UNIVERSIDAD PERUANA UNIÓN

FACULTAD DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA

E.P. DE INGENIERÍA AMBIENTAL

INFORME 01

FIJACIÓN DE MUESTRAS Y TINCIÓN SIMPLE

DOCENTE:

Haro Casildo Sady Lourdes

CURSO

Microbiología Ambiental

AUTOR:

Jonathan Pinto Cahuapaza

Vía Chullunquiani 2018- IV

 TITULO

FIJACIÓN DE MUESTRAS Y TINCIÓN SIMPLE

OBJETIVOS

 Aprender las técnicas de preparación, fijación y coloración para el estudio de los

microorganismos

REVISION DE LITERATURA INTRODUCCION

En microbiología el microscopio se utiliza de forma rutinaria, ya que proporciona importante

información para la identificación temprana y definitiva de los microorganismos (Pathol B. 2000).

En la valoración de las muestras, es trascendente el poder de resolución del microscopio, el cual

se define como la capacidad que posee un objetivo para distinguir la distancia mínima entre dos

puntos del objeto para que se puedan visualizar como dos puntos separados. El poder de resolución

de un objetivo es el responsable de la calidad, claridad, nitidez y fineza detallada de la imagen, y

depende de la longitud de onda (λ) del haz de luz utilizado y de la apertura numérica del objetivo

empleado. El máximo poder de resolución en un microscopio de luz emitida es de 0.2 μm, por lo

que se requiere de una amplificación entre 1000-1400x, mientras que el poder de resolución del ojo

humano es de aproximadamente 0.2 mm. Para aprovechar esta ventaja de los microscopios, se han

desarrollado técnicas tintoriales que destacan las características morfológicas de los

microorganismos (Keller PJ. 2013).

Según Madison B. (2001), existe una gran variedad de tinciones que pueden ser aplicadas dentro

del campo de la microbiología.

Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a células, tejidos, fibras, etcétera,

químicamente, el colorante está constituido de un componente cromóforo y un auxocromo. El

cromóforo es todo grupo aislado, covalente e insaturado, que tiene una absorción característica en

la región ultravioleta o visible; dicho de otra forma, es la capacidad que tiene la molécula para que

sus electrones absorban energía o luz visible, se exciten y emitan diversos colores de acuerdo con

la longitud de emitida como resultado del cambio en el nivel energético (Fung D. 1998)

Según Ronay V. (2011), afirma que, aunque los microorganismos vivos se pueden observar

directamente en fresco al microscopio óptico, la mayoría de las veces es necesario teñirlos para que,

por medio del uso de colorantes, sea mucho más fácil su identificación;6 además, la presencia de

ciertas estructuras, así como su reacción a determinadas técnicas, nos permite clasificar a las

bacterias. Así pues, los colorantes tienen las siguientes funciones:

- Permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes.

- Revelan su forma y tamaño.

- Muestran la presencia de estructuras internas y externas.

- Producen reacciones químicas específicas.

El control de calidad de los métodos tintoriales es importante, ya que así se asegura que la

preparación de la muestra haya sido adecuada, el método físico con mayor utilización en

microbiología es el calor seco, que consiste en exponer directamente la laminilla a la flama del

mechero, con esto se logra detener los procesos vitales de las células y los microorganismos para

una mejor visualización.

 MATERIALES Y METODOS

Para la presente práctica se tuvo que poner mucha atención al docente encargado del

área, quien fue el Ingeniero Zady Casillo. Quien nos dios la información detallada de la

práctica a realizar, así como los materiales a usar.

Los materiales que se usaron en esta práctica fueron los siguientes:

- Microscopio optivo

- Laminilla de Porta obejetos

- Cubre objetos

- Agua estancada

- Pipeta pauster

- Mechero

- Azul de metileno

- Lugol

- Agua destilada

- Mondadientes

Posteriormente de alistar y tener los materiales completos, se procedió con la práctica, el

constó de tres fases

Primera fase.

Montaje en vivo.

En esta primera fase procedió a tomar una gota de la muestra, el cual fue puesto

directamente en el portaobjetos.
 Seguidamente se puso el cubreobjetos de una forma inclinada para un buen montaje de

la muestra, para esto se dispuso a agar la muestra con la mano derecha y el cubreobjetos

con la otra mano, se hizo todo esto para tener un mejor resultado.
 Seguidamente se prosiguió a poner la muestra en el microscopio para su posterior

visualización.

