar una gota de cada antígeno previamente mezclado al anillo
correspondiente.
4. Mezclar con un palillo (1/óvalo).
5. Balancear la placa durante dos min.
6. Interpretar la prueba antes de tres min, con la ayuda del aglutinoscopio.
Anotar el número de los antígenos que den la reacción positiva (aglutinación
franca).
7. Practicar la prueba con los antígenos que dieron la reacción negativa (falta de
aglutinación) usando 0.01 ml de suero.
Anotar los números de los antígenos que den reacción positiva (aglutinación
franca).
8. Practicar la prueba cuantitativa usando los antígenos que aglutinaron con el
suero.

PRUEBA CUANTITATIVA
I.-Cuando los antígenos aglutinan con 0.08 ml de suero.
a) Trasladar con pipeta de vidrio 0.04, 0.02, 0.01 y 0.005 ml de suero por óvalo.
b) Mezclar el antígeno y agregar una gota a cada cantidad de suero.
c) Mezclar con un palillo comenzando con el óvalo que tenga 0.005 ml de suero y
terminando con el que tenga 0.04 ml de suero.
d) Balancear la placa x dos min.

e) Interpretar la prueba antes de 3 min con ayuda del aglutinoscopio para

determinar la cantidad más pequeña de suero que da la aglutinación franca.
II.-Cuando los antígenos aglutinan con 0.01 ó 0.005 mI:
a) Preparar una dilución progresiva doble de suero (1:2,1:4., 1:8, 1:16) en
albúmina bovina al 33% de la siguiente manera:
- Trasladar 0.1 ml de albúmina a c/u de los 3 tubos de ensayo y etiquetados.
- Agregar 0.1 ml de suero del paciente al primer tubo y mezclar para obtener la
dilución 1:2
- Trasladar 0.1 ml de la dilución 1:2 al segundo tubo y mezclar para obtener la
dilución 1:4
- Trasladar 0.1 ml de la dilución 1:4 al tercer tubo y mezclar para obtener la
dilución 1:8, etc.
b) Trasladar 0.01 de cada dilución a la plaza de vidrio.
c) Agregar una gota del antígeno correspondiente (mezclado).
Mezclar con palillo. Balancear x dos min.

INTERPRETACIÓN
Detectar la dilución mayor que de la reacción positiva (aglutinación franca).
Reportar el número del antígeno y el título determinado:
VOLUMEN DE SUERO (ml) TITULO
0.08------------------------------------------------------------------------1:20
0.04------------------------------------------------------------------------1:40
0.02------------------------------------------------------------------------1:80
0.01------------------------------------------------------------------------1:160
0.005 (0.01 de dilución 1:2) ----------------------------------------1:320
0.01 de dilución 1:4---------------------------------------------------1:640
0.01 de dilución 1:8---------------------------------------------------1:1280
0.01 de dilución 1:16-------------------------------------------------1:2560
NOTAS.- 1.-En días calurosos, las reacciones pueden ser falsamente positivas
2.-Títulos menores de 1:80 se pueden considerar normales. Tomar en cuenta
diagnóstico clínico.

INVESTIGACIÓN PREVIA AL EXPERIMENTO

1) ¿Qué significa “reacciones febriles”?
2) ¿Para qué resulta útil la demostración de anticuerpos en el suero contra las
especies de Salmonella?
3) ¿Porqué en la actual serología de suero de Salmonella deben utilizarse
Antígenos representativos de diversos grupos de Salmonella?
4) ¿Cuál es el (cuales son los) antígeno (s) de superficie de Salmonella?
5) ¿Cómo resultan los títulos de aglutininas O en el transcurso de la enfermedad?
6) ¿Cómo resultan los títulos de aglutininas H en el transcurso de la enfermedad?
7) ¿Por qué el título de aglutinina O constituye el indicador más fiable en una
infección reciente de Salmonella?
8) ¿Qué puede enmascarar la respuesta de la aglutinina en el suero?
9) ¿Cuáles son las especies que reconoce el esquema taxonómico de Salmonella
y cuál es la que contiene más de 1500 serotipos?

CUESTIONARIO PARA ANEXAR AL REPORTE

1) ¿Qué parámetros debemos considerar al considerar un resultado serológico?
2) ¿En qué consiste la preparación de antígeno H y la del antígeno O?
3) ¿Qué enfermedades se diagnostican en la prueba serológica con cepas de
Proteus y en que consiste su preparación?
4) ¿Cómo diagnosticaría en su laboratorio una infección por Salmonella?
5) ¿Cuál es el tratamiento de elección contra Salmonelosis?
6) ¿Cuáles son los factores importantes en la profilaxis de la transmisión de la
fiebre tifoidea de hombre a hombre?
7) ¿Considera usted poder erradicar la enfermedad humana causada por
Salmonella que infectan los animales y al hombre?
8) Investigue que es el fenómeno de prozona, postzona y zona de equivalencia.
9) ¿Por qué es más conveniente empezar a trabajar con la dilución 1:40?
10) ¿Qué es título?
11) ¿Qué títulos considera indicativos de presencia de enfermedad en las
reacciones febriles (positivos) y porque?
PRACTICA NO. 9
PRUEBAS CRUZADAS
INTRODUCCIÓN
La transfusión es uno de los modelos trascendentales que obligan a la aplicación
rigurosa del control de calidad. Actualmente, hay una gran variedad de pruebas
pre transfusionales que se han desarrollado para mejorar la seguridad y eficacia
de una transfusión; si se efectúan de manera adecuada, establecen la
compatibilidad ABO entre el donador y el receptor y detectan la mayoría de los
anticuerpos clínicamente significativos.
FUNDAMENTO:
Este se logra a través de la detección de anticuerpos salinos y de anticuerpos
incompletos.
OBJETIVO:
Establecer la aceptación o rechazo de una transfusión.
METODO
1. Preparar una suspensión al 5% de hematíes en solución isotónica, tanto del
donador como del receptor.
2. Usando tubos de ensayo pequeños:
PRUEBA MAYOR PRUEBA MENOR
Una gota de suero del receptor Una gota de suero del donador
Una gota de suspensión de eritrocitos Una gota de suspensión del
Del donador receptor

