El Journal of Antibiotics (2016), 1 - 8

y 2016 Japón Antibióticos Asociación de Investigación Todos los derechos reservados 0021-8820 /

16 www.nature.com/ja

ARTÍCULO ORIGINAL

La actividad antimicrobiana y las interacciones de péptidos catiónicos

derivados de Galleria mellonella cecropina D-péptido similar con
membranas modelo

José Oñate-Garzón 1, Marcela Manrique-Moreno 1, Steven Trier 2, Chad Leidy 2, Rodrigo Torres 3,4
y Edwin Patiño 1

Los péptidos antimicrobianos son efectoras moléculas del sistema inmune innato contra los patógenos invasores. La carga catiónica en sus estructuras tiene una fuerte
correlación con la actividad antimicrobiana, siendo responsable de la interacción electrostática inicial entre péptidos y la superficie microbiana aniónico. Este documento contiene
evidencia de que carga los modi fi de cationes en el péptido neutral Gm cecropina D-como (WT) mejoró la actividad antimicrobiana de la modi fi péptidos ed. Dos péptidos catiónicos
derivados de secuencia WT nombrado como Δ M1 y Δ M2, con carga neta de 5 y 9, respectivamente, mostraron al menos un aumento de ocho veces en su actividad antimicrobiana
en comparación con WT. El mecanismo de acción de estos péptidos se investigó usando pequeñas vesículas unilaminares (SUVs) como membranas modelo. Para estudiar los
efectos de permeabilización de los péptidos sobre las membranas celulares, liposomas calceína atrapadas fueron utilizados y los resultados mostraron que todos los péptidos
indujeron liberación de calceína de 1-palmitoil-2oleoyl-sn-glicero-3-fosfoglicerol SUVs (POPG), mientras que en 1-palmitoil -2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), POPC /
POPG y 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (POPE) / POPG SUVs, solamente Δ M1 y Δ M2 induce una permeabilización notable. Además, las interacciones de estos
péptidos con fosfolípidos a nivel del esqueleto de glicerol y dominio hidrófobo se estudiaron a través de cambios observados en la polarización y generalizada Florida anisotropía de
fluorescencia usando sondas tales como laurdan y DPH, respectivamente. Los resultados sugieren que los péptidos clasificadas ligeramente la estructura de bicapa en el nivel del
esqueleto de glicerol y en el núcleo hidrofóbico en 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol SUVs (DMPG), mientras que en

1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC) / SUVs DMPG, solamente Δ M1 y Δ péptidos M2 aumentaron el orden de bicapas. Así, los péptidos se induciendo la agrupación de
los fosfolípidos de la creación de dominios de fosfolípidos con una temperatura de transición de fase más alta.

The Journal of Antibiotics la publicación anticipada en línea 21 de diciembre de 2016; doi: 10.1038 / ja.2016.134

INTRODUCCIÓN
Los péptidos antimicrobianos (AMP) realizan muchas funciones importantes en la inmunidad innata de
los insectos, que se encuentran en la hemolinfa, donde su papel es matar a la invasión de
microorganismos. Una característica especial de AMP es que es menos probable que las bacterias
desarrollan resistencia contra ellos 1
que podrían hacer frente a este cuello de botella y, por tanto, evaluar modi fi cationes de la
carga y otros parámetros estructurales para mejorar su actividad antimicrobiana.
AMP han sido clasificadas fi ed en diferentes tipos de moléculas tales como (1) lineal α- péptidos
helicoidales sin residuos de cisteína, por ejemplo, cecropinas; (2) β- hoja estabilizado por

AMP ya ejecutan su actividad biológica a través de un no especificado fi mecanismo de c, disulfuro fi de puentes, por ejemplo, defensinas; (3) péptidos con predominio de residuos de

la orientación de las membranas celulares bacterianas principalmente, a diferencia prolina y / o glicina. 6 Las interacciones de AMP induce daño de la membrana a través de una

antibióticos convencionales. La mayoría de estos péptidos están formados por o 50 residuos y formación de desagregación o poro detergente-como debido a las interacciones electrostáticas

tienen una carga neta positiva que está relacionado con su actividad lítica. 2 Además, la carga e hidrófobas con los grupos de cabeza o las cadenas acilo de los fosfolípidos, respectivamente. 2,7

es una propiedad que es importante debido a la interacción de los amplificadores con la Amplificadores tienen un amplio espectro de actividad antimicrobiana, ya que poseen acentúan

membrana aniónica siendo dependiente en gran medida de la atracción electrostática. 2 - 5 Los la actividad contra las bacterias Gram-positivas, bacterias Gram-negativas, hongos, parásitos,

esfuerzos para aislar o descubrir nuevas moléculas de AMP de origen natural contra bacterias virus con envuelta e incluso las células de cáncer debido en parte a interacciones

multirresistentes son caros y consume mucho tiempo. Por lo tanto, la síntesis de fase sólida es electrostáticas. 8

un método útil para modi peptídicos fi catión

1 Instituto de Química, Departamento de Química, Universidad de Antioquia, Grupo de Bioquímica Estructural de Macromoléculas, Medellín, Colombia; 2 Departamento de Física, Universidad de los Andes, el Grupo de Biofísica, Bogotá,

Colombia y 3 Escuela de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Industrial de Santander, Santander, Colombia

edwin.patino@udea.edu.co
Correspondencia: 4 Dirección
Dr. E. Patiño, actual: Instituto
Departamento de Química,
de Química, Universidad
Universidad de Antioquia,
de Antioquia, Grupo deGrupo de Bioquímica
Bioquímica Estructural
Estructural de Macromoléculas,
de Macromoléculas, código050010,
código postal postal 050010,
Calle 67Calle 67 #Laboratorio
# 53-108 53-108. Laboratorio 1-314, Medellín
1-314, Medellín, 050010, 050010, Colombia.
Colombia. E-mail:

