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Memorias del XXXVII Encuentro Nacional de la AMIDIQ

3 al 6 de Mayo de 2016, Puerto Vallarta, Jalisco, México

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN PRELIMINAR Aspergillus niger PARA LA
BIOLIXIVIACION DE PIROLUSITA
Susana Citlaly Gaucín Gutiérrez, Cuauhtémoc Ulises Moreno Medina, Samuel Hernandez Rodarte, Hamlet Avilés Arnaut,
Hiram Medrano Roldan
Maestría en Sistemas Ambientales, Instituto Tecnológico de Durango, Felipe Pescador 1803 Ote, Nueva Vizcaya, Durango,
Dgo. 34080, MÉXICO, susana_gaucin@hotmail.com ,

Resumen
En la biolixiviación de minerales el empleo de microorganismos nativos de material de mina es
fundamental debido a la diversidad microbiológica que puede encontrarse, los microorganismos
deseados para la recuperación de metales pueden crecer en condiciones compatibles con los procesos de
extracción. El Aspergillus niger es un microorganismo eukaryota del reino fungi el cual tiene como
peculiaridad la generación de ácidos orgánicos como metabolitos, estos metabolitos son empleados para
la lixiviación biológica indirecta de diversos metales presentes en minerales.
Este hongo crese en medios de altas concentraciones de metales y de baja disponibilidad de carbono
orgánico, crece principalmente en pH neutro sin embargo se ha podido desarrollar en pH de 2. Al aislar
este microorganismo de material de mina se empleó el medio 9K para conocer su desarrollo y
crecimiento en bajas concentraciones de carbono orgánico, bajos pH y altas concentraciones de
minerales, el crecimiento encontrado de este microrganismo fue posterior a la estimulación de muestra
de suelo la cual estaba constituida principalmente por tierra vegetal con medio 9K a pH 2 , esta muestra
después de 20 días se aisló en medio liquido por la técnica de NMP con medio 9K a pH 2 obteniendo en
la dilución directa el crecimiento más representativo del microorganismo presunto obteniendo como
hipótesis que al llegar a la fase de muerte de las bacterias reductoras de hierro y azufre presentes en la
primera etapa de la estimulación proveyeron la cantidad necesaria de carbono orgánico para que el
Aspergillus níger pueda desarrollarse.
Introducción
La pirolusita es el mineral más importante del manganeso, se le encuentra disponible como mineral de bajo grado
asociado a metaloides como el hierro, plata, zinc, oro y níquel[1].
El alto contenido de manganeso en minerales con plata no es factibles para el procesamiento de la plata
debido a los bajos niveles de recuperación de plata utilizando los métodos como la flotación,
cianuración o fundición.[2]. La biolixiviación se da por la catálisis de los microorganismos en los
minerales. Los microorganismos utilizan el mineral como fuente de energía mediante el intercambio de
electrones que se dan en las reacciones metabólicas liberando metales valiosos[3].
El Aspergillus niger es un hongo empleado en una amplia gama de lixiviación de minerales como son
Al, Cd, Cr, Cu, Zn y Mn, esto debido a que produce ácidos orgánicos los cuales son: ácido acético,
ácido cítrico, ácido oxálico, ácido fórmico, ácido fumárico, siendo el ácido cítrico el que se produce en
mayo cantidad, el cual es el principal responsable de la biooxidación de óxidos metálicos[4].
Estos ácidos excretados como metabolitos dependen de algunos factores como son: concentración de
Hierro, concentración de fuente de carbono, concentración de azucares y el pH. Sus metabolitos lixivian
los minerales subministrando iones hidronio para la acidólisis del mineral y el acomplejamiento de los
minerales formando quelatos, el principal metabolito empleado en la solubilización de metales es el
ácido cítrico, el cual es sintetizado como intermediario por la ruta metabólica de los ácidos
tricarboxilicos en la condensación del acetil-CoA [5]. La fuente de energía de este microorganismo son