AUTOTESTIGO
Una gota de eritrocitos del receptor más dos gotas de suero del receptor
- Agitar cada tubo y centrifugar inmediatamente a 1000 x g durante 1 min.
- Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar si hay
aglutinación.
- Si el resultado es dudoso, incubar a 37°C durante 20 min.
- Centrifugar a 1000 x g durante 1 min y remover los eritrocitos sedimentados.
Observar si existe hemaglutinación macroscópica.
- Si la reacción continua siendo negativa, débil positiva o dudosa se lavan los
eritrocitos 4 veces con solución isotónica a 0.9%.
- Después del último lavado se elimina el sobrenadante (solución isotónica) y se
resuspenden los eritrocitos en las ultimas 1 — 2 gotas de solución isotónica.
- Agregar una gota de suero de Coombs a cada tubo.
- Mezclar. Centrifugar a 1000 x g durante un min.
- Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar si existe la
aglutinación macroscópica. También se puede observar al microscopio sin
cubreobjetos.
- Interpretación: en caso de compatibilidad, las reacciones o pruebas cruzadas no
presentan ni hemólisis ni aglutinación.
NO aglutinación en la prueba mayor y en la prueba menor, esto significa 100% de
COMPATIBILIDAD SANGUÍNEA.
Aglutinación en la prueba mayor: 75% de incompatibilidad
Aglutinación en la prueba menor: 25% de incompatibilidad

PRUEBAS CRUZADAS EN MEDIO PROTEINICO

PRUEBA MAYOR PRUEBA MENOR
Dos gotas de suero de receptor Dos gotas suero donador
Una gota de suspensión de eritrocitos Una gota de suspensión eritrocitos
Del donador al 2 % del receptor al 2 %
Agregar 2 gotas de albumina al 22%

- Incubar 15 min a 37°C

- Mezclar y centrifugar durante un min a 3000 x g.
- Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar si existe
aglutinación macroscópica.
PRACTICA NO. 10
PRUEBA DE COOMBS
El Fundamento de la Prueba de Coombs es que permite demostrar la presencia
de anticuerpos incompletos mediante el uso de un segundo anticuerpo, que es
una antiglobulina. La Prueba de Coombs directa se utiliza como método
diagnóstico de enfermedades como las anemias hemolíticas, la enfermedad
hemolítica del recién nacido y en las reacciones transfusionales. La Prueba de
Coombs indirecta se usa para realizar tipificación de grupos sanguíneos, pruebas
sanguíneas cruzadas y como método de rastreo para evitar reacciones
transfusionales.
PRUEBA DE COOMBS DIRECTA
FUNDAMENTO
Se emplea la antiglobulina para detectar los anticuerpos incompletos
antieritrocitarios, que ya se encuentran unidos in vivo a los eritrocitos. Es un
procedimiento valioso en el diagnóstico de la anemia hemolítica del recién nacido
y en la anemia hemolítica auto inmune.
METODO EN TUBO
- Colocar una pequeña cantidad de sangre completa en un tubo de ensayo.
- Lavar con solución isotónica 4 veces, centrifugando en cada ocasión y eliminar
el sobrenadante salino.
- Preparar una suspensión de eritrocitos al 2%
- Depositar una gota de la suspensión de eritrocitos en un tubo pequeño y añadir
una gota de suero de Coombs.
- Mezclar y centrifugar a 1000 x g durante 1 min.
- Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar si existe
aglutinación macroscópica.
INTERPRETACIÓN
Aglutinación: significa prueba directa positiva.

PRUEBA DE COOMBS INDIRECTA

FUNDAMENTO
Se emplea la antiglobulina para detectar la presencia de anticuerpos incompletos
antieritrocitarios no unidos in vivo a los eritrocitos. Para detectar ciertos grupos
sanguíneos como el Duffy, kell y kidd. Se realiza en dos fases, en la primera se
enfrentan los anticuerpos frente a hematíes de antigeinicidad conocida para
provocar su unión y posteriormente se añade al antiglobulina hemaglutinante.
METODO EN TUBO
- Preparar una suspensión de eritrocitos al 5%
- Depositar una gota de la suspensión de eritrocitos a cada tubo pequeño
- Mezclar y centrifugar a 1000 rpm durante un min.
- Remover suavemente los eritrocitos sedimentados
- Lavar con solución isotónica 4 veces, centrifugando en cada ocasión y eliminar
el sobrenadante salino dejando 1 o 2 gotas para resuspender.
- Añadir una gota de suero de Coombs. Mezclar y centrifugar.
- Remover suavemente los eritrocitos sedimentados y observar si existe
aglutinación macroscópica.
INTERPRETACIÓN
Aglutinación: significa la presencia de anticuerpos incompletos.

