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INTRODUCCIÓN

Las plantas producen una enorme variedad de compuestos


naturales llamados terpenos
noids, que comprenden más de 40,000 compuestos. La
riqueza de estos naturales
compuestos contribuye de muchas maneras diferentes a
las diversas características de las plantas, tales
como sabor, sabor, pigmentación y aroma (Vezzaro et al.,
2012), y participa en diversos
crecimiento de plantas y procesos de desarrollo (Bouvier et
al., 2005). Todos los compuestos isoprenoides
se derivan de 2 precursores básicos de cinco carbonos,
isopentenil difosfato (IPP) y su isómero
dimetilalil difosfato (DMAPP), que sufren condensaciones
consecutivas para
duce prenyl difosfatos. Los diferentes precursores prenyl
difosfatos intermedios (GPP,
FPP y GGP) son posteriormente convertidos por terpeno
sintasa en una variedad de carburos de terpeno.
bon esqueletos. Entre todos los organismos vivos, los 2
precursores de isopreno de cinco carbonos (es decir, IPP y
DMAPP) a estos terpenoides se sintetizan mediante 2 vías
diferentes [es decir, metil-d-eritritol-
Las rutas del 4-fosfato (MEP) y del ácido mevalónico
(MVA)] (Vranová et al., 2013). El MVA
vía utiliza ácido mevalónico como precursor para la síntesis
de IPP y DMAPP, mientras que
MEP utiliza piruvato y gliceraldehído-3-fosfato como
precursores para la síntesis de IPP
y DMAPP. Se han logrado avances notables en las últimas
2 décadas después del descubrimiento
de la vía MEP como una alternativa para la biosíntesis de
IPP y DMAPP.
Recientemente, la vía del MEP representa uno de los
objetivos más prometedores para el desarrollo
ing nuevos herbicidas y drogas antiparasitarias; también
tiene como objetivo mejorar el valor nutricional de los
cultivos
plantas (Cordoba et al., 2009). Los genes y sus respectivas
enzimas involucradas en el MEP
vía son objetivos atractivos para la producción de productos
comercialmente importantes (por ejemplo,
vors, fragancias, pigmentos y polímeros) (Phillips et al.,
2008) y el desarrollo de nuevos
medicamentos y herbicidas antibacterianos y
antiparasitarios (Kuntz et al., 2005).
La vía del MEP funciona mediante la participación de 8
enzimas consecutivas para
Duce los bloques básicos universales IPP y DMAPP de
compuestos isoprenoides de los precursores
piruvato y D-gliceraldehído 3-fosfato (Cordoba et al., 2009).
Todos los pasos involucrados en el
La ruta biosintética del MEP ha sido identificada, y el gen
respectivo involucrado en la codificación
la enzima específica ha sido clonada de diferentes
especies de plantas. En este sentido, DXR fue el
primer gen identificado y se considera como el paso
limitante en la vía MEP. Sobreexceso
Presión de genes DXR en diversas especies de plantas
(Kuntz et al., 2005), incluida Arabidopsis (Estévez et al.,
2001), tomate (Lois et al., 2000), papa (Morris et al., 2006)
y Ginkgo bi-
loba (Gong et al., 2006), resultó en un aumento de 2-7
veces en el nivel de varios isoprenoides finales
productos, incluyendo clorofila, carotenoides, tocoferoles y
ABA. Una alternativa interesante
explorar en el futuro será la manipulación genética de esta
enzima junto con
otras enzimas aguas abajo de la vía MEP (Cordoba et al.,
2009). En este contexto,
versión de 2C-metil-4-fosfato-d-eritritol a 2C-metil-eritritol-4-
fosfato es
el siguiente paso comprometido en la vía del MEP. El gen
responsable de la síntesis del
enzima que cataliza esta etapa se ha clonado a partir de
especies de plantas tales como Arabidopsis y arroz. UN
La mayor preocupación en el CMS hoy en día es la mejora
continua de la biosíntesis de terpenoides de plantas.