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01Ca(NO 3 ) 2 . calentar en mechero durante 5 segundos dejando que hierva el colorante. niger. 0. 7H 2 O y 2g de extracto de levadura y ajustado a pH 2. esterilizado en autoclave a 120° C y 15 psi por 15 minutos de la misma manera se realizó otra prueba con medio sólidificante de agar a un pH 2 y 4.7H 2 O. niger se realizó con el medio de cultivo 9K esterilizado el cual está constituido por: 3g (NH 4 )SO 4 . esperando un color naranja como resultado positivo a la generación de ácidos. al llegar a los 10 días se tomó una porción del medio con la cepa y se procedió a inundar la superficie con fenolftaleína e identificar el cambio de coloración en la superficie. [6] Estudios realizados muestran que en condiciones de baja concentración de oxigeno el A. © 2016 Academia Mexicana de Investigación y Docencia en Ingeniería Química ISBN 978-607-95593-4-2 BIO-517 . Metodología El aislamiento del A.5g K 2 HPO 4 . Para la realización de resiembra de inoculo se realizó tinción de esporas con verde de malaquita.[4]. La técnica de tinción de esporas fue realizando un frotis de la muestra de medio sólido. Memorias del XXXVII Encuentro Nacional de la AMIDIQ 3 al 6 de Mayo de 2016. lavar con agua desionizada. El A.5 MgSO 4 .35% en 14 días. niger ha sido clasificado morfológicamente de manera sencilla el color de las hifas comienza de color claro blanco con tonalidades amarillas dentro de las primeras 50 horas de crecimiento y se tornan de color negro partiendo del centro de la colonia donde se forman las primeras esporas. Para la tinción fluorescente se realizó fijando muestra del hongo tomando una porción del medio solido fijando en porta objetos con formaldehido. Para la prueba de generación de ácidos se siguió la siguiente metodología se cultivó la cepa en medio sólido. Puerto Vallarta. lavar con agua desionizada el exceso y dejar secar. las muestra empleada para la obtención del microorganismo fue tierra vegetal de minera dedicada a la extracción de plata. posteriormente agregar naranja de acridina al 10% por 2 minutos. posteriormente agitando y transfiriendo un mililitro al siguiente tubo y así hasta llegar a una dilución en la cual según la concentración de células sea cercana a 0. para así determinar la viabilidad de aislar el A. México principalmente los compuestos sulfurados y a que los oxida directamente. el azufre y el hierro ferroso de los minerales a ácido sulfúrico y férrico. a través de acción enzimática. agregando dos gota de verde de malaquita al 5%. lavar con agua destilada y agregar 2 gotas de safranina por 2 minutos y lavar con agua desionizada y leer en el microscopio con lente de 100X en aceite de inmersión.1g KCl. Posteriormente se procesó al aislamiento en medio líquido 9K con pH 2 y por medio de la técnica de número más probable realizando diluciones hasta llegar a un blanco se realizó la inoculación del medio inoculando con 1 ml de muestra con medio 9K a el primer tubo de dilución. posteriormente leer en microscopio de fluorecencia con filtro verde. lavar por 15 segundo con solución de alcohol – acetona al 50 -50 y agregar fluoricidina al 5% por 2 minutos. Jalisco. 0. El aislamiento de cepas en medio sólido fue con medió 9K solidificado con agarosa. 14g FeSO 4 .niger las tasas de lixiviación de manganeso como pirolusita son de 93. 0. La muestra fue incubada a 30°C por 15 días en los cuales se monitoreo pH y redox con electrodo de inmersión maraca HANNA modelo HI99121. 0.