MÉTODO EN PLACA:
- Preparar una suspensión de hematíes grupo sanguíneo “O” factor Rh positivo
- Agregar dos gotas de suspensión de eritrocitos al 50%, en un tubo.
- Agregar cinco gotas de suero problema. Mezclar e incubar a 37°C durante 60
min.
- Lavar los eritrocitos en cuatro ocasiones con solución isotónica y resuspender
hasta obtener una suspensión de aproximadamente el 50%.
- Depositar una gota de la suspensión de eritrocitos lavados y sensibilizados en
un portaobjetos.
- Depositar separadamente una gota de suero de Coombs.
- Mezclar con un aplicador de madera y rotar el portaobjetos.
- Observar si hay aglutinación dentro de los dos min siguientes.
- Agregar a un lado 1 gota de suero de Coombs.
- Mezclar con un agitador.
- Rotar el portaobjetos
- Observar si hay aglutinación dentro de los siguientes dos min.
PRÁCTICA NO. 12
ANTIESTREPTOLISINAS
INTRODUCCIÓN
El anticuerpo estreptolisina O se encuentra presente en casi todas las personas
en títulos bajos, debido a que las infecciones estreptocócicas son comunes. Sin
embargo, un título alto o creciente de antiestreptolisina O, indica una infección
reciente producida por estreptococo β-hemolítico de grupo A, como amigdalitis,
escarlatina, sepsis puerperal, erisipela, etc.
Tiene además especial interés en los procesos que aparecen como segunda
enfermedad: fiebre reumática y glomerulonefritis aguda. Por lo tanto a pesar de
no ser una prueba específica para fiebre reumática, apoya su diagnóstico cuando
lo sugieren la historia y los signos clínicos.
FUNDAMENTO
La estreptolisina O, producida por el estreptococo β-hemolítico de grupo A, tiene
la propiedad de producir hemólisis cuando se pone en contacto con glóbulos
rojos. Al colocar distintas diluciones de un suero que contenga antiestreptolisina
O en presencia de dosis constantes de estreptolisina O, se produce una reacción
antígeno - anticuerpo que neutraliza la capacidad hemolítica de la misma. Este
fenómeno se evidencia por una inhibición de la hemólisis al agregar suspensión
de glóbulos rojos del 3 al 5%. El título de antiestreptolisina será la recíproca de la
máxima dilución del suero del paciente capaz de neutralizar totalmente la
estreptolisina.

REACTIVOS
Estreptolisina O: estreptolisina liofilizada titulada.
Buffer concentrado: solución de buffer fosfatos conteniendo fosfatos 0.36 mol/l y
cloruro de sodio 1.2 moI/l, para pH final 6.5
Agua destilada
Eritrocitos frescos humanos de grupo O
Solución fisiológica
PREPARACIÓN
Buffer: diluir el contenido del frasco con el volumen de agua destilada indicado
en el rótulo. A baja temperatura el buffer concentrado puede cristalizar. En tal
caso colocar en baño de agua a 37°C unos minutos mezclando por inversión
hasta dilución completa.
Estreptolisina O: disolver cada vial con el volumen de buffer indicado en el rótulo,
mezclando por inversión hasta disolución completa.
Suspensión de eritrocitos: lavar los mismos tres veces con solución fisiológica.
Luego del último lavado centrifugar a 2000 x g durante 15 min. En el
sobrenadante no debe aparecer hemólisis; caso contrario desechar. Con los
eritrocitos lavados, una vez descartado el sobrenadante, preparar una suspensión
del 3 al 5% con buffer pH 6.5

ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO

Reactivos provistos: son estables en refrigerador (2 - 10°C) hasta la fecha de
vencimiento indicado en la caja.
Estreptolisina O: Una vez preparada es estable 2 horas a temperatura ambiente,
5 días en refrigerador (2 - 10°C) o 2 meses congelada (-20°C) y fraccionada.
Buffer: estable 1 año en refrigerador (2 - 10°C).
Suspensión de eritrocitos: los eritrocitos pueden usarse hasta 48 horas después
de preparada la suspensión si previamente se lavan una vez con buffer y no se
observa hemólisis.
MUESTRA
Suero
a) Recolección: debe obtenerse suero libre de hemólisis.
b) Aditivos: no se requieren.
c) Sustancias interferentes conocidas: muestras con hemólisis visible pueden
conducir a una interpretación errónea de los resultados, por lo que deben
descartarse.
d) Estabilidad e instrucciones de almacenamiento: la antiestreptolisina en suero
es estable congelada por lo que puede mantenerse en estas condiciones hasta
efectuar el ensayo.