Finalmente se procedió ver en el microscopio la muestra de agua estancada, esta

visualización de vio en diferentes resoluciones de acercamiento, se miro en 4X, 10X y 40x.

Teniendo cada una diferentes vistas en vivo.

4X Panoramico

PTL (Potencia Total del Lente)

P.T.L.: 400 X

Descripción:

En esta primera vista directa, solo se

podía ver unos puntos muy pequeños,

algunos se movían, pero no se podía distir

muy bien que eran.

10 X Mediano Aumento

PTL (Potencia Total del Lente)

P.T.L.: 1000 X

Descripción:

En esta vista directa, se podía ver

algunas bacterias pequeñas, casi todas se

movían de rápidamente de un lugar a otro,

pareciera que estuviesen nadando, alguas

desaparecían rápidamente y otras giraban en

su mismo lugar, también se pudo ver algunas algas de menor tamaño , pero en este punto

no se podía distinguir muy bien que eran algunos organismos de color oscuro.
40X Mayor Aumento

PTL (Potencia Total del Lente)

P.T.L.: 4000 X

Descripción:

En esta vista directa, se podían ver mucho

mejor a los microorganismos que habitan en

dicha muestra de agua estancada, se podía ver

claramente sus formas y se podía distinguir los

microrganismos, se lograba ver las diferencias

entre ellos, ya que sus movimientos eran muy diferentes, algunos de trasladaban

rápidamente de un lugar a otro, mientras que otros solo giraban en un determinado lugar,

otros iban en línea casi recta. Con este mayor aumente se pudo ver mas con mas claridad a

los diferentes microrganismos.

Segunda fase.

Fijación de muestras

Para este proceso, se dispuso usar dos muestras diferentes, unos fue tomada del agua

estancada y la otra de la secrecion dental, la primera muestras que es del agua estancada se

suguió en siguiente procedimiento

En primer lugar se tomó una pequeña muestra (cual llamaremos M1) y se pudo en el

portaobjetos, seguidamente fue exparcida con la ayuda del mondadiente quedando de una

forma uniforme en la superficie del portaobjetos.

 Seguidamente se dejo secar al ambiente por unos minutos, despues aue finalizo el

secado, se procedio a hacer la fijacicion, para lo cual el portaobjetos con la muestra M1 se

llevo al mechero y se paso 3 veces por encima de llama de fuego

Quedando asi los microorganismo fijos en este portaobjetos.

Para la muestra M2 (secreción dental), se tomo un mondadiente el cual se rozó de forma

circular en los dientes y se puso a esparcirlo en el portaobjetos con la ayuda de una

pequeñísima gota de agua destilada.

 Seguidamente se hizo secar al ambiente, después que fue secada se procedio también a

hacer la fijación de muestra mediante el pase del portaobjetos al fuego directo del mechero.

Teniendo así nuestra muestra M 2 lista para hacer su respectiva tinción.

Segunda fase.

Tinción simple

Para este proceso, se usó los colorantes de Azul de Metileno y el Lugol, se procedio a

dejar caer a las muestras estos colorantes respectivamente.

 Para la muestra M 1 se usó el Azul de metileno y para la muestra M 2 se utilizó el

Lugol, a ambas muestras se les dejo caer unas gotas de colorante y esta se dejo puesto en un

lugar seguro durante un minuto

Después de dejarlos durante un minuto se procedió a lavar las muestras de una forma

inclina para que el agua no cayese de forma directa y esta no pueda ser alterado por la caída

del agua.
Después del lavado de ambas muestras, se siguió con el secado para así pode poner la

muestra en el microscopio, este secado fue necesario para no dañar los instrumentos.

Finalmente se puso una gota de agua en cada muestra para un mejor montaje que nos

permita ver con mas claridad los microrganismos fijados en el portaobjetos

Una vez teniendo ya listas las dos muestras se procedió a mirar en el microscopio con los

diferentes lentes de aumento.

