Facultad de Ciencias Exactas Químicas Y Naturales – UNAM.

Maestría en Tecnología de los Alimentos

Prof. Adjunta: Dra. María Alicia Martos
JTP. Bqca Mgter Emilce Roxana Zubreski
Auxiliar docente de Primera Dra. Ana Paula Butiuk

TRABAJO PRÁCTICO
CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO – CULTIVO BATCH

1. OBJETIVOS
 Estudiar un proceso discontinuo, donde el objetivo será la producción de biomasa.
 Analizar el desarrollo del microorganismo desde su siembra hasta el agotamiento del medio,
midiendo la evolución de la concentración celular (x) en función del tiempo.
 Determinar los parámetros de crecimiento.
 Poner de manifiesto el efecto de los componentes del medio de cultivo sobre el crecimiento
celular.

2. FUNDAMENTOS TEORICOS

2.1. Curva de crecimiento microbiano

El cultivo discontinuo o cultivo batch es el método de cultivo más simple, consiste en un recipiente
cerrado en el que no existe aporte de nutrientes ni egreso de productos.
Cuando se siembran microorganismos en un medio de cultivo adecuado, la concentración de biomasa
(x gcel.secas/l) aumenta, empleando los nutrientes que le aporta el medio de cultivo para producir nuevas
células. Este proceso continúa hasta que algún nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato
limitante), se produce la acumulación de alguna sustancia inhibidora formada por los propios
microorganismos, etc. el crecimiento se detiene y finaliza el batch.
La evolución del cultivo con el tiempo sigue una curva típica denominada “curva de crecimiento
microbiano”. Los sucesos que tienen lugar durante la misma pueden separarse en cuatro fases (Fig. 1).

1
 Figura 1: Curva de crecimiento microbiano

Fase lag o fase de latencia:

El crecimiento del microorganismo no comienza inmediatamente después de la inoculación del medio
de cultivo, necesita un período de adaptación a las condiciones de cultivo, denominado fase lag o fase
de latencia. Durante este período no hay división celular pero sí aumento de la masa individual de los
microorganismos. La duración de esta etapa depende de la cantidad inicial de inóculo, edad y estado
fisiológico de las células.
La duración de la fase de latencia depende especialmente del cultivo previo y de la edad del inóculo. Si
el inóculo procede de un cultivo en fase estacionaria de crecimiento, las células tienen que alcanzar las
nuevas condiciones de crecimiento mediante la síntesis de RNA, ribosomas y enzimas. Si la fuente de
carbono y energía del medio de cultivo son distintas de las del cultivo previo, la adaptación a las
nuevas condiciones se halla, generalmente, ligada a una síntesis “de novo” de enzimas que no eran
necesarias en el otro cultivo y que por lo tanto no habían sido sintetizadas. La formación de esas
enzimas nuevas es inducida por el nuevo sustrato.
Para acortar la fase lag, el inóculo debe ser tomado de la fase logarítmica y ser transferido a
condiciones lo mas semejante posibles a las que se encontraba.

Fase de crecimiento exponencial:

Finalizada la fase lag, la concentración de biomasa (x) comienza a aumentar en forma lenta y luego
más rápidamente, hasta llegar a una etapa en la cual las células crecen a una velocidad específica
máxima y constante (m). Esta etapa se denomina fase logarítmica o fase exponencial y representa el

2
mayor potencial reproductivo de la célula. Al final de esta fase se alcanza la máxima concentración
microbiana ( xf = xmax).
La fase exponencial o logarítmica de crecimiento se caracteriza por la constancia de la velocidad de
división que es una medida específica de cada especie.

Fase estacionaria:
Luego de la fase exponencial hay un rápido período de desaceleración causada por el agotamiento de
algún nutriente (el sustrato limitante) o por acumulación de inhibidores y por lo tanto  tiende a 0, se
entra en la llamada fase estacionaria.
dx
En esta fase el crecimiento se detiene,  = 0 y por lo tanto rx = = 0
dt
En la fase estacionaria aún pueden utilizarse los productos de reserva., sólo las células muy sensibles
mueren instantáneamente. Mientras las células puedan seguir obteniendo la energía necesaria para su
mantenimiento, permanecerán viables durante un período relativamente largo.