PROCEDIMIENTO
Preparar diluciones de la siguiente forma:
1:10 (0.2 ml de suero + 1.8 ml de Buffer)
1:100 (0.5 ml de dilución 1:10 + 4.5 mI de Buffer)
1:500 (1 ml de dilución 1:100 + 4 mI de Buffer)
Luego proceder de la siguiente forma:

MATERIAL
- Tubos de ensayo.
- Material volumétrico apropiado.
- Centrífuga.
- Baño de agua a 37°C
CONDICIONES DE REACCIÓN
- Temperatura de reacción: 37°C
- Tiempo de incubación: 60 min.
- Volumen final de reacción: 2 ml
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
El título de la muestra se expresa mediante la inversa de la mayor dilución en la
cual se observa ausencia total de hemólisis.
El tubo 12 (control eritrocitario) no deberá presentar hemólisis mientras que el
tubo 13 (control estreptolisina O) deberá mostrar hemólisis completa.
MÉTODO DE CONTROL DE CALIDAD
Para controlar el procedimiento y los reactivos es conveniente procesar
simultáneamente un suero con cantidad conocida de antiestreptolisina O.
VALORES DE REFERENCIA
Normalmente, pueden existir en suero hasta 200 unidades de antiestreptolisina
O. Títulos superiores son indicativos de un proceso infeccioso por estreptococo β-
hemolítico de grupo A.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
En caso de conservar la estreptolisina O reconstituida congelada, se recomienda
fraccionaria de modo de evitar los congelamientos y descongelamientos
sucesivos que ocasionan su deterioro.

INVESTIGACIÓN PREVIA AL EXPERIMENTO

1. ¿Qué es la Estreptolisina O?
2. ¿Cuál es el título de antiestreptolisina O (ASO) en adultos, que se considera
como límite superior normal?
3. ¿Cómo es el título de ASO en un recién nacido, y porque?
4. ¿Cómo se obtiene el antígeno necesario para el método de medición del título
ASO?
5. ¿Qué enfermedad presentan los pacientes con incidencia mayor de títulos
elevados ASO?
6. ¿Cuáles son los anticuerpos utilizados más a menudo en situaciones clínicas?
PRACTICA NO. 13
DIAGNOSTICO SEROLÓGICO DE SÍFILIS
INTRODUCCIÓN
La sífilis es una enfermedad infecciosa aguda o crónica cuyo agente causal es
Treponema pallidum (T. pallidum ) perteneciente, junto con otros treponemas,
Borrelias y Leptospiras, a la familia Treponemataceae.
La enfermedad está clasificada como venérea y de declaración obligatoria, siendo
su mecanismo de transmisión el contacto directo con una lesión productiva. Tras
un período de incubación de 12 a 90 días (media de 21 días), aparece en el lugar
de la inoculación una lesión primaria, rica en treponemas (el chancro), que
desaparece espontáneamente a las pocas semanas. Durante este primer estadío,
conocido como sífilis primaria, T. pallidum se multiplica en los linfáticos
regionales distribuyéndose por la sangre a todos los órganos del individuo
(infección sistémica).
Generalmente las pruebas serológicas se hacen positivas en este período pasadas
3-4 semanas de la infección. En el paciente no tratado, el segundo estadío
comienza con la aparición de una de las manifestaciones sistémicas de la
enfermedad: una erupción en piel, palmas y plantas, la roseola sifilítica,
acompañada de síntomas generales y frecuentemente, de otros signos
localizados (condilomas genitales). Las lesiones abiertas de este período son muy
contagiosas. Tras la primera desaparición espontánea de la misma y durante el
primer y segundo año, pueden aparecen brotes similares cada vez de menor
intensidad (fases de latencia precoz) hasta que desaparecen totalmente todos los
signos y síntomas (fase de latencia tardía). El tercer estadío de la enfermedad,
que solo se presenta en unos pocos pacientes, se caracteriza por la formación de
lesiones granulomatosas destructivas (gummas) que, curiosamente, tienen
escasa carga treponémica. En este período pueden aparecer síntomas y signos
de focalización de la enfermedad: neurosífilis, sífilis cardiovascular, etc.
La identificación del T. pallidum mediante el examen directo del exudado de la
lesión (campo oscuro y/o fluorescencia directa) es una prueba definitiva para
asegurar el diagnóstico, aunque un resultado negativo del mismo no descarta la
posibilidad de la enfermedad, ya que la presencia de treponemas puede ser
escasa dependiendo de los días de evolución y de tratamientos previos.
Debido a las dificultades que puede presentar la realización del diagnóstico
directo, la experiencia indica que el diagnóstico indirecto (serológico) se ha
convertido en el procedimiento de uso más frecuente. Actualmente existen
diferentes técnicas para el diagnóstico serológico de sífilis: las no treponémicas
(reagínicas) no determinan anticuerpos específicos frente a T. pallidum y se
basan en antígenos compuestos de soluciones alcohólicas con cantidades
determinadas de cardiolipina, colesterol y lecitina.
Miden anticuerpos frente a estas sustancias que son producidas por los tejidos
dañados por el T. pallidum. Estas pruebas son: VDRL (Venereal Research
Disease Laboratory), RPR (Rapid Plasma Reagin), TRUST (Toluidine Red
Unheated Serum Test), USR (Unheated Serum Reagin) y ELISA
(Enzimoinmunoensayo). Son de bajo costo, fáciles de efectuar, se utilizan como
pruebas de inicio en la detección de sífilis y para evaluar la respuesta al
tratamiento. La desventaja que presentan es que, debido a su inespecificidad,
pueden arrojar falsos resultados positivos.
Las pruebas treponémicas, en cambio, detectan específicamente los anticuerpos
de T. pallidum y su utilidad en el laboratorio está orientada a confirmar los
resultados arrojados por las pruebas no treponémicas. Las pruebas treponémicas
más conocidas son: FTA-Abs (Inmunofluorescencia indirecta con absorción del
suero), FTA-Abs 200DS (Inmunofluorescencia indirecta con absorción y doble
tinción), TPHA (Microhemaglutinación), Captia syphilis M (ELISA de captura
anti cadena pesada), ELISA IgG, y WESTERN BLOT, las cuales tienen muy bajo
índice de falsos resultados, tanto positivos como negativos. Deben realizarse con
una absorción previa del suero para eliminar la reacción cruzada con otras
treponemas. Sin embargo, carecen de utilidad para monitorear los tratamientos,
ya que suelen permanecer positivas en el 85/90% de los pacientes tratados y
curados.