PARA M1

4X Panoramico M 1

PTL (Potencia Total del Lente)

P.T.L.: 400 X

Descripción:

En esta vista de la muestra M1 no se

puede ver con mucha clarita, solo se

pudieron ver unos puntitos de color azul

10 X Mediano Aumento M 1

PTL (Potencia Total del Lente)

P.T.L.: 1000 X

Descripción:

En esta vista directa, se puedo ver

algunas bacterias pintadas de color azul,

estas no tenían movimiento, algunos no

estaban con la respectiva tinción, no se

podía diferenciar unas bacterias de otras

40X Mayor Aumento M 1

PTL (Potencia Total del Lente)

P.T.L.: 4000 X

Descripción:

En esta vista directa, se pudo ver mucho

mejor a los microorganismos que estaban

fijados en dicha muestra de agua estancada,

no se podía ver claramente sus formas y

tampoco se podía distinguir los

microrganismos, ya que al parecer la fijación de había alterado su forma de cada uno de los

microrganismos, se lograba ver las diferencias entre ellos solamente por la notación de su

color, ya que no tenían movimientos.

PARA M 2

4X Panoramico M 2

PTL (Potencia Total del Lente)

P.T.L.: 400 X

Descripción:

En esta vista de la muestra M2 solo se

logra divisar alguno puntos de color naranja

claro, estos son puntitos que no tienen

movimiento y solo se ven esos puntos y no

hay otro microrganismo de tamaño más

grande que una bacteria

10 X Mediano Aumento M 2

PTL (Potencia Total del Lente)

P.T.L.: 1000 X

Descripción:

En este proceso de mediano aumento se

pudo notar considerablemente como las

bacterias estaban coloradas de un color

naranja, y estas no mostraban movimiento alguno teniendo así una mejor vista de las

bacterias de la muestra M2.

40X Mayor Aumento M 2

PTL (Potencia Total del Lente)

P.T.L.: 4000 X

Descripción:

En este ultimo procedimiento, la muestra

M2 se vio con un 40x teniendo así una

mejor vista de las bacterias encontradas y

fijadas en el portaobjetos, estas no tenían

ninguna clase de movimientos, el algunos

lugares había más tinción que en otras, por lo que se propone que la extensión debió ser

mas cuidadosa.
 RESULTADOS

Se pudo ver a los microrganismos de la muestra de agua estancada, estos

microrganismos eran bastantes, tenían un movimiento rápido y se deslizaban con gran

facilidad de un lugar a otro.

Cada observación a diferencia distancia, nos dio una mejor vista, ya que nos acerca cada

vez más cerca la imagen, teniendo así una vista sorprendente

Las coloración obtenidas por las diferentes tinciones nos ayudo de forma positiva en la

diferenciación de algunos microrganismos, lo que nos llevaría a un mejor estudio estos, ya

que no tenía movimiento pudiéndolos visualizarlos más claramente a cada uno de ellos.

DISCUCIONES

No se puso pudo ver a 100 x ya que no se contaba con los materiales para dicho

procedimiento.

La fijación de las muestras, los cuales fueron pasados por el mechero de alcohol no fueron

las adecuadas, ya que su llama de fuego era luminosa y esto dejaba una mancha en el

portaobjetos al momento de pasar por fuego, alterando así de una forma a los resultados de

las muestras
 CONCLUSION

Si se pudo aprender las técnicas de preparación, fijación y coloración le las muestras para

el estudio de los microrganismos

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Decré D, Barbut F, Petit JC.2000. Role of the microbiology laboratory in the diagnosis of
nosocomial diarrhea. Pathol Biol (París). 48: 733-744.

2. Keller PJ. 2013. Imaging morphogenesis: technological advances and biological insights. Science.
340: 123-168.

3. Madison BM. 2001. Application of stains in clinical microbiology. Biotech Histochem; 76: 119-
125.

4. Luis SBM, Altava B. 1997. Introducción a la química orgánica. Universitat Jaume..

5. Fung DC, Theriot JA. 1998. Imaging techniques in microbiology. Curr Opin Microbiol; 1: 346-351.

6. Ronay V, Attin T. 2011. Black stain –a review. Oral Health Prev Dent; 9: 37-45.

7. Guarner J, Brandt ME. 2011. Histopathologic diagnosis of fungal infections in the 21st century.
Clin Microbiol Rev; 24: 247-280.

8. Calvo GA, Esteban RFJ, Montuenga F. 2009. Técnicas en histología y biología celular. 2nd ed.
Madrid Spain: Elsevier.