UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN MARTÍN

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FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE INGENIERÍA

AGROINDUSTRIAL

MANUAL DE PRÁCTICAS DE:

MICROBIOLOGÍA AGROINDUSTRIAL

POR: Ingº EPIFANIO MARTÍNEZ MENA

Ingº NELSON GARCÍA GARAY

TARAPOTO - PERÚ
2018
 MANUAL DE PRÁCTICAS:

“MICROBIOLOGÍA AGROINDUSTRIAL”

POR: INGº M. Sc. EPIFANIO MARTÍNEZ MENA

Ingeniero en Industrias Alimentarias
Master Sciencie en Tecnología de Alimentos
Responsable de la Asignatura de Microbiología Aplicada
Docente Adscrito al DAIAI.

INGº NELSON GARCÍA GARAY

Ingeniero Agroindustrial
Responsable del Laboratorio de Microbiología y Fermentación
Responsable de la Asignatura Microbiología Aplicada
Docente Adscrito al DAIAI.

Segunda edición. Junio, 1995. Tarapoto - Perú

Primera reimpresión. Abril, 2000. Tarapoto – Perú

Corregida y actualizada. Julio, 2018. Tarapoto – Perú

 INTRODUCCIÓN

"No basta dar un paso para

llegar a la meta, sino que cada paso debe
ser una meta sin dejar de ser un paso".
GOETHE

El presente Manual de prácticas de Microbiología Aplicada se ha elaborado

tomando en cuenta aquellos métodos que resulten prácticos en los análisis
microbiológicos de los alimentos, los cuales son aplicados en los países
latinoamericanos. No pretende satisfacer todas las exigencias de los especialistas
en este campo de la microbiología de los alimentos, ya que ésta hoy en día, es una
especialidad extensa; sino más bien es un pequeño compendio de técnicas
aplicadas a cualquier laboratorio de control de alimentos.

Los métodos que se presentan para la determinación de microorganismos que

afectan la calidad higiénica y la vida útil de estos productos, son en su mayoría
técnicas propuestas por organismos de probada solvencia científica como:
International Comissión on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF),
American Public Health Association (APHA), y unos pocos corresponden a técnicas
propuestas por eminentes especialistas en el campo de la Microbiología de Alimentos
como el Prof. Dr. D. A. A. Mossel y otros.

El deseo de esta publicación, es que contribuya en algo a incrementar las fuentes de

información, un tanto escasas en nuestro medio, esperando que las técnicas que se
recomienden sean utilizadas en el Análisis Microbiológico de los alimentos.

Finalmente, y como ésta es una primera edición, el autor ruega y quedará muy
agradecido a los lectores que lo informen de cualquier errata u omisión observada.

Ing. M. Sc. EPIFANIO

MARTÍNEZ MENA
Docente Adscrito
Departamento
Académico
de Ingeniería

Agroindustrial.
 INTRODUCCIÓN A LA SEGUNDA EDICIÓN

Para publicar la segunda edición del “Manual de Prácticas de Microbiología Aplicada”,

los autores revisaron honestamente la primera edición presentada por el Ingeniero
Martínez Mena, y propusieron incluir algunas prácticas de interés en la carrera
profesional de la Facultad de Ingeniería Agroindustrial.

Siempre respetando los métodos y las técnicas ya propuestas, más los conocimientos
adquiridos a lo largo demás de una década en los análisis microbiológicos de los
alimentos, sumados a estos la enseñanza impartida a través de la asignatura de
Microbiología de los Alimentos; queremos de esta manera llegar a los estudiantes de
la Facultad de Ingeniería Agroindustrial de la Universidad Nacional de San Martín -
Tarapoto, personas interesadas y público en general, y así aumentar los
conocimientos en el campo microbiológico.

Quedaremos muy agradecidos a los lectores que informen de cualquier errata u

omisión observada.

Ing. M. Sc. Epifanio Martínez

Mena.

Ing. Nelson García Garay.

 ÍNDICE GENERAL

Página
Introducción

Introducción a la Segunda Edición

Índice General

:
5

Índice de Prácticas

:
6

Precauciones de seguridad en el Laboratorio de Microbiología :

7

Instrucciones de Laboratorio
 :
8

Formato para la presentación del Informe de Laboratorio

:
9

PRÁCTICA Nº 01

:
11

PRÁCTICA Nº 02

:
15

PRÁCTICA Nº 03

:
18

PRÁCTICA Nº 04
 :
24

PRÁCTICA Nº 05

:
27

PRÁCTICA Nº 06

:
31

PRÁCTICA Nº 07

:
39

PRÁCTICA Nº 08

:
50

PRÁCTICA Nº 09
 :
52

PRÁCTICA Nº 10

:
55

PRÁCTICA Nº 11

:
59

Referencias Bibliográficas

:
62

ÍNDICE DE PRÁCTICAS

Página

PRÁCTICA Nº 01: Métodos de Esterilización. Por: Calor, Filtración,

Humedad y Desecación, Radiaciones, Agentes Químicos.
:
 11

PRÁCTICA Nº 02: Observación Macroscópica y Microscópica de:

Bacterias, Mohos y Levaduras. : 15

PRÁCTICA Nº 03: Familia Enterobacteriaceae. Coloración Gram.

Galería Bioquímica de OxNiGLUMoCISKAD.

:
18

PRÁCTICA Nº 04: Análisis Microbiológico de los Alimentos: Muestreo

y transporte, Preparación de Diluciones, Tipos de siembra.
:
24

PRÁCTICA Nº 05: Pruebas Microbiológicas más utilizadas en el

Control Microbiológico de los alimentos: Expresión Microbiológica
de la población microbiana de los alimentos. Microorganismos
Indicadores. Microorganismos Indicadores de Alteración. : 27

PRÁCTICA Nº 06: Microorganismos Indicadores de Higiene:

Enterobacterias; Coliformes Totales, Escherichia coli; y Anaerobios
Sulfito Reductores.

:
31

PRÁCTICA Nº 07: Microorganismos Patógenos. Determinación de:

Staphylococcus aureus; Bacillus cereus; Clostridium perfringens;
Salmonella sp.; Listeria monocytogenes; Escherichia coli 0157:H7;
y Vibrio cholerae. : 39

PRÁCTICA Nº 08: Análisis Microbiológico de Aguas. Métodos de

aplicación.

:
50
PRÁCTICA Nº 09: Microbiología de la leche. Prueba de la Reductasa. : 52

PRÁCTICA Nº 10: Análisis Microbiológico de Alimentos Enlatados. :

55

PRÁCTICA Nº 11: Elaboración de productos alimenticios mediante

la acción de microorganismos: Yogur, Vino, Vinagre, Encurtidos,
Chucrut, etc.

:
59

PRECAUCIONES DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

1) Los materiales tóxicos e infecciosos son siempre potencialmente peligrosos

por lo que deben ser manipulados con el debido cuidado.

2) El uso indebido de aquellos materiales en el laboratorio pueden dar lugar a

peligrosas consecuencias, no solo para el personal que comete la falta, sino hacia
otras personas a las cuales dispersa las toxinas o microorganismos patógenos.

3) El análisis de microorganismos patógenos en alimentos, involucra ciertos riegos

de contaminación ya sea desde el mismo alimento, como de los cultivos y
concentrados tóxicos que se derivan de ello.

4) La experiencia establece que aquellos riesgos pueden ser minimizados y

eliminados por la comprensión del peligro potencial y por la aplicación de
 prácticas apropiadas en el laboratorio.

INSTRUCCIONES DE LABORATORIO

1) Use siempre guardapolvo.

2) No participar en los trabajos si tiene heridas en las manos.

3) No coma, beba o fume en el área del laboratorio, siempre evite el contacto de las
manos con la boca, nariz, ojos, etc.

4) El área de trabajo que se le asignen, consérvelo limpio y ordenado.

5) Las carteras, libros y demás útiles colóquelos en las gavetas individuales u otro
lugar, nunca sobre las mesas de trabajo.

6) Antes de cada sesión de trabajo, limpie el área con desinfectante y luego lave las
manos.

7) Coloque las pipetas usadas en los recipientes destinados para tal fin.

8) Coloque el material de descarte en recipientes apropiados para autoclavar.

9) Los cultivos mixtos de microorganismos patógenos, requieren especial cuidado,

evite que se produzcan aerosoles.

10) Para centrifugar materiales tóxicos o infecciosos use únicamente tubos con tapa.

11) En caso de producirse salpicaduras, cubra inmediatamente el área con

desinfectante apropiado.
12) Reporte inmediatamente al profesor, cualquier accidente que ocurra, por
pequeño que sea: rasguño, cortadura, quemadura.

13) Identifique su material de trabajo con Nº, fecha, experiencia y demás datos.

14) Incuba el material en la estufa, o en el lugar que se le asigne.

15) Deje su área de trabajo en perfecto orden a la hora de retirarse.

16) Lavarse las manos al principio y al final de cada sesión de trabajo.

Se permitirá la comunicación y movilización de los estudiantes dentro del Laboratorio,

siempre que la conversación y movimientos conciernen directamente con el trabajo
que se efectúe.

FORMATO PARA LA PRESENTACIÓN DEL INFORME DE LABORATORIO

A continuación se va a proporcionar pautas generales para la estructura u

ordenamiento en la redacción de un informe.

Las pautas de una estructura básica son las siguientes:

- Título
- Introducción
- Objetivo (s)
- Revisión de literatura
- Materiales y métodos
- Resultados
- Discusión
- Conclusiones
- Referencias Bibliográficas
- Anexos.

1) TÍTULO.
El título debe dar una idea precisa de la naturaleza del trabajo; debe ser claro y
breve.

2) INTRODUCCIÓN.
La introducción sirve para suministrar al lector los antecedentes, razones,
implicaciones y otros aspectos que permitan conocer la naturaleza y finalidad del
trabajo. Por ello una buena introducción debe reseñar brevemente los siguientes
aspectos:
- Importancia y naturaleza del estudio.
- Propósito.
- Relación con otros estudios.
- Limitaciones del trabajo.

3) OBJETIVO (S).
 Se deben describir con precisión los propósitos de la práctica. Algunos lo
incluyen al final de la introducción.

4) REVISIÓN DE LITERATURA.
En esta parte se dan a conocer los hechos, opiniones o sugerencias de otros
autores relacionados al tema de trabajo.

Actualmente, se preconiza una revisión de literatura breve; sólo debe referirse a

aspectos directamente relacionados con el tema del artículo, haciendo énfasis en
los más recientes.

El autor está en la obligación de mencionar las fuentes de información que usa,

debe citar al autor o autores de los trabajos consultados. Las citas bibliográficas
podrían escribirse de la siguiente manera: “Las levaduras son sensibles a la
acción de los ácidos (Carbonell, 1970)”, y “Amerine (1970), demostró el efecto
represivo del ácido acético sobre las levaduras”.
5) MATERIALES Y MÉTODOS.
Es la parte descriptiva de los procedimientos usados en la investigación, en sus
diferentes fases.

Por materiales se tiene por ejemplo: procedencia del material, lugar de las
experiencia, período de trabajo, dosis empleada, equipos e instrumentos,
productos químicos, etc.

Por método: El diseño experimental, las técnicas de laboratorio, los procesos

técnicos, modificaciones de los métodos, etc.

6) RESULTADOS.
Los resultados, son la presentación de los hechos obtenidos hasta la terminación
de la experiencia. Esta presentación debe hacerse en un orden lógico,
agrupando bien los diversos resultados.

Conviene tener presente que los resultados se limitarán a los datos obtenidos,
sean estos positivos o negativos. No se debe incluir suposiciones, conjeturas o
posibles datos en otras circunstancias. No se puede especular. En esta parte se
puede incluir cuadros estadísticos, tablas, ilustraciones (fotografías, mapas,
gráficos, dibujos).

7) DISCUSIÓN.
Ésta, es la parte más importante del informe, es considerada como la
sustentación del trabajo. Es la parte central del escrito y en ella se refleja la
personalidad, capacidad y madurez intelectual de la autor.

El autor tiene que argumentar, discutir, refutar, hacer deducciones. Se deben

puntualizar las ventajas y limitaciones de los resultados.

8) CONCLUSIONES.
Es una puntualización de las generalizaciones, sugerencias y deducciones que
emanan del trabajo. Las conclusiones tienen que basarse en hechos
comprobados; tendrán claridad si se agrupan en un orden lógico y se enumeran.
 A continuación se algunos ejemplos:

1. Es posible conocer cepas de levaduras de alta capacidad fermentativa, a partir

de uvas procedentes de viñedos de nuestro país.

2. Mediante el empleo de levaduras seleccionadas, se puede obtener una

fermentación más rápida y un vino de mejor calidad.

9) REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.
Es la enumeración de las publicaciones consultadas y citadas. Los elementos
principales y el orden de una referencia o cita bibliográfica son las siguientes:
Autor, Año de Publicación, Título de la publicación, Número de la edición, Casa
editora, lugar de publicación, paginación.

10. ANEXOS.
PRÁCTICA Nº 01: MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN.
Calor, Filtración, Humedad y Desecación, Radiaciones, Agentes
Químicos.

I. INTRODUCCIÓN.

Los laboratorios relacionados con estudios microbiológicos por lo menos debe contar con
equipos básicos tales como: Autoclave, Estufas (de incubación y de esterilización),
refrigerador, Microscopio, balanza.

Para los trabajos microbiológicos, se requiere contar con anterioridad al desarrollo del
experimento, contar con instrumentos limpios y sobretodo estériles; por lo tanto es
necesario la preparación y esterilización de éstos por anticipado.

Se entiende por ESTERILIZACIÓN a todo tratamiento de todo material con un agente físico
o químico que conlleve a la eliminación de toda forma de vida en él. La inactivación parcial
o la esterilización, se puede lograr de diferentes maneras: Por medio de calor (húmedo y
seco), Por filtración, por humedad y desecación, Por radiación, y Por agentes químicos.

II. OBJETIVOS.
- Conocer el fundamento de los métodos de esterilización.
- Conocer los equipos con que cuenta el laboratorio, y los que se utilizan para
esterilización.
- Conocer los materiales de vidrio, básicos para el uso en un laboratorio de microbiología.
- Aprender a preparar los materiales de vidrio y medios de cultivo para su esterilización.

III. MATERIALES Y MÉTODOS.

Materiales.
-Equipos: Autoclave, Horno, Estufas (incubación, esterilización), Baño María, Cámara luz
UV.
-De vidrio: Tubos de ensayo, placas petri, pipetas de 1, 2, 5,10 mL., matraces de 100,
250, 500, y 1000 mL.
-Otros: Mecheros, asa bacteriológica, algodón, hilo pabilo, papel kraft, gradilla, tijera,
fósforo, detergente, jabón, lapicero rotulador, escobilla, toalla.

Procedimiento.
A) ESTERILIZACIÓN POR MEDIO DEL CALOR. El efecto del calor sobre los
microorganismos está en relación con el grado de humedad del ambiente de
esterilización y es calor que se propaga es por conducción, convección y radiación;
de ello se distingue dos métodos muy usados. CALOR HÚMEDO: Pasteurización,
Tindalización, Ebullición y Vapor a presión en autoclave y CALOR SECO: Estufa de
Esterilización, Fuego directo al rojo vivo e Incineración.

CALOR HÚMEDO: La inactivación por calor húmedo requiere de menos temperaturas

que la que se realiza en ausencia de agua. Los enlaces débiles se rompen más
fácilmente por calor húmedo (atmósfera saturada de vapor de agua), debido a que
las moléculas de agua pueden desplazar a los puentes de hidrógeno.

Autoclave y manejo. Equipo que consta de una caldera de cobre cubierta por cobre y
estaño y protegida por una camiseta metálica de acero inoxidable formando paredes
dobles.

En la base posee una fuente de calor eléctrica (resistencia), por encima de ésta se
encuentra un recipiente con la base cribado para la salida de vapor y al mismo tiempo
sirve para colocar los materiales, en la parte superior posee una tapa de bronce con
un dispositivo alrededor que permite un cierre hermético además de contener tornillos
para evitar la salida de vapor.

La tapa en la parte externa también posee una válvula de seguridad que funciona
cuando la presión interna excede; Una espita, que permite la salida del aire frío al
inicio del calentamiento; un barómetro, para medir la presión; un termómetro, para
temperatura.

Modo de uso. Después de colocar el material a esterilizar previamente rotulado se

prende el equipo y se deja la espita abierta, se cierra herméticamente la tapa y
cuando hay desprendimiento de vapores por la espita hasta formar gotas de agua se
cierra, luego se controla la temperatura y la presión deseada.

Vapor a Presión. El autoclave, es el equipo usado para esterilización de materiales

por calor húmedo en el laboratorio de microbiología, debido a que alcanza
temperaturas superiores a la de ebullición del agua, el tratamiento se efectúa en un
compartimiento herméticamente cerrado y saturado con vapor de agua y a presiones
superiores a la atmosférica (121°C, y 15 Ib de presión por 15 minutos), en la
esterilización de medios de cultivo y para materiales de desecho se utiliza mayor
tiempo (hasta 30 minutos a 134°C, la presión se incrementa por encima de 26 Ib.). En
sólo 7 minutos se eliminan todas las formas vegetativas y esporas contaminantes
presentes.

Ebullición. Método por el cual se pueden esterilizar jeringas, guantes de jebe,

sondas, ropa, etc.; haciendo hervir durante 10 a 40 minutos, en donde se van a
eliminar todas las formas vegetativas de los microorganismos y bacterias.