Fase de declinación o muerte:

En esta última etapa, la concentración celular disminuye como resultado de la escasez de reservas de
energía o por autolisis.
Al igual que el crecimiento, la muerte de las células es constante y en un gráfico semilogarítmico esta
fase se representa a través de una línea recta.

2.3. Parámetros que caracterizan el crecimiento de un cultivo

El conocimiento de la cinética de crecimiento y de la producción de metabolitos resulta fundamental
en el tratamiento cuantitativo de los procesos biotecnológicos ya que permite predecir el curso de una
fermentación, evaluar las velocidades, el rendimiento y la productividad. El conocimiento de estos
parámetros permite optimizar el proceso productivo.

2.3.1 Velocidad específica de crecimiento máxima (m)

A partir del balance de biomasa en un reactor batch se obtiene:

dx (1)
rx = =µ.x
dt

3
Siendo:

dx
= velocidad de crecimiento microbiano (g/l.h)
dt

µ= velocidad específica de crecimiento (representa la velocidad de crecimiento por

unidad de biomasa. (seg-1)
x = biomasa (gcel.secas/l)

Suponiendo que no se forma producto y que la relación entre  y s puede ser representada por la
ecuación de Monod surge:

dx s (2)
 m x
dt ks  s

µm = velocidad específica de crecimiento máxima

ks = constante de saturación, da una idea de la afinidad del microorganismo por el sustrato (a menor k s,
mayor afinidad).

Al principio del cultivo batch, todos los nutrientes están en exceso, aún el sustrato limitante entonces s
>> ks por lo tanto para la fase exponencial, la ec. 2 se reduce a:

(3)
dx
rx = = m . x
dt

Es decir que durante la fase exponencial, la velocidad de crecimiento (rx) puede describirse por una
ecuación de primer orden, considerando que en esta fase el sustrato limitante está en exceso y el
crecimiento se llevará a cabo con el máximo valor de  posible (m = cte.).
Por lo tanto, durante la fase exponencial, la velocidad específica de crecimiento es constante y máxima
en las condiciones que se opera, se denomina entonces µ max = velocidad específica de crecimiento
máxima.

4
Integrando la ecuación 3 y suponiendo que a t = 0, x =x0 se obtiene:

ln x – ln x0 = m. t (4)

O bien:

xf = x0 . em.t (5)

Por lo tanto en esta fase la concentración de biomasa aumenta exponencialmente y también los hace rx,
ya que reemplazando le ec. 5 en la 3 se obtiene:

dx
rx = = m . x0 . em .t (6)
dt

Representando el logaritmo natural de la concentración de células frente al tiempo (ec. 4) se obtiene

una línea recta cuya pendiente es µm (la velocidad específica de crecimiento) y ordenada al origen ln
x0.
Si antes de la fase exponencial se presenta fase lag, se debe corregir la ec. 4, lo que consiste en restarle
el tiempo transcurrido hasta que comienza efectivamente el crecimiento (tlag), correspondiente al
período lag.

(7)
ln x – ln x0 = m. (t - tlag)

Las ecuaciones 4 y 5 no tienen en cuenta que el crecimiento provoca agotamiento de nutrientes y la

acumulación de productos tóxicos.

A medida que transcurre el tiempo el sustrato limitante (s) va disminuyendo y por lo tanto rx, hasta
que en la fase estacionaria: s = 0 y rx = 0.

2.3.2. Tiempo de duplicación o de generación (tg)

Tiempo de duplicación es el tiempo necesario para que la biomasa se duplique.
Considerando x= 2x0 en la ecuación 4 se obtiene:

5
 ln 2
ln 2 x0 = ln x0 + µm . td td = ( 8)
m

2.3.3. Cálculo del coeficiente de rendimiento

El coeficiente de rendimiento se define como la cantidad de biomasa producida o de producto formado
por unidad de masa de sustrato limitante consumido.

(9)
x x  x0
Yx/s =  (gx/gs)
s s  s0

Siendo x y s la concentración de biomasa y sustrato (g/l) respectivamente.

