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Universidad Nacional Del Santa

Facultad de Ingeniería
Escuela Académico Profesional de Agroindustria

A2

ASIGNATURA: INTEGRANTES:

 Laboratorio de Bioprocesos. ARDILES FALCON, Natalia E.
MORENO SÁNCHEZ, Sully R.
DOCENTE: MOZO MALCA, Vanessa J.
 Ms. Augusto Castillo Calderón. TRUJILLO ACOSTA, Mary T.
VEGA FLORES, Cely A.
CICLO: VIII

PRE - INFORME N° 03

TÍTULO: BIOCATÁLISIS ENZIMÁTICA

ÍNDICE

Pág.

I. OBJETIVOS …………………………………………………………………………………

Objetivo General…………………………………………………………………………

Objetivos Específicos……………………………………………………………………

II. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS ………………………………

III. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL…………………………………………………….

-Determinación de proteínas: método de Bradford………………………….

-Método de inmovilización de invertasa en alginato de sodio…………..

-Determinación del rango de linealidad y actividad de la enzima……..

IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES Y/O TAREAS ……………………………

V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ……………………………………………….

VI. ANEXOS ……………………………………………………………………………………..

7])de un caldo crudo libre de células de Kluyveromyces marxiamus NRRL Y- 7571 en sus formas solubles e inmovilizada.2. PRE-INFORME N°03 DEL EXPERIMENTO BIOCATÁLISIS ENZIMÁTICA I. para evaluar su comportamiento. . montar y poner en marcha el sistema mini-reactor con inulasa inmovilizada.  Inmovilizar inulasa en geles.  Diseñar.1.  Obtener el caldo enzimático de Kluyveromyces marxiamus NRRL Y- 7571  Determinar el rango de linealidad y actividad enzimática (actividades volumétrica y específica) de la enzima en el caldo crudo.  Objetivos específicos:  Preparar reactivos para obtener curvas de calibrado de DNS y proteínas. OBJETIVOS:  Objetivos generales:  Diseñar y realizar diferentes experiencias de estudios cinéticos de la enzima inulasa (2.1-β-D-fructan fructanohidrolasa [EC 3.  Determinar los parámetros cinéticos de la enzima soluble e inmovilizada.

3g/l  Matraces  Inmovilización de invertasa  Alginato de sódio al 1.1g de azul de coomassie G-250  Reactivo Bradford  Etanol al 98%  Acido fosfórico al 85%  Água destilada  Micropipetas  Pipetas  Tubos de ensayo 500 µL  Espectrofotómetro  Suero de bobino 0.5-4.0 %  Solución de CaCl2 0. MATERIALES:  Método Bradford  0.05M  Jeringa  Matraces  Mechero  Mini-reactor  Baño Maria  Cronómetro  Pipetas  Micropipeta .II.1M y 0.

 Rango de linealidad y actividad de la enzima Tubos de ensayo con tapa (4) y 2 tubos para blanco Soluciones: Solución de sustrato (2.25 ml para 4 tubos) Pipetas (3) Baño Maria Cronometro Espectrofotómetro UV Agua helada  Determinación de azucares reductos DNS  Ractivo DNS  Micropipeta  Tubos de ensayo (9)  Pipeta  Agua destilada  Rejilla  Mechero Bunsen  Agua delada  Agitador Maximix  Espectrofotometro III. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL: .9 ml por tubo) Extracto crudo enzimático (0.

desde una solución de 20g/L a 40º C y pH 4.7 (Tampón acetato de sodio 0.066 M  PM= 266 g/mol # 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 # 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑀= → 0.05 M Elaboración de preparado enzimático  Pesar 1.066 = → # 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 = 3.5%-2.  Hallando peso de Na4P2O7 para 0.053 g de Na4P2O7.96 𝑥 10−3 𝑚𝑜𝑙 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛 0.6 M  Utilizar como soporte Alginato de sodio al 1. . que libera un micromol (1 µmol) de azucares reductores por minuto.066 M en un recipiente b) Llevar a un pH 8.5 c) Agregar 20 g de levadura a un vaso de precipitación de 100 ml y cubrir con papel aluminio d) Mantener a 20°C y dejar reposar hasta el día siguiente e) Centrifugar.06 𝐿 𝑊 # 𝑑𝑒 𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 = → 𝑊 = 1. quedándonos con el sobrenadante (centrifugar 2 veces) f) Guardar el sobrenadante (preparado enzimático) hasta la siguiente semana.5% (p/v)  Usar un sistema mini-reactor enzimático por lotes agitado.Consideraciones:  Usar soluciones concentradas de sacarosa: 0.2 M – 0.053 𝑔 𝑑𝑒 Na4P2O7 𝑃𝑀 a) Agregar 60 ml de fosfato de sodio (Na4P2O7) 0.  Definición: una unidad internacional de Invertasa es aquella cantidad de enzima necesaria.