Pasteurización. Método que por lo general se realiza en Baño María a una

temperatura de 65°C por 30 minutos, en donde se eliminan todas las formas
vegetativas de las bacterias pero no las termófilas; se utilizan en el saneamiento de
leches y bebidas alcohólicas. También puede utilizarse estufas que alcancen
temperaturas mayores de 60°C.

En caso de leche, también puede utilizarse temperaturas de 72-75°C en capa fina,

durante 15 segundos, esta pasteurización se denomina "STASSANIZACIÓN".

Tindalización. Conocido comúnmente como calentamiento intermitente, consiste en

someter al producto por tres días consecutivos a un calentamiento hasta 65°C
 durante media hora, se utilizan para sustancias que no soportan elevadas
temperaturas. La temperatura puede variar de 56 a 100°C, los aparatos muy
empleados son el de ARNOLD y de KOCH.

Vapor Fluente. Su acción es similar a la del agua a 100°C, se usa mucho en los
laboratorios para esterilizar medios de cultivo que llevan sustancias que se puedan
alterar a temperaturas superiores; se hace actuar sobre el material un chorro continuo
de vapor de agua por 30 a 60 minutos, el vapor debe ser obtenido a 100°C no más.

CALOR SECO. Método por el cual, la esterilización necesita recurrir a mayores

temperaturas que la efectuada por el calor húmedo, su acción fundamental es de
oxidación de los constituyentes esenciales mediante la rotura de los puentes de
hidrógeno y la desnaturalización de las proteínas. Existen tres formas de calor seco.

- HORNO PASTEUR Y MANEJO. Equipo, que por lo general es grande y de forma

rectangular o cuadrada, cubiertas por una pared triple metálica, la cual está
recubierta en su interior por planchas de asbesto del mismo modo que la puerta y los
lados, en la base están las resistencias eléctricas, las que permiten alcanzar
elevadas temperaturas hasta 250°C, constan de un termostato, un termómetro y un
cronómetro, las cuales facilitan su control durante su uso. Las temperaturas de
esterilización usadas son de 160°C por una hora, de 170°C por 40 minutos, de 180°C
por 20 minutos. En este tipo de esterilización el calor se inicia por conducción y se
propaga por convección.

Por lo general se utiliza para la esterilización de material de vidrio y material

quirúrgico, una vez colocado los materiales en su interior, se cierra y espera hasta
que alcáncela temperatura deseada y se propaga el tiempo indicado (evitar abrir
durante el proceso de v esterilización).

Flameado. Muy utilizado en esterilización de asas metálicas de siembra (hasta el rojo

vivo), con las que se inoculan las bacterias; también se utiliza en la esterilización de
bocas de tubos y placas petri al realizar el trasplante de los microorganismos.

Incineración. Ideal para aquellos productos contaminados que no importa su

destrucción como por ejemplo: ropa, cadáveres de animales y otros materiales de
desecho.

B. ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN. Consiste en hacer pasa un líquido por un

material poroso cuyo diámetro de poro sea inferior al de las bacterias y virus. El
mecanismo de filtración se debe al hecho de que los microorganismos por tener
carga eléctrica negativa y los filtros carga eléctrica positiva, los microorganismos
quedan adsorbidos frente a la presión y la acción del vacío.

Las membranas que son utilizadas como filtros son de amianto o de acetato de
celulosa cuya porosidad fluctúa de 0.005 a 1 um. De diámetro; muy útiles en la
esterilización de medios líquidos, soluciones de albúmina, soluciones de antibióticos y
otras sustancias que pueden ser alteradas por acción de calor.

C. ESTERILIZACIÓN POR RADIACIONES.

Rayos Ultravioleta (UV). La radiación UV producida artificialmente producida en el
espectro de 2537 angstroms ha sido utilizada por su actividad germicida esterilizante
por más de 30 años.

La acción de los UV se debe a la producción de ozono que logra ia asepsia, ya que

este gas conserva su acción inhibidora hasta una dilución 1 x 40.000.
 La inactivación de los microorganismos por los rayos UV, está en función de la dosis
de energía radiante: la efectividad de la aplicación de una determinada intensidad de
radiación es propia del intervalo de tiempo, sin embargo la dosis requerida para los
diferentes microorganismos varí ampliamente. Las bacterias vegetativas son de tres a
diez veces más susceptibles a la inactivación que las bacterias esporuladas; los
hongos y sus esporas son cien a mil veces más resistentes que las bacterias
vegetativas.

Su utilidad en la esterilización de ambientes y superficies, cabinas de siembra,

envasado de antibióticos, preparación de vacunas bacterias y virus inactivadas,
potabilización de aguas de mesa. El tiempo mínimo para la exposición a la luz UV
varía desde 30 minutos a más según el grado de contaminación y la distancia; y
dependerá del nivel de aplicación rayos UV.(Alto nivel: destruye todos los
microorganismos con la excepción de alta carga de esporas bacterianas; Nivel
intermedio: inactiva el microorganismo Micobacterium tuberculosis, las bacterias
vegetativas, la mayoría de los virus, hongos, pero destruyen necesariamente las
esporas bacterianas; Bajo nivel: destruye la mayoría de las bacterias, algunos virus y
algunos hongos, pero no se puede depender de ella para eliminar microorganismos
como el bacilo de la tuberculosis y esporas bacterianas.

Cuando se utiliza luz UV., es muy importante que las lámparas sean limpiadas
periódicamente con alcohol y se verifique su efectividad con cierta frecuencia. Para la
aplicación de luz UV., es necesaria una adecuada protección personal en particular
de los ojos y manos. Se utilizan lámparas generadoras de luz UV., y las radiaciones
UV comprendidas entre 210 y 328 nm. tienen acción bactericida pero esporicida; la
longitud de onda más eficaz es a 3300 angstrom.

D. AGENTES QUÍMICOS. Los que destacan son los bacteriostáticos y los bactericidas.

Solución de Fenol al 2.5 %. Empleada en la esterilización de superficies muy

irritantes para los ojos, siempre debe trabajarse con guantes.

Alcohol al 70 %. Empleado en la desinfección de manos y material de polietileno.

Solución de Formol. Contiene un aproximado de 4 % de formaldehido, se utiliza en la

desinfección de superficies y en algunos casos en la esterilización de medios de
cultivo.

Hipocloritos. Contiene una concentración de 2500 ppm de cloro y se utilizan para

descontaminar pipetas y vasijas.

Solución de Yodo. Se prepara en alcohol al 50 % a una concentración de 1600 ppm

de yodo y puede emplearse en la desinfección de manos.

Otros. Cloramina al 2%, Alcohol Isopropílico al 70%, Peróxido de Hidrógeno al 6%.

IV. CUESTIONARIO.

1. Nombrar los equipos de esterilización con que cuente el laboratorio e indicar su

funcionamiento y aplicación.

2. Indicar qué materiales se esterilizan en el autoclave y en la estufa de esterilización y

explicar la acción esterilizadora de esos equipos.

3. Explicar la manera de esterilizar ambientes, superficies (piso, mesas de trabajo,

paredes), del laboratorio de Microbiología y Fermentación.
 4. ¿Qué entiende por Bioseguridad, y cómo debe implementarse en el laboratorio?

PRÁCTICA Nº 02: OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA Y MACROSCÓPICA DE:

BACTERIAS, MOHOS Y LEVADURAS.

I. INTRODUCCION.
El cuerpo humano es una gran superficie cutánea y mucosa por la que entra en contacto
con el medio ambiente. En la superficie existen diversos sectores, donde residen
microorganismos con diferentes características de humedad, temperatura, pH y
disponibilidad de nutrientes.

La flora humana normal, es el conjunto de gérmenes que conviven con el huésped en

estado normal, sin causarle enfermedad. Su composición es característica para la especie
humana, tanto en los gérmenes que la componen en su número y distribución en el
organismo. La flora normal coloniza las superficies cutáneomucosas normales; por otro
lado, en el organismo existen sectores que son estériles en condiciones normales, por
ejemplo, la pleura, meninges, cavidad peritoneal, pericardio, etc.

La flora basal es la característica de cada sector del organismo y está constituida por
gérmenes que siempre están presentes en ese sector. Por ejemplo, Staphylococcus
epidermis en la piel, la Escherichia coli, en el intestino. En cambio la flora transitoria es
variable de un ser humano a otro y está compuesta por gérmenes que colonizan en forma
intermitente un determinado sector; esta flora puede incluir bacterias potencialmente
patógenas para el propio individuo u otras personas que entran en contacto con él.

La morfología de las bacterias es importante porque permiten distinguir las diversas formas,
bacilar, cocos, espirilos, espiroquetas, sarcinas, diplococos, etc. Se debe tener mucho
cuidado al preparar la muestra de alimento, la fijación por aplicación de calor a la lámina
porta objeto luego la coloración, teniendo en cuenta elementos estructurales básicos que
son necesarios para su identificación, como, por ejemplo: pared celular, cápsula, espora,
flagelos, Gram, etc. y así poder lograr una buena observación de la morfología bacteriana.

Los hongos, un grupo heterogéneo, de organismos eucariotas, heterótrofos no

fotosintéticos, con pared celular. Basándose en la apariencia macroscópica de la colonia se
puede diferenciar dos tipos de hongos: si producen colonias opacas, cremosas o pastosas
se denominan LEVADURAS; si producen crecimientos aéreos, algodonosos o filamentosos,
se denominan MOHOS.

El conjunto de elementos que constituyen un hongo se denomina talo, el talo puede ser
unicelular (en levaduras): en los mohos el talo incluye una parte vegetativa, el micelio,
compuesta por hifas y una parte reproductora. Las hifas son tubos que contienen núcleo y
citoplasma. El micelio puede ser tabicado y no tabicado.
El crecimiento saprofítico de los hongos puede ser dañino y causar cuantiosas pérdidas si
ocurre en materias primas industriales, además producen micotoxinas altamente
toxigénicos y en algunos casos carcinógenos; son importantes en las fermentaciones
industriales para la producción de cerveza, vino, pan, antibióticos, vitaminas y ácidos
orgánicos.

II. OBJETIVOS.
- Adiestrar al estudiante en el cultivo de microorganismos (bacterias y hongos).
- Conocer la diversidad de microorganismos que están presentes en el medio ambiente.

- Observar el crecimiento de las colonias de microorganismos en diferentes medios de

cultivo a partir de diferentes muestras de alimentos.
- Observar la morfología macroscópica microbiana y aprender a diferenciar los distintos
tipos.
- Observar la morfología microbiana en nuestras teñidas a diferenciar los distintos tipos.
- Utilizar correctamente el microscopio.

III. MATERIALES Y MÉTODOS.

Materiales.
Equipo: Microscopio
Material de vidrio: Placas Petri, laminas portaobjeto, laminas cubreobjetos.
Colorante para tinción: solución de cristal violeta 1%, solución de safranina, solución de
azul de metileno al 1 %.
Otros: medios de cultivo, mechero de alcohol, asa bacteriológica, aceite de inmersión,
pinzas de madera, fosforo y detergente
Muestras de alimentos: yogurt, vinagre, frutas y verduras.

Procedimiento.
La observación macroscópica de los microrganismos, se realizarán observando la
morfología de las colonias que crecen en los medios de cultivo; y la observación
microscópica, se realizaran en muestras fijadas y teñidas.

1. MICROOSGANISMOS DEL AMBIENTE DE TRABAJO.

Con medios de cultivo paqueteados (Agar Nutritivo, Oxitetraciclina Glucosa Agar y Agar
Mac Conkey).

Abrir las placas con el medio de cultivo y recorra el ambiente del laboratorio, cierre las
placas e incubar en la estufa o lo que indique el profesor. Observar el crecimiento de los
microorganismos sobre el medio de cultivo con la ayuda de una lupa o a simple vista.

Esquematizar los resultados y realizar coloraciones (simples o Gram).

2. MICROORGANISMO DE LOS ALIMENTOS.

- Poner diferentes muestras de alimentos, sobre filtros de papel húmedo.
- Introducir en bolsa plásticas (como si fueran cámaras húmedas).
- Dejar las muestras en un lugar tibio por unos días.
- Observar y esquematizar los resultados.

3. BACTERIAS DEL YOGUR.

Este es un producto lácteo producido por la fermentación de la leche, añadiendo una
asociación de dos cepas bacterianas: el Streptococcus termophilus, poco productor de
ácido, pero muy aromático, y el Lactobacillus bulgaricus, buen productor de ácido
láctico, manteniendo a temperaturas que oscilan entre 40–45ºc.
 - Disolver una mínima porción de yogur en una pequeña gota de agua
- Fijar con metanol para eliminar parte de la grasa.
- Teñir con un colorante cualquiera de los ya mencionados durante 1-2 minutos
- Observar al microscopio.

En el experimento se podrá observar dos morfologías distintas de bacterias (cocos y

bacilos).

4. BACTERIAS DEL VINAGRE.

El vinagre es una solución acuosa rica en ácido acético resultante de la fermentación
espontánea del vino o de bebidas alcohólicas de baja graduación. La acetificación del
vino es producida por bacterias aeróbicas del ácido acético, principalmente Acetobacter
aceti, y también por especies del género Gluconobacter.

- Disolver una pequeña cantidad de muestra con una gota de agua en una lámina porta
objeto y entender
- Dejar secar y fijar con calor.
- Teñir con un colorante cualquiera de los mencionados durante 1-2 minutos.
- Observar al microscopio.

En el experimento se observará la presencia de bacilos rectos con flagelos polares.

5. LEVADURAS DEL VINO.

El vino de uva es elaborado a partir de zumo o jugo de uva por acción de levaduras
(Saccharomyces ellipsoideus), que transforman la glucosa y fructosa del zumo a alcohol
etílico y anhídrido carbónico, en ausencia de oxígeno.

- Disolver una pequeña cantidad de muestra con una gota de agua en una lámina
porta-objeto y extender.
- Dejar secar y fijar con calor.
- Teñir con un colorante de los mencionados 1-2 minutos
- Observar al microscopio.

En este experimento se observará levaduras esféricas ovoides y alimonadas

IV. CUESTIONARIO.

1. Porqué es importante estudiar a los microrganismos?.

2. Porqué es necesario con algunas muestras, fijar y teñir para observar al
microscopio.
3. Porqué es necesario añadir aceite de inmersión y observar con el objetivo de
inmersión cuando se trabaja con muestras fijas?.
4. Explicar sobre los métodos de tinción que se utilizan en la microbiología?.
5. Qué medios específicos se utilizan para el cultivo de bacterias y hongos?.
6. Porqué es necesario ajustar el pH de los medios de cultivo, cuál es el valor
adecuado para bacterias y hongos?.
7. Qué morfología macroscópica y microscópica, ha observado en la práctica, teniendo
en cuenta las muestras usadas?.
8. Qué muestras recomendaría usar usted para esta práctica, que determinaría,
explicar?
PRÁCTICA Nº 3. FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE.
Coloración Gram. Galería Bioquímica de OxNiGLUMoCISKAD.

I. INTRODUCCIÓN.

Existe un conjunto de microorganismos que integran la flora microbiana del intestino del
hombre y de los animales, representados por millones de bacilos Gram negativo no
esporulados, que se encuentran también en las excretas, aguas, pastos, suelos,
alimentos y vegetales al estado normal y en descomposición, etc.

El conocimiento de esta flora, es obligatoria en los estudios microbiológicos, no sólo

porque algunos géneros y especies ocupan destacada posición en la patogenia entérica
de origen humano animal, sino porque también es una base fundamental en la sanidad
pública y en el diagnóstico bacteriológico en general. Nos estamos refiriendo a los
integrantes de la Familia Enterobacteriaceae, cuyo conocimiento racional y orgánico
permite establecer el diagnóstico inmediato de las enfermedades entéricas, dictar las
medidas de orden epidemiológico y establecer las causales de una serie de
enfermedades entéricas, dictar las medidas de orden epidemiológico y establecer las
causales de una serie de enfermedades intestinales, que forman un extenso capítulo de
la patogenia infecciosa del país.

Algunos autores afirman que la tercera parte de las excretas normales y secas, de
origen humano, se componen de bacterias, en su mayoría muertas; de las cuales 9/10
partes de ellas corresponden a las denominadas bacterias Gram negativas, que en casi
su totalidad de las Enterobacteriaceae y el décimo restante por microorganismos Gram
positivos. Si esta proporción ha sido considerado en un individuo que consume un
régimen alimenticio normal y mixto, es de suponer la alteración que sufriría esta
relación por variación de la dieta, por la implantación de estos dos patológicos y
disturbios intestinales, cuyos agentes son precisamente, los miembros de esta familia,
agrupados en las tribus: Salmonella, Shigella, Proteus , y Colibacilo, que integran
numerosos géneros y especies.

II. OBJETIVO.

- Hacer que el alumno recuerde las técnicas y procedimientos básicos de Microbiología

General, para poderlos aplicar posteriormente en el control microbiológico de los
alimentos.