Recibido el 12 de mayo de de 2016; 7 revisado de septiembre de de 2016; aceptaban 12 de octubre de el año 2016
 La actividad antimicrobiana y las interacciones de péptidos catiónicos
J Oñate-Garzón et al
Nuestra investigación se centra en la evaluación de dos péptidos sintéticos catiónicos
llamados Δ M1 y Δ M2, que se deriva de la cecropina D-como de
Galleria mellonella. dieciséis Cecropina D-como está compuesto de 39 residuos, es neutral a
pH 7,4 y muestra actividad antibacteriana frente a bacterias Gram-positivas y
Gram-negativas. La carga en los análogos de péptidos Δ M1 y Δ M2 se incrementó mediante
la sustitución de residuos de ácido glutámico y aspártico negativas con los residuos de
arginina y lisina positivos. La glutamina aminoácido neutro también se sustituyó con lisina,
y todas las sustituciones se llevaron a cabo en el fi primeros 18 aminoácidos de la NH 2- terminal.
Sin embargo, el mínimo IC para Δ M1 y Δ péptidos análogos M2 fue menor que la de tipo
salvaje D-como cecropina. El uso de la auto-extinción de la Florida fluorescencia tinte
calceína y las sondas de membrana laurdan (6-lauroil-2-dimetilaminonaftaleno) y DPH
(1,6-difenil-1,3,5-hexatrieno), se encontró que los análogos peptídicos inducen
permeabilización de la membrana y las alteraciones en el comportamiento termotrópico de
pequeñas vesículas unilaminares (SUV).
MATERIALES Y MÉTODOS
Productos Biológicos
Escherichia coli ( ATCC 25922), Pseudomona aeruginosa ( ATCC 27853) y
Staphylococcus aureus ( ATCC 25923) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC;
Rockville, MD, EE.UU.).
Construcción de los péptidos de sustitución de la carga y el índice hidrófobo
Las sustituciones de aminoácidos, basados ​en estudios Bordo y Argos, 9 se introdujeron en la secuencia
de tipo salvaje para generar Δ M1 y Δ péptidos M2. La carga neta de cada péptido después de
intercambiar residuos se calculó como la adición de los residuos básicos. Péptido hidrofobicidad, de fi define de transición de fase de las mezclas de lípidos de poros de 100 nm de diámetro fi filtro (Whatman,
como la media de los valores de hidrofobicidad de todos los residuos dentro de un péptido de acuerdo
con una escala estándar, 10 se calculó utilizando el software Heliquest (http:. // heliquest ipmc.cnrs.fr/).
La síntesis de péptidos, puri fi características de cationes y de secuencia
Los péptidos se sintetizaron por el método en fase sólida 11 utilizando Fmoc (9- Florida uoroenylmethoxycarbonyl)
como un grupo protector en el NH 2- región terminal en un sintetizador automático 433 A Applicated
Biosystems (Universidad de Lausanne, Suiza). Después de eso, los péptidos se obtuvieron con 95% de
pureza por cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa usando una columna preparativa
Vydac C-18 y la aplicación de una mezcla de: (A) H 2 O con TFA al 0,1% (v / v) y acetonitrilo (B) que
contiene TFA al 0,1% (v / v) como fase móvil. Para la elución de los péptidos, se utilizó el siguiente
programa de gradiente: 30 min con 5 - 70% de B en 1 ml min - 1 y detección a 220 nm. Por último, la masa
molar de puri fi péptidos ed se determinó por matriz de desorción láser asistida por ionización de tiempo
de
Florida ight MS. 12
proyecciones volante de tres péptidos se llevaron a cabo de acuerdo con el fi rst dieciocho
residuos del NH 2- secuencia de la región de terminal, ya que es la región donde se realizaron las
sustituciones de residuos en Δ M1 y Δ péptidos M2. Estas proyecciones se calcularon utilizando
software bioinformático (http:. // rzlab ucr.edu/scripts/wheel/wheel.cgi).
Actividad antimicrobiana
La determinación de la MIC se realizó de acuerdo con el método descrito por Wiegand et al., 13 con
una ligera modificación fi cationes. Las bacterias se cultivaron en un precultivo durante la noche a 37
° C se agitaron suavemente. El cultivo se diluyó en caldo nutritivo hasta una DO 625 de 0,1 se alcanzó
(aproximadamente 1 × 10 8 CFU ml - 1). Entonces tales cultivo se diluyó por un factor de 1: 200. 10 μ l
alícuotas de diluciones seriadas de péptido, siendo 100 y 0,62 μ METRO, la concentración máxima y
mínima, respectivamente, se mezclaron con 90 μ l de la suspensión bacteriana alcanzar una fi inóculo
final de aproximadamente 5 x 10 5
CFUml - 1. Las mezclas se transfirieron a placas de 96 pocillos, se incubaron a 37 ° C durante 18 - 20 h y la
absorbancia a 625 nm se midió en un Multiskan Go (Thermo). La MIC se informó como la concentración
más baja que mostró inhibición del crecimiento. solución salina tamponada con fosfato (PBS, 138 m METRO NaCl,de fluorescencia se realizaron utilizando un espectrofotómetro de ISS-PC1 Florida uorometer (ISS) con λ Excª 340 nm.
3 m METRO KCl,