b) Añadir 5 ml de reactivo Bradford (a cada muestra) y dejar reaccionar durante 5 minutos.1 g de azul de Coomassie G-250 en 50 ml de etanol al 98%. mezclar con1 ml del preparado invertasa y cargar todo a una jeringa provista de aguja.05 M. d) La concentración se obtiene interceptando la medida de absorbancia en la curva de calibrado. dejarlos en reposo en refrigeración por 3 a 4 horas y luego lavarlos con una solución de CaCl2 0. d) Los “beads” esféricos de enzima inmovilizada. e) Empacar los “beads” dentro del minireactor. . La curva de calibrado se obtiene a partir de muestras de concentración conocida de una solución estándar de albumina suero de bovino y analizadas según este procedimiento. b) De la disolución anterior tomar 5 ml. c) Leer la absorbancia a una longitud de onda de 595 nm. contrastándola con un blanco de agua destilada de 500 µl.  MÉTODO DE INMOVILIZACIÓN DE INVERTADA EN ALGINATO DE SODIO a) Prepara una disolución de alginato de sodio al 2% y calentar a 80°C por 15 minutos y luego enfriar a 45°C.1 M. mas 100 ml de ácido fosfórico al 85% y con agua destilada aforar a un litro- Procedimiento: a) Agregar a un tubo de ensayo 500 µl de muestra convenientemente diluida. c) Con la jeringa gotear la mezcla dentro de 30 ml de solución agitada de CaCl2 0. DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS: MÉTODO DE BRADFORD Reactivo: Disolver 0.

d) Colocar la muestra en Baño Maria por 3 minutos.25 ml de extracto crudo enzimático a cada uno de los 4 tubos de ensayo y se dejó reaccionar por los tiempos requeridos por el experimento: 5. 1:4 y 1:6 según como convino.  METODOLOGÍA DE LA OBTENCIÓN DE PREPARADO ENZIMÁTICO DE LEVADURA .  DETERMINACIÓN DEL RANGO DE LINEALIDAD Y ACTIVIDAD DE LA ENZIMA Las experiencias se realizaron a diferentes diluciones del extacto crudo enzimático. El procedimiento fue el siguiente: a) Se prepararon 4 tubos de ensayo con tapa. y posteriormente almacenar hasta realizar el análisis de azucares reductores. 1:2. 15 y minutos. 1:1. rafinosa 15 g/l e inulina achicoria 10 g/l) a pH 5.5 ml de solución de sustrato a la concentración definida (concentraciones estándares de sacarosa 20 g/l. se agregó a cada uno 2. respectivamente. b) Se adiciono 0. Se graficó la concentración de producto contra el tiempo de reacción y se expresó correctamente los valores de las actividades volumétrica y especifica. e) Finalmente se hicieron las determinaciones de azucares reductores. c) Colocar los” beads” dentro del reactor e inmediatamente sacar la 1° muestra (1 ml con una micropipeta). e) Llevar a agua helada por 5 minutos.0 con tampón citrato-fosfato y se calentaron en una baño Maria a 55°C durante 2 minutos. c) La reacción se detuvo introduciendo cada tubo en baño de agua a 100°C por 3 minutos y luego puestos en agua helada. Comportamiento de un reactor por lote con enzima inmovilizada a) Preparar 45 ml de sacarosa (20 g/ml) b) Colocarlo en el reactor y dejarlo que alcance 45°C. d) Simultáneamente en otros dos tubos se hicieron los blancos para el sustrato y para la enzima. 10.

066M  Vasos precipitados  Probeta  DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES MEDIANTE EL MÉTODO DEL DNS Materiales:  Reactivo DNS  Espectrofotometro  Mechero  Agua destilada  Micropipeta  Matraces . Materiales:  Levadura seca  Fosfato de sodio a 0.