izquierda cepa después de 7 días. Al finalizar el monitoreo por 15 días se procedió a realizar el aislamiento en medio 9K líquido. Memorias del XXXVII Encuentro Nacional de la AMIDIQ 3 al 6 de Mayo de 2016. Derecha cepa a las 50hr. El crecimiento del microorganismo de presento cuando se inoculo en la fase de muerte de las bacterias la cual fue a los 17 días. Obteniéndose en la dilución directa el crecimiento de microorganismo relacionado bibliográficamente con la morfología del Aspergillus niger. niger aislada en medio sólido 9K. El crecimiento de la cepa aislada en medio sólido como se ha revisado en la bibliografía la morfología de la colonia las primeras 50 horas de crecimiento el color de las hifas es blanco a amarillento y en el centro donde comienza la concentración de esporas es donde comienza a tomar una coloración negra al llegar a los 7 días. Esta morfología es la obtenida al aislar la cepa. Puerto Vallarta. © 2016 Academia Mexicana de Investigación y Docencia en Ingeniería Química ISBN 978-607-95593-4-2 BIO-518 . Monitoreo de pH de muestra en medio 9K pH como se muestra en la Figura 1 y 2. México Resultados El monitoreo de pH y redox confirmo la actividad microbiológica de lixiviación de minerales al aumentar los valores de redox y disminución del Figura 1. sin embargo la prueba no tubo crecimiento hasta que se efectuó la prueba en medio solido con medio sólidifícante de agar a un pH 4 obteniendo el resultado mostrado en la Figura 3. Jalisco. Posible cepa de A. Figura 3. Monitoreo de redox de muestra en medio 9K Figura 2. cuando el pH del medio bajo a 4 y la concentración de bacterias activas monitoreadas al inicio descendió a una concentración de 2000 células /ml. se realizó la primer prueba sembrando la cepa en medio solido con medio gelificante de agarosa y a un pH de 2 debido a que se han reportado crecimiento de este microorganismo a pH acido.

Memorias del XXXVII Encuentro Nacional de la AMIDIQ 3 al 6 de Mayo de 2016. niger visto con microscopio de fluorescencia.. Derecha. p. 2011. la cepa aislada cambio su coloración debido a la presencia de esporas en las hifas. con fenolftaleína al inundar una porción del medio la superficie donde está fijada la sepa al medio se torna de color naranja. Gonzalez. 2013. Izquierda. 12. vol. vol. 56. 17. pp.. Mex. para el crecimiento del microorganismos el pH optimo es de 4 a 6. “R OBTENCIÓN DE MANGANESO A PARTIR DE RESIDUOS MINEROS POR MEDIO DE BIO-OXIDACIÓN FÚNGICA. pp. [4] A. B. L. 21–29.” Rev. J. C.” Rev. 6. Apl. la presencia metabolitos como son los ácidos orgánicos de esta cepa aislada serán empleados para pruebas de biolixiviación de magnesita y pirolusita. F. por lo cual se obtuvo una prueba positiva de generación de ácidos como metabolitos de la cepa aislada. 3. 2004. © 2016 Academia Mexicana de Investigación y Docencia en Ingeniería Química ISBN 978-607-95593-4-2 BIO-519 . [2] A. Ocampo . G. así como con baja cantidad de carbono orgánico pudiendo emplear microorganismos inactivos (muertos) como principal fuente de carbono para requerimientos metabólicos del hongo. 6. esporas y estructura del microorganismo aislado como se observa en la Figura 4. Ing. Figura 4. Quim. “Comparación entre 5 métodos para la extracción de ADN de Triatomíneos: su utilización en la técnica de ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD). Posible cepa de A. no. Lopez Valdivieso. S.. Jalisco. 1997. esporas. Nodarse and J. B. Reyes . Zapata Espinosa. vol. “Recuperacion De Plata En Minerales Con Alto Contenido De Manganeso. Conclusiones El Aspergillus niger puede crecer en medios de altas concentraciones de metales y bajas condiciones de humedad .5. F.” Rev. Investig. and A. Cubana Med. Trop. and A. 550. Rodríguez. Referencias [1] B. Reyes Bahena. [3] J. J. E. México A los 7 días de incubación a 30°C. 208–213. M. no. Puerto Vallarta.” no. para obtener la certeza de la presencia de esporas y el desarrollo del micelio del hongo se analizó con microscopia fluorescente realizando la fluorescencia con fluorisidina y naranja de acridina con lo cual podemos observar con detalle las hifas. “An analysis of the methabolism of Aspergillus niger groing over a solid substrate. Cuerpo del hongo Al realizar la prueba bioquímica de presencia de ácidos en el medio de cultivo.