2.3.4. Cálculo de la máxima concentración de biomasa

A partir de la ecuación 4 y considerando que x= xmax cuando t= tf se obtiene:

ln xmax = ln x0 + µm . tf xmax = anti log ln xmax

2.4. Métodos para medir el crecimiento microbiano

2.4.1. Mediante determinación del número de células

Recuento microscópico directo:
Se utilizan cámaras de recuento especiales (Neubauer, Petroff-Hausser).
Son portaobjetos excavados de volumen perfectamente conocido cuando se sella herméticamente con
cubreobjetos resistentes.
La suspensión microbiana se coloca en la cavidad cuadriculada de dimensiones conocidas y se tapa
con el cubre objeto. Como se conoce el área de las cuadrículas y la altura de la cámara de recuento, el
volumen ocupado por la suspensión en cada cuadrícula queda determinado. Por lo tanto para obtener el
número de microorganismos por ml de suspensión, se requiere contar el número de organismos en
varias cuadrículas, calcular la cifra media de recuento por cuadrícula y multiplicar por el factor de
conversión correspondiente.

6
 Limitaciones: Poco sensible, se requiere una concentración de 107 cel/ml, o más para que se
pueda observar una célula en el campo microscópico. Poco práctico para una gran cantidad de
muestras. Requiere tiempo y habilidad. Se cuentan tanto células vivas como muertas
(recuento total).
Ventajas: rápido y poco material implicado.

Método del Recuento en Placa:

Se basa en la capacidad de una célula viable de formar una colonia en un medio de cultivo adecuado
Standard (PCA). Por lo tanto se cuentan colonias, cada una proviene de una sola célula viable.
(Célula viable: capaz de dividirse y formar células hijas.)
a) Método de extensión en placa (o en superficie):0,1 ml de la suspensión celular se extiende sobre la
superficie de la placa usando una espátula de Drigalski. La placa se incuba y se cuentan las colonias.
b) Método de vertido en placa (en volumen): 1 ml de la suspensión en la placa y se agrega el agar
fundido a 45 ºC.

Se cuentan aquellas placas que tengan entre de colonias: 30 a 300 col./placa.

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La técnica en placa requiere la dilución previa de la muestra, para que el número de colonias que se
desarrollen en la placa sea del orden aproximado de 30 a 300 colonias/placa.

Ventajas: Elevada sensibilidad, se pueden contar muestras con pocas células. Determina sólo
microorganismos viables.
Desventajas: Las colonias deben provenir de 1 sola célula (problemas con microorganismos que dan
grumos o cadenas). Precisa distintos medios para diferentes microorganismos.
Método del NMP
Se efectúan diluciones decimales de la población inicial, las que se incuban a temperatura adecuada en
tubos conteniendo medios de cultivos líquidos standards. Se observa el desarrollo de las distintas
diluciones.
Los tubos que contengan células se observará desarrollo y se pondrán turbios.
La proporción de tubos inoculados que muestran crecimiento es una medida de probabilidad, se
utilizan tablas estadísticas.

2.4.2. Medida de la masa celular

Determinación del peso seco:

A partir de una suspensión celular, se separan las células por centrifugación, se lavan y secan en
estufa hasta peso constante.
Limitaciones: se precisan de 1.109 a 5 .109 cel. para formar 1 mg de sustancia seca. Tedioso, lleva
mucho tiempo.

Medida de la turbidez de una suspensión celular:

Es un método óptico y representa la técnica más rápida para medir la masa celular de los
microorganismos unicelulares.
Esta técnica se basa en el hecho de que pequeñas partículas difractan (o dispersan) la luz incidente en
forma proporcional a su concentración (dentro de ciertos límites).
Cuando un haz de luz pasa a través de una suspensión celular, la reducción de la cantidad de luz
transmitida como consecuencia de la difracción es una medida de la densidad celular. La intensidad de
luz transmitida es por lo tanto inversamente proporcional al número de células presentes y se mide
habitualmente con un espectrofotómetro (Figura 2) que mide en unidades de absorbancia. Absorbancia

8
(A) se define como el logaritmo de la relación entre la intensidad de luz incidente en la suspensión (I 0)
y la luz transmitida por la suspensión (I): Este método requiere una curva estándar (Abs. vs x).

A = log I0 / I

Ventajas: Preciso, dentro de ciertos límites, rápidas y fáciles de utilizar.