III. REVISIÓN DE LITERATURA.

A las enterobacterias, se les describe como microorganismos Gram negativo no

esporulados, móviles o inmóviles, provistos de flagelos en perítrico, que adoptan la
forma de bacilos y cocobacilos; viven normal y patológicamente como huéspedes en el
intestino del hombre y de los animales, se les halla en los alimentos en descomposición,
excretas de origen humano y animal, en las aguas del albañal y emuntorios; en general
viven saprofíticamente en las materias orgánicas en descomposición. Gran número de
especies que integran esta familia son patógenas para el hombre y los animales;
produciendo infecciones graves en forma individual, endémica y epidémica.
 Son diferenciados por sus reacciones bioquímicas, caracterizándose porque reducen
invariablemente los nitratos a nitritos, con excepción de Erwinia; tienen reacción
oxidasa negativa, fermentan glucosa con producción de ácido (A) o ácido y gas (ag);
algunos géneros, como Proteus, descomponen precozmente la úrea, y la mayoría es
fenilalanina negativo, con excepción de Proteus y Providencia. La fermentación de la
lactosa, la tolerancia al cianuro de potasio, reacción frente a ácidos orgánicos, y la
descarboxilación de los aminoácidos, se realizan en forma variable.
Evidentemente que los microorganismos integrantes de la Familia de las
Enterobacteriaceae, no producen citocromo-oxidasa, son Gram negativos y reducen los
nitratos a nitritos, aún cuando estas reacciones deben ser cuidadosamente
consideradas, pues la prueba de la citocromo-oxidasa es positiva para las Pseudomonas,
Alcaligenes, Aeromonas y Vibrios.

IV. MATERIALES Y METODOS.

A) Coloración Gram a partir de una cepa marcada

- Desengrasar un porta-objeto con alcohol y algodón.
- Descolgar una gota de agua estéril, suspender en ella una pequeña cantidad de
cepa problema y homogenizar.
- Dejar secar y flamear suavemente la extensión para fijarla.
- Cubrir con una solución del colorante primario, Cristal violeta u otro similar y dejar
en contacto por espacio de 2 minutos. Lavar con agua de caño.
- Cubrir con el mordiente o fijador y dejar en contacto por un minuto. Lavar.
- Decolorar con la solución de Alcohol-Acetona (1:1). Lavar.
- Cubrir con solución de contraste, safranina u otro similar y dejar en contacto por
30 segundos. Lavar.
- Secar suavemente, agregar una gota de aceite de inmersión y observar al
microscopio. Anotar los resultados.

B) Galería Bioquímica de OxNiGLUMoCISKAD para Enterobacterias.

A partir de una cepa marcada, efectuar las siguientes pruebas bioquímicas:

- Reacción de la Oxidasa (Ox)
- Reducción de los Nitratos (Ni)
- Fermentación de la Glucosa (G)
- Fermentación de la Lactosa (L)
- Hidrólisis de la Urea (U)
- Ensayo de Movilidad por cultivo (Mo)
- Asimilación del Citrato (C)
- Formación del Indol (I)
- Formación del Acido Sulfhídrico (S)
- Prueba de la Tolerancia al Cianuro de Potasio CNK (K)
- Transformación de la Fenilalanina en Acido Phenil Pirúvico APP (A).
- Descarboxilación de la lisina (D)

C) Fundamento y procedimiento de las pruebas bioquímicas para la familia

Enterobacteriaceae

Constituida por gérmenes abastonados Gramnegativo, móviles (flagelos en perítrico)

e inmóviles, Oxidasa negativos, Nitratos son reducidos a nitritos, todas fermentan la
glucosa con o sin producción de gas, la diferencia de estas bacterias se basan en el
comportamiento bioquímico, tratamiento recomendado por MOSSEL-QUEVEDO y
llamado:
 Ox Ni G L U Mo C I S K A D

OXIDASA (Ox)

Llamada también Citrocromo Oxidasa; Es una enzima por la cual las bacterias que las
poseen, oxidan la tetrametil-para-fenil-endiamina en Indol (azul).
 Prueba
En una placa petri colocar un papel de filtro, humedecer este con el reactivo de
Kovacs (solución de tetrametil-parafenil-endiamina al 1% en agua destilada).
Preparar el reactivo inmediatamente antes de usarlo, debido a que se oxida con el
aire y la luz. En la parte humedecida hacer una estría de cultivo joven (18 a 24 horas
de incubación) de más o menos 5 mm. de longitud considerar la prueba como
positiva, si en 5 segundos aparece un color azul intenso. Las enterobacterias no
deben dar esta reacción.

REDUCCIÓN DE NITRATOS (Ni)

Las bacterias que poseen la enzima nitrato-reductasa, tienen la propiedad de reducir

los nitratos a nitritos.

Prueba
Sembrar el germen a estudiar en agar o caldo nutritivo que contenga además 1/1000
de Nitrato de Potasio. Después de incubar a 37º/24 horas, añadir gotas de solución A
y de solución B (Reactivo de Gries) o en su defecto reactivo sólido formado por ácido
sulfanílico, ácido tartárico, y alfa-naftil-amina.

La prueba es positiva si aparece color rojizo en ambos casos. Sino aparece dicha
coloración agregar sobre el cultivo que contiene el reactivo, Zn o Mg en polvo;
observar después de 10 minutos si la coloración es rojiza, considerarla como
negativa ya que en el caso, son el Zn, Mg, y no el germen, es el que se ha reducido
en nitratos.

PRUEBA MEDIO CULTIVO Tº Y TIEMPO REACTIVO A RESULTADO

DE INCUBACIÓN AÑADIRSE POSITIVO
Tetrametil
Ox -.-.- -.-.- parafenil Sin coloración
endiamina
Ni Caldo nitrato 37ºC X 24-48 H Reactivo gries Color rojizo
G Agar glucosa 37ºC X 24-48 H Color amarillo
L Agar lactosa 37ºC X 24-48 H Color amarillo
U Caldo urea 37ºC X 24-48 H Color grosella
intenso
Mo Agar Movilidad 37ºC X 24-48 H Turbidez
C Agar Citrato 37ºC X 24-48 H Color azul
simmons
Reactivo Anillo rojo
I Caldo peptonado 37ºC X 24 H
de kovacs grosella
S Agar kligler 37ºC X 24 H Coloración negra
Agar base + 0.1 Disco blanco en
K 37ºC X 18-24 H
ml de CNK 0.5% superficie
A Agar fenilalanina 37ºC X 18-24 H Sal Férrica Color verde
D Agar lisina fierro 35-37ºC X 24-48H Color púrpura
FERMENTACIÓN DE GLUCOSA, LACTOSA Y PRODUCCIÓN de H2S (GLS)

El H2S es formado por determinadas Enterobacterias, ya sea por desaminación de

aminoácidos azufrados (tiosulfatos, sulfitos). En el medio, el H 2S formado, reacciona
con la sal de Fe contenido en él y da sulfuro de fierro (FeS) de color negro. La
prueba en condiciones aerobias, es reversible.

Prueba y lectura.

Se puede realizar en un sólo medio: Kligler (Hierro dos azúcares), en el cual la

siembra se realiza por picadura profunda, y una estría en la superficie. Incubar a
37ºC, por 18 a 24 Horas.

Parte inferior amarilla: Fermentación de Glucosa.

Parte superior amarilla: Fermentación de Lactosa.
Ruptura del medio: Producción de gas (Glucosa)
Ennegrecimiento en la puntura de inoculación: H2S positivo.
Indicador del medio: Rojo de fenol

HIDRÓLISIS DE LA UREA (U)

Las enterobacterias que poseen la enzima ureasa, hidrolizan la Urea, alcalinizando en

esta forma el medio de cultivo, haciendo virar con ello el rojo de fenol, indicador de
este, del anaranjado al grosella intenso (prueba positiva).
Medio de cultivo: Caldo úrea

DETECCIÓN DE MOVILIDAD (Mo)

Prueba
Como medio de cultivo se utiliza un medio semi-sólido (agar nitratado que lleva 3%
de agar) distribuidos en tubos de "U" la siembra se realiza por puntura, introduciendo
la aguja de Kolle 5 mm de profundidad, sólo en una de las ramas.

Lectura
Después de incubar a 37ºC por 24 horas, considerar la prueba positiva, si un
enturbiamiento se extiende desde la rama cultivada a la otra.
KNO3: Fuente de Oxígeno, necesaria para la movilidad del germen aerobio.

ASIMILACIÓN DEL CITRATO (C)

Las enterobacterias que utilizan el Citrato de Sodio como única fuente de Carbono,
alcalinizan el medio agar Citrato de Simmons, haciendo virar el indicador azul de
bromo timol, del verde al azul intenso.

Para esta prueba hay que tener las siguientes precauciones:

 - Utilizar tubos nuevos, o bien los usados, esterilizado al calor seco para destruir allí
los posibles restos de materia orgánica que pudiera contener.

- Realizar siempre la siembra a partir de un medio sólido porque con medio líquido
se arrastraría restos de materia orgánica.

- Realizar la siembra en pequeña cantidad y trazando sólo una línea a lo largo de la

superficie de inclinación.
PRODUCCIÓN DE INDOL (I)

Algunas enterobacterias, tienen la propiedades hidrolizar el aminoácido triptofano.

Uno de los productos finales de esta degradación es el Indol.

Prueba. Para detectarlo, a un cultivo de 18 a 24 Horas en caldo Peptonado, adicionar

el reactivo de Kovacs para Indol. Prueba positiva: Anillo grosella en la superficie.

TOLERANCIA AL CIANURO DE POTASIO (K)

Prueba. Para determinar la resistencia de las diferentes enterobacterias frente al

CNK; se realiza la siembra del germen a estudiar, en medio base al que se le ha
colocado previamente 0.1 ml. de una solución al 0.5%. Se usan tubos de 8 x 160
mm., y se siembran tres usadas de más o menos 6 mm. de diámetro, a partir de un
cultivo de 18 a 24 horas Incubar a 37ºC por 18 a 24 horas como máximo.

Lectura
Prueba positiva: Disco blanco en la superficie del medio.
Prueba negativa: Turbidez en la parte inferior, con una superficie completamente
transparente, o ausencia total de desarrollo.

PRUEBA DE ACIDO PHENIL PIRUVICO (A)

La fenilalanina, es un aminoácido que determinadas enterobacterias pueden

transformar en ácido phenil pirúvico.

Prueba. Sembrar el germen a estudiar, en forma abundante (estrías) aminoácido en

estudio. Después de la incubación a 37ºC por 24 horas, investigar en el medio la
presencia de ácido fenil pirúvico, adicionando unas gotas de sal férrica (Cl 3Fe).
Prueba positiva: Aparición inmediata de color verde.

DESCARBOXILACIÓN DE LA LISINA (D)

Ciertas enterobacterias pueden transformar por descarboxilación la lisina en

Cadaverina, que por desaminación libera grupos amino (NH 2), bajo la forma de NH3,
alcalinizando el medio de cultivo.

Prueba. Esta prueba se realiza en el medio de Taylor, que lleva glucosa, lisina y
púrpura de bromocresol como indicador del medio.

Lectura. Después de incubar a 37ºC por 24 horas, considerar la prueba como

positiva si el medio Violeta varía al color púrpura.
Prueba negativa: medio de color amarillo, por fermentación de la glucosa.

V. CUESTIONARIO.
 1) Porqué las bacterias gramnegativas retienen el colorante de contraste, durante la
coloración Gram.
2) Mencione diferencias entre bacterias Gramnegativas y bacterias grampositivas.
3) Describa a las bacterias entéricas y nombre a los géneros más representativos,
dando características de cada uno de ellos.
4) Mencione las enfermedades que ocasionan algunos géneros de la familia
Enterobacteriaceae.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS DE DIFERENCIACIÓN PARA ENTEROBACTERIAS

DIV GRUPO Ox Ni G L U Mo C I S K A D
1 Shigela - + + - - - - - - - - -

Alkalencens-Dispar - + + +- - - - + - - - +-
Escherichia
- + +g +- - +- - +- - - - +-
2 Salmonella - + +g - - +- + - - +- - +*

Arizona - + +g -+ - + + - + - - +

Citrobacter - + +g +- - + + - + + - -

Bethesda-Ballerup - + +g - - + + - + + - -
3 Enterobacter - + +g + -+ + + - - + - +-

Hafnia - + +g - -+ - + - -+ + - +

Klebsiella - + +g +- + - + -+ - + - +

Serratia + +g -+ - + + - - + - -
4 Proteus vulgaris - + +g - + + +- + + + + -

Proteus mirabilis - + +g - + + +- - + + + -

Proteus morgani - + +g - +- + - + - + + -

Proteus rottgeri - + +g - -+ + + + - + + -

Providencia - + +g - - + + + - + + -

De acuerdo a EDWARDS (1960)

 g = Presencia de gas
+- = Normalmente positivo (+)
-+ = Normalmente negativo (-)
* = Excepción Salmonella paratyphi

PRACTICA Nº 4. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS

(Muestreo, Preparación de diluciones y Tipos de siembra).

I. INTRODUCCIÓN.

Importancia del contenido microbiano de los alimentos.

- Alimentos Puros: Se encuentran Bacterias, Mohos, Levaduras, y otros.
- Alimentos degradados: Que puede ser ácidos, alcalinos, Insípidos, mediante las
cuales los alimentos se descomponen, y se producen toxinas (sustancias proteicas
producidas por microorganismos patógenas).

Es importante para el Análisis Microbiológico de los alimentos, Estado Higiénico,

Conservación, Procesamiento, y Manipuleo adecuado de los alimentos.

Muestra y Transporte

- Agua: Superficial (ríos, lagos); Subterránea (puquianos, pozos); Potable, etc.

- Alimentos líquidos: Bebidas alcohólicas, Bebidas no alcohólicas, Jugos y Néctares,

Leches, y otros similares.

Estos alimentos usan como empaque para su venta, envases tales como: Botellas,
bolsas, cajas, etc.

- Alimentos sólidos: La superficie de los alimentos es la puerta de entrada para que

empiece el deterioro de éstos.

- Alimentos gaseosos: Mediante la exposición de las placas con el medio de cultivo

específico, al medio ambiente; se pueden encontrar coliformes, mohos y levaduras,
bacterias viables.

Transporte de las muestras.- Esta operación debe variar en lapsos de tiempo 6-12 horas
antes de iniciarse el análisis, y mantener en refrigeración a rangos de 3 a 5ºC.
Muestreo en la fábrica o planta: La extracción de la muestra será efectuada por personal
profesional o un técnico bien entrenado, y cada vez que se realice el muestreo, la
muestra irá acompañada de su informe con los siguientes datos:

- Nombre del producto del que se extrajo la muestra.

- Lugar, Fecha y Hora de la toma de muestra.

- Procedencia de la muestra.

- Temperatura de la muestra al momento de la extracción.

- Condiciones y circunstancias pertinentes en el momento de la extracción de la

muestra así como también el estado de los envases y medio ambiente en que se han
mantenido estos.
 El número de muestras a extraer, se realizará de acuerdo al tamaño del lote, pero para
ello se hará uso de las siguientes tablas:
A. Cuando el tamaño del lote es pequeño:
Tamaño de lote (N) Tamaño de la muestra (n)
Hasta 90 02
90 a 150 03
151 a 280 05
181 a 500 08
501 a 1200 13
más de 1200 20

B. Cuando el tamaño del lote es grande:

Tamaño del lote (N) Tamaño de la muestra (n)
600 a menos 06
601 a 2000 13
2001 a 7200 21
7201 a 15000 29
15001 a 24000 48
24001 a 42000 84
más de 42000 126

II. OBJETIVO.

- Introducir en el estudiante, las operaciones básicas en el Análisis Microbiológico de

los Alimentos.

III.MATERIALES Y MÉTODOS.

1. Materiales.
- Solución salina peptona (S. S. P.)
- Agar Recuento u otro similar
- Matraces de 100, 250, 500 ml.
- Pipetas de 1, 2, 5, 10 ml.
- Tubos de prueba de 12 x 160mm
- Placas petri grandes
- Mecheros
- Muestra de alimentos.

2. Métodos.

Muestreo en el laboratorio para el Análisis Microbiológico.

- En Muestras líquidas. En estos casos, es necesario realizar un buen agitado con el
fin de homogenizar bien la muestra, de manera que no haya fases diferenciadas en
el líquido. También cabe indicar que no es necesario realizar una dilución inicial
para efectuar al análisis microbiológico, pues este se realiza directamente a partir
 de la muestra original (m. o.), ya sea leche, agua, licores y bebidas en general,
etc.
- En muestras sólidas. En el caso de muestras sólidas es necesario diluir con una
solución fisiológica, para poder efectuar el análisis; ya que directamente de la
muestra sólida no se puede realizar dicho análisis.

Para proceder al homogeneizado, se pueden elegir uno de dos, Tomar de 10 a 20

gr. de la muestra sólida para el análisis.