FUNDAMENTO
La prueba del VDRL es un procedimiento de floculación no treponémico usado
para detectar anticuerpos en sueros de pacientes con sífilis designados como
reaginas. Si el resultado no esta de acuerdo con la observación clínica, se debe
hacer una prueba de inmunofluorescencia.
MATERIAL
Equipo de diagnostico para pruebas no treponémicas
Suero problema, Suero testigo
Placas de aglutinación
Baño maría
Microscopio y aplicadores de madera
METODO
1. Inactive el suero a 56°C durante 30 min (para VDRL)
2. Adicione en las placas una gota de los siguientes sueros: suero problema,
suero testigo positivo, suero testigo negativo.
3. Coloque una gota de emulsión del antígeno, en cada uno de los pozos de la
placa.
4. Mezcle por tres min y lea de inmediato en un microscopio con objetivo 10X. La
presencia de floculación se interpreta como una prueba positiva.
INVESTIGACIÓN PREVIA AL EXPERIMENTO
1. ¿Qué es la Sífilis y cómo se puede prevenir?
2. ¿Cómo se diagnostica en un laboratorio clínico?
3. ¿Qué significa la prueba del antígeno no treponémico?
4. ¿Qué significa VDRL?
5. ¿Qué significa la prueba del antígeno treponémico?
6. Explique cómo se presenta una sífilis congénita.
PRACTICA NO. 14
DETERMINACION DEL FACTOR REUMATOIDE
INTRODUCCIÓN
La artritis reumatoide (AR) es una enfermedad autoinmune sistémica que afecta
el 1% de la población adulta a nivel mundial , se caracteriza por inflamación
crónica de la membrana sinovial que finalmente conduce a pérdida de la función,
dolor crónico y fatiga, hasta incapacidad en las personas que la padecen. Su
causa es desconocida, aunque múltiples factores están involucrados en la
patogenia de la enfermedad.
Características inmunitarias principales
• Los factores reumatoides IgM, IgA e IgG monomérica y pentamérica, existen
en suero y líquido sinovial
• Clínicamente, hay vasculitis y sinovitis.
Consideraciones generales
La AR es una enfermedad inflamatoria crónica, recidivante y sistémica, que
afecta principalmente las articulaciones. Afecta de 1 a 3% de la población de
EUA, con una relación de mujeres a varones 3:1. Los síntomas constitucionales
incluyen malestar general, fiebre y pérdida de peso. La enfermedad tiene un
inicio característico en las articulaciones pequeñas de manos y pies, y progresa
de manera centrípeta y simétrica. Los ancianos pueden presentarse con afección
de las articulaciones grandes proximales. Son frecuentes las deformidades. Las
manifestaciones extraarticulares son vasculitis, atrofia de piel y músculo, nódulos
subcutáneos, linfadenopatía, esplenomegalia y leucopenia.
Patogenia inmunitaria
Se desconoce la causa de la AR. Cerca de 70% de los individuos con AR tienen un
haplotipo HLA -DR4. Este haplotipo posee algunas variantes diferentes. Ciertos
alelos HLA –DR determinan la susceptibilidad a la enfermedad, así como su
intensidad. Es posible que éstos y quizás otros determinantes genéticos
proporcionen susceptibilidad a un factor ambiental no identificado, como un
virus, que inicia el proceso de la enfermedad. Aunque nunca se han identificado
partículas virales, en teoría un estímulo antigénico origina la aparición de una IgG
anormal, lo cual ocasiona la producción de factor reumatoide y el desarrollo
eventual de la enfermedad.
Cualquiera que sea el estímulo primario, los linfocitos sinoviales producen IgG,
IgM monomérica e IgM pentamérica antiinmunoglobulina (es decir, factores
reumatoides). La presencia de agregados de IgG o complejos de IgG factorreumatoide,
pueden activar el sistema del complemento e inducir diversos
fenómenos inflamatorios, como liberación de histamina, producción de factores
quimiotácticos para neutrófilos PMN y células MN y daño a la membrana con
citólisis. Existe un marcado flujo de leucocitos hacia el espacio sinovial.
Las prostaglandinas y los leucotrienos, producidos por células inflamatorias, se
consideran que desempeñan una función principal en la mediación de los
procesos inflamatorios. Además, los lisosomas activados y las enzimas liberadas
al espacio sinovial por leucocitos, amplifican más aún la respuesta inflamatoria de
la membrana sinovial.
El infiltrado mononuclear que se observa de manera característica dentro del sino
vio, incluye colecciones perivasculares de células CD4 y conjuntos intersticiales
de células CD8, linfocitos B, linfoblastos, células plasmáticas y macrófagos. La
interacción inmunitaria de estas células origina liberación de linfocinas, las cuales
ocasionan acumulación de macrófagos dentro del sinovio. Las diversas células
inflamatorias de la articulación producen proteínas y colagenasas que lesionan el
cartílago y las estructuras de soporte celular.
Los factores reumatoides pueden tener una función importante en la causa de la
enfermedad extraarticular. Los sujetos con vasculitis reumatoide tienen títulos
aumentados de factores reumatoides de IgG, IgM e IgA. Los complejos antígenoanticuerpo
aplicados a animales de experimentación en presencia de factor
reumatoide IgM, originan vasculitis necrosante. En teoría, los complejos inmunitarios
inician la inflamación vascular por la activación del complemento. La
afección pulmonar se relaciona con el depósito de complejos 11S y 15S, que
contienen agregados de IgG en las paredes de vasos pulmonares y alvéolos.
El factor reumatoide IgM 19S también se ha detectado en arteriolas y paredes
alveolares adyacentes a los nódulos cavitarios. Los factores reumatoides no
inician el proceso inflamatorio que ocasiona la enfermedad reumatoide, pero
quizá perpetúen y amplifiquen este proceso.
Diagnóstico inmunitario
El dato serológico más importante es el título aumentado de factor reumatoide,
presente en más de 75% de los individuos. Los factores reumatoides son
inmunoglobulinas con especificidad para el fragmento Fc de la IgG. La mayor
parte de las técnicas de laboratorio detecta factor reumatoide de IgM
pentamérica, pero las propiedades del factor reumatoide también se aprecian en
IgG e IgA.
El factor reumatoide de IgM pentamérica puede combinarse con moléculas IgG
para formar un complejo soluble circulante de alto peso molecular de
inmunoglobulinas en el suero.
En la AR, la electroforesis de proteínas séricas puede mostrar incremento de alfa-
2 -globulina, hipergammaglobulinemia policlonal e hipoalbuminemia. A menudo,
se aprecian en la vasculitis reumatoide los crioprecipitados compuestos de
inmunoglobulinas. Los valores séricos del complemento en general son normales,
pero pueden estar reducidos cuando hay vasculitis activa. Muchos sujetos tienen
anticuerpos antinucleares.
Se dispone de varias pruebas para detectar factor reumatoide en el laboratorio.
En la actualidad, el método más utilizado para detección de factor reumatoide es
la prueba de fijación en látex. La gamma-globulina agregada (fracción II de
Cohn) se absorbe en las
Partículas de látex, que entonces se aglutinan en presencia del factor
reumatoide; sin embargo, no es específica, aunque si muy sensible, lo que
origina gran incidencia de resultados falsos positivos. La prueba de eritrocitos
sensibilizados de abeja (prueba de Rose- Waaler) depende de la fijación de
anticuerpo específico, y es más específica que el análisis de fijación de látex. Los
eritrocitos de carnero se recubren con anticuerpo de conejo contra eritrocitos de
carnero. Los eritrocitos de carnero sensibilizados se aglutinan en presencia de
factor reumatoide. Otras técnicas capaces de detectar el factor reumatoide de
todas las clases, incluyen RIA, inmunofluorescencia indirecta, ELISA y
nefelometría con láser.
Sin embargo, resultados negativos de una prueba de factor reumatoide realizada
con los procedimientos usuales de laboratorio no excluyen el diagnóstico de AR.
Cerca de 20% de los individuos con AR por otra parte clásica son seronegativos.
Algunos de estos pueden tener IgG, IgA o factores reumatoides monoméricos.
Por el contrario, los factores reumatoides no son únicos para la AR. El factor
reumatoide también se encuentra en sujetos con lupus eritematoso sistémico
(30%), en un gran porcentaje de sujetos con síndrome de Sjogren (90%), y con
menor frecuencia, en individuos con esclerodermia o polimiositis. Las pruebas
positivas de aglutinación con la prueba de látex, también se presentan en
personas con cierto número de afecciones inflamatorias crónicas como hepatitis
crónica activa, kala-azar, sarcoidosis, neoplasia y sífilis. La prueba de los
eritrocitos de carnero sensibilizados, en general es negativa en esos trastornos.
En algunas enfermedades infecciosas crónicas, como lepra y tuberculosis, pueden
ser positivas la prueba de látex y la prueba del eritrocito de carnero sensibilizado.
En la endocarditis bacteriana subaguda, ambas pruebas pueden ser positivas
durante la enfermedad activa y es posible que se vuelvan negativas al mejorar el
paciente. En los reclutas militares se ha notado la aparición transitoria de factor
reumatoide después de vacunaciones. Los estudios epidemiológicos han
mostrado que un número pequeño de gente normal tiene factores reumatoides.
Gran proporción de los ancianos tiene prueba positiva de látex, aunque en
general es negativa la prueba de eritrocitos de carnero sensibilizados.