The Journal of Antibiotics
1,5 m METRO NaH 2 correos 4, 8.1 m METRO N / A 2 HPO 4 y pH 7,4) se utilizó como control negativo, y oxitetraciclina y
polimixina B (1 μ METRO) se utilizaron como control positivo para las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas
respectivamente.
actividad hemolítica
Los eritrocitos se aislaron de sangre periférica humana fresca. Se lavaron tres veces con PBS por
centrifugación durante 5 min a 3000 gramo y se resuspendieron en PBS. Los péptidos a diferentes
concentraciones (115, 80, 57,5, 40, 25 y 12.5 μ METRO), se añadieron a eritrocitos humanos 4% en PBS y
se incubaron a 37 ° C durante 1 h. Después, las mezclas se centrifugaron a 4000 gramo durante 5 min.
Las alícuotas del sobrenadante se transfirieron a placas de 96 pocillos. La hemólisis se midió mediante
absorbancia a 540 nm con un Multiskan Go (Thermo). Para los controles negativos y positivos, los
eritrocitos en PBS (en blanco) y los eritrocitos en PBS con 5 μ METRO de melitina (positivo) se utilizaron
respectivamente. El porcentaje de hemólisis se calculó usando la siguiente ecuación: [(Abs en la
solución de péptido - Abs en PBS) / (Abs en melitina - Abs en PBS)] x 100. 14 concentración hemolítica 50
(HC 50) es la concentración necesaria de péptido para inducir 50% de la lisis de los eritrocitos en
condiciones fisiológicas.
Preparación de pequeñas vesículas unilamelares
aniónico deshidratado y lípidos zwitteriónicos se disolvieron en el disolvente CHCl 3: CH 3 OH (70:30,% v / v) y
CHCl 3, respectivamente. Las muestras se secaron bajo nitrógeno gaseoso y se colocaron bajo vacío
durante la noche para eliminar el disolvente residual. Films se hidrataron con tampón Hepes (10 m METRO Hepes,
110 m METRO KCl, 0,01 m METRO EDTA, 0,03 m METRO CaCl 2, pH: 7,4) o tampón de calceína (10 m METRO Hepes,
110 m METRO KCl, 0,01 m METRO EDTA, 0,03 m METRO CaCl 2, 50 m METRO
Calceína, pH: 7,4). Las mezclas se homogeneizaron por vórtice durante 2 min. Después de eso,
cada mezcla se incubó por 10 min a 37 ° C, por encima de la temperatura de transición de fase ( T metro).
Este ciclo se repitió tres veces. vesículas multilamelares se extruyeron por encima de la temperatura
Clifton, NJ, EE.UU.), utilizando un extrusor de mano (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, EE.UU.) 20
veces para obtener SUVs. Cada SUV fue nombrado con las abreviaturas de los fosfolípidos que lo
componen: 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (POFG),
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC ), POPC / POPG,
1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina
(POPE) / POPG,
1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DMPG), 1,2-dimiristoil-
sn-glicero-3-fosfocolina (DMPC), DMPC / DMPG y POPE / DMPG. Todas las mezclas de
fosfolípidos se realizaron en proporción de 3: 1.
experimentos de liberación de calceína
SUVs calceína-cargado se separaron de colorante granel a través de cromatografía de exclusión por tamaño
usando Sephadex 50 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.). La concentración de fosfolípido SUVs calceína
total se ajustó a una fi concentración final de 25 μ METRO y que fueron expuestas a diferentes concentraciones
de péptidos: 0,5, 0,35, 0,25 y 0,05 μ METRO, a 37 ° C. Las mediciones de fluorescencia se realizaron en un
espectrofotómetro ISS-PC1 Florida uorometer (ISS, Champaign, IL, EE.UU.), utilizando
λ Excª y λ em de 490 y 519 nm, respectivamente. los Florida intensidades uorescencia se registraron como función
del tiempo (0 - 300 s). El porcentaje de calceína liberada se calculó como: [( F t - F contr) / F nene - F contr)] × 100, donde F
t es el Florida señal de fluorescencia medido en un momento t bajo la in Florida influencia de los péptidos, F contr es
el
Florida señal de fluorescencia se mide al mismo tiempo t en ausencia de péptidos, y F nene
es el total Florida señal de fluorescencia obtenida después de la interrupción completa de los liposomas por 1% de
Triton X-100.
Laurdan polarización generalizada
la de Florida influencia de los péptidos sobre la transición toliquid-cristalina de gel a nivel del esqueleto de
glicerol, así como de la temperatura de transición de fase ( T metro) se determinó usando laurdan
(6-lauroil-2-dimetilaminonaftaleno) sonda (Molecular Probe, Eugene, OR, EE.UU.). El desplazamiento
espectral de emisión de laurdan
Florida uorescencia resultados de los cambios en los fenómenos de relajación dipolar debido a
Florida fluctuante hidratación de la membrana. En la excitación, el momento dipolar del laurdan aumenta
notablemente y las moléculas de agua que rodean la sonda reorientar alrededor del nuevo dipolo. 15 Las mediciones
La concentración de lípidos de