Tendremos resultados más exigentes utilizando 20 gr., ya que el tamaño de la

muestra es mayor con relación la flora deseada. Para someter la muestra ya
homogeneizado, es necesario pesar exactamente dicha cantidad de muestra,
extraídos de diferentes partes de la muestra en condiciones asépticas.
El homogeneizado se realiza mezclando la muestra pesada con una solución
fisiológica (por lo general solución salina peptonada), en volumen tal que sumada
al peso de la muestra resulte 100 ml. el homogeneizado se efectúa vigorosamente
mediante una licuadora, cuidando utilizar los vasitos en estado estéril, por tiempo
no mayor de 3 minutos. El homogeneizado resultante se denomina solución
madre (S.M.), que vendría a ser también la primera dilución, a partir de la cual se
preparan las demás diluciones y los análisis microbiológicos respectivos.
Preparación de las diluciones para el análisis microbiológico.
Utilizando la muestra original (muestras líquidas), o la solución madre (muesta
sólida homogenizada), se preparan las diluciones para lo cual se procede de la
siguiente manera:

Tomar con la ayuda de una pipeta estéril, un milímetro de la muestra original

(líquido) o solución madre (homogeneizado), y llevar aun tubo de ensayo estéril
conteniendo 9 ml. de la Solución Salina Peptonada (SSP) estéril, homogenizar; será
la dilución 10 (-2), y así sucesivamente hasta obtener las diluciones requeridas.
Composición de Solución Salina Peptonada
Peptona............................. 1.0 gr.
Cloruro de Sodio.............. 8.5 gr.
Agua destilada.................. 1.0 L.
Esterilizar a 120ºC por 15 minutos, debidamente repartidos en tubos de ensayo a
razón de 9 ml. y en frascos erlenmeyer a razón de 90 ml..
Tipos de Siembra.
a. Incorporación : 1.0 ml. de la dilución respectiva.
b. Extensión : 0.1 ml. de la dilución respectiva.
c. Estrías : - Por picadura profunda y estría superficial.
- Por agotamiento de superficie

IV. CUESTIONARIO.
1. Porqué se utiliza Solución Salina Peptonada (SSP), o suero Fisiológico en la
preparación de diluciones?.
2. Cuál es la importancia de las diluciones?.
3. Para la toma de muestras de alimentos sólidos, líquidos, semilíquidos, gaseosos;
¿Qué materiales utilizaría?. De ejemplos de estos tipos de alimentos.
4. Fundamente, Porqué utilizaría y en qué casos, siembra por Incorporación,
siembra por Extensión, siembra por Estrías; en los Análisis microbiológicos de
los alimentos?.
PRÁCTICA Nº 5. PRUEBAS MICROBIOLÓGICAS MÁS USADAS EN EL
CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS
(Expresión Microbiológica de la población microbiana de los
alimentos. Microorganismos Indicadores. Microorganismos
Indicadores de Alteración.).

I. INTRODUCCIÓN.

1) Expresión Microbiológica de la Población Microbiana de los Alimentos.

- La población microbiana de los alimentos se expresa por un entero seguido de
un decimal y multiplicando por 10, elevado a una potencia. Esa expresión en lo
posible debe provenir de un promedio de resultados. Ejemplo:

4,5000 4.5 x 104

4,5600 4.6 x 104

- La población microbiana siempre está dada en número de colonias o

microorganismos por gramo de muestra si la muestra es sólida o por mililitro si
es líquida. Cuando la población es cero o cercana a cero, se expresa como nulo;
y cuando la población está entre cero y uno, se dice menor que uno.

- Cuando el análisis es cualitativo, es decir se investiga la presencia o ausencia de

un microorganismo en un alimento y no la cuantía, el resultado se expresa
como Negativo o Positivo, respectivamente.

2) Grupos de Microorganismos.

Todos los alimentos ya sean frescos o procesados, están sujetos a diversos

factores de alteración, como consecuencia, se conservarán de acuerdo a como son
o fueron tratados, manipulados, almacenados, etc., y de acuerdo a la eficiencia
aplicado al procesamiento del alimento.

De tal manera que existen grupos de microorganismos que nos indican por
ejemplo, alteración del producto, mal procesamiento, deficiencia del almacenaje,
condiciones higiénicas inadecuadas, contaminación fecal, tratamiento térmico
inadecuado, etc. La presencia de estos microorganismos en cierto número se
considera como índice de que el alimento fue tratado, conservado y manipulado en
condiciones inadecuadas, que permitieron la llegada o resistencia y proliferación de
microorganismos patógenos. A estos se les denomina MICROORGANISMOS
INDICADORES.

Los principales microorganismos indicadores son:

a) Microorganismos Indicadores de Alteración.
b) Microorganismos Indicadores de Higiene.
c) Microorganismos Patógenos.

3) Microorganismos Indicadores de Alteración.

a. Definen a los microorganismos asociados con la vida útil de los productos; las
materias primas contaminadas, limpias, y desinfectadas incorrectamente o
condiciones inadecuadas de tiempo/temperatura durante la producción o
conservación de los alimentos o una combinación de estas circunstancias, se
expresarán en un recuento alto de gérmenes viables.
 b. Por lo general, alimentos que contienen partes o sus constituyentes en
descomposición, presentan cargas elevadas de alrededor de 10 6 a 108
microorganismos por gramo o mililitro.

c. También se puede afirmar que los recuentos altos indican que el producto va a
alterarse pronto.

d. El número de microorganismos aerobios mesófilos, bacterias heterotróficas,

aerobios mesófilos esporulados, mohos, levaduras, levaduras osmófilas,
bacterias ácido-lácticas y microorganismos lipolíticos, son las pruebas
microbiológicas más adecuadas, como índice de alteración de los alimentos.

NOTA: También es necesario advertir que existen casos en donde los recuentos
altos carecen de significado como es el caso de las salchichas,
encurtidos, quesos y otros productos lácteos, donde es natural una gran
multiplicación de los microorganismos, ya que tiene lugar una
"fermentación" o "maduración" del producto.

e. El número de microorganismos viables, es el número de colonias que se

desarrollan a partir de un g. o mL. de muestra sobre un determinado medio de
cultivo.

f. Preparación de los medio de cultivo.

-Agar Recuento (Plate Count).

Triptona 5.0 g.
Extracto de Levadura en polvo 2.5 g.
Glucosa 1.0 g.
Agar Agar 15.0 g.
Agua destilada 1.0 L.

Después de la disolución de estos ingredientes, llevar el pH a 7.0 y luego

esterilizar a 121ºC x 20 minutos.

-Oxitetraciclina Glucosa Agar (OGA).

Extracto de levadura en polvo 5.0 g.

Glucosa 20.0 g.
Agar Agar 20.0 g.
Agua destilada 1.0 L.

Disolver en Baño María y Esterilizar a 121°C por 20 minutos y conservar a

50°Caproximadamente. Agregar en condiciones Estériles, 100ml de una
solución acuosa al 0.1% de Oxitetraciclina bajo la forma de terramicina,
recientemente preparada y esterilizada por filtración. Repartir en placas petri
estériles.

II. OBJETIVO.
- Enseñar al estudiante el significado y las operaciones a seguir en la ejecución de la
prueba microbiológicas más utilizadas en el control microbiológico de los
alimentos.
III. MATERIALES.

1. Materiales.
- Placas petri, tubos de ensayo, pipetas de 1, 2, 5, 10ml, frascos erlenmeyer,
licuadora, cuchillos y vaso de licuar.
- SSP (Solución Salina Peptonada), Agar Recuento, Medio OGA, Estufas de
incubación, Mecheros.
- Diversas muestras de alimentos.

2. Métodos.

La forma de operar y calcular el recuento bacteriano es el siguiente:

a) Numeración de Gérmenes Aerobios Mesófilos Viables (GMVA).

Mezclar en placas estériles 1 ml. de la serie de diluciones con 15 ml. del medio de
cultivo Agar Plate Count, conservado a más o menos 50ºC. Luego de solidificado,
adicionar una capa fina de medio de cultivo a manera de "capa selladora" (más o
menos 5 ml). Luego incubar a 37ºC x 24 - 48 horas.

b) Numeración de Hongos (Mohos y Levaduras). Llevar 0.1mL de cada disolución en

otras tantas placas Petri conteniendo el medio OGA (Oxitetraciclina Glucosa Agar)
estéril y solidificado. Extender sobre la superficie del medio con la ayuda de una
espátula de Drigalsky. Incubar a temperatura de 22°C o al medio ambiente por 3 a
5 días. Al cabo de este tiempo realizar el recuento de Mohos (colonias
filamentosas) y el de levaduras (colonias pastosas y brillosas), por separado los
límites para el recuento de colonias debe ser ente 3 - 100 colonias. Los cálculos y
expresiones de la población se realizan de forma instruida anteriormente.

Identificación de mohos y levaduras:

Cuando se quiere identificar el moho, se procede a aislar las células

respectivamente en láminas portaobjetos estéril es conteniendo una capa fina de
medio OGA, sobre la que se inocula el moho a estudiar, luego se cubre la
superficie con una lámina cubre-objeto estéril; convenientemente acomodado en el
interior de una placa Petri estéril, se incuba a 22°C o al medio ambiente por 3-5
días.

Después contar el número de colonias que se han desarrollado en las placas petri
que contienen entre 30 y 300 colonias (para GAMV), y de 3 y 100 (para Mohos y
Levaduras), guardando siempre la relación de décimo entre las diluciones
contiguas.

Calcular el número de bacterias viables por ml. o gr. de muestra; el resultado debe
ser expresado como:

N = a x bn

Donde: a, varía entre 1.1 - 9.9

b, es igual a 10
n, puede ser 2 ó más de 2

Ejemplo: 58'846,532
 Se debe escribir: 5.9 x 107 ufc/g. ó ml.

IV. CUESTIONARIO.

1. Reporte otros métodos de recuentos bacterianos, indicando fundamentos,

operación y precisión.
2. Defina lo que es un factor de dilución.
3. Defina lo que es un microorganismo indicador.
4. Qué significa los límites de 30 a 300?
5. El análisis microbiológico de una muestra de harina de maíz, se obtuvo el siguiente
resultado de Gérmenes Aerobios Mesófilos Viables (considere que analizó 18 g. de
muestra).

Lecturas
Dil. Nº 1 Nº 2

S.M. Infin. Infin.

-2 308 284
-3 28 76
-4 04 6

Calcule el número de colonias (ufc) por gramo de muestra.

6. Del análisis microbiológico de una muestra de agua se ha obtenido el siguiente

resultado de Gérmenes Aerobios Mesófilos Viables (GAMV).

Lecturas
Dilución Nº 1 Nº 2

M.O. Infin. Infin.

-1 629 Infin.
-2 458 Infin.
-3 222 531
-4 38 98
-5 3 11

Nota: La lectura Nº 2, se obtuvo de tubos de diluciones bien agitadas.

Se pide:
a) Encontrar el número de microorganismos por mL. de agua.
b) Fundamentar el porqué de la elección de los datos para los cálculos.
c) Discutir acerca de la importancia del agitado de la solución.

7. Por qué utiliza el pH 7.0 y una relación Temperatura/Tiempo de esterilización de

121º C x 20 minutos.
PRACTICA N° 6. MICROORGANISMOS INDICADORES DE HIGIENE
(Enterobacterias, Coliformes Totales, Escherichia coli, y
Anaerobios Sulfito Reductores).

I. INTRODUCCIÓN.
Los microorganismos indicadores de higiene son: Enterobacterias, Coliformes totales,
Escherichia Coli, y Anaerobios sulfito reductores; microorganismos no patógenos que
están asociados con la higiene.

A) ENTEROBACTERIAS TOTALES. Las Enterobacterias, son un conjunto de

microorganismos que integran la flora microbiana del intestino del hombre y de los
animales que poseen las siguientes características: Son bacilos gram negativos no
esporulados; Son móviles e inmóviles, provistos de flagelos en peritrico; Se les
diferencia por sus reacciones bioquímicas y que se caracterizan porque todas
reducen los nitratos a nitritos, con excepción de Erwinia sp., tiene reacción oxidasa
negativa, fermentan la glucosa con reducción de ácido(A) o ácido y gas(AG);
algunos gérmenes descomponen precozmente la urea; la mayoría son fenilalanina
negativa, con excepción del proteus y providencia; la fermentación de la lactosa, la
tolerancia al Cianuro de potasio, y la descarboxilación de los aminoácidos, se
realizan en forma variable.

Las reacciones bioquímicas de las Enterobacterias, son mayormente utilizadas con

la finalidad de investigar y detectar Salmonella sp, en los alimentos.

B) COLIFORMES. El termino coliformes totales, comprende los géneros: Escherichia,

Enterobacter, Klebsiella, y Citrobacter, y se caracterizan por utilizar la lactosa como
fuente de carbono. Los coliformes distintos a la E. coli, persisten en el suelo o sobre
las superficies, tales como los granos, frutas y otros productos del campo.

C) Escherichia coli. Este microorganismo habita naturalmente en el tracto digestivo del

hombre y de otros animales de sangre caliente.

La presencia de este microorganismo en un alimento dado se interpreta como

contaminación directa o indirecta de origen fecal, por lo que se considera a la E. coli
como el indicador clásico de la presencia simultánea de bacterias patógenas
entéricas, entre ellas, Salmonella tiphy, otras Salmonellas, Shigella, Vibrios,
parásitos diversos, y virus entéricos. Sin embargo la presencia de E. coli en un
alimento no indica que existan también necesariamente gérmenes patógenos, sino
simplemente advierte el riesgo de que pudieran estar presentes.

D) ANAEROBIO SULFITO REDUCTORES. Los anaerobios sulfito-reductores

constituyen un grupo asociado a los Clostridium spp y como tal se caracterizan por
ser organismos Gram positivos, anaeróbicos, formadores de esporas, que están
normalmente en las heces, aunque en número mucho más reducido que E. coli. Su
representante más característico es Clostridium perfringens, estos microorganismos
tienen la capacidad de reducir los sulfitos a sulfuros a partir de aminoácidos y
compuestos azufrados y para su detección se utiliza la evidente coloración negra
dada por la formación del precipitado.

El origen de los anaerobios sulfito-reductores no es exclusivamente fecal, ya que

pueden proceder de otras fuentes ambientales, como suelo, sedimentos marinos,
vegetación en descomposición, heridas infectadas de hombre y animales, aguas
superficiales, como también en los alimentos, especialmente cuando las condiciones
de higiene en la elaboración son deficientes.
 Debido a las características que poseen los anaerobios sulfito-reductores es que se
han propuesto como indicadores de contaminación de alto riesgo del agua. La
ventaja más importante es que sus esporas sobreviven en el agua mucho más
tiempo que los organismos del grupo coliforme y son resistentes a la desinfección,
al punto que pueden ser detectados en algunas muestras de agua después de
haber recibido pre desinfección, floculación, sedimentación, filtración y la
desinfección terminal.

En conclusión, podemos considerar lo siguiente:

- Las Enterobacterias totales, son indicadores de los métodos de limpieza y

desinfección de superficies en las fábricas de alimentos y de calidad higiénica de
los componentes de los alimentos.

- La E. Coli, es un buen indicador de la contaminación fecal para la mayoría de los

alimentos.

- Los demás coliformes, son buenos indicadores de una limpieza y de infecciones

no adecuadas o de una industrialización o procesamiento no correctos de los
alimentos.

- Los anaerobios sulfito-reductores, debido a las características que poseen es que

se han propuesto como indicadores de contaminación de alto riesgo del agua.

MEDIOS DE CULTIVO: Los medios de cultivos en la siguiente práctica son los

siguientes:

A) Para Enterobacterias. Método de Recuento en placas.

Agar Mac Conkey, por el método de recuento en placas. Se debe añadir a la

fórmula del Agar Mac Conkey, 10 g. de glucosa. Cuando se trata de determinar la
presencia de Salmonella spp., se produce de otra manera, ya que la presencia en
los alimentos de cualquier serotipo de Salmonella, es potencialmente peligrosa
como fuente de enfermedad para el hombre, bien de modo directo por el consumo
de estos alimentos o indirectamente mediante la contaminación secundaria de
utensilios, de equipos para el tratamiento e industrialización de los alimentos o de
otros alimentos.

B) Para Coliformes.- Método de Recuento en placas.

Agar Rojo Violeta con Sales Biliales (VRBA), que tiene la siguiente composición:
- Cristal Violeta 2.0 mg.
- Rojo Neutro 30.0 mg.
- Extracto de levadura en polvo 3.0 gr.
- Sal Bilial N°3 1.5 gr.
- Lactosa 10.0 gr.
- Cloruro de sodio (Na Cl) 5.0 gr.
- Peptona 7.0 gr.
- Agar Agar 15.0 gr
- Agua destilada 1.0 L

Después de la disolución llevar el pH del medio a 7.3. El calentamiento se realiza a

más o menos 100°C para la disolución de los ingredientes, al eliminar las bacterias
vivas que pueden dificultar la numeración de Coliformes, hace que no haya
 necesidad de esterilizar el medio , solo se le conserva a 50 – 60°C después de
lograrse la disolución.

Este método permite enumerar no solamente los bastones Gram (-) que fermentan
la lactosa (denominada bacterias coliformes o coli-aerógenes), como la E. coli,
Citrobacter freundii, Enterobacter aerógenes, etc., sino también las bacterias
intestinales lactosa (+), conocidas como Colifecales, patógenas indeterminados,
como la Salmonella, Arizona, Shigella, y las especies denominadas
“Paracolobactrun”. El medio se caracteriza porque lleva consigo un colorante
apropiado y sales biliales que van a inhibir el desarrollo de las bacterias que no
sean Coliformes.

C) Para Anaerobios Sulfito Reductor.- Método de Recuento en placas.

Agar Sulfito de Hierro, Base

- Peptona de caseína 15.0 g.
- Extracto de Levadura 10.0 g.
- Sulfito de sodio 0.5 g.
- Agar Agar 15.0 g.
- Agua destilada 1.0 L.
Aditivo. Sulfato de hierro (II) 1.4 g.

Disolver 40.5 g/litro, distribuir (eventualmente) en matraces, esterilizar en

autoclave (15 minutos a 121°C) e incorporar a aproximadamente 50°C, 20 mL./litro
de una solución al 7% de sulfato de hierro (II). Verter en placas. pH 6.9.

D) Para Coliformes totales, Coliformes fecales y Escherichia coli.- Método de Numero

Más Probable (NMP).

1) Prueba Presuntiva, para determinar Coliformes Totales. Para esta prueba se

utiliza el Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis al 2% (CLVBB) a doble y simple
concentración.

- Verde Brillante 15.0 mg.