ARTRITIS JUVENIL
Sus características inmunitarias principales son la existencia de factores
reumatoides evidentes o “escondidos” y la presencia de anticuerpos
antinucleares.
La artritis juvenil consiste en un grupo de trastornos que se presentan en
individuos menores de 16 años de edad. La incidencia de esta enfermedad tiene
un punto máximo en los varones a la edad de dos años y de nuevo a los nueve
años, mientras que en las niñas alcanza su punto mayor entre 1 y 3 años de
edad. Esta enfermedad se puede presentar como una enfermedad sistémica
(enfermedad de StiII), poliartritis o pauciartritis seronegativa, o bien poliartritis
seropositiva idéntica a la artritis reumatoide del adulto. El pronóstico de las niñas
con enfermedad pauciarticular es excelente, mientras que los varones con esta
enfermedad pueden desarrollar finalmente espondilitis anquilosante.
FUNDAMENTO
Las partículas de poliestireno cargadas con gamma-globulina humana son
aglutinadas por las muestras que contienen factores reumáticos.
OBJETIVO
Procesar el estudio de laboratorio para identificar la presencia o ausencia de
factores reumatoides en pacientes, así como establecer sus características y
significado inmunitario.
MATERIALES Y REACTIVOS
3 Pipetas serológicas de 1/100 ml
1 Placa plástica de prueba de factor reumatoide
3 Muestras séricas presuntamente positivas a factores reumatoides
Aplicadores de madera o de plástico
PROCEDIMIENTO
1. Llevar las muestras de los pacientes y/os reactivos a temperatura ambiente.
2. Colocar en uno de los campos de la placa de prueba, 40 μl de muestra sérica
del paciente sin diluir; en otro campo, una gota (aproximadamente 40 μI) de
suero control positivo y, finalmente, en un tercer campo, colocar una gota de
igual magnitud que las anteriores de suero control negativo.
3. Colocar una gota (aproximadamente 40 μl) del reactivo comercial Rapi Tek-RF
previa agitación, en cada una de las muestras; después, utilizando los
aplicadores de madera o de plástico, mezclar estas soluciones. Al terminar,
imprímale a la placa un movimiento de rotación con el fin de homogeneizar los
componentes.
4. Al cabo de 2 min observe si se presenta una aglutinación (prueba positiva).
INTERPRETACIÓN
Una clara aglutinación indica la presencia de factores reumatoides. Las muestras
que no reaccionan a la prueba no contienen factores reumatoides o estos se
encuentran en una concentración menor a las 20 UI/ml.