Determinación de la concentración celular por valoración del contenido de nitrógeno

Entre los principales constituyentes del material celular se encuentran las proteínas y como el
nitrógeno es un componente fundamental de estas, puede estimarse la población de células en función
del contenido de nitrógeno en las células. El contenido de nitrógeno en la célula es del 12 % en peso
seco.
Para esta determinación, hay que recoger las células, lavarlas para eliminar el medio y realizar un
análisis químico cuantitativo de nitrógeno. Las determinaciones del nitrógeno microbiano son
laboriosas y se deben efectuar sobre muestras libres de otros compuestos nitrogenados extraños.

3. TRABAJO EXPERIMENTAL

4.1. Microorganismo: Saccharomyces cerevisiae

4.2. Medio de cultivo:

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4.2.1. Composición

Componentes Composición (g/l)

PO4H2K 3
PO4HK2 2
SO4Mg.7H2O 0,5
SO4(NH4)2 1,5
Extracto de levadura 1
Glucosa 5

4.2.2. Preparación Medio 1

Solución A: Solución de glucosa (10 X) 100 ml:

Preparar 100 ml de una solución de glucosa de 50 g/l (10 x), pH: 7. Esterilizar 15 min – 1 atm.
Usar 10 ml para 100 ml de medio.

Solución B: Solución de fosfatos (5 X) 100 ml:

PO4H2K ----------- 1,5 g
PO4HK2 ----------- 1,0 g
Agua dest. --------- 100 ml

Ajustar pH a 5,0. Esterilizar 15 min – 1 atm. Usar 20 ml para 100 ml de medio.

Solución C: Solución otras sales y extracto de levadura (5 X) 100 ml:

SO4Mg.7H2O ----------- 0,25 g
SO4(NH4)2 ----------- 0,75 g
Ext. de levadura -------- 0,5 g
Agua destilada --------- 100 ml
Ajustar pH a 5,0. Esterilizar 15 min – 1 atm. Usar 20 ml para 100 ml de medio.

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Medio completo
Soluciones Concentración Precultivo (50 ml) Fermentación
Sn. madre (100 ml)
Sn A (glucosa) 10 x 5 ml 10 ml
Sn B (fosfatos) 5X 10 ml 20 ml
Sn C (sales y ext. lev.) 5X 10 ml 20 ml
Agua destilada 20 ml 30 ml
Volumen total 45 ml 80 ml

Precultivo: Mezclar las soluciones en un Erlenmeyer de 250 ml en forma aséptica, agregando en total
45 ml de medio completo.
Fermentación: Mezclar las soluciones en un Erlenmeyer de 500 ml en forma aséptica, agregando en
total 90 ml de medio completo.

4.2.3. Preparación Medio 2

A los efectos de estudiar el efecto del agregado de mayor concentración de la FCE sobre el
crecimiento microbiano se preparará un medio con 10 g/l de glucosa.

Solución A: Ídem medio 1.

Solución B: Ídem medio 1
Solución C: Ídem medio 1
Medio completo
Soluciones Concentración Precultivo (50 ml) Fermentación (100 ml)
sn. madre
Sn A (glucosa) 10 x 10 ml 20 ml
Sn B (fosfatos) 5X 10 ml 20 ml
Sn C (sales y 5X 10 ml 20 ml
ext. lev.)
Agua destilada 15 ml 20 ml
Volumen total 45 ml 80 ml

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4.2.4. Preparación Medio 3
Se estudiará el crecimiento microbiano utilizando otra fuente de nitrógeno como urea. Por lo cual el
sulfato de amonio se reemplazará por urea, considerando una cantidad equivalente de nitrógeno.

SO4(NH4)2 PM = 132 g 21,2 % de nitrógeno

Por lo tanto 1,5 g/l de sulfato de amonio aportan 0,318 g/l de N2
Urea (NH2)2CO PM = 62 g 45,16 % de N2
Por lo tanto se necesitarán 0,7 g/l de urea para obtener 0,318 g/l de N2 en el medio de cultivo.

Solución A: Ídem medio 1

Solución B: Ídem medio 1

Solución D: Solución otras sales (5 X) 100 ml:

SO4Mg.7H2O --------- 0,25 g

Ext. de levadura -------- 0,5 g
Agua destilada --------- 100 ml

Ajustar pH a 5,0. Esterilizar 15 min – 1 atm. Usar 20 ml para 100 ml de medio.