liposomas se ajustó a 0,25 m METRO y la sonda laurdan se añadió a una relación lípido: sonda de 1: 500.
Después, se añadieron los péptidos a una fi concentración final de
2.5 μ M ( 1 de péptido / 100 lípidos) bajo agitación continua y el aumento de la temperatura desde 12
hasta 37 ° C, 1 ° C cada dos minutos. Se obtuvo el valor de polarización generalizada (GP) usando
la siguiente ecuación:
GP ¼ yo 440 yo 490 = yo 440 þ yo 490
donde 440 y yo 490 son las Florida intensidades uorescencia en longitudes de onda de emisión de 440 nm (fase
de gel) y 490 nm (en fase líquida-cristalina), respectivamente. La temperatura de fusión se calcula el máximo
de la fi derivado primera de los valores de GP como función de la temperatura, correspondiente a la de Florida punto
de reflexión de la curva. La pendiente de la transición proporciona información sobre la cooperatividad del
proceso.
DPH Florida la polarización de fluorescencia
DPH Florida anisotropía de fluorescencia es dependiente de los movimientos dinámicos naturales de la
bicapa y el cambio de sus valores son indicativos de cambios en el orden de los dominios donde se ubica
la sonda. Las concentraciones de lípidos y péptidos se ajustaron como se ha mencionado en ensayos
laurdan y sonda DPH (Molecular Probe) se añadió en un lípido: sondear proporción de 1: 500. Los péptidos
se añaden a bajo agitación continua y el aumento de la temperatura desde 12 a 37 ° C. La polarización de
fluorescencia se midió con un espectrofotómetro de ISS-PC1 Florida uorometer (ISS) usando λ Excª y λ em de
349 y 426 nm respectivamente. anisotropía de fluorescencia ( r) se calculó usando la ecuación: r = I 0 - yo 90 / yo
0+ 2 ' yo 90, dónde
yo 0 es el Florida fluorescencia intensidad cuando el ángulo entre polarizadores es de 0 °, yo 90 es el
Florida fluorescencia intensidad cuando el ángulo entre polarizadores es de 90 °. La temperatura de fusión ( T metro) se obtuvo
como se ha mencionado anteriormente.
análisis estadístico
Los ensayos biológicos y biofísicos se llevaron a cabo al menos por triplicado. Se utilizaron las pruebas de rangos
múltiples de LSD para determinar si estadísticamente significativa fi diferencias signifi se produjeron entre los
valores medios obtenidos. HC 50 estaba determinado
La Tabla 1 Aminoácidos secuencias y propiedades de WT, Δ M1 y Δ péptidos M2
nombre del péptido Secuencia
1 10 20 30
WT NH-ENFFKEIERAGQRIRDAIISAAPAVETLAQAQKIIKGGD-Ac
Δ M1 NH-ENFFK R yo R TRAPO K RIRDAIISAAPAVETLAQAQKIIKGGD-Ac
Δ M2 NUEVA HAMPSHIRE- R NFFK R yo R TRAPO K RIR K AIISAAPAVETLAQAQKIIKGGD-Ac
Abreviatura: o H 4, hidrofobicidad. un Q = cargar.
Figura 1 proyecciones de rueda helicoidal de la fi primeros 18 residuos de la NH 2- secuencia de la región terminal de cada péptido. ( un) Cecropina D-como G. mellonella ( WT) péptido; ( segundo) Δ péptido M1; ( do) Δ péptido
M2. Por defecto, la salida presenta los residuos hidrofílicos como círculos, los residuos hidrofóbicos como los diamantes y potencialmente cargado positivamente como pentágonos. La hidrofobicidad es un código de
color, así: el residuo más hidrofóbico es de color verde, y la cantidad de verde está disminuyendo proporcionalmente a la hidrofobicidad, con cero hidrofobicidad codificado como amarillo. residuos hidrofílicos se
codifican rojo con rojo puro siendo el residuo más hidrófilo (sin carga), y la cantidad de rojo disminuyendo proporcionalmente a la hidrofilicidad. Los residuos potencialmente cargados son de color azul claro. ruedas
helicoidales están adaptados de http://rzlab.ucr.edu/scripts/wheel/wheel.cgi.
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utilizando una ecuación modelo correlacionado ajustados. Todos los análisis estadísticos se realizaron
utilizando el software Statgraphics Centurion XV.
RESULTADOS
diseño de péptidos y características de secuencia
Péptido WT es un cecropina-D de Galleria mellonella compuesto de 39 residuos (p85210,
UniProt KB) dieciséis con una carga neutra a pH 7,4. Este cecropina fue seleccionado como el
péptido molde en este estudio para cambiar su carga neutra a una carga positiva en los
últimos 18 residuos en NH 2-
terminal de la región. El aumento de la carga neta se logró mediante la sustitución de
E6R, E8R y Q12K para Δ M1 y para Δ También se realizaron M2 substituitions anteriores,
pero, además, E1R y D16K (Tabla 1, letras en negrilla). péptido Δ M1, con tres
sustituciones en la cara polar, dio como resultado una carga neta aumentaron de 0 a
+5. Por otro lado, el péptido Δ M2 con fi cinco sustituciones resultado en una carga neta
pasaron de 0 a 9 (Tabla 1).
Residuos de sustituciones en la cara polar de la hélice no alteraron la cara no polar en
las modi fi péptidos ED (Figura 1). En estos fi primeros 18 residuos de la cara polar
consistía en 10 residuos con 5 residuos conservados en todos los péptidos (Asn 2, Lys 5,
Arg 9, Arg 13 y Arg 15). La cara no polar en esta región consistió en 8 residuos: dos Phe,
tres Ile, Ala dos y un residuo Gly. Sin embargo, el índice de hidrofobicidad de los
péptidos disminuyó después de las sustituciones de la inicial 0,232 visto en WT a 0.193 y
0.178 para Δ M1 y Δ M2, respectivamente.
Antimicrobial, la actividad hemolítica y el índice terapéutico
La actividad antibacteriana de los péptidos fueron evaluados (Tabla 2) contra cepas de
bacterias Gram-positivas y Gram-negativos como la MIC. péptidos catiónicos mostraron la
actividad más alta, especialmente contra las bacterias Gram-negativas. En E. coli, Δ M1 y Δ péptidos
M2 mostraron MIC de 2.5 y 1.5 μ METRO, respectivamente. Además, en P. aeruginosa,
Q un oH4
39
0 0,232
+5 0,193
+9 0,178
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Tabla 2 MIC, HC 50 y TI de los péptidos contra las bacterias y los hRBC El índice terapéutico (TI) es un parámetro ampliamente aceptada para representar la
especificidad fi ciudad de reactivos antimicrobianos para procariota frente a las células
E. coli ATCC P. aeruginosa S. aureus ATCC
eucariotas 17,18 y se calculó por: HC 50 / MIC (Tabla 2).
25922 ATCC 27853 25923 Δ péptido M1 tenía una TI ligeramente más alta que la exhibida por Δ bacterias M2 en
Gram-negativas, mientras que en S. aureus, Δ M2 tenía una TI de 147,
Péptido HC 50 en hRBC ( μ METRO) MIC ( μ METRO) TI MIC ( μ METRO) TI MIC ( μ METRO) TI 4,2 veces más alta que la obtenida para Δ M1. TI no pudo evaluarse para el péptido WT
debido a que el HC 50 no se encontró en la concentración máxima evaluado.
WT 4 115 40 42
DAKOTA DEL NORTE DAKOTA DEL NORTE 4 100 ND