N. sylvestris se cultiva como planta ornamental y ha sido
ampliamente adoptado como diploide
sistema modelo en biología vegetal para estudios de
biosíntesis de terpenoides, ingeniería de plastidios, her-
resistencia a bicidas y resistencia a virus de plantas (Maliga
y Svab, 2011; Sierro et al., 2013). los
clonación e identificación de genes implicados en la
biosíntesis de terpenoides se han llevado a cabo en
diferentes especies de plantas, pero se le ha prestado poca
atención a N. sylvestris. Aislamiento de los genes
involucrado en catalizar el primer paso de la vía de
biosíntesis de terpeno abrirá nuevos parámetros
digms para explorar la síntesis de terpenoides en las
especies modelo diploides de N. sylvestris. Ge-
La manipulación neta de los genes implicados en la
biosíntesis de isoprenoides en N. sylvestris ofrecerá
nuevos corredores para la biosíntesis de metabolitos
importantes desde el punto de vista nutricional y comercial.
Teniendo en cuenta la importancia de la síntesis de
terpenoides en N. sylvestris, la principal
El tema del trabajo actual fue la exploración y
experimentación del CMS en N. sylves-
tris. Primero, el CMS involucrado en la síntesis de la
estructura principal de cinco carbonos para la síntesis de
terpenoides corriente abajo fueron clonados; luego, el perfil
de expresión fue identificado usando análisis
de la localización in vivo, las propiedades físicas y
químicas, y la estructura tridimensional.
Por último, se consideran las futuras orientaciones para la
investigación.
MATERIAL Y MÉTODOS
Preparación de muestras de plantas
Las semillas de N. sylvestris se cultivaron en condiciones
controladas en una casa de vidrio.
Las raíces, tallos y hojas se cosecharon de las plantas y se
almacenaron a -70 ° C.
Preparación del ARN total
El ARN total se extrajo utilizando el mini kit de purificación
de ARN de la planta GeneJET ™ (MBI)
Fermentas, EE. UU.), Y la integridad de esas muestras se
evaluó mediante gel de agarosa (1%) elec-
troforesis. La concentración y pureza de las muestras de
ARN se detectaron mediante Nano Drop
2000. El ADN complementario de la primera cadena
(ADNc) se sintetizó utilizando Revert Aid ™
Kit de síntesis de cADN First Strand (MBI Fermentas).
Clonación de ADNc
El CMS de Salvia miltiorrhiza (GenBank: AEZ55667.1) se
utilizó en nuestro TBLASTN
buscar contra la base de datos EST. Una secuencia (GB:
EB430262.1, 864 pb) recuperada después de una
Se encontró que la búsqueda de BLAST era altamente
homóloga al S. miltiorrhiza CMS. La cartilla
los pares Mid-F y Mid-R, basados en la región conservada,
fueron diseñados para amplificar el medio fragmento de N.
sylvestris CMS. El programa de reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) solía
amplificar el fragmento medio fue el siguiente: 10 min a 94
° C durante 1 ciclo; 30 s a 94 ° C, 30 s
a 50 ° C, y 1 min a 72 ° C durante 35 ciclos; y 10 min a 72 °
C. Amplificación rápida de cDNA
fines (RACE) se utilizó para amplificar los extremos 5 'y 3'
del CMS. RACE se realizó
con el kit de amplificación de cDNA SMARTTM RACE
(Clontech) según el fabricante
instrucciones. Los primers específicos de genes (GSP)
basados en la secuencia intermedia de N. sylvestris fueron
diseñado (Tabla 1). GSP1 combinado con el cebador UPM
se utilizó para amplificar el 5'-RACE
fragmento con las siguientes condiciones de PCR: 10 min a
94 ° C; 30 s touch-down de 70 a
50 ° C en incrementos de 0.5 ° C; seguido de 20 ciclos de
30 segundos a 94 ° C, 30 segundos a 50 ° C y 90
segundos a
72 ° C; y, finalmente, 10 minutos a 72 ° C. GSP2
combinado con el cebador UPM se utilizó para amplificar
el fragmento 3'-RACE con las siguientes condiciones de
PCR: 10 min a 94 ° C; 30 s de aterrizaje
de 60 a 50 ° C en pasos de 0,5 ° C; seguido por 20 ciclos
de 30 sa 94 ° C, 30 sa 50 ° C y 90 s
a 72 ° C; y finalmente, 10 minutos a 72 ° C. De acuerdo con
las secuencias ensambladas, diseñamos el
iniciadores de genes de longitud completa ORFF y ORFR
(Tabla 1) para aislar la secuencia completa del
CMS. Las condiciones de PCR utilizadas para aislar la
secuencia de longitud completa fueron las siguientes: 10
min a
94 ° C; y 35 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a
55ºC y 90 segundos a 72ºC. Los productos de PCR fueron
se separó en gel de agarosa al 1% por electroforesis;
luego, las bandas respectivas fueron recuperadas
(Kit de purificación de ADN TaKaRa Agarose Gel Ver. 2.0)
y subclonado en el vector PMD18-T
(TaKaRa, China) para la secuenciación (BGI-Beiji Análisis
bioinformático de la secuencia CMS
El marco de lectura abierto (ORF) de la secuencia NsyCMS
fue deducido por el ORF
software buscador en NCBI. DNAMAN, InterProScan
(http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/),
WOLF PSORT (http://psort.hgc.jp/form.html) y DAS
(http://www.sbc.su.se/~miklos/
DAS /) se usaron para predecir la propiedad fisicoquímica,
la estructura, la localización y la transposición.