- Peptona 10.0 gr.
- Lactosa 10.0 gr.
- Bilis deshidratada 20.0 gr
- Agua destilada 1.0 L

Esta fórmula es a simple concentración, para obtener doble concentración, se

adiciona el doble de cada componente en un litro de agua destilada. Después de
la disolución llevar el pH a 7.0 – 7.2 y repartir en tubos de ensayo a razón de 9.0
ml. Provistos de una campana Durham y esterilizar a 121°C x 15 minutos.

2) Prueba Confirmativa o Test de Eijkman, para determinar Colifecales. Se utilizan

Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis al 2%(CLVBB) a simple concentración, y
Caldo Peptonado , cuya composición es la siguiente:

- Peptona o Triptona 10.0 gr.

- Cloruro de sodio 5.0 gr
- Agua destilada 1.0 L.

Después de la disolución llevar el pH a 7.0 y repartir a razón de 5.0 ml. por tubo
de ensayo y esterilizar a 121°C por 20 minutos.
 3) Prueba Bioquímica IMViC, para determinar E. coli; se utilizan los medios de
cultivo.

-Medio Politrópico Kligler. Después de la disolución llevar el pH a 7.4, repartir en

tubos de ensayo y esterilizar a 121°C x 20 minutos; luego dejar solidificar en
posición inclinada bajo la forma de “pico de flauta”.

-Medio para ver la formación del Indol. Se utiliza el caldo Peptonado o

Triptonado.

-Medio para la reacción del Rojo de Metilo.

-Medio para la reacción de Voges ProsKauer. Para las dos reacciones se utiliza el
mismo medio (MR-VP) y es inútil el ajuste del pH, repartir en tubos de ensayo
esterilizar a 121°C x 20 minutos.

-Medio para asimilación del Citrato. Se utiliza como medio el Citrato de Simmons.

Después de la disolución llevar al pH a 6.8, luego repartir en tubos de ensayo y

esterilizar a 121°C x 20 minutos; dejar solidificar bajo la forma de “pico de flauta”.

II. OBJETIVO.
Enseñar al estudiante las técnicas e interpretación de los microorganismos indicadores
de higiene en los alimentos.

III. MATERIALES Y METODOS.

1) Materiales.
Placas Petri, tubos de ensayo, pipetas de 1, 2, 5 y 10 mL., frascos Erlenmeyer,
licuadora, cuchillos, vaso de licuar, mortero y pilón, estufas de incubación, baño
maría eléctrica, Agar Rojo Violeta con Sales Biliales (VRBA), Agar Mac Conkey,
Agar Sulfito de Hierro base, Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis al 2%(CLVBB)
de doble y simple concentración, y muestras de alimentos sospechosos.

2) Procedimiento.

2.A RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS. La forma de sembrar es como sigue:

Mezclar en placas petri estériles 1.0 mL. De la serie de diluciones con más o
menos 15.0 mL. Del Agar Mac Conkey. Dejar enfriar hasta la solidificación, luego
recubrir la mezcla con más o menos 5.0 mL. del medio de cultivo. Luego de
solidificado, incubar a 37°C por 24 – 48 horas. Pasando el tiempo de incubación,
contar las colonias de las placas que contienen entre 30 y 300 colonias. Tanto en
colonias violetas con precipitado rojo violeta, como aquellas transparentes,
amarillentas verdosas y deducir el número de Enterobacterias por gr. o mL. de
muestra.

2.B RECUENTO DE COLIFORMES. Mezclar en placas Petri esteriles, 1.0 mL. De la

serie de disoluciones con más o menos 15.0 mL. Del medio de cultivo, y mezclar.
Una vez solidificado recubrir la mezcla con más o menos 5.0 ml del medio estéril.
Luego llevar a incubación a 37°C x 24 – 48 horas: luego de este tiempo contar las
colonias de las placas que contienen entre 30 – 300 colonias, el número de
colonias violeta rodeadas de un precipitado rojo violeta, y deducir el número de
coliformes por gramo o mililitro de muestra.
2.C RECUENTO DE ANAEROBIOS SULFITO REDUCTOR. El material se extiende en
capa delgada sobre la superficie de dos placas por cada ensayo o dilución, la cual
ha sido colocado previamente por un minuto en un baño maría a 80°C y enfriada
rápidamente con agua fría. Una de las placas se incuba en condiciones aerobias y
la otra en condiciones anaerobias, ambas a 30°C durante dos días.

Se deduce que existen anaerobios mesófilos, cuando; solamente las placas

cultivadas en condiciones anaerobias presentan ennegrecimiento. Los cálculos y
las expresiones de estas poblaciones se realizan de la misma forma que para los
recuentos en placas.

2.D Coliformes, Colifecales y E. coli. Método de Número Más Probable (NMP).

1) Para Coliformes Totales.

- Pipetear tres veces 10 mL. del homogeneizado del alimento, en tres tubos de
ensayo con CLVBB al 2% de doble concentración.
- Pipetear tres veces 1 mL. del homogeneizado en tres tubos de ensayo con
CLVBB al 2% a simple concentración.
- Pipetear tres veces 1 mL. de cada uno de las diluciones siguientes del
homogeneizado en tres tubos de ensayo con CLVBB al 2% a simple
concentración.
- Agitar cada tubo de ensayo e incubar a 36- 37°C x 24 – 48 horas.
- Pasado el tiempo de incubación, anotar los tubos de ensayo que muestren
producción de gas más de 1/3 del volumen de la campana de Durham.
- Elegir la dilución más alta (la más diluida), en la que sean positivos de
formación de gas los tres tubos y las dos diluciones superiores (más diluidas)
más próximas. Si esto no es posible, a que ninguna de las diluciones
trabajadas presentan tres tubos positivos, seleccionar las tres últimas
diluciones y anotar el número de diluciones y anotar el número de tubos
positivos de cada una.
Por ejemplo: Si las tres últimas diluciones positivas fueron 1:100, 1:1000, y
1:10000; y el número de tres tubos positivos en cada dilución fuera: 3 – 1 –
0, el resultado se anotaría del siguiente modo:

Diluciones: 1: 100 =3
1: 1000 =1
1: 10000 =0
Este valor 3 – 1 – 0, se busca en la tabla del NMP, de tres alícuotas; y nos
dará la población de coliformes totales.

La población se calcula de la siguiente manera:

Lectura: 3 – 1 – 0 (1:100, 1:1000, 1; 10000).
Valor de la Tabla del NMP: 43
Dilución intermedia: fd(i) = 1000

Población/gr. o mL. = ( NMP / 100 ) X fd (i)

2
N° = ( 43 / 100 ) X 1000 = 430 = 4.3 X 10 UFC /g. o mL.

Nota: Estos cálculos han sido realizados considerando que se analizaron 10

Unidades de muestra problema.
2) Para determinar el Número de Colifecales.
 Se sigue el Test de Eijkman, compuesto por dos tubos de ensayo conteniendo
CLVBB al 2% a simple concentración, uno y caldo Peptonado (CP) el otro, en
los que siembran por azadas el inoculo de cada tubo positivo de la prueba
anterior, luego se incuban en Baño María a 44°Cx 24 horas. Para el cálculo se
anotan los tubos de CLVBB al 2 % con formación de gas (aquí no interesa ya
la condición de más de 1/3 del volumen de la campana, suficiente con que
haya igual o cercado a 1/3 de gas) y su respectivo CP con formación de Indol
(formación de anillo rojo grosella con tres gotas de reactivo de Kovac´s).
Cualquier variación contraria, se considera prueba negativa. Luego del triple
número obtenido, se logra el valor respectivo de la tabla de NMP y se procede
igual que para el anterior caso visto.

3) Para determinar E. coli.

Para determinar E. coli, se hace uso de la galería Bioquímica de IMViC; a
partir de los tubos positivos con CLVBB al 2% procedentes del Test de
Eijkman, se siembran unas azadas por picadura profunda y estría superficial
en el medio Politrópico de Kligler Irón Agar, y se incuban a 37°Cx24 horas.

Seguir trabajando solo con aquellos tubos con Kligler que hayan virado al
“amarillo” la parte superior a todo el medio (lactosa positivo).Descartar
aquellas que presenten además un precipitado negruzco o la parte superior
del tubo o todo el medio de color rojo. De los Kligler positivos, se siembran por
azadas en 4 tubos que contienen: Caldo Peptonado, caldo Rojo de Metileno,
Caldo Voger Proskauer, y Agar Citrato de Simmons; luego se incuban a
37°Cx24 horas.
Se consideran para las lecturas los siguientes resultados:

- Caldo Peptonado (l).

Se investiga la formación de Indol formando después de la incubación,
agregando gotas de reactivo de Kovac´s y agitando en seguida. La reacción
es positiva si la fase alcohólica esta coloreada de rojo claro u oscuro y
constante.

- Caldo Rojo de Metilo (M).

Después de haber incubado la siembra a 37°C por 24 horas, agregar 5 gotas
de una solución al 0.04% de rojo de metilo. La reacción se considera positiva,
si la coloración es roja y negativa si es amarilla.
- Caldo Voges ProsKauer (Vi).
Caracteriza gérmenes que producen Acetil Metil Carbinol (AMC) a partir de
glucosa que lleva el medio de cultivo. Al Acetil Metil Carbinol, se reconocen
oxidándolo a diacetil. Al tubo con el medio respectivo inoculado e incubado a
37°C por 24 horas, se le agrega unos mgs. de creatina p.a y 0.5 mL. de una
solución de soda al 40% y agitar fuertemente por 3 minutos. La reacción es
positiva, si la coloración rojo carnil aparece al cabo de 10 minutos. (La lectura
se puede hacer solo con KOH, pero la creatina se utiliza como estabilizador).

- Agar Citrato de Simmons (C).

Una vez sembrada el inoculo por estría superficial en el Agar citrato de
Simmons inclinado, e incubado a 37°C por 24 horas; la reacción es positiva si
el medio presenta una coloración azul.
 Luego de los resultados obtenidos (confirmados según IMViC en la tabla N°1), se
logra el valor de la tabla del NMP, para después calcular la poblacion de E. coli, en
la muestra problema, de manera similar que los anteriores.

TABLA N° 1
============================================
I M Vi C
Escherichia coli + + - -
Enterobacter aerógenes - - + +
(O Aerobacter aerógenes).
Citrobacter -+ + - +
Klebsiella -+ - + +

TABLA Nº 2: TABLA DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) DE MC CRADY

TUBOS POSITIVOS ÍNDICE DEL NMP Limite Confianza (95 %)

10ml 1.0ml 0.1ml POR 100 ml Inferior Superior
----------------------------------------------------------
0 0 1 3 0.5 9
0 0 2 6
0 0 3 9
0 1 0 3 0.5 13
0 1 1 6
0 1 2 9
0 1 3 12
0 2 0 6
0 2 1 9
0 2 2 12
0 2 3 16
0 3 0 9
0 3 1 13
0 3 2 16
0 3 3 19
1 0 0 4 0.5 20
1 0 1 7 1.0 21
1 0 2 11
1 0 3 15
1 1 0 7 1.0 23
1 1 1 11 3.0 36
1 1 2 15
1 1 3 19
1 2 0 11 3.0 36
1 2 1 15
1 2 2 20
1 2 3 24
1 3 0 16
1 3 1 20
1 3 2 24
1 3 3 29
2 0 0 9 1.0 36
2 0 1 14 3.0 37
2 0 2 20
2 0 3 26
 2 1 0 15 3.0 44
2 1 1 20 7.0 89
2 1 2 27
2 1 3 34
2 2 0 21 4.0 47
2 2 1 28 10 150
2 2 2 35
2 2 3 42
2 3 0 29
2 3 1 36
2 3 2 44
2 3 3 53
3 0 0 23 4 120
3 0 1 39 7 130
3 0 2 64 15 380
3 0 3 95
3 1 0 43 7 210
3 1 1 75 14 230
3 1 2 120 30 280
3 1 3 160
3 2 0 93 15 380
3 2 1 150 30 440
3 2 2 210 35 470
3 2 3 290
3 3 0 240 36 1300
3 3 1 460 71 2400
3 3 2 1100 150 4800
3 3 3 1100 más
---------------------------------------------------------------------------------------------------

IV. CUESTIONARIO.
1. Que finalidad tienen las diluciones? Donde se requieren más diluciones, en una
muestra fresca o en una muestra procesada). Porque?.
2. Defina lo que es un microorganismo indicador de la higiene, y cuál es la
importancia en los alimentos?.
3. Exponga todo acerca de la influencia de los microorganismos indicadores de la
higiene en la salud del hombre.
4) Reporte el fundamento de la tabla del NMP de MC Crady.
5) Analizando 15 g. de una muestra de tomate, en la investigación de la
contaminación fecal se ha encontrado el siguiente resultado:

Medio VRBA
Dilución L - 1 L - 2
S.M. inf. 786
-2 589 286
-3 68 43
-4 13 8

Encontrar el número de Coliformes por gramo de muestra, y fundamente la

elección de sus datos para sus cálculos.
PRÁCTICA No 7. MICROORGANISMOS PATÓGENOS (Determinación de:
Staphylococcus aureus; Bacillus cereus; Clostridium
perfringens; Salmonella sp.; Listeria monocytogenes;
 Escherichia coli 0157:H7; y Vibrio cholerae).

I. INTRODUCCIÓN.
En cuanto a los microorganismo patógenos, tenemos a Staphylococcus aureus ,
Bacillus cereus, Clostridium perfringens , cuya cantidad en los alimentos condiciona sus
peligrosidad para causar enfermedades alimentarias. Los microorganismos patógenos,
Salmonella sp.; Listeria monocytogenes ; Escherichia coli O 157:H7; y Vibrio cholerae, y
otros patógenos, su sola presencia en los alimentos, condiciona su peligrosidad para la
salud.

El Staphylococcus aureus, es utilizado como indicador de la contaminación a partir de

la piel, boca y de las fosas nasales, de los manipuladores de alimentos; como también
del material y equipo mal limpiado. Cuando se encuentra un gran número de
estafilococos e un alimento significa que la temperatura de conservación no ha sido
adecuada, así como tampoco la limpieza y desinfección de los utensilios.

En lo que se refiere a la población de Bacillus, son aerobios y están presentes

normalmente en el suelo y en la materia en descomposición de origen animal y
vegetal, varios producen una sustancia viscosa en medios que contienen sacarosa.
Varían los caracteres fisiológicos, ya que hay aerobios estrictos y especies que son
anaerobios facultativos. Un pequeño número de termófilo, en los cultivos viejos puede
verse formas Gram negativos y algunas especies, se describen mejor como “Gram
indefinida”. Aparte del Bacillus cereus, el organismo que causa alteración de los
alimentos y de Bacillus. anthracis, la identificación de otras especies es
extraordinariamente difícil.

El Bacillus cereus, es potencialmente productor de una forma leve de intoxicación

alimentaria semejante en síntomas y en periodo de incubación a la determinada por el
Clostridium perfringens. En este caso, no ha sido demostrada la sustancia casual. Este
germen es común en el suelo, la vegetación y en muchos alimentos, brutos o
manufacturados. Thatcher (1972) indica que, "el principal factor que influye en la
proliferación de este microorganismo, que determina casos de intoxicación únicamente
cuando se encuentra en gran número en el alimento, es la refrigeración inadecuada de
los alimentos proteicos cocinados de alto contenido de humedad”.

Una población de Bacillus cereus de menor a 10 mos/g. en los alimentos, no es

prueba suficiente que permita concluir que este organismo es la causa de un caso o
brote de intoxicación alimentaria.

Clostridium perfringens es una bacteria anaeróbica (incapaz de crecer en la presencia

de oxígeno), con forma de bastón, Gram-positiva y formadora de esporas. Está
distribuida ampliamente en el medio ambiente y se encuentra frecuentemente en el
intestino de los humanos así como también en el de varios animales domésticos y
salvajes. Sus esporas sobreviven en el suelo, en los sedimentos y en las áreas sujetas
a la polución fecal tanto humana como animal. El envenenamiento causado por
Clostridium perfringens es diagnosticado a través de sus síntomas y del típico período
de tiempo que la enfermedad tarda en aparecer. El diagnóstico es confirmado al
detectar la presencia de la toxina en las heces de los pacientes. También, se puede
tener una confirmación bacteriológica al encontrarse un número excepcionalmente
grande de las bacterias causantes en los alimentos implicados o en las heces de los
pacientes.

En la mayoría de los casos, la causa actual del envenenamiento por Clostridium

perfringens es el abuso en las temperaturas de los alimentos preparados. Un número
pequeño de organismos está presente normalmente después de la elaboración del
producto, y pueden multiplicarse hasta llegar a niveles muy peligrosos durante su
enfriamiento y almacenamiento. Las carnes y sus derivados son los más implicados.
En aquellas instituciones que brindan servicios de alimentación (tales como las
cafeterías de los colegios, los hospitales, las casas de cuidado de niños y ancianos, las
cárceles, etc.), se dan las causas más comunes de ocurrencia de envenenamiento por
Clostridium perfringens, debido a que ahí se preparan grandes cantidades de
alimentos con muchas horas de anticipación.

La presencia de cualquier serotipo de Salmonella, es potencialmente peligroso como

fuente para el hombre, bien de modo directo para el consumo de estos alimentos o
indirectamente mediante la contaminación secundaria de utensilios, de equipos para el
tratamiento e industrialización de los alimentos.

Esto serotipos de salmonella, producen la salmonelosis, que es una enfermedad que

afecta al tracto-intestinal, siendo más grave en niños y ancianos. Esta infección se
caracteriza por temperaturas elevadas, diarrea, a veces tan intensa que determina una
gran deshidratación, dolores intestinales y vómitos. La causa más frecuente de la
Salmonelosis; es el consumo de alimentos contaminados, otra viene a ser el de los
portadores, que generalmente son aquellos manipuladores de los productos
contaminados y los pacientes que sufren de Salmonelosis.