INVESTIGACIÓN PREVIA AL EXPERIMENTO

1. Describe que es la proteína C reactiva
2. ¿En que individuos encontramos esta proteína?
3. ¿Cómo se determina la presencia de esta proteína?
4. ¿En que casos aumentan los niveles de proteína C reactiva?
5. ¿Cuál es su utilidad más común?
PRACTICA No 15
Aislamiento de linfocitos mediante centrifugación en gradiente de densidad

Introducción
Para muchas pruebas inmunológicas in vitro se requieren preparaciones purificadas o
Enriquecidas de linfocitos de la sangre periférica. Algunos ejemplos son la enumeración o
recuento de linfocitos T y B por métodos manuales, las pruebas de respuesta proliferativa
hacia mitógenos en cultivo, la determinación de antígenos HLA, la respuesta al cultivo
mixto de linfocitos, y otros procedimientos de utilidad tanto en el laboratorio clínico de
rutina como en el de investigación.
Las primeras técnicas empleadas para aislar los linfocitos sanguíneos consistían en
mezclar la muestra con un agente aglutinante de eritrocitos, con el fin de que estos se
separaran debido a la sedimentación de los grumos. Sin embargo, estas técnicas son
lentas, dan un bajo rendimiento final y una baja pureza. Posteriormente se desarrollaron
las técnicas de centrifugación en gradientes. Bøyum (1958) ideó un método basado en la
centrifugación de la muestra sobre un gradiente de densidad discontinuo, cuyo medio
original consistía en una mezcla de ficoll y metrizoato de sodio, con densidad de 1,077
g/ml. Este método es rápido y simple, por lo que se utiliza muy comunmente para obtener
preparaciones enriquecidas de linfocitos sanguíneos. Aunque estrictamente esta técnica
resulta en la separación de los leucocitos mononucleares, que incluyen tanto a los
linfocitos como a los monocitos, los primeros superan ampliamente en número a los
segundos, cuando se trabaja con muestras de sangre periférica.

El medio de separación
El medio de separación para purificar linfocitos sanguíneos consiste en una mezcla
de dos componentes. El ficoll 400 es un polímero sintético de sacarosa y epiclorhidrina, de
400.000 daltons, soluble en agua. Por otra parte, el diatrizoato de sodio (que ha sustituído
al metrizoato de la fórmula original de Bøyum ) es un compuesto que, al ser mezclado con
el ficoll, forma soluciones de baja viscosidad y alta densidad. La función del diatrizoato es
proveer la densidad óptima para la separación y a la vez la osmolaridad adecuada para
mantener la viabilidad de las células. Además, el ficoll causa la aglutinación de los
eritrocitos, lo cual facilita aún más su sedimentación. Es recomendable que el medio de
separación se mantenga en envases protegidos de la luz, debido a la fotosensibilidad del
diatrizoato. La mezcla de ficoll-diatrizoato está disponible comercialmente, estéril y lista
para su uso, por una variedad de fabricantes (ejs. Ficoll-Paque®, Lymphoprep®, etc.).
También puede prepararse esta mezcla a partir de sus dos componentes, ajustando la
densidad final a 1,077 ± 0,001 g/ml