Para ello emplearemos el método de los inversos o Lineweaver – Burke. para un modelo cinético simple . La manera más adecuada de obtenerlos es por linealización de la ecuación cinética. La forma usual de determinar los parámetros cinéticos es a través de mediciones de velocidad inicial de reacción a diferentes concentraciones de sacarosa en un reactor por lote.  DISEÑAR Y MONTAR EL SISTEMA MINI-REACTOR CON INVERTASA INMOVILIZADA. Métodos de linealización para determinar parámetros cinéticos Método Eje Y Eje X Intercepto Intercepto Pendiente Eje Y Eje X Lineweaver – Burke 1/v 1/s 1/v -1/k k/V Hames s/v S k/V -k 1/v Eadie – Hofstee V v/s V v/k -k . PARA DETERMINAR LOS PARÁMETROS CINÉTICOS DE LA ENZIMA.

TABLA N°01: Detalle Técnica experimental para determinación de parámetros cinéticos N° MUESTRA Sol(A)ml Sol(B)ml Sol (C) ml Conc. pH 5. (C): Solución sustrato sacarosa.0 (B): Extracto crudo de inulasa. 1/v KAP/VAP 1/VAP -1/KAP 1/s Figura 01: Determinación de parámetros cinéticos mediante método de inversos de Lineweaver – Burke TÉCNICA EXPERIMENTAL: (A): Buffer citrato-fosfato 0. Sacarosa(g/l) 1 26 1 3 2 23 1 6 3 20 1 9 4 18 1 11 5 15 1 14 6 12 1 17 7 9 1 20 8 6 1 23 9 3 1 26 10 0 1 29 .05 M.

TABLA N°02: Datos experimentales azúcares DNS minDNS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 2 6 10 15 .

 Determinación de Azúcares Reductores Mediante DNS  Rango de Linealidad y Actividad Enzimática 10/12/2013  Determinación de los parámetros cinéticos de la Enzima Soluble  Inmovilizar Inulinasa en Geles 10/12/2013  Diseñar y montar el sistema mini-reactor con Enzima inmovilizada.  Presentación del informe final 16/01/2014 . para determinar los parámetros cinéticos de la enzima. reactivos esterilización 10/12/2013 de materiales)  Determinación de curva de calibrado de Proteínas mediante el método de Bradford  Determinación de curva de calibrado de Azúcares Reductores mediante DNS  Preparación del medio de cultivo por lote de Kluyveromyces 10/12/2013 marxianus  Obtención del preparado de enzimático en bruto de Inulinasa 10/12/2013 de levadura.  Determinación de Proteínas mediante el Método de Bradford. CRONOGRAMAS DE ACTIVIDADES Y TAREAS ACTIVIDADES FECHA  Recolección de Guía e Información 09/12/2013  Acopio de materiales: (instrumentos.IV.

PDF  ENZIMAS: QUÉ SON Y PARA QUE SIRVE. 254 – 315. ANEXOS . Escuela de Ingeniería Bioquímica. Universidad Católica de Valparaíso. Profesor Andrés Illanes Frontaura. Departamento de Biotecnología. Tecnología de Enzimas 1990.A. edit. pp.  FUSIÓN TRADUCCIONAL DE LA INVERTASA ZMINVB DE Zymomonas mobilis A UN DOMÍNIO DE UNIÓN A CELULASA. y HUBBLE J. México.A..V. QUINTEROS RAMIREZ Rodolfo. .  GACESA P. Biotecnologia Segunda Edicion 1985.. Universidad Nacional Autónoma de México. Editorial El Manual Moderno. Mexico.V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS  SCRIBAN RENE..  Ingeniería Bioquímica. D.PDF  HIDRÓLISIS DE LA SACAROSA POR INVERTASA INMOVILIZADA EN NYLON- 6 EN UN REACTOR CONTINUO.PDF  Inmobilized enzymes: Theory.pdf VI. S. Profesor Agustín López Munguia. cap.  Reactores Enzimáticos..  Cinética enzimática. Alhomba. 6. ZARAGOZA – ESPAÑA. 1981. de C. primera edición. Editorial Acribia S.F. methods of study and applications.