Δ M1 1752.3 2,5 701 5 350 50 35

Δ M2 735,4 1.25 588 2.5 294 5 147

experimentos de membrana de permeabilidad
Abreviaturas: HC 50, concentración hemolítica 50; hRBC, los glóbulos rojos humanos; , La concentración de inhibición mínima MIC; ND, no
Después de evaluar la actividad antimicrobiana de los péptidos, los experimentos de permeabilidad
determinado; TI, el índice terapéutico.
de la membrana se llevaron a cabo mediante la medición de la liberación de calceína atrapada dentro
SUVs preparadas a partir de los lípidos representativos de bacterias Gram-negativas. Tanto los
péptidos neutros y catiónicos muestran la actividad en POPG SUVs partir de la concentración más
baja, con ~ 85% de la calceína liberada en una proporción entre péptido y lípido de 1: 100 (0,25 μ METRO
de péptido) (Figura 3). Sin embargo, el péptido WT tiene una ligera actividad en las otras mezclas de
liposomas (figura 3A). Cuando los péptidos catiónicos se añaden a modelos de membrana, la
actividad de permeabilización disminuye de acuerdo con el siguiente orden liposomas: POPG 4 POPC
/ POPG 4-

POPC 4 PAPA / POPG (Figuras 3B y C). En liposomas POPC / POPG, ambos péptidos
exhiben una actividad de liberación máxima alrededor de 70% a la concentración más alta,
mientras que en POPC SUVs que alcanzaron una actividad de alrededor de 40%. La
actividad mínima se muestra en Pope / POPG SUVs, con una actividad en torno al 10% a la
concentración más alta.

Los resultados de la curva de valoración liberación de calceína mostraron que satura a 0,25 μ M
Figura 2 actividad hemolítica del WT ( ●), Δ M1 ( ♦) y Δ M2 ( ■) se midió usando células sanguíneas rojas
humanas. Los datos son el promedio de al menos tres experimentos independientes por duplicado ± sd
( 1: 100 péptido: lípido), independientemente de la composición de SUV las curvas mostró una

Las barras de error representa la sd actividad estable después de esta relación (Figura 3). Por lo tanto, una fi comparación nal de la
* signi fi diferencia no puede al péptido WT, PAG o 0.01. actividad de liberación de calceína de los péptidos a 0,25 μ METRO se llevó a cabo (Figura 4). En
liposomas POPG, todos los péptidos mostraron actividad, pero Δ M1 efecto péptido es signi fi cativamente
más alta que la exhibida por Δ péptidos M2 y WT ( PAG o 0,01), mientras que en liposomas POPC

MICs péptidos catiónicos exhibidos de 5 y 2,5 μ METRO para Δ M1 y Δ M2, respectivamente. ambos péptidos catiónicos, Δ M1 y Δ M2, tener una actividad signi fi cativamente ( PAG o 0,01) más

Por otro lado, las bacterias Gram-positivas fue menos sensible a los WT y Δ péptidos M1 en alta que el péptido WT. Además, en los liposomas compuestos por mezclas de lípidos Δ péptido

las concentraciones evaluadas (Tabla 2), Δ péptido M2 mostró la mayor actividad M2 tiene la actividad más alta ( PAG o 0,01) a diferencia de péptido WT, que muestra casi ninguna

antimicrobiana contra S. aureus, alcanzando un MIC de 5 μ METRO, mientras Δ M1 alcanzó un actividad (Figura 4).

MIC 10 veces mayor que la exhibida por Δ M2. péptido WT tenía propiedades
antimicrobianas frente a bacterias Gram-negativas con MICs observado a aproximadamente
40 μ METRO y no se detectó ningún efecto sobre bacterias Gram positivos.
cambios de hidratación de fosfolípidos (polarización generalizada de laurdan)

Después de determinar a través de los experimentos de liberación de calceína que 1: 100