Solución E: Solución urea (10 X = 7 g/l) 50 ml:

Urea --------- 0,7 g
Agua dest. --------- 100 ml

Ajustar pH a 5,0. Esterilizar por filtración, utilizando un filtro de 0,22 m. Usar 10 ml para 100 ml de
medio

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Medio completo
Soluciones Concentración Precultivo (50 ml) Fermentación (100 ml)
sn. madre
Sn A (glucosa) 10 x 5 ml 10 ml
Sn B (fosfatos) 5x 10 ml 20 ml
Sn D (sales) 5x 10 ml 20 ml
Sn E (urea) 10 x 5 ml 10 ml
Agua destilada 15 ml 20 ml
Volumen total 45 ml 80 ml

Precultivo: Mezclar las soluciones en un Erlenmeyer de 250 ml en forma aséptica.

Fermentación: Mezclar las soluciones en un Erlenmeyer de 250 ml en forma aséptica.

Fundamento: Los carbohidratos se deben esterilizar en forma separada de los compuestos nitrogenados
orgánicos, a los efectos de evitar la reacción de Maillard entre los grupos carbonilos de los azúcares
con los grupos amino de las proteínas, aminoácidos, etc., lo que conduciría a la formación de
productos de condensación y por lo tanto a la inactivación de significativas cantidades de
carbohidratos y nitrógeno amínico.
Además es importante autoclavar las sales de calcio y magnesio aparte de los fosfatos a los efectos de
evitar pérdidas importantes de magnesio, potasio, amonio, sodio y fosfatos por precipitación de sales
poco solubles como MgNH4PO4, MgKPO4 y MgNaPO4.

4.2. Precultivo
A partir de una estría joven de la levadura en estudio en agar YM preparar una suspensión de células
en 30 ml de agua destilada, ajustando de manera de obtener una densidad óptica de 0,9 a 620 nm.
Agregar 5 ml del inóculo a los 45 ml de medio para precultivo. Incubar el Erlenmeyer a 30 ºC en baño
termostatizado rotatorio a 180 rpm (New Brunswick), durante 24 h.

4.3. Fermentación
Agregar 20 ml del pre cultivo a un Erlenmeyer de 500 ml, conteniendo 90 ml de medio de
fermentación. Incubar el Erlenmeyer a 30 ºC, en baño termostatizado rotatorio a 180 rpm. Extraer
muestras en forma aséptica (15 ml) cada media hora. Medir biomasa por densidad óptica a 620 nm y
glucosa residual, según se describen en los apartados 3.4.1 y 3.4.2 respectivamente.

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Representar los datos de glucosa residual y biomasa en función del tiempo. El momento de la
inoculación se considera tiempo cero.

4.4. Determinaciones analíticas

4.4.1. Biomasa
El crecimiento microbiano (gcélula seca/l) se determina por mediciones de densidad óptica (DO 620 nm)
y utilizando la curva de calibración previamente construida (DO vs biomasa) se obtienen los valores de
biomasa (g/l) correspondientes.
Procedimiento: Para cada tiempo, se extraen 10 ml del caldo de fermentación, se efectúan diluciones
(1/2, ¼, 1/8, etc.), se lee el valor de D.O a 620 nm. Se elige el valor de D.O. entre 0,3 – 0,7 y se
obtiene la concentración de biomasa expresada en g/l.

Construcción de la curva de calibración (DO vs biomasa):

a) Determinación del peso seco: se toman 10 ml de caldo de fermentación, se centrifugan a 4000 rpm,
10 min, se elimina el sobrenadante, la biomasa se lava con agua destilada y se vuelve a centrifugar,
este procedimiento se repite 3 veces. La biomasa se resuspende con agua destilada, se trasvasa a
vasitos de aluminio previamente tarados para la determinación de peso seco a 80 ºC.
b) Determinación de los valores de Absorbancia: Se toman otros 10 ml de caldo de fermentación, se
realizan diluciones (1/2, 1/4, 1/8, etc.) se lee el valor de D.O. a 620 nm de cada una de las diluciones.
Estos valores se relacionaron con los valores de peso seco correspondiente a cada dilución y se
construye la curva de calibración (D.O. vs peso seco).