hélices de membrana de la proteína codificada. ClustalW
(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) y
MEGA 4.0 se usaron para el alineamiento y el análisis
filogenético (bootstrap = 100). Una estructura tridimensional
El modelo tural se construyó con SWISS-MODEL
(http://swissmodel.expasy.org/) usando
Modeller 8.0 (Fiser y Šali, 2003). La proteína secretora
también fue analizada por Signal P4.0
Servidor (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/).
Análisis de expresión génica
Los pares de cebadores específicos de gen NsyCMS-YF,
NsyCMS-YR, NsyMK-YF y NsyMK-
YR se usaron para la PCR fluorogénica cuantitativa (Tabla
1) y el gen de la actina (GenBank:
AB181991) sirvió como control endógeno. La mejor
temperatura de recocido fue finalmente
determinado por gradiente de PCR. La PCR fluorogénica
cuantitativa se realizó con SYBR
Premix EX Taq (Takara) en el sistema de PCR en tiempo
real ABI 7500 (Applied Biosystems,
ESTADOS UNIDOS). La PCR se llevó a cabo con 2 μL de
ADNc como plantilla, 0,5 μL de cada cebador, 7,5 μL
2X SYBR Green PCR Master Mix y 4,2 μL de agua
desionizada en una mezcla de reacción de 15 μL.
El programa de PCR fue el siguiente: un ciclo de 5 minutos
a 95 ° C; y 40 ciclos de 30 sa 95 ° C,
5 s a 95 ° C, y 34 s a 60 ° C. Cada muestra se cuantificó
por triplicado para cada biológico
replicar, y se realizaron 3 réplicas biológicas. La señal de
fluorescencia fue recolectada
y la curva de disociación trazada. Para el dibujo de curva
estándar, una concentración de plantilla de
Se usaron 243 ng / μL; para la amplificación génica
específica de especie, la plantilla era 3 veces en serie
diluido de 243 ng / μL a 3 pg / μL. Sobre la base de los
valores CT de todos los puntos de dilución en una serie,
una
curva estándar fue generada.
Los niveles de expresión para cada muestra se registraron
como CT. Los valores de CT se transformaron
a cantidades relativas a la muestra. Usando 2ΔΔCT como
la eficiencia de amplificación de PCR:
RESULTADOS
Aislamiento y secuenciación de la ORF
Una búsqueda BLAST del CMS contra la base de datos del
genoma del tabaco reveló
secuencia del gen servido en N. sylvestris. La secuencia
media del gen de 462 pb de N. sylvestris
se obtuvo mediante PCR realizada con el par de cebadores
Mid-F y Mid-R (Figura 1A). Residencia en
la secuencia central de los cebadores CMS, sentido y
antisentido para 3'-RACE y 5'-RACE
diseñado, y tanto los fragmentos de los extremos 5 'como 3'
de los respectivos genes se amplificaron (Figura 1B,
DO). Los fragmentos del extremo 5 'y 3' se ensamblaron, y
la secuencia de codificación putativa de longitud completa
fue obtenido. La secuencia de nucleótidos completa
contenía un ORF de 954 pb (Figura 1D). Estas-
se renombró como NsyCMS y se registró en GenBank (número de acceso
KC961733).