Δ péptido M2 exhibió una alta actividad contra bacterias Gram-positivas y
péptido: lípido interrumpe la integridad de la membrana, se estudiaron los cambios en las
Gram-negativas, que tiene el máximo efecto antimicrobiano con al menos un aumento de
propiedades fisicoquímicas de las bicapas por el seguimiento de la dependencia de la
19 veces en la actividad en comparación con efecto observado de péptido WT. Δ péptido
temperatura en la sonda laurdan. laurdan Florida espectro fluorescente es sensible a la
M1 tenía al menos un aumento de 8 veces en efecto bactericida
polaridad de la membrana, por lo tanto, proporciona información de la dinámica molecular del
en lo que respecta al péptido WT en
nivel de glicerol columna vertebral estimado a partir del parámetro de GP. Un aumento en el
Bacterias Gram-negativo. Por lo tanto, el aumento de la carga neta en la cara polar mostró un
valor de GP se asocia con bicapas altamente ordenadas, mientras que una disminución en el
aumento sustancial en la actividad antimicrobiana de los péptidos.
valor GP se asocia con mayor Florida fluidez de las membranas. Como dilucidado, gel claro y
fases líquidas con una de fi Ned T metro se observaron en la curva sigmoidal (Figura 5), ​tal
Los efectos citotóxicos de los péptidos en las células rojas de la sangre fue seguido por el control de la
como se ha informado en estudios anteriores. 19 - 21 Los resultados de los péptidos catiónicos
liberación de hemoglobina a partir de suspensiones de células de eritrocitos con seis concentraciones
en liposomas DMPG mostraron que la adición de péptidos induce un ligero pero signi fi aumento
diferentes que van desde 12,5 hasta 115 μ METRO.
GP peralte ( PAG o 0,01) en y por encima de la temperatura de transición de fase (Figura 5a).
A efecto de concentración-respuesta con la modi fi péptidos ed se observó con un signi fi efecto
Además, los péptidos provocan un pequeño cambio en el T metro 24 a 24,5 ° C (Tabla 3). Los
hemolítico peralte ( PAG o 0,01) en comparación con el péptido WT (Figura 2). los Δ péptido resultados de la incorporación de Δ M1 y Δ péptidos m2 en DMPC / DMPG SUVs mostraron un
M2 tenía la actividad hemolítica más alta con una HC 50 de 735,4 μ M y 6,88% de hemólisis aumento leve los valores de GP por encima de la transición de fase (Figura 5c), pero no
a 115 μ METRO, mientras Δ M1 tenía un efecto hemolítico inferior con una HC 50 de indujeron una signi fi aumento del peralte T metro.

1752.3 μ METRO y 2,3% de hemólisis a 115 μ METRO. Por otro lado, el péptido WT mostró
una muy ligera actividad hemolítica a la máxima concentración evaluada.

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figura 3 La liberación de calceína de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (POFG; ... ● ...), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC;

__ ▲ __), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina PAPA / POPG (3: 1; - - ♦ - -) y POPC / POPG (3: 1; - - - ■ - - -) liposomas, en aumento de la concentración a 25 ° C. péptidos ensayados fueron ( un) WT, ( segundo)

Δ M1 y ( do) Δ M2. La ordenada muestra el porcentaje de liberación de calceína después de la adición de péptidos como una fracción de la cantidad total liberada por 1% de Triton X-100. Los datos son la media de al

menos tres experimentos independientes ± barras de error representan la sd

Dakota del Sur ' s.

Los cambios en la membrana Florida fluidez de las bicapas (DPH Florida anisotropía de fluorescencia)

Para seguir el efecto perturbador de los péptidos en el dominio hidrófobo de bicapas, los
cambios en Florida fluorescencia anisotropía de DPH de la temperatura se midieron a un
1: péptido 100: lípido (Figura 6). El análisis de los resultados re Florida ect que la
incorporación de los péptidos sobre DMPG SUVs indujo un cambio en la T metro 24 a 26,12
° C (Tabla 4). El mismo cambio leve en el T metro se observó en los experimentos anteriores
con laurdan. No hubo significación fi cambio no puede en la anisotropía de abajo y por
encima de la temperatura de transición de fase (Figura 6a).

Figura 4 Medición de la liberación de calceína de 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glycero3-fosfoglicerol
(POPG), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina
(POPC), 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina (POPE) / POPG (3: 1) y POPC / POPG (3: 1)
pequeñas vesículas unilaminares (SUVs), sobre el efecto de una concentración de 0,25 μ METRO a 25 ° C.
Los resultados se dan en porcentaje y los péptidos se representan como: WT (barras negras), Δ M1 (barras
estriado) y Δ M2 (barras punteadas). Los datos son el promedio de por lo
menos tres independientes
experimentos ± barras de error representan el sd sd ' s. * signi fi diferencia no puede al péptido WT, PAG o 0.01.
En contraste, la incubación de los péptidos sobre DMPC y POPE / DMPG SUVs no
afectó el parámetro GP (Figuras 5b y d), indicando que la hidratación de los grupos
polares de los fosfolípidos no se alteran por los péptidos. La cooperatividad de la
transición deducida como el punto más empinado de la curva (Figura 5 y Tabla 3)
cambió ligeramente bajo efecto péptidos en absoluto liposomas.
En cuanto a los experimentos sobre SUVs de DMPC / DMPG, sólo los péptidos
catiónicos ( Δ M1 y Δ M2) indujo un aumento menor de la anisotropía por encima de la T m ( Figura
6c). Los resultados en DMPC SUVs mostró que la adición de los péptidos no tuvo efecto
en el núcleo hidrofóbico ordenada de bicapas (Figura 6b).
DISCUSIÓN
En esta investigación, se presenta evidencia de la evaluación de la actividad
antimicrobiana de un péptido de tipo salvaje conocida como cecropina D-like y dos modi
catiónicos fi péptidos ed derivados de la secuencia natural. Se evaluaron los péptidos en
bacterias Gram-negativas y Gram-positivas y efectos citotóxicos en las células rojas de la
sangre humana. Además, la interacción biofísica de los péptidos con los lípidos sintéticos
se investigó para comprender su actividad biológica. Hemos empleado una combinación
de Florida experimentos uorescencia para evaluar el efecto interrumpir de los péptidos y la
interacción a diferentes profundidades de la membrana. El análisis de los resultados
mostró que las variantes de péptidos catiónicos que se sintetizaron exhiben una actividad
antimicrobiana signi fi cativamente más alto que el péptido WT. Se acepta que, el aumento
de la carga se acompaña de un aumento en el antimicrobiana

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Figura 5 valores de polarización generalizada (GP) como una función de la temperatura bajo el efecto de tratamientos: HEPES ( ●), WT ( ♦), Δ M1 ( ■) y Δ M2 ( ▲) en péptido: relación molar de lípido de 1: 100 (2,5 μ METRO). Los
datos se obtuvieron a partir de ( un) DMPG, ( segundo) DMPC, ( do) DMPC / DMPG (3: 1) y ( re) PAPA / DMPG (3: 1) los liposomas preparados en 10 m METRO Hepes. La longitud de onda de excitación era de 340 nm y las
longitudes de onda de emisión eran 440 nm (fase de gel) y 490 nm (en fase líquida-cristalina).