4.4.2. Determinación de Glucosa

Se determina por el método de glucosa oxidasa-peroxidasa (Glicemia, Wiener, Argentina).
Reactivo: Glicemia enzimática. Laboratorio Wiener.
Fundamento del método: La glucosa es oxidada enzimáticamente por la glucosa oxidasa (GOD) a
ácido glucónico y agua oxigenada. Esta última en presencia de peroxidasa (POD) produce la
copulación oxidativa del fenol con la 4-aminofenazona (4-AF), dando lugar a la formación de un
cromógeno rojo cereza con absorbancia máxima a 505 nm.

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 GOD
Glucosa + H2O ----------- ácido glucónico + H2O2
2 H2O2 + 4-AF + fenol ------- 4 p-benzoquinona-monoimino fenazona + 4 H2O

Procedimiento:
En tres tubos de ensayos marcados B (blanco), S (standard), D (desconocido), colocar:

B S D
Standard 20 µml
Muestra 20 µl
React. de trabajo 2 ml 2 ml 2 ml

Incubar los tubos a 37 ºC, durante 10 min. Leer en espectrofotómetro a 505 nm.

Cálculos:
Concentración de glucosa (g/l) = D* f
f = 1,00 (g/l)/ S
D= absorbancia de la muestra desconocida
S = absorbancia del standard
f = valor de concentración que le corresponde a una unidad de absorbancia.

4.5. Obtención de los parámetros cinéticos:

Con los datos obtenidos se elabora la siguiente tabla:

Tiempo Dilución Dens. óptica Biomasa (g/l) Ln x Glucosa (g/l)

(x)

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  Graficar ln x vs tiempo.
 Graficar glucosa residual vs tiempo.
 Calcular m
 Calcular Yx/s

4. CUESTIONARIO:

a) En el medio de cultivo usado en el práctico de cinética, indique lo siguiente:

 La fuente de carbono y energía y la fuente de nitrógeno.
 Qué función cumple el agregado de extracto de levadura en el medio de cultivo.

b) Para la preparación del medio de cultivo, se prepararon diferentes soluciones que contenían los
distintos componentes. Explique qué componentes tenían cada una de las soluciones preparadas y
cómo se esterilizaron cada una de ellas. ¿Qué efectos indeseables se tendrían si no se prepararan y
esterilizaran las distintas soluciones por separado?

c) ¿De qué manera se regula el pH durante el proceso?

d) ¿Con qué objeto se realiza el precultivo?

e) ¿Por qué los cultivos se deben realizar con agitación (en un agitador rotatorio)? ¿Qué ocurriría si los
Erlenmeyers se colocan en estufas de cultivo sin agitación?

f) Si durante la fermentación se usara menor cantidad de glucosa en el medio de cultivo que la que se
utilizó en el TP. ¿Cómo debería ser el tiempo del proceso?

g) Si la fermentación se llevara a acabo a una temperatura menor a 30°C. ¿Qué efecto tendría sobre la
curva de crecimiento?

h) Determine el rendimiento máximo teórico de producción de biomasa a partir de la glucosa. El

rendimiento obtenido experimentalmente en el TP, ¿cuánto representó el máximo teórico?

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PARA LA REALIZACIÓN DEL TRABAJO PRÁCTICO LOS ALUMNOS DEBERÁN
TRAER:

 Guantes de látex
 Barbijo
 Chaquetilla o guardapolvo
 Cabello recogido.

Por grupo:

 1 Marcador para vidrio

 1 Alcohol 96
 1 paquete de algodón mediano.

BIBLIOGRAFÍA
 Brock T, Madigan T, Martinko J, Parker J. Biology of microorganisms. 7ª Ed. New
Jersey: Prentice Hall. 1994.
 Ertola, R; Yantorno, O.; Mignone, C. Microbiología Industrial. Secretaría general de la
Organización de los Estados Americanos. 1994.
 Scraag, A. Biotecnología para ingenieros: Sistemas biológicos en procesos
tecnológicos. Noriega Editores. 1996.
 Stanier y otros. The microbial world. Prentice – Hall, 1986
 Trevan, M.D. y otros. Biotecnología: Principios biológicos. Editorial Acribia.1990.

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