5 TABLA N°1: COMPOSICIÓN DE MEDIO SÓLIDO DE MANTENCIÓN .0 KH2PO4 3.7H2O 0.0 Activación (NH4)2SO4 5.0 KH2PO4 5.5 KCl 0.0 Fermentación (NH4)2SO4 5.0 Sacarosa 10.57 pH 6.0 Extracto de levadura 5.5 pH 5.0 – 6. CONCENTRACIÓN MEDIO NUTRIENTE (G/L) Extracto de levadura 10 Sólido de Mantención Peptona 20 glucosa 20 agar 20 Sacarosa 20 Extracto de levadura 5. activación y cultivo para K. Referencias de composición de medios de mantención.7H2O 0.0 MgSO4.0 MgSO4. marxianus para la producción de inulinasa.

6 FERMENTACION Extracto de levadura 5.0 0.6 Extracto de levadura 5.7H2O 0.0 0.15 pH 6.7H2O 0.15 (NH4)2SO4 5.15 MgSO4.57 0.5 0.00 TABLA Nº 2: COMPOSICIÓN DE MEDIO DE ACTIVACIÓN (Para 30 ml de solución) MEDIO NUTRIENTE CONCENTRACIÓN (g/l) (g/30ml) Sacarosa 20.0 (NH4)2SO4 5.015 KCl 0.0 0.0 0.15 ACTIVACION KH2PO4 5.0 0.00 SOLIDO DE Glucosa 20 1.00 Agar 20 1.0 0.0171 TABLA N° 3: COMPOSICIÓN DEL MEDIO DE FERMENTACIÓN MEDIO NUTRIENTE CONCENTRACIÓN (g/l) (g/30ml) Sacarosa 20.5 0.15 MgSO4.50 MANTENCION Peptona 20 1.0 0.15 pH 6. (Para 50 ml de solución) MEDIO NUTRIENTE CONCENTRACIÓN (g/l) (g/50ml) Extracto de Levadura 10 0.015 .0 0.0 KH2PO4 5.

4% K = 0.PREPARACION DE MEDIO DE FERMENTACION (VOLUMEN DE 300ML) Para un volumen de medio = 30% del volumen del matraz Para una concentración final = 3 g/l Tomando la composición Elemental del Microorganismo Sacharomyces cerevisiae ATCC 4126: C = 45 % N =9% Mg = 0.5 % P = 2.0 22.3954 0.46 0.1186 potasio KH2PO4 N Sulfato de amonio 9.5 28. -----.0783 0.0 % Elemento Nutriente %Célula %Nutriente Yx/s So(g/L) So(g/300ml) C Sacarosa 45 42.73 57.6034 C12H22O11 N Extracto de -----.38 0. CALCULO DE % NUTRIENTES  Fuente de Carbono: Sacarosa: C12 H22 O11  PM = 342 .6.21 2.76 11.4 9.5 1.5728 (NH4)2SO4 Mg Sulfato de magnesio 0.865 24.5 . -----.9094 0.10 0.5613 5.3567 1.0235 potasio KH2PO4 P Fosfato diacido de 2.3447 1.9 Levadura K Fosfato diacido de 0.0 21.7H2O pH 5.6625 0. 3 0.1825 0.0548 heptahidratado MgSO4.

6 Otras Fuentes: Y X/S = (%Nutriente/%Celulas) . CÁLCULO DE YX/S Para Fuente de Carbono: Y X/S = (%Nutriente/%Celulas)*0.2.

9094 Para Fuente de Potasio: KH2PO4 Para Fuente de Magnesio: S0= (3/57.5613) = 5.76/ 2.21/ 9.5 = 1.3567V Y X/S = (28.5) = 57.5 = 0.3447 S0= (3/2.38 Y X/S = (9.0) = 11.38)x1.1/45)*0.0) = 2.865/ 0.5 = 0.3954 .6 = 0.6625)x1.5613 (NH4)2SO4 Para Fuente de Potasio: KH2PO4 Y X/S = (21.1825 Para Fuente de Fósforo: KH2PO4 S0= (3/11.5 = 0.4) = 24.6625 Para Fuente de Carbono: S0 = Xf /Yx/s Otras Fuentes: S0 = ( Xf /Yx/s)*1.7H2O Y X/S = (22.46)x1.7H2O S0= (3/24.5 Para Fuente de Carbono: Sacarosa: Para Fuente de Nitrógeno: C12 H22 O11 (NH4)2SO4 S0= (3/0.0783 MgSO4.3567)x1.46 Para Fuente de Magnesio: Para Fuente de Fósforo: KH2PO4 MgSO4.73/ 0. Para Fuente de Carbono: C12 H22 O11 Para Fuente de Nitrógeno: Y X/S = (42.