Fundamento de la separación
Al estratificar una muestra de sangre sobre el ficoll-diatrizoato y centrifugar, las
células mononucleares se separan de las demás debido a diferencias de densidad. Como
se mencionó, el ficoll aglutina los eritrocitos, por lo que estos pasan a través del medio y
sedimentan al fondo. Los granulocitos también sedimentan por su tamaño y densidad, y
por su tendencia a formar agregados. Los mononucleares (linfocitos y monocitos), por su
menor densidad, se quedan en la interfase entre el plasma y el medio (Figs.1.1 y 1.2), con
una contaminación relativamente baja de plaquetas y otros tipos celulares. Al final de la
centrifugación, los leucocitos mononucleares se recogen del anillo blanco que se forma en
la interfase entre el plasma y el ficoll-diatrizoato. Este procedimiento permite recuperar
alrededor de un 50% de los linfocitos presentes en la muestra, con una viabilidad mayor
del 90% (determinada mediante exclusión del azul tripán, ver abajo). Por ejemplo, el
fabricante del Ficoll-Paque® describe los resultados obtenidos con su medio de la
siguiente manera:

linfocitos: >90% de las células de la fracción obtenida >90% viabilidad

50 ± 15% rendimiento (recuperación de linfocitos de la muestra)
otras células: <5% granulocitos <10% eritrocitos
plaquetas en cantidades bajas Los mononucleares que se obtienen por esta técnica (>90%
linfocitos) deben ser lavados con una solución balanceada de sales (SSB) o con el medio
que se va a utilizar en la prueba particular, con el fin de eliminar restos del reactivo, de
plasma y de plaquetas.

Factores que afectan el procedimiento

La cantidad de sangre a procesar debe guardar proporción con el volumen y la altura
del medio de separación. Al aumentar la altura del estrato de sangre con respecto a la
altura del medio, se aumenta la contaminación con eritrocitos en la interfase. Por esto, el
diámetro del tubo es un factor importante para establecer el volumen de sangre óptimo
para fraccionar. Para aumentar el tamaño de la muestra, es preferible aumentar el
diámetro del tubo, tratando de no variar la altura de las capas de medio y de sangre.
El rendimiento y la pureza de los linfocitos dependen en gran parte de la eficiencia
en la remoción de los eritrocitos. Cuando estos son aglutinados por el ficoll, algunos
linfocitos son atrapados dentro de los grumos, y por lo tanto se pierden. Este fenómeno se
reduce diluyendo la sangre 1:2 antes de fraccionarla, usando una solución salina
balanceada, con el fin de mejorar el rendimiento final de los linfocitos.
La aglutinación de los glóbulos rojos se favorece conforme aumenta la temperatura,
con lo cual se acelera la separación, pero se disminuye el rendimiento (ej. a 37°C). En
bajas temperaturas (4°C) se disminuye la velocidad de agregación, por lo que hay que
prolongar el tiempo de separación. Una temperatura de alrededor de 18°C da resultados
óptimos en cuanto al balance entre tiempo y rendimiento.
Procedimiento
1. Colocar 3 ml de F-D (ficoll-diatrizoato) en un tubo de 10-15 ml.

2. Diluir 2 ml de sangre (anticoagulada1 o desfibrinada) con 2 ml de solución salina

balanceada (SSB) o con solución salina amortiguada con fosfatos (PBS) pH 7,2.

3. Estratificar cuidadosamente 4 ml de la sangre diluída sobre el F-D (¡no mezclar!).

4. Centrifugar a 400 xg durante 20 min, a temperatura ambiente, en un rotor de ángulo

libre.

5. Con cuidado de no mezclar las capas, sacar el tubo de la centrífuga y aspirar el plasma
(capa superior) con una pipeta, delicadamente, dejando intacto el anillo blanquecino de
células mononucleares en la interfase.

6. Aspirar el anillo de células mononucleares, sin recoger demasiado2 plasma, ni F-D.

Depositar las células en un tubo limpio.

7. Lavar las células agregando ~8-10 ml de SSB y resuspendiendo suavemente con una
pipeta. Recuerde que está trabajando con células vivas que son sensibles a fuerzas
Mecánicas, así como a la osmolaridad y todos los componentes de la solución en que se
encuentran suspendidas.

8. Centrifugar a 100 xg por 5 min. Botar el sobrenadante mediante la inversión rápida del
Tubo (las células se quedan adheridas al fondo, formando un botón) y repetir el lavado.
9. Después del segundo lavado, los linfocitos pueden ser resuspendidos suavemente en el
medio apropiado que se va a utilizar para cada propósito.

10. Para comprobar el porcentaje de viabilidad celular, mezclar partes iguales de la

Suspensión de células y de azul tripán, por ejemplo 100 μl + 100 μl, y cargar una cámara
de recuento (Figs. 1.3 y 1.4). Observar inmediatamente al microscopio y contar las células
Viables (claras), distinguiéndolas de las dañadas (azules). Calcular la concentración de
Células en la suspensión original, tomando en cuenta cualquier dilución realizada
previamente al recuento.
Referencias
Bøyum, A. (1964) Separation of white blood cells. Nature 204, 793.
Bøyum, A. (1976) Isolation of lymphocytes and macrophages. En: Lymphocytes, isolation,
fractionation and characterization, p 9. (Natvig, J.B., Perlmann, P. y Wigzell, H., Eds.) Supl.
No. 5, Scand. J. Immunol. 5, 9.
Ficoll-Paque for in vitro isolation of lymphocytes (1975). Folleto de Pharmacia Fine
Chemicals
Co., Uppsala, Suecia.
Hudson, L. y Hay, F.C. (1989) Practical Immunology, 507 pp. Oxford: Blackwell Scientific
Publications.
Mishell, B.B. y Shiigi, S.M. (1980) Selected Methods in Cellular Immunology, 486 pp. San
Francisco: W.H. Freeman & Co.