Tabla 3 Efecto de los péptidos a una concentración de 2,5 μ METRO en la temperatura de
transición y la pendiente mínima de transición obtenido por control de valores de GP de
DMPG y los liposomas DMPC / DMPG
DMPG
lisil-PG en la membrana. Estudios ha postular que estos lípidos se repelen y evitar el
secuestro de péptidos catiónicos en la membrana bacteriana. 23 Por otro lado, la barrera
de peptidoglicano de las bacterias Gram-positivas constituyen una protección contra la
atracción electrostática y la inserción de péptidos que reducen el antimicrobiano. 3
DMPC / DMPG (3: 1)

Los experimentos antimicrobianas de péptido WT no mostraron actividad contra las bacterias

pendiente Min (DGP / d T T metro ± sd (° pendiente Min (DGP / d T
Gram-positivas; Sin embargo, Cytry norte ska et al., dieciséis informado de que la cecropina D-péptido
Tratamiento T metro ± sd (° C) metro) ± Dakota del Sur C) metro) ± Dakota del Sur
similar (WT) tiene actividad antimicrobiana alcanzar un MIC que varía desde 6,9 ​hasta 34,4 μ METRO en E.

Hepes 24 ± 0 - 0.1319 ± 0.019 23,5 ± 0 - 0.1594 ± 0.01 coli D31 ( rfa mutación),

WT 24.1 ± 0,003 - 0.0904 ± 0.003 23,5 ± 0 - 0.1672 ± 0.01 M. luteus, L. monocytogenes y S. Lueta, pero no se determinó en
Δ M1 24.5 * ± 0 - 0,0888 ± 0.003 23,5 ± 0 - 0.1332 ± 0.02 E. coli ATCC 25922 de la cepa se utilizó (MIC de 40 μ METRO) fue encontrado. Esto se debe a
Δ M2 24.5 * ± 0 - 0,0885 ± 0.007 23,5 ± 0 - 0.1077 ± 0.02 la concentración máxima de WT utilizado en este estudio fue 34,4 μ METRO, esto puede

Abreviaturas: DMPC, 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina; DMPG, 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol; GP, la polarización explicarse por el adicional de que carecen
generalizada; T metro, temperatura de transición de fase.
5.6 μ METRO para alcanzar el MIC.
* PAG o 0.01.
El ensayo de liberación de calceína aclara la capacidad de los péptidos para inducir un efecto

membrana disruptores. El mecanismo responsable de permeabilización es la inserción de

actividad. 3 - 5 Un aumento en la carga positiva inducir una atracción superior a la densidad
de carga superficial de la membrana. La magnitud de esta atracción también aumenta a moléculas anfifílicas en la membrana bacteriana, seguido de la partición del monómero en la

medida que el péptido se aproxima a la membrana. 22 bicapa lipídica y oligomerización que conducen a un desequilibrio entre el interior y el exterior lea Florida

et y la conducción de los cambios de forma. 20 Los resultados de los experimentos de calceína

Nuestros resultados demostraron que las bacterias Gram-negativas eran más sensibles a proporcionan evidencia de que los péptidos tienen la capacidad de afectar a las vesículas POPG a

los péptidos bajo evaluación. bacterias Gram-negativas están constituidos por una fracción través de un mecanismo de membrana que provocan perturbaciones, lo que podría conducir a la

inferior de lípidos aniónicos en sus membranas en comparación con las bacterias pérdida del contenido citoplasmático en cultivos de bacterias.

Gram-positivas. Además, S. aureus

que era menos sensible a las AMP ensayados, incluye lípido catiónico

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Figura 6 DPH Florida anisotropía de fluorescencia ( r) valores en aumento de la temperatura bajo el efecto de tratamientos: HEPES ( ●), WT ( ♦), Δ M1 ( ■) y Δ M2 ( ▲) en péptido: relación molar de lípido de 1: 100 (2,5 μ METRO). Los datos se
obtuvieron a partir de ( un) DMPG, ( segundo) DMPC, ( do) DMPC / DMPG (3: 1) y ( re) PAPA / DMPG (3: 1) los liposomas preparados en 10 m METRO Hepes. La longitud de onda de excitación era de 349 nm y longitud de onda de
emisión fue 426 nm.

Tabla 4 Efecto de los péptidos a una concentración de 2,5 μ METRO de la temperatura de las bicapas de PC son más hidratada de PE. Este fenómeno permite la incorporación de
transición térmica y la pendiente mínima de transición obtenido por el control de la DPH Florida anisotropía
moléculas de péptidos en capas de agua intercalada POPC y luego una posible inserción en
de fluorescencia de DMPG y DMPC liposomas / DMPG las bicapas. En el caso de PE, los grupos polares tienen una carga efectiva más alta, se
forman fuertes interacciones electrostáticas y enlaces de hidrógeno intermoleculares directa
entre el + NH 3 y el PO 4 - que reducen la hidratación. Además, los péptidos catiónicos
DMPG DMPC / DMPG (3: 1) interactúan preferentemente con POPC líquido-cristalina en lugar de bicapas PAPA
probablemente debido a una mayor hidratación y la disminución de la densidad de
pendiente Min (d r / re T metro) T metro ± sd (° pendiente Min (d r / re T metro) empaquetamiento de los fosfolípidos en PC como en comparación con PE. 25,26
Tratamiento T metro ± sd (° C) ± Dakota del Sur C) ± Dakota del Sur