Listeria monocytogenes, bacilo corto, aerobio, Gram-positiva, no forma esporas, móvil,

patógeno intracelular. Algunos estudios sugieren que entre el 1 y 10% de los seres
humanos pueden ser portadores intestinales de L. monocytogenes. Esta bacteria se ha
encontrado en por lo menos 37 especies diferentes de mamíferos, tanto domésticos
como salvajes, además de en por lo menos 17 especies de aves y posiblemente
también en algunas especies de pescados y mariscos. Puede ser aislada del suelo, del
forraje ensilado y de otras fuentes ambientales. Listeria monocytogenes es altamente
resistente a los efectos de la congelación, el secado y el calentamiento. Esta última
característica es especialmente notoria ya que se trata de una bacteria que no forma
esporas. Adicionalmente, la mayoría de las especies de Listeria monocytogenes son
patógenas en cierto grado.

Listeria monocytogenes ha sido asociada con alimentos tales como la leche cruda, la
leche líquida supuestamente (o erróneamente) pasteurizada, los quesos (en especial
las variedades que han sufrido un corto período de maduración), el helado, los
vegetales crudos, las salchichas de carne cruda fermentada, las aves de corral, crudas
y cocidas, las carnes crudas (de todo tipo) y el pescado fresco o ahumado. Su
capacidad de crecer a temperaturas tan bajas como los 3°C permite su multiplicación
en los alimentos refrigerados.

Probablemente, una prevención total no es posible; no obstante, los alimentos

adecuadamente cocidos, calentados o almacenados son por lo general seguros, ya
que la bacteria muere a una temperatura de 75°C. El mayor riesgo lo constituye la
contaminación cruzada, que se da cuando los alimentos cocidos entran en contacto
con las materias primas crudas o contaminadas (como por ejemplo a través de las
tablas para picar).

Escherichia coli, es una bacteria presente frecuentemente en el intestino distal de las

personas y animales de sangre caliente; la mayoría de cepas son inocuas, pero
algunas pueden causar graves intoxicaciones alimentarias. El serotipo 0157:H7,
productor de la toxina Shiga, puede causar graves enfermedades a través de los
alimentos y es el más importante por su impacto en la salud pública. El origen principal
de los brotes por este microorganismo son alimentos como carne picada cruda o poco
 cocida, leche cruda, y hortalizas contaminadas por materia fecal. Escherichia coli,
serotipo 0157:H7, productora de la toxina Shiga, es termosensible, se destruye
cociendo los alimentos hasta que todas las partes alcancen una temperatura de 70° C
o más.

Vibrio cholerae, es una bacteria que pertenece a la familia Vibrionaceae. Su tamaño

varía de 1-3 mm de longitud y 0,5-0,8 mm de diámetro. Bacilo gramnegativo aerobio
facultativo, levemente curvo, fermentador de glucosa y sacarosa, es oxidasa positiva.
Su estructura antigénica consiste en antígeno flagelar H y un antígeno somático O.
Este último, permite la diferenciación entre cepas patógenas y no patógenas.

Existen más de 139 serotipos diferentes. Tradicionalmente el serotipo O1 ha sido el

causante de las grandes epidemias y pandemias. Este incluye dos clases de biotipos:
el clásico y la variante el TOR. Forma parte de la flora normal de aguas saladas,
desembocadura de los ríos, bahías con salinidad moderada y estuarios, donde se
asocia a menudo con algas, plancton, conchas, caparazones, crustáceos, moluscos y
otros seres vivos para sobrevivir. También habita en aguas de interior. Sobrevive a la
congelación, aunque es más difícil la proliferación, lo que puede impedir que se
alcance la cantidad de microorganismos capaces de provocar la infección en el
individuo. Es sensible a la desecación y a la acidez.

Vibrio cholerae, agente causal de una enfermedad gastrointestinal llamada cólera que
puede expandirse rápidamente como epidemia y/o pandemia a través de la ingesta de
agua y/o alimentos contaminados. El cólera se transmite por la ruta oral-fecal a través
de agua o alimentos contaminados. Otra forma de contraer esta enfermedad es por el
consumo de mariscos crudos o mal cocidos, provenientes de aguas contaminadas. La
dosis infectiva de bacterias requeridas para causar enfermedad clínica varía con la
fuente de origen. Si es ingerida con agua la dosis es de 1.000-1.000.000 organismos.
Cuando es ingerida con alimentos, pocos organismos se requieren para causar
enfermedad (100-10.000). La infección de persona a persona es rara y los animales no
tienen rol en la transmisión de la enfermedad.

En las fábricas y plantas, donde se tratan y se industrializan los alimentos, estos

microorganismos se determinan a partir de otros alimentos no tratados, a partir del aire
del ambiente, o por contacto con superficie en la que se depositaron restos en polvo
de ingredientes alimenticios, tales como los productos derivados de los huevos. La
moderna tecnología de producción en masa de los alimentos y la distribución de estos
en grandes zonas, son factores que pueden ocasionar innumerables brotes de
enfermedades en poblaciones numerosas. Para evitar estos problemas de
contaminación, es preciso adoptar en las industrias donde se manipulan productos
contaminados con estos gérmenes, medidas adecuadas de higiene.

II. OBJETIVO.
Enseñar al estudiante la interpretación de los procedimientos microbiológicos para la
determinación de Staphylococcus aureus ; Bacillus cereus; Clostridium perfringens;
Salmonella sp.; Listeria monocytogenes ; Escherichia coli 0157:H7; y Vibrio cholerae.

III. MATERIALES Y METODOS.

1) Materiales:
- Muestras de alimentos sospechosos
- Tubos de ensayo, placas Petri, mecheros, pipetas, y otros.
- Solución Salina Peptonada en frascos Erlemmeyer y en tubos de ensayo.
- Agar Baird Parker en placas
- Agar Dextrosa Triptona o Agar Dextrosa Peptona.
- Agar Selectivo para Perfringens (SPS).
 - Caldo Manitado (simple y doble concentración) en frascos.
- Caldo Selenito, Caldo Tetrationato Base, Agar Kligler.
- Agar Desoxicolato Citrato, Agar Salmonella Shigella, Agar Bismuto Sulfito.
- Galeria Bioquimica OxNiGLUMoCISKAD.
- Caldo de Enriquecimiento para Listeria
- Agar Selectivo para Listeria
- Caldo Laurilsulfato
- Fluorocult Agar E. coli 0157:H7
- Agar Selectivo para Vibrio (Agar TCBS)

2) Métodos y Procedimiento.

a) Toma de muestra. Proceder de la siguiente forma en condiciones asépticas.

- Pesar 10g de la muestra homogenizar en 90 ml de SSP estéril, para después
preparar las diluciones requeridas, donde se estudiara la población de
Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, y Clostridium perfringens.

- Pesar 25g de muestra problema y se investigará la presencia de Salmonella

spp.; Listeria monocytogenes ; Escherichia coli 0157:H7; y Vibrio cholerae.

b) Numeración de Staphylococcus aureus. Sembrar 0.1 mL. de cada disolución (o lo

indicado por profesor) de la muestra problema, en las placas Petri que contiene el
medio solidificado y estéril. Extender el inoculo en las superficies del medio con la
ayuda de una espátula de Drigalsky estéril.

Incubar a 37°C por 24-48 horas, si aparecen colonias pequeñas de color negro
rodeado de un halo transparente (la enzima lecitinasa ha digerido la lecitina del
medio), estamos frente a un Staphylococcus aureus sospechoso o presuntivo.

Para confirmarlo, se les practican las PRUEBAS DE PATOGENICIDAD a un número

de colonias sospechosas igual a la “raíz cuadrada del total de colonias sospechosas
de la placa Petri respectiva” (en caso de que el número total de colonias es mayor a
5), o todas las colonias sospechosas de la placa Petri (en caso de que el número
total de colonias sospechosas es 5 o menor que 5).

MEDIO BASE:
- Triptona 10.0gr
- Extracto de carne 5.0 gr
- Extracto de levadura 1.0 gr
- Glicocola 12.0 gr
- Piruvato de sodio 10.0 gr
- Cloruro de litio 5.0 gr
- Agar agar 20.0 gr
- Agua destilada 1.0 L

3ml de Telurito de potasio (solución al 3.5% filtrado sobre G5).

50ml de una emulsión de yema de huevo (concentrada Egg, YOLK EMULSION,

OXOID) o bien preparada en el laboratorio al 20% en condiciones asépticas

50 ug/ml de Sulfamezatina. Preparar una solución stock al 0.2% p/v de sal sódica
de Sulfamezatina disolviendo 0.5 de Sulfamezatina pura (Imperial Chemical
Industries) en 25 ml de NaOH N/10 y llevar a 250 mL. con agua destilada.
Estas colonias sospechosas seleccionadas, se inoculan en sendos tubos de ensayo
con caldo BHI (Caldo Cerebro Corazón) y se incuban a 37°C por 24 horas. El caldo
BHI tiene la siguiente composición:

- Infusion de cerebro de ternera 200.0 g.

- Infusion de corazon vacuno 250.0 g.
- Proteasa peptona 10.0 g.
- Dextrosa 2.0 g.
- Cloruro de sodio (NaCl) 5.0 g.
- Fosfato de disodio (Na2PO4) 2.5 g.
- Agua destilada 1.0 L.

Ajustar el pH a 7,4 y después de la disolución se reparten en tubos de ensayo chico

(10 x 70 mm) a razón de 5 ml. por tubo. Esterilizar a 121 o C x 15 minutos.

Las pruebas de Patogenicidad son las siguientes:

Prueba de la Coagulasa. Mezclar en un tubo estéril 0.5 ml de suero de conejo o

plasma oxalato de conejo (deshidratado y regenerado).Incubar a 37 o C y observar
desde la media hora. Es coagulasa positivo, cuando se produce coagulación de
suero.

Reacción de la Desoxirribonucleasa (Dnasa). Sembrar por estría en placas Petri que

contienen Agar Dnasa sodificado y estéril, e incubar a 37 o C por 24 horas. Al cultivo
obtenido, cubrirlo con milímetros de una solución de HCl 1N, la prueba será positiva
si aparece una zona clara y transparente alrededor de las colonias (lo que significa
que la enzima Desoxirribonucleasa ha digerido el ácido Desoxirribonucleico del
medio).

El medio Dnasa tiene la siguiente composición:

- Triptosa 20.0 .r
- ADN 2.0 g.
- NaCl 5.0 g.
- Agar agar 15.0 g.
- Agua destilada 1.0 L.

Después de la disolución, esterilizara a 121° C por 10 minutos, luego enfriar y

mantener a 50 C para adicionarle 10mL./Litro de una solución de cristal Violeta al
0.1 % estéril. Repartir en placas estériles y enfriar.

Prueba de Fermentación Manitol. Sembrar en un medio Agar manitol (por picadura

profunda) mantenido a 40C (semi-sólido), la cepa sospechosa, y dejar enfriar hasta
que se solidifique completamente. Incubar a 37° C x 24 horas; y ser posible hasta 2
o 3 días. El cambio de coloración del purpura al amarillo, en todo el tubo nos indica
Manitol Positivo.

El medio Agar Manitol tiene la siguiente composición:

- Triptona 10.0 g.
- D-manitol 10.0 g.
- Extracto de levadura polvo 1.5 g.
- Cloruro de sodio 5.0 g.
- Agar agar 15.0 g.
- Púrpura de la bromocresol 15.0 mg.
- Agua destilada 1.0 L.
 Ajustar el pH del medio a 7.0., después de la disolución repartir en tubos de 13 x
100 mm.a razón de 5 ml por tubo y esterilizar a 121 o C x 20 minutos, y dejar enfriar
el media hasta 40 o C en posición vertical.

Prueba de fosfatasa: Sembrar por estrías en medio Agar fosfatasa solidificada y

estéril en placas Petri, la cepa sospechosa. Incubar a 37 o C x 24 horas. Revelar el
crecimiento bacteriano con una solución y transparente alrededor de la colonia.

El medio Agar Fosfatasa tiene la siguiente composición:

- Extracto de carne 10.0 g.

- Peptona 10.0 g.
- Cloruro de Sodio 5.0 g.
- Agar agar 15.0 g.
- Agua destilada 1.0 L.

Ajustar el pH del medio a 7.5 y después de la disolución esterilizar a 121 o C por 20

minutos. A 1.0 L. de Agar Base Fosfatasa estéril y enfriada a 50 oC adicionar
asépticamente 1 ml. de fosfato de fenolftaleína al 1% estéril. Repartir en placas
Petri estériles y enfriar hasta solidificarse.

c) Para Bacillus cereus.

- Para comprobar la presencia de esporas del microorganismos, calentar el
homogenizado (S.M o M.O) y sus diluciones a 75 - 80 oC por 10 - 20 minutos.
- Sembrar 1ml de c/u de las diluciones en sendas placas Petri estériles,
posteriormente adicionarlo el Agar Dextrosa Triptona, conservado a 50 oC.
- Dejar solidificar, para adicionarlo una segunda capa de medio de cultivo.
- Incubar comprobando si son gérmenes mesófilos (hasta 72 horas a 32 oC), y
si son gérmenes termófilos (hasta 48 horas a 55 oC).
- Contar las colonias desarrolladas con un halo amarillo (por producción de ácido).

Las colonias “flat-sour”, típicas tienen borde liso, de 2 a 3 mm. De diámetro, con una
mancha central opaca y están rodeadas generalmente por una zona amarilla (halo).
Las colonias vecinas, muy alcalinizantes, pueden enmascarar la coloración amarilla.

Bacillus subtilis. Colonias enlazados, lisas o rugosas, de 4.5 mm. de diámetro en

Agar Dextrosa Triptona, con un halo amarillo.

Bacillus mesentericus : Se considera que es sinónimo de B. subtilis en Europa, pero

en América se supone pertenecen a B. pumilis . Las dos cepas producen el "pan
viscoso".

Bacillus cereus: Colonias grandes, irregularmente planas, como “vidrio molido “de 4-
6 mm., cuando crecen en Agar Dextrosa Triptona; con producción de ácido.

Bacillus stearothemophilus : Este germen y otros termófilos asociados con él

,forman sobre Agar Dextrosa Triptona colonias grandes, de 4 mm. con un halo
amarillo, que se debe a la producción de ácido, cuando se cultiva a 60 oC, pero crece
probablemente a 37 oC y no lo hace a 20 oC. Este germen es la causa de la alteración
de los alimentos enlatados conocida como agriado sin abombamiento (flatsour),
produce acido pero no gas.

Los cálculos y las expresiones de la población se realizan de la misma forma que

para los recuentos en placas petri.
 Preparación del medio de Cultivo. Agar Dextrosa Triptona (o Agar Dextrona
Peptona).
Triptona (ó peptona) 10.0 g.
Dextrosa 5.0 g.
Púrpura de bromocresol al 1.6% 3.0 mL. (0.048g)
Agar agar 12.0 g.
Agua destilada 1.0 L.

Se disuelve por calentamiento, ajustar el pH a 6.6 - 7.0, luego esterilizar a 121 oC por
15-20 minutos. Mantener el medio a 50 oC para utilización en el análisis. Las placas
con el medio de cultivo son claras y de color violeta.

d) Para Clostridium perfringens.

- Sembrar 1ml de c/u de las diluciones en sendas placas Petri estériles,
posteriormente adicionarlo el Agar Selectivo para Perfringens (agar SPS),
conservado a 50oC.
- Dejar solidificar, para adicionarlo una segunda capa de medio de cultivo.
- Incubar hasta 48 horas a 37°C, en anaerobiosis.
- Contar las colonias negras desarrolladas.
- Se sugiere hacer investigación complementaria para la identificación.

Preparación del medio de Cultivo. Agar Selectivo para Perfringens (Agar SPS).
Peptona de Caseína 15.0 g.
Extracto de Levadura 10.0 g.
Citrato de Hierro (III) 0.5 g.
Sulfito Sódico 0.5 g.
Polimixina-B sulfato 0.01 g.
Sulfadiacina sódica 0.12 g.
Agar agar 13.9 g.
Agua destilada 1.0 L.

Se disuelve por calentamiento, ajustar el pH a 6.9 - 7.1, luego esterilizar a 121 oC

por 15-20 minutos. Mantener el medio a 50 oC para utilización en el análisis. El
medio de cultivo preparado es claro y amarillento.

e) Procedimiento para Investigación y Detección de Salmonella spp.

Pre-enriquecimiento: Adicionar 25 gramos de muestra problema a 80 mL. de Caldo

Manitado simple. Incubar a 37ºC por 18 - 24 horas (en caso positivo vira el color
de púrpura a amarillo). Si la muestra problema proviene de un tratamiento técnico
(como congelado, deshidratado, enlatado, etc), utilizar Caldo Manitado de doble
concentración.

El Caldo Manitado se prepara de la siguiente manera:

Extracto de carne 1.0 g.
Proteosa peptona #3 10.0 g.
D-manitol 5.0 g.
Cloruro de sodio 5.0 g.
Sol.alcohólica de púrpura de Bromocresol al 1.6% 1.0 mL.
Agua destilada 1.0 L.
pH del medio
7.2 - 7.4

Después de la disolución repartir en frascos a razón de 80 ml. c/u y esterilizar a

121ºC por 15 minutos. El caldo de doble concentración es aquella que contiene el
doble de los ingredientes en 1.0 L. de agua destilada.

Enriquecimiento: Sembrar 0.5 mL. de Caldo Manitado positivo en cada uno de los
siguientes medios: Caldo Selenito y Caldo Tetrationato. Incubar a 37ºC por 24
horas.

Los medios de enriquecimiento se preparan de la siguiente manera:

Caldo Tetrationato:
Proteosa peptona 5.0 g.
Sales biliares 1.0 g.
Tiosulfato de Calcio 10.0 g.
Agua destilada estéril 1.0 L.
pH del medio 7.0

Disolver al Baño María hasta ebullición, evitando el sobrecalentamiento. Enfriar por

debajo de 60ºC y agregar la solución Yodada.

2 ml. de solución Yodada: (Yodo cristalizado, 6.0 g.; yoduro de potasio (IK), 5.0 g.;
Agua destilada estéril, 20 ml.) Preparación extemporánea.
 La mezcla de ambos, repartir en tubos de ensayo estéril a razón de 10-12 ml. cada
tubo. No calentar después de añadir la solución yodada. La prueba será positiva
cuando se produce un precipitado en el fondo del tubo y una fase líquida superior
turbia.

Caldo Selenito:
Triptona 5.0 g.
Lactosa 4.0 g.
Selenito de Sodio 4.0 g.
Fosfato de Sodio 10.0 g.
Agua destilada 1.0 L.
pH del medio 7.0

Disolver por ebullición y repartir en tubos de ensayo estéril a razón de 10 - 12 mL.

cada tubo. La prueba será positiva cuando el caldo adopte un aspecto turbio y un
color ladrillo rojizo.

Selección: De los medios de cultivo de enriquecimiento positivos; Sembrar en placas

petri conteniendo los medios de siembra por estrías (Agotamiento de superficie).

Los medios de cultivo Selectivos son Salmonella Shigella Agar (SSA) y Desoxicolato
Citrato Agar (DCA). También se puede utilizar Bismuto Sulfito Agar (BSA). Una vez
sembrado se incuba a 37ºC por 24 horas, al cabo de los cuales se aíslan las colonias
que presentan las siguientes características:

SSA: Colonias entre incoloras y rosa pálido, opacas y translúcidas; algunas

colonias con centro negro.
DCA: Las colonias típicas de salmonellas son aplanadas, con los bordes incoloros y
el centro gris o negro.
BSA: Las colonias son pardas, grises, tendiendo a negro, y presentan a veces un
brillo metálico.

Si el fin del estudio es determinar el número y la proporción relativa de los

diferentes serotipos presentes en la muestra, deben aislarse 12 colonias (6 de cada
placa de medio selectivo) pero si se trata simplemente de determinar la presencia o
ausencia de Salmonellas, basta sólo 2 colonias de cada medio de Agar selectivo,
para llevar a cabo con ellas las pruebas de identificación.

Identificación: Las colonias sospechosas sembrar por picadura profunda y estría

superficial en un agar politrópico inclinado llamado "Kligler". Se incuba a 37º C por
24 horas. Las salmonellas son glucosa positiva, H 2S positivos y lactosa negativos,
además Gram negativo, comprobado estos resultados en el Kligler, se deberá
continuar con la Galería bioquímica OxNiGLUMOCISKAD, de lo contrario, la prueba de
Investigación y detección de Salmonella spp, culmina en el Kligler.

En la preparación de los medios para la galería bioquímica de OxNiGLUMoCISKAD,

revisar la práctica referente a esta galería.

Ox Ni G L U Mo C I S K A D
Salmonella spp + Ag - - -+ + - +- - - +
Shigella spp + + A - - - + + - - - -

f) Para determinación de Listeria monocytogenes.

 - Preparar la muestra, con 25 g. de muestra en 225 mL. de Caldo de
enriquecimiento para Listeria, respectivamente; luego incubar por 48 horas a
25°C.
- Luego extender 0.1 ml., de la siembra anterior en el Agar Selectivo para Listeria
distribuidos en placas, e incubar hasta 48 horas a 37°C; de manera que se
puedan obtener colonias individuales bien aisladas.
- Las colonias de Listeria monocytogenes, son pequeñas, de borde nítido,
ligeramente abombadas con superficie lisa tornasolada, borde claro, azul
verdoso transparente y centro poco transparente, verde amarillento.
- Continuar con la identificación, a partir de colonias aisladas del medio de
cultivo de la prueba anterior y reportar el resultado como AUSENCIA o
PRESENCIA por 25 g. de muestra.

- Caldo de Enriquecimiento para Listeria. Para inhibir el crecimiento de la flora

gramnegativa, está la presencia del tiocianato y ácido nalidíxico, y para la
represión de Enterococos, son útiles los colorantes de Acridina en combinación
con los anteriores agentes selectivos.

Disolver 26 g. de medio de cultivo, conjuntamente con 37.5 g. de tiocionato

potásico en un litro de agua, distribuir y esterilizar en autoclave a 121°C por 15
minutos, a un pH de 7.3 – 7.5. El medio de cultivo distribuido es claro y
amarillento.

- En el Agar Selectivo para Listeria, mejora la selectividad con el uso de una

combinación de Trypaflavin y Ácido nalidíxico.
Disolver 39 g. de medio de cultivo, en un litro de agua, y esterilizar en autoclave
a 121°C por 15 minutos, a un pH de 7.3 – 7.5. Distribuir en placas de capa de
poco espesor; las placas con el medio de cultivo son claras y de color amarillo-
verdoso.

g) Para determinación de Escherichia coli O157:H7

- Preparar 25 g. de muestra alimentaria, y sembrar en 225 mL. de caldo
Laurilsulfato, e incubar durante 16 a 24 horas a 37°C. A continuación se extiende
aproximadamente 0.1 mL. del caldo sobre la superficie del medio de cultivo
Fluorocult Agar E. coli 0157:H7, de manera que se puedan obtener colonias
individuales bien aisladas.

- Después de la incubación a las colonias que presentan una coloración

verdosa y son sorbita negativos, se analizan mediante una lámpara UV de onda
larga respecto a la formación de fluorescencia. Las colonias sorbita negativos y
sin fluorescencia deben aislarse seguidamente y comprobarse con antisueros
especiales, y reportar el resultado como AUSENCIA o PRESENCIA por 25 g. de
muestra.

- Medio de Cultivo Fluorocult Agar para E. coli 0157:H7, agar selectivo para aislar y
diferenciar cepas enterohemorrágicas (EHEC) de E.coli 0157:H7, procedentes de
alimentos.

El dexocicolato sódico inhibe en gran medida la flora acompañante gram-positiva.

La sorbita sirve juntamente con el indicador del pH azul de bromotimol para
identificar la degradación de la sorbita, lo que en caso de microorganismos sorbita-
positivos conduce a una coloración amarilla de las colonias. Las sorbita-negativos
por el contrario no producen un cambio de color del medio de cultivo y crecen por
tanto como colonias verdosas. La 4-metilumbeliferil-B-D-Glucuronidasa (MUG)
reacciona con gérmenes productores de B-D-glucuronidasa, dando 4-
metilumbeliferona, que fluoresce al irradiar con la luz UV. Contrariamente a la
 mayoría a la mayoría de cepas de E. coli, la E. coli 0157:H7, no puede formar B-D-
glucuronidasa. Al irradiar con la luz UV de larga longitud de onda no tiene lugar a la
formación de fluorescencia.

Disolver 55 g./litro de agua desmineralizada y esterilizar en autoclave por 15

minutos a 121°C, el medio de cultivo tiene un pH de 7.3 a 7.5, y las placas con el
medio de cultivo son límpidas y de color verde azulado.

h) Para determinación de Vibrio cholerae.

- Preparar la muestra, 25 ó 50 g. de muestra en 500 ml. de Solución Salina
Peptonada, y preparar unas 4 ó 5 diluciones, e incubar a 37°C por 24 horas.
- Luego sembrar en las placas con Agar TCBS, en superficie, por estría; e incubar a
37°C por 24 horas. Si es necesario puede utilizar dos medios de cultivos solidos
distintos, un medio de cultivo muy selectivo (Agar TCBS), y otro menos selectivo
(Agar Nutritivo).

Entre las colonias que se cuentan están las siguientes especies de Vibrio.

Vibrio cholerae, Vibrio cholerae Tipo el Tor. Colonias planas, de 2 – 3 mm. de

diámetro, y amarillas.

Vibrio parahaemolyticus. Colonias grandes y amarillas.

Vibrio alginolyticus. Colonias pequeñas, con el centro verde azulado.

Pseudomonas, Aeromonas y otros. Colonias azules.

Enterobacterias y otros. Colonias diminutas y transparentes.

- Continuar con la identificación, a partir de tres colonias aisladas del medio de cultivo
de la prueba anterior y reportar el resultado como AUSENCIA o PRESENCIA por 25
ó 50 g. de muestra.

- El medio de cultivo, Agar Selectivo para Vibrio (Agar TCBS), actúa inhibiendo
notablemente las enterobacterias, por la presencia de tiosulfato y citrato, y por el
medio fuertemente alcalino. La bilis de buey y el colato inhiben, sobre todo a los
enterococos. Solamente algunas cepas de Proteus, sacarosa positiva pueden
formar colonias amarillas semejantes a la de los vibriones. El indicador mixto azul de
timol – azul de bromo timol, presenta un claro viraje a amarillo por la formación de
ácido, incluso en medio fuertemente alcalino.

- El medio de cultivo no necesita esterilizar en autoclave, tiene un pH de 8.6, y las

placas con el medio de cultivo son claras y de color azul verdoso,

IV. CUESTIONARIO.

1. Cómo es la contaminación y que le indica la presencia de Staphylococcus aureus ;

Bacillus cereus; Clostridium perfringens; Salmonella sp .; Listeria monocytogenes ;
Escherichia coli O 157:H7; y Vibrio cholerae, en los alimentos?

2. Haga una relación de las enfermedades ocasionados Staphylococcus aureus ;

Bacillus cereus; Clostridium perfringens; Salmonella sp.; Listeria monocytogenes ;
Escherichia coli O 157:H7; y Vibrio cholerae, por el consumo de alimentos
contaminados.
 3. Qué cantidad de microorganismos por gramo de muestra, está permitido en los
alimentos utilizados como muestra para la práctica, para su consumo?.

PRÁCTICA Nº 8. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DEL AGUA.

I. INTRODUCCIÓN.

Los principales medios a través del cual los microorganismos patógenos alcanzan los
suministros de agua, es la contaminación fecal. Las enfermedades más importantes
que pueden tener su origen en el agua son la fiebre Tifoidea, otras salmonelosis, cólera,
y disentería bacilar y amébica.

Los agentes virales de infecciones como hepatitis y poliomielitis son organismos fecales
y pueden estar presentes en agua contaminada. El método para el examen
bacteriológico del agua está destinado a darnos un índice de la contaminación fecal. Los
microorganismos patógenos no se multiplican necesariamente en el agua, pero sin
embargo pueden estar presentes en gran número y fácilmente de detectarse si hay
contaminación fecal. Entonces un cuadro demostrativo de E. coli en agua, nos indica
una fuente fecal de los organismos.

En aguas cuya fuente se ha sometido a proceso de purificación (tal como los

reservorios), la presencia de E. coli es un indicador de que el proceso de clorificación es
inadecuado. A través de patrones bacteriológicos, el agua para beber (agua potable)
debería estar libre de coliformes y no contener más de 10 microorganismos por mililitro.

II. OBJETIVO.

Efectuar el examen bacteriológico del agua utilizando la Técnica de filtración por

membrana.

III. MATERIALES Y MÉTODOS.

1. Materiales.
 - Muestra de diferentes tipos de agua (manantial, agua corriente, ríos, riachuelos,
agua de caño, etc.)
- Pipetas estériles y Pinzas estériles.
- Equipo de Filtración de Membrana.
- Medios de Cultivo.
- Estufa de Incubación.

2. Métodos.
 - Un disco filtrante estéril se pone en la unidad de filtración.
- Se hace pasar un volumen de agua (100 ml) por el disco filtrante las bacterias
serán detenidas en la superficie de la membrana.
- Se quita el disco filtrante y se pone sobre una almohadilla absorvente que se ha
saturado previamente con el medio de cultivo apropiado (2 ml aproximadamente).
Las almohadillas absorventes con los discos filtrantes se acomodan en placas petri
de tamaño especial y se incuban a 35º por 20 horas.
- Después de la incubación se desarrollan colonias sobre el disco filtrante en
cualquier lugar donde haya quedado atrapado por la filtración.
- Con una lupa o utilizando el microscopio con el objetivo de menor aumento
examine la superficie del filtro para las colonias que poseen una superficie brillosa,
verduzca. Cuente el número total de éstas colonias "brillosa -verdosas" sobre el
filtro.
IV. CÁLCULOS .

Anotar el número de colonias que se hallan presentes en el agua examinada usando la

siguiente fórmula:

Nº de Coliformes contados X 100

-------------------------------------------- = Nº de Coliformes / 100 ml.
Mililitros de muestra

Ejemplo: Una muestra de 20 ml. se agregó al filtro embudo que contenía

aproximadamente 80 ml de agua estéril. Después de la incubación, se contaron 32
colonias brillosas sobre el filtro de membrana.

Entonces: (32 X 100) / 20 = 160 coliformes / 100 ml.

V. CUESTIONARIO.

1. Explique la importancia del método empleado en la práctica en el análisis de las

aguas destinadas al consumo humano y la industria.

2. Comente sobre los diferentes tipos de agua (río, agua de caño, manantial, agua de
lluvia, pozos.).

3. Cómo procedería Usted para poder utilizar esas aguas arriba mencionadas, en la
industria y el consumo humano?. Explique por separado cada uno de ellos.

4. Comente y explique acerca de las aguas que se usan en la Región San Martín para el
consumo humano y la industria.
PRÁCTICA Nº 09. MICROBIOLOGÍA DE LA LECHE

I. INTRODUCCIÓN

La leche es un excelente medio de cultivo para numerosos microorganismos

productores de alteraciones, inclusive mohos y levaduras, por su elevado contenido de
agua, su pH casi neutro y su riqueza en alimentos para los microorganismos.
Generalmente la leche fresca no pasteurizada contiene más o menos microorganismos
en relación con la higiene del ordeño, limpieza y manipulación del utillaje. La leche
cruda mantenida a temperatura de refrigeración durante varios días, muestra
invariablemente algunas bacterias o todas de los siguientes géneros: Streptococcus,
Leuconostoc, Lactobacillus, Microbacterium, Propionibacterium, Micrococcus,
Coliformes, Proteus, Pseudomonas, Bacillus , y otros.

En cuanto a la Reducción del Azul de Metileno, es un método indirecto para calcular el

contenido total de bacterias de la leche. De manera que en lugar de contar las
bacterias, se establece una correlación entre el tiempo que se necesita para reducir el
colorante azul de metileno en la leche a una forma incolora y la probable población
bacteriana de la muestra.

Por lo general, el tiempo que se necesita para la reducción del colorante es

inversamente proporcional al número de bacterias presentes en la leche. Este método
puede adaptarse para el examen de gran número de muestras en un corto tiempo, pero
sin embargo, si la población bacteriana es alta, este método no nos da la información de
la probable fuente de contaminación.

No hay necesidad de que los utensilios de vidrio utilizados para esta prueba sean
estériles, pero su contaminación puede reducirse al mínimo tratándoles con agua
hirviente o vapor que circule libremente.

Tal como existe en la ubre, la leche posee un potencial de oxido-reducción

suficientemente bajo para reducir inmediatamente el azul de metileno. La incorporación
de oxígeno durante el ordeño, enfriamiento, trasvase, etc. eleva el potencial redox
aproximadamente de + 0.06 a - 0.01 voltios.

Se cree que en el mecanismo de la reducción del colorante durante la prueba,

intervienen varios factores relacionados entre sí, pero lo que si es seguro que el proceso
respiratorio de las bacterias elimina oxígeno de la leche, provocando un cambio en el
potencial de óxido-reducción, puesto que por lo general, el oxígeno mantiene un
potencial positivo, y a medida que el potencial va oxidando, el hidrógeno pasa de los
elementos constitutivos de la leche y de los metabolitos al azul de metileno, causando
 su reducción.

La prueba del azul de metileno, por su sencillez y la rapidez con que se obtienen los
datos, es fácil, práctica y económica; sin embargo este método tiene sus limitaciones y
son las siguientes:

1) La temperatura de incubación de 37ºC (98.6ºF) no es favorable para el metabolismo

de todas las bacterias contenidas en la leche.

2) Las distintas bacterias tienen capacidad diferente por lo que respecta a rebajar el
potencial de óxido-reducción de la leche.

Por estas razones:

- Las bacterias termodúricas permanecen inactivas durante la prueba, y esta es la
objeción más importante, ya que estas bacterias son las que constituyen el problema
más importante para el elaborador.

- Las bacterias psicrófilas y termófilas tendrán muy poca o ninguna actividad durante la
prueba.

- Los materiales inhibidores de la leche impedirán también la proliferación de muchas

bacterias y harán que la prueba de una indicación de una calidad más alta que la
realmente existente.

II. OBJETIVOS.

- Conocer el número de microorganismos presentes en la leche, mediante Recuento en

placas y aplicación de la prueba del azul de metileno.
- Comparar resultados de estas dos pruebas de cuantificación.