Hepes 24 ± 0 - 0,092 ± 0.02 23.5 ± 0 - 0.1063 ± 0,015

Para caracterizar adicionalmente las interacciones de péptidos con bicapas de
WT 26.1 * ± 0.57 - 0.0681 ± 0,001 23,5 ± 0 - 0,113 ± 0,003
fosfolípidos, la Florida sondas fluorescentes, laurdan y DPH, se emplearon. Laurdan es
Δ M1 26.1 * ± 0.57 - 0.0671 ± 0.009 23,5 ± 0 - 0,0805 ± 0,006
sensible al ambiente polar, 27 se considera un sensor en el nivel de glicerol columna
Δ M2 26.1 * ± 0.57 - 0.0639 ± 0.006 23,5 ± 0 - 0,0678 ± 0,006
vertebral de los lípidos. Los valores de GP en fase de transición aumentaron ligeramente
Abreviaturas: DMPC, 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina; DMPG, 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol; DPH,
1,6-difenil-1,3,5-hexatrieno; T metro, temperatura de transición de fase.
con la adición de cualquiera de los tres péptidos a DMPG SUVs. Hubo un efecto similar en
DMPC / DMPG SUVs bajo el efecto de los péptidos catiónicos, lo que indica que estos
* PAG o 0.01.
péptidos afectan a la hidratación de la región de la cabeza polar. Por otro lado, la
anisotropía del DPH tuvo un pequeño aumento en las membranas de DMPG y DMPC /
En cuanto a los resultados con el POPC / POPG (3: 1), PAPA / POPG (3: 1) SUVs, WT DMPG. Los resultados sugieren que la interacción péptido con DMPG y DMPC / DMPG
induce menos permeabilización de Δ M1 y Δ péptidos M2, como la observada en la liposomas, cambia el
actividad antimicrobiana contra las bacterias Gram-negativas cuyas membranas mantener
el 3: 1 PE composición de fosfolípidos / PG. 24 Si la carga mundial de los SUV es el mismo Florida fluidez de la bicapa a un sistema más rígido. El aumento en el orden de la bicapa
y se determina por el contenido de PG, la principal diferencia radica probablemente en los podría ser debido al blindaje de los cargos grupo polar después de péptido de unión,
grupos amino terminales, siendo estos + N (CH 3) 3 en POPC y + NH 3 en PAPA. Es bien evitando la repulsión lateral entre los lípidos y el establecimiento de dominios de
informado de que los grupos de cabeza de péptido-fosfolípido con mayor temperatura de transición de fase. 28 La presencia de
dominios desestabilizaría

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la e inducir bicapa fi fuga de calceína ciente de las vesículas. 29
Además, estos resultados podrían indicar que los péptidos catiónicos también actuaron través de
la unión y la desestabilización de la membrana microbiana conduce a la liberación del contenido
citoplasmático de las bacterias.
Δ M1 y Δ M2 cargado péptidos tenían un efecto dependiente de la concentración en la
actividad hemolítica. Δ M2 (9) inducida por la liberación más alta de hemoglobina, ya que
tiene una interacción más fuerte con la superficie de los eritrocitos de Δ M1. WT tuvo un
efecto hemolítico baja, estos resultados se correlacionaron con los resultados de
permeabilización
ion híbrido PC SUVs, donde la superficie de la membrana tiene una naturaleza electrónica
similar a la membrana de los eritrocitos ya que están generalmente compuestos por
fosfolípidos zwitteriónicos. 24 péptidos catiónicos mostraron mayor actividad hemolítica tal vez
debido a una interacción electrostática inicial a través de los grupos cargados negativamente
de la membrana, incluyendo el fosfato y restos de carbohidratos que contienen ácido siálico. 30
La concentración necesaria para liberar la hemoglobina fue dramáticamente mayor en
comparación con la necesaria para matar las bacterias. Esto es porque la membrana de los
eritrocitos se compone principalmente de fosfolípidos zwitteriónicos, que pudieran
obstaculizar la aparición de interacciones electrostáticas con los péptidos catiónicos;
Además, dichas membranas poseen colesterol contribuyen a la rigidez y resistencia contra el
efecto permeabilizador de los péptidos. 24
En conclusión, el aumento de residuos básicos en la cara polar en una plantilla de AMP
se asoció con un mejorar la actividad antimicrobiana principalmente contra las bacterias
Gram-negativas. Además, el aumento de la carga también se asocia con un efecto de
permeabilización en SUVs y la posible formación de dominios en la membrana, lo que
sugiere que los péptidos serían matando bacterias mediante permeabilización de la
membrana y la liberación de contenido citoplasmático. Por otro lado, el aumento de la
carga neta también mejora aumentar la actividad hemolítica, aunque esta actividad no
representaría un riesgo considerable para un enfoque clínico. Sin embargo, serían
necesarios más estudios para determinar la estabilidad del péptido en ' en vivo ' modelos.
Por lo tanto, este estudio da una idea de la introducción de residuos catiónicos en las
secuencias de péptidos con respecto a la actividad biológica de ser útil en el diseño y
desarrollo de moléculas con una baja actividad hemolítica y mejora de la actividad
antimicrobiana.
CONFLICTO DE INTERESES
Los autores declaran no hay aire Florida icto de intereses.
EXPRESIONES DE GRATITUD
JO-G COLCIENCIAS gracias por el doctorado, becas y todos los colaboradores que han hecho posible
este trabajo.
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