III. MATERIALES Y MÉTODOS.

1. Materiales:
- Muestras de leche.
- Materiales de vidrio: Pipetas, placas petri, tubos ensayo.
- Medios de cultivo para Gérmenes Viables y Coliformes.
- Solución saturada de azul de metileno.
- Mecheros.
- Estufa de incubación.
- Agua estéril.

2. Métodos:

a) Recuento en placas para Gérmenes Viables y Coliformes.

Siembra por incorporación, tal como lo realizado en las prácticas anteriores.

b) Prueba de la Reducción del Azul de Metileno.

- Codificar tres tubos de prueba grandes y estériles.

I. R. : Inicio de Reducción.
M. R. : Muestra para Reducción.
 F. R. : Final de Reducción.

- A cada tubo codificado, agregar 10 ml. de leche.

- Añadir 1 ml. de la solución del Azul de Metileno a dos tubos (IR Y MR).
Mezclar.
- Al tercer tubo (FR) agregar 1 ml de agua estéril. Mezclar.
- A los tubos IR y FR introducir en agua hirviendo por 3 minutos.
- A todos los tubos poner en Baño María a 35 - 37º C. Tener cuidado que el
nivel del agua esté por encima del contenido del tubo.
- Controlar el tiempo, a partir del momento que se dejo el tubo en Baño María.
Hacer controles a partir de 30 minutos.

Interpretación de Resultados.

- Para recuento en placas para Gérmenes Viables y Coliformes, según lo

aprendido en prácticas anteriores.

- Para la prueba del Azul de Metileno.

Durante la incubación se observan cambios de color, lo que expresa el tiempo

transcurrido desde el inicio de la incubación hasta decoloración completa.

El tiempo de reducción se expresa en horas y medias horas transcurridas desde

el inicio de la incubación hasta la completa decoloración. Bajo ninguna
circunstancia se reportan los resultados en términos de números de bacterias.

Precauciones.

- Evitar una prolongada exposición de los tubos que contienen la leche y el

colorante a la luz, especialmente a la luz solar.

- Se debe mantener los tubos en Baño de agua fría hasta completar el lote de
muestras para colocar en baño de agua caliente, pero si se tiene que esperar un
tiempo conveniente antes de la incubación, almacenarlos entre 0 y 4.4ºC.

Tabla de calificación.
Más de 4 horas. Muy Buena (A)
De 3 a 4 horas. Buena (B)
Más de 30 min. a menos de 3 horas. Aceptable (C)
Hasta de 30 minutos. Mala (D)

IV. CUESTIONARIO.

1) Explique las causas por las que en algunas muestras de leche es rápida la reducción
del Azul de Metileno.

2) Cuánto es el estándar aceptable de Gérmenes Viables y Coliformes en leches frescas

destinadas al consumo humano.
PRÁCTICA Nº 10. MICROBIOLOGÍA DE ALIMENTOS ENLATADOS
(CONSERVAS).

I. INTRODUCCIÓN

Si bien el objetivo del enlatado de alimentos es la destrucción de los microorganismos,

con todo, en determinadas ocasiones, estos productos experimentan alteraciones
microbianas. Las principales causas de estas alteraciones son: El tratamiento
insuficiente, el enfriamiento inadecuado, la contaminación de la lata como consecuencia
de fugas a través de las costuras y la alteración de los alimentos antes de ser enlatados.
Como quiera que algunos alimentos enlatados sean sometidos a tratamientos térmicos
de poca intensidad, es de esperar que, al realizar el examen microbiológico de tales
alimentos, se pueda encontrar un número bastante elevado de diferentes tipos de
microorganismos.

Los microorganismos que alteran los alimentos enlatados, se pueden clasificar de la

siguiente manera.

1. Microorganismos Mesófilos: Anaerobios de la Putrefacción, Anaerobios Butíricos,

Acidúricos del Agriado Plano, Lactobacilos, Levaduras, Mohos.

2. Microorganismos Termófilos: Esporas del Agriado Plano, Termófilos anaerobios que

producen Ácido Sulfhídrico, y Termófilos anaerobios que producen no Ácido
Sulfhídrico.

II. OBJETIVOS

- Dar a conocer al alumno las pautas a seguir para llevar a cabo un control de calidad
microbiológica de alimentos enlatados (conservas).

III. MATERIALES Y MÉTODOS

1. Materiales:

- Muestra problema.
- Caldo Cerebro Corazón.
- Caldo Cerebro Corazón + Cisteína + Almidón.
- Caldo Oxitetraciclina Glucosa.
- Abridor de latas estéril.
- Espátulas, Tijeras, Pinzas (Estériles).
2. Método.

a. Toma de muestra. Tomar las muestras de acuerdo a las reglas matemáticas:

- En el caso de un lote aislado, 1 al 2% de latas (de acuerdo a la exactitud

requerida en el análisis).

- Para un examen de rutina en la misma fábrica de 10 a 20 latas (según la

exactitud que se requiere).
En ambos casos tomar las muestras al azar. Retirar las etiquetas de las latas, lavar
estas con agua jabonosa y escobilla. Colocar las latas dentro de hojas de papel filtro,
perfectamente limpio, con el objeto de descubrir cualquier pérdida del producto.

b. Pre-Incubación: Realizar 2 tipos de pre-incubación.

- A 32 – 37ºC X 15 - 21 días.
- A 55ºC X 7 - 10 días.

NOTA: Durante el período de pre-incubación examinar y agitar las latas

diariamente, invirtiéndolas de posición, separar y examinar
inmediatamente aquellas que muestran hinchamiento o pérdida de
contenido.

c. Preparación de las latas para el examen: Desinfectar con alcohol al 7% todas las
latas a examinar. Flamear la parte a ser abierta con la ayuda de un mechero por
el lado que no tiene número de control. Abrir con un abridor de latas estéril,
eliminar totalmente la tapa y abrir la conserva con la base de una placa estéril.

d. Examen del contenido de una conserva: Examinar cuidadosamente y

asépticamente el contenido de la lata y efectuar las pruebas de esterilidad para
conservas que consiste en lo siguiente:

Investigación de aerobios.

Medio de cultivo: Caldo Cerebro Corazón (CCC), o Brian Hearth Infusion (BHI).

- Tomar tres (03) tubos que contengan 20 ml de CCC, agitar para eliminar el
oxígeno disuelto en su seno, y añadir a cada tubo 2 - 3 gr. de muestra
problema.

- Incubar por 24 - 48 horas a la misma temperatura que se pre-incubó la

conserva.

Investigación de anaerobios.

Medio de cultivo: Caldo Cerebro Corazón adicionado 30 mg. de Clorhidrato de

cisteína y un gramo de almidón soluble por un litro
respectivamente.

- Proceder de igual forma que para aerobios; además añadir una capa de parafina
estéril (punto de fusión 45 – 55ºC).
 - Finalmente incubar por 24 - 48 Horas, a la misma temperatura que se
pre-incubó la conserva.

Investigación de hongos y levaduras.

Medio de cultivo: Oxitetraciclina Glucosa líquida (sin agar).

- Usar una serie de tres tubos que contenga el medio antes indicado, y cada tubo
añadir la misma cantidad de muestra problema anteriormente indicado.

- Incubar a temperatura ambiente por 3 - 5 días.

e. Control De Sellado.

El cierre de la lata debe ser adecuado para retener la calidad de los productos
enlatados, requiriéndose una resistencia permanente, contra presiones externas o
internas que pueden tener lugar durante el procesamiento, embarque y
almacenamiento.

En el examen se utilizan los siguientes procedimientos:

Inspección visual.

Durante el proceso de producción es esencial mantener constantemente un

observador que pueda detectar fallas que son notorias a simple vista.

La detección puede ser: Visual o táctil y los defectos pueden ser: Sellos
incompletos, falsos sellos, caídas de un reborde, presencia de arrugas, etc.

En las plantas industriales se acostumbran hacer estas observaciones por lo

menos cada 15 minutos.

Mediciones Externas

Se requiere de un micrómetro par su medición. La medida de la altura del espesor

y de la profundidad del sello debe hacerse por lo menos cada 2 horas, con tres
(03) lecturas para cada dimensión.

Las mediciones normales son:

* Longitud o altura : 0.177-0.123 pulg. ó 3.01-3.08 mm.

* Espesor : 0.053-0.057 pulg. ó 1.37-1.47 mm.
* Profundidad : 0.123 pulg. ó 3.08 mm.

Barnizado y otras características.

Observar si el barniz del interior de la lata se ha desprendido o se ha oscurecido;

lo mismo anotar las características organolépticas del contendido de la conserva,
excluido el sabor.

IV. RESULTADOS

Si hay desarrollo, hacer coloración gram para determinar la clase de gérmenes

 presentes.
Considerar que el producto es estéril si un tubo como máximo demuestra desarrollo. Sin
embargo, si esto ocurre, mejorar la asepsia durante la manipulación o controlar la
cantidad de la materia prima.

V. CUESTIONARIO

1. Organolépticamente (uso de los sentidos), cómo demostraría que un alimento

enlatado está malogrado?.

2. Qué géneros de microorganismos se encuentran en alimentos enlatados, como signo

de deterioro?. Explique.

ESQUEMA PARA DIAGNOSTICAR LA CAUSA DE ALTERACIONES DE UN

ALIMENTO ENLATADO

LATA O BOTE DE ALIMENTO ENLATADO

GAS
NO HAY GAS (liso)

DESCENSO DE pH
H2S
(Generalmente fugas)
Olor a H2S, maíz y
AGRIADO POR MESÓFILOS
guisantes,
color negro,
TERMÓFILOS

Putrefacción
sulfhídrica

AGRIADO LACTOBACILOS FLORA

VARIADA
(Frutas) (Fugas)

ABOMBAMIENTO POR H2 H2O-H2

CO2
LEVADURA
ALCOHOLICA

CARNES
CURADAS
 (Bacillus spp.)

TERMÓFILOS MESÓFILOS
(Olor ácido)

OLOR PUTREFACTO OLOR ÁCIDO

(Anaerobios de la Putrefacción)

FERMENTACIÓN BUTÍRICA FERMENTACIONES VARIADAS

AEROBACILOS
(Gérmenes anaerobios sacarolíticos) (Fugas)

PRÁCTICA Nº 11. ELABORACIÓN DE PRODUCTOS ALIMENTICIOS

MEDIANTE LA ACCIÓN DE MICROORGANISMOS
(Yogur, Encurtido, Vinagre, Vino, Chucrut, Pan, etc.).

I. INTRODUCCIÓN

La ciencia que estudia, describe y sistematiza los microorganismos se llama

microbiología, en el sentido más amplio, se entiende la ciencia de todos los
microorganismos, de tan pequeñas dimensiones que no son perceptibles a simple vista.
Tales microorganismos también se engloban bajo el concepto de microbios.

La microbiología abarca las ciencias de los hongos filamentosos, las levaduras, las
bacterias. Aquellos seres microscópicos que se denominan microorganismos de la
industria de la fermentación o más brevemente “MICROORGANISMOS
FERMENTATIVOS”, son aquellos que mediante sus procesos metabólicos transforman
los hidratos de carbono en alcoholes o ácidos orgánicos (eventualmente aldehídos y
cetonas) con o sin formación de anhidrido carbónico u otros gases.

Entre los microorganismos de fermentación se deben mencionar en primer lugar a las

levaduras; pero también, entre los hongos filamentosos y entre las bacterias, se
pueden hallar microbios que se deben considerar como microorganismos fermentativos.

Los verdaderos microorganismos de fermentación, encuentran utilización en la técnica a

saber, en la fermentación de bebidas fermentadas como la cerveza, vino, sidra y
similares; en la fabricación de etanol y otros alcoholes; en la obtención de ácido
orgánico, sobre todo acético y láctico; y en pequeñas proporciones, en la producción de
aldehídos y cetonas. Los procesos fermentativos se llevan a cabo en medio ácido o
acidifican el medio.

Fermentación, es el proceso en que los carbohidratos y sustancias similares, se oxidan

liberando energía, en ausencia de aceptores de electrones compuestos. Los aceptores
finales de electrones, son compuestos orgánicos producidos directamente en el
desdoblamiento de los carbohidratos.

A partir de que sirve para conservar los alimentos y para contribuir la variedad de la
dieta del hombre, tiene otras consecuencias importantes. Varios de sus productos
finales, particularmente los ácidos y alcoholes, son inhibidores de los microorganismos
patógenos comunes que logran introducirse en los alimentos; como en la incapacidad
 del Clostridium botulinum de crecer y producir toxina cuando el índice de pH es inferior
a 4,5.

Entre los microorganismos de mayor importancia de las fermentaciones, se tienen a las

levaduras, seguido de los hongos y luego las bacterias.

Las levaduras son hongos verdaderos cuyo crecimiento habitual y predominante es

unicelular. Los efectos de las levaduras en los alimentos pueden ser beneficiosos o
perjudiciales. Fermentaciones realizadas por levaduras toman parte en la elaboración de
alimentos como el pan, cerveza, vino, vinagre, y quesos de maduración superficial; las
levaduras se cultivan para la obtención de enzimas y como alimento. Las levaduras son
perjudiciales cuando determinan la alteración del Chucrut, jugo de frutas, jarabes,
melazas, miel, gelatinas, carnes, vinos, cerveza y otros alimentos.

Los hongos, microorganismos multicelulares, filamentosos, cuyo crecimiento en los

alimentos se conoce fácilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso. Los
hongos filamentosos abarcan muchas especies, hasta la fecha se han descrito, al
menos 100 mil especies, distribuidas en unos 3000 géneros. Cuando los hongos
saprofitos viven en la naturaleza, atraviesan por lo que sabemos un ciclo vital, que
consiste en la permanencia invernal en el terreno, para lo cual desarrollan órganos
especiales de reposo, e invernación, y en la permanencia veraniega en frutos y partes
vegetales en putrefacción. En el estadío mencionado en último lugar, el hongo
desarrolla su micelio y sus órganos reproductores.

Algunos hongos filamentosos se encuentran durante todo el año en la naturaleza al

estado fructificante, sin embargo sobrepasa toda la capacidad reconocida en el tiempo
de los hongos filamentosos producir antibióticos, bajo lo cual se entienden productos
farmaceúticos que, cuando se introducen en el organismo humano o animal, son
capaces de luchar de una forma muy activa contra las bacterias o especies virácicas
productoras de enfermedades. También en la agricultura, los hongos filamentosos
saprofitos tienen una enorme importancia, en el sentido útil contribuyen a la formación
de humus en el terreno.

Las bacterias son microorganismos unicelulares, ampliamente distribuidas por toda la

naturaleza, las bacterias se encuentran en el suelo, en la superficie del agua, en la
atmósfera, y como es natural en la superficie de la mayoría de los objetos que están a
nuestro alcance en la vida diaria.

En la vida del hombre, las bacterias juegan un papel extraordinariamente importante.

El hombre por ejemplo, ya está predestinado desde el nacimiento para la convivencia
con bacterias; su salud y su bienestar están amenazadas durante toda la vida por las
bacterias reproductoras de enfermedades y la mayoría de los productos alimenticios que
el hombre necesita, están expuestas a la destrucción bacteriana; por otra parte, muchos
productos alimenticios importantes se obtienen con la ayuda de bacterias.

Las bacterias que amenazan la salud del hombre y de los animales, se llaman
patógenos. Estos representan la menor parte de todas las bacterias existentes, su
peligrosidad se fundamenta en la capacidad de formar sustancias tóxicas o de destruir
tejidos.

II. OBJETIVO
- Dar al estudiante las pautas necesarias preliminares para la elaboración de productos
agroindustriales, mediante el uso de microorganismos.
III. MATERIALES Y MÉTODOS

1. Materiales

A. YOGUR
- Leche fresca
- Leche en polvo
- Cultivo de Yogur
- Cocinilla eléctrica
- Baño maría
- Refrigeradora
- Materiales diversos de vidrio
- Saborizantes

B. VINO
- Materia prima e insumos (Uva, Azúcar)
- Equipo de fermentación
- Baldes y Bandejas de plástico
- Materiales diversos de vidrio
2. Método.

A. Para Yogur Batido

MATERIA PRIMA (Leche fresca)

PASTEURIZADO (80 - 90ºC por 30 minutos)

(Si se desea, agregar leche en polvo de 30 a 40 gramos por litro de leche)

ENFRIADO, (Hasta 40 - 45ºC)

INOCULACIÓN (agregar cultivo de yogur de 20 a 30 gramos por litro de leche)

INCUBADO (A 40 - 45ºC por 2.5 a 3 horas)

REFRIGERADO (Poner en refrigeración)

BATIDO Y ENVASADO (Previa adición de edulcorante y saborizantes)

B. Para Vino.
MATERIA PRIMA (Uva)

LAVADO, DESPALILLADO Y SELECCIONADO

ESTRUJADO

ADICIÓN DE AZÚCAR

ADICIÓN DE CULTIVOS FERMENTADORES

PRIMERA FERMENTACIÓN (4 - 6 días)

DESCUBADO
 SEGUNDA FERMENTACIÓN (20 - 30 días)

TRASIEGO

CLARIFICADO, FILTRADO

ENVASADO

IV. RESULTADOS, DISCUSIONES Y CONCLUSIONES.

Todos los resultados presentar en cuadros y graficarlos, hacer las discusiones

respectivas previa revisión bibliográfica, para así poder emitir sus conclusiones.

V. CUESTIONARIO.
1. Hacer una lista de productos agroindustriales que se elaboran mediante el uso de
microorganismos. Mencionar al o a los microorganismos responsables de cada
producto.

2. Hacer una lista de los productos que se elaboran en la Región San Martín por acción
de microorganismos. Nombrar a las empresas